专利名称：鸡ibdv vp3蛋白b细胞抗原表位ⅱ的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子的免疫学领域，特别是涉及一系列鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B细胞抗原表位。
二.
背景技术：
鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的鸡的急性、高度接触性、杀淋巴细胞性的传染病，1957年在美国的Delaware州的Gumboro镇的肉鸡群中首次发生，又称甘布罗病，1962年Winterfield分离鉴定出IBDV。该病在美国及世界各国均有发生和流行，1988～1992年在我国大面积暴发流行，造成巨大的经济损失。研究发现，IBD是一种以体液免疫反应为主的免疫损伤性疾病，IBDV属于双RNA病毒科(Birnaviridae)，禽双RNA病毒属(avianbirnavirus)，该病毒有两个血清型，血清I型对鸡致病，II型仅感染火鸡但不致病，IBDV病毒粒子为单层衣壳，无囊膜，呈二十面体对称，直径为60-70nm，氯化铯中浮密度为1.31-1.34，对乙醚和氯仿不敏感，高度抗酸。
鸡传染性法氏囊病病毒IBDV为双链RNA病毒，其基因组由A、B两个片段组成。A片段由3200-3300bp核苷酸组成，B片段由2800-2900核苷酸组成。A片段含有一个大的开放阅读框架(ORF)和一个小ORF。大ORF编码有1012个氨基酸组成的病毒前体多聚蛋白(polyprotein)，分子量约为110kD。该前体蛋白由VP3，VP4和VP3组成。小ORF编码分子量约17kD的VP5蛋白。B片断编码病毒蛋白VP1，该蛋白为RNA依赖性的RNA聚合酶，与病毒的复制和组装有关。
VP3蛋白为IBDV的主要保护性抗原，含有中和性B细胞抗原表位，保护性抗原是作为疫苗使用的推荐抗原。在保护性抗原中具有中和作用的B细胞抗原表位在刺激中和性抗体产生中起重要作用。抗原表位又称抗原决定簇，是指能够被抗体、TCR/MHC复合物结合并识别的抗原片断，其中，能够被抗体结合并识别的抗原表位称为B细胞抗原表位；能够被TCR/MHC复合物结合并识别的抗原表位称为T细胞抗原表位。当病毒抗原进入机体后，保护性抗原与B淋巴细胞表面的抗原受体分子sIgM和IgD结合而导致B淋巴细胞活化和克隆化增值，并产生针对特异性B细胞抗原表位的抗体，发挥免疫保护作用。因此，B细胞抗原表位决定着机体产生抗体的特异性，是诱导体液免疫的基本单位，对特定病毒的蛋白质抗原来说，鉴定其B细胞抗原表位便是揭示病毒体液免疫的本质。
蛋白质抗原B细胞抗原表位鉴定中常用的方法有基因工程定点突变表达抗原蛋白分析法、随机噬菌体肽库技术和合成多肽检测技术等。定点突变表达抗原蛋白方法是最常用的技术之一，该方法方便、简单、成本低，但是，该方法只能粗略地鉴定出蛋白质抗原中发挥抗原性的关键氨基酸位点，不能最终确定该抗原表位的最短氨基酸序列，也不能区分出该抗原表位是属于线性表位还是构像性表位。噬菌体肽库技术能够模拟表达与特异性配体结合的多肽序列，经过多轮筛选后可以测序分析出与某一抗原特定抗体结合的抗原表位，不仅可以测定线性抗原表位，而且还能模拟构像性抗原表位。合成多肽技术可以最明确地鉴定出某一蛋白抗原中特定的线性B细胞表位。本项发明应用基因工程技术重叠(overlapping)表达IBDV的VP3结构蛋白，用体外免疫反应初步确定VP3中与特异性中和性单抗结合的区域；然后，应用肽库技术和overlapping合成多肽技术确定该结构蛋白上的线性最短氨基酸序列及模拟构像表位；最后，再应用合成多肽技术验证表位的正确性。
三.
发明内容
本发明的目的是提供一系列鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白中和性B细胞抗原表位。
本发明的技术方案是
一种鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B细胞抗原表位，其氨基酸序列为861 H-Lys-Met-Glu-Thr-Met-Gly-Ile-OH 867。
所述的鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B细胞抗原表位，其氨基酸序列向N端和C端依照鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白氨基酸序列扩展，扩展后的多肽氨基酸序列为856H-Thr-Arg-Ile-Ser-Lys-Lys-Met-Glu-Thr-Met-Gly-Ile-Tyr-Phe-Ala-Thr-Pro-OH 872。
一种鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B细胞抗原表位，其氨基酸序列为881H-Arg-Gly-Pro-Ser-Pro-Gly-Gln-Leu-Lys-Tyr-Trp-Gln-Asn-Thr-Arg-Glu-Ile-OH 897。
一种鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B细胞抗原表位，其氨基酸序列为728H-Pro-Arg-Asp-Trp-Asp-Arg-Leu-Pro-Tyr-Leu-Asn-Leu-OH739。
所述的鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B细胞抗原表位，其氨基酸序列向N端和C端依照鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白氨基酸序列扩展，扩展后的多肽氨基酸序列为723H-Arg-Phe-Pro-His-Asn-Pro-Arg-Asp-Trp-Asp-Arg-Leu-Pro-Tyr-Leu-Asn-Leu-Pro-Tyr-Leu-Pro-Pro-OH744。
所述的鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B细胞抗原表位为合成多肽。
所述的鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B细胞抗原表位为翻译或转录该多肽的核苷酸序列。
所述的鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B细胞抗原表位在N端或C端进行化学修饰。
所述的化学修饰为多肽链N端的自然氨基化或乙酰化，或C端的自然羧基化或酰胺化。
由本发明的鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B细胞抗原表位组成的免疫原或疫苗，至少包括权利要求中提及的一个抗原表位至全部抗原表位，这些多肽通过自身连接、相互连接或与载体连接，并辅以T细胞抗原表位，包括Th1和/或Th2表位多肽。这些T细胞抗原表位可以来源于鸡传染性法氏囊病病毒IBDV病毒蛋白或其它动物蛋白中具有刺激机体细胞免疫活性的多肽序列。
检测鸡IBDV病毒可以应用针对VP3的单克隆抗体或者应用针对VP3多肽抗体，检测方法可以包括琼脂扩散试验、间接ELISA、双抗体夹心ELISA、快速检测试纸条免疫膜层析技术等。
检测鸡IBDV抗体，包括母源抗体、疫苗免疫抗体、野毒感染产生抗体、抗鸡IBDV单克隆抗体等。检测方法可以包括琼脂扩散试验、间接ELISA、双抗体夹心ELISA、快速检测试纸条免疫膜层析技术等。
本发明的积极有益效果是1.由本发明的鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B细胞抗原表位设计的免疫原或疫苗免疫动物机体后能够产生针对IBDV的中和性抗体，并能够在体内或体外中和IBDV，阻止病毒感染动物机体。
2.由本发明的鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B细胞抗原表位设计的免疫原或疫苗能够在体内或体外中和或预防鸡IBD经典毒株、超强毒株或/和变异毒株的感染。
3.本发明的鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B细胞抗原表位与载体连接或自身连接或相互连接，能够免疫动物，在免疫动物时产生的抗多肽抗体或抗鸡传染性法氏囊病病毒IBDV抗体能够在体内外中和鸡传染性法氏囊病病毒IBDV病毒并产生免疫保护。
4.本发明的鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B细胞抗原表位或其连接物在免疫动物时产生的抗多肽抗体或抗IBDV抗体能够检测IBDV病毒或其多肽。
5.本发明的鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B细胞抗原表位或其连接物能够检测抗鸡传染性法氏囊病病毒IBDV抗体或抗鸡传染性法氏囊病病毒IBDV多肽抗体。
四.
具体实施例方式实施例一鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B细胞抗原表位片断的基因克隆SPF种蛋孵育至11日龄，取鸡胚胎制备鸡胚成纤维细胞，接种IBDV-H4株病毒，37℃培养96小时，收取病毒。以超速离心和40~60％蔗糖密度梯度离心分离病毒，获得病毒粒子。用TRIZOL法抽提病毒总RNA，用蛋白酶K处理基因组RNA，降解RNA双链分子，以此为模板应用RT-PCR方法扩增IBDV A片断基因。回收纯化PCR产物，并与pGEM-T载体连接，转化大肠杆菌，构建A片断基因克隆。
根据VP3结构特征和抗原性分析结果设计用于overlapping表达病毒蛋白的系列引物，PCR扩增VP3及VP3基因片断。构建VP3及其片断的原核表达载体，并在pET系统原核表达病毒抗原，表达的病毒抗原经溶解复性后，制备免疫原，免疫BALB/C小鼠，制备单克隆抗体。
根据Biolabs公司的噬菌体肽库手册进行IBDV中和性单抗的系列筛选。①用LB/IPTG/xgal扩增M13噬菌体肽库并进性滴度测定；②IBDV单抗标记免疫亲和磁珠；③免疫亲和磁珠与2×1011扩增的噬菌体反应60min；④PBST洗10次，洗去未结合的噬菌体；⑤应用免疫亲和磁分离技术收集与IBDV单抗结合的噬菌体；⑥洗脱与单抗结合的噬菌体；⑦洗脱噬菌体的扩增与滴度测定；③重复③~⑦步操作进行肽库的第二至三轮淘选；⑨第三轮淘选后从LB/IPTG/xgal平板上挑选蓝斑菌落进行扩增，提取噬菌体DNA并进行序列测定；⑩用IBDV快速检测试纸条进一步鉴定噬菌体展示多肽的反应性。最后应用肽库抗原表位分析程序分析确定克隆物质为鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B细胞抗原表位。
实施例二Fmoc固相多肽合成法overlapping合成系列VP3抗原肽片断并进行Dot-ELISA筛选根据原核表达VP3及overlapping表达VP3抗原片断的间接ELISA单抗反应谱，以及噬菌体肽库技术筛选的VP3中和抗体位点序列，确定overlapping合成多肽的初步序列。并应用Chou and Fasman算法用计算机分析这些多肽片断的二级结构特征、亲水性、抗原性、表面可及性等特性，设计合成多肽的序列。并应用peptide程序分析合成难度特性，设计多肽合成程序，应用多肽合成仪进行自动合成和手工合成相结合的方法合成多肽序列。具体流程如下设计合成多肽序列→peptide程序分析→设计合成程序→按树脂的取代值计算并称取Fmoc-AA-Wang-resin或Rink resin→DMF溶涨树脂→*加20％piperidine脱Fmoc保护，搅动6min→*加下一位氨基酸和HBTU进行酰化反应，N2搅动反应30min→*用Kaiser法或TNBS法测试反应的完成情况→*DMF洗5次，每次1min→重复带有*的步骤，在树脂上连接下一位氨基酸，直到该多肽序列合成完成→根据组成肽链氨基酸不同选取适当的试剂用TFA法裂解肽链与树脂的连接→冷乙醚沉淀TFA多肽→Sephadex G-25脱盐纯化→LC-MS和HPLC分析鉴定和纯化多肽→多肽与载体的偶联→Dot-ELISA测试中和性单抗与多肽的反应性→分析IBDV中和性单抗反应性B细胞抗原表位。
实施例三鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B细胞抗原表位的合成根据VP3蛋白B细胞抗原表位的氨基酸序列，应用固相多肽合成技术，采用自动多肽合成仪或人工多肽合成方法。固相树脂采用Fmoc保护的氨基酸Wang树脂或其它树脂，树脂经DMF溶涨、piperidine脱Fmoc保护后，根据氨基酸序列顺序，加入Fmoc保护的氨基酸，在HBTU存在情况下进行酰化反应。酰化反应完成后经过洗涤，再加入第二位的Fmoc-氨基酸进行酰化反应，并洗涤。如此循环，从多肽序列C末端起始向N末端，按照序列顺序合成完整的多肽链。合成完成后，根据组成肽链氨基酸不同选取适当的试剂用TFA法裂解肽链与树脂的连接并用冷乙醚沉淀TFA多肽，经脱盐纯化、LC-MS和HPLC分析鉴定后备用。在整个合成过程中，每个氨基酸酰化反应后可以应用Kaiser法或TNBS法测试反应的完成情况。为了便于使表位多肽和载体蛋白连接，在合成多肽时可以在多肽序列的N末端添加一个半胱氨酸。
以氨基酸序列81H-Lys-Phe-Asp-Gln-Met-Leu-OH86为例合成5μmol多肽所需试剂和操作流程如下主要试剂N，N-二甲基甲酰氨(DMF)；脱保护试剂I20％Piperidine/DMF；脱保护试剂II二氯甲烷(DCM)；缩合、活化试剂2-(1H-苯并三哇)-N，N，N’，N’一四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)溶于NMM(N-甲基吗啡啉)/DMF；切割试剂94％三氟乙酸(TFA)；20种Fmoc保护氨基酸(25μmol/L)Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-Glu(OtBu)-OH；Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-Asn(tBu)-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Val-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH。主要树脂Fmoc-Leu-Wang-Resin；Symphony多肽合成仪美国Protein Technology公司。
多肽合成中氨基酸偶联步骤根据目的肽链产量，称量10mg Fmoc-Leu-WangResin放入反应瓶；(1)加入1.25ml DMF，混合10分钟，用N2吹掉DMF，重复3次以上；(2)加入1.25ml 20％Piperidine/DMF，混合5分钟，用N2吹掉液体，加入1.25ml 20％Piperidine/DMF，混合反应15分钟；(3)重复步骤(1)；(4)加入1.25ml 25μM的Fmoc-Met-OH；加入1.25ml 0.4NMM/DMF，混合反应45分钟以上，用N2吹掉液体；(5)重复步骤(1)；(6)重复步骤1～5依次加入Fmoc-Met-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH完成多肽序列中每个氨基酸的偶联；(7)氮气吹干树脂。
已合成完毕的目的肽的切割基本步骤如下(1)加入1.25ml DMF，混合10分钟，用N2吹掉DMF，重复3次以上；(2)加入1.25ml 20％Piperidine/DMF，混合5分钟，用N2吹掉液体，加入1.25ml 20％Piperidine/DMF，混合15分钟；(3)重复步骤(1)；(4)用DCM洗涤三次以上；(5)加入94％TFA混合反应2小时以上；(6)收集切割产物。
多肽合成产物粗提将无水乙醚缓缓加入收集的产物中，冰浴10分钟，3000rpm，离心10分钟，留沉淀，弃上清，重复3次，沉淀物用冻干机干燥，-20℃保存备用。取少量样品用于HPLC，GC-MS检测。
实施例四鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B细胞抗原表位的化学修饰按照实施例三的方法合成的多肽片断，其N末端为自然氨基修饰，C末端为自然羧基修饰。
N末端乙酰化修饰方法按照以上介绍的多肽合成方法合成至最后一个Fmoc保护氨基酸偶联结束，并进行N末端Fmoc保护集团的去除，然后进行以下操作。取150μl(2.6μmol)乙酸酐和20μl(0.1μmol)EIPEA溶于4.8mlDMF中，充分混合并在冰浴中冷却。然后将以上混合溶液加入多肽合成反应瓶中反应5分钟。再依次用5ml DMF和二氯甲烷(DCM)洗2次，每次5分钟。氮气吹干后按照前述常规合成方法进行侧链保护集团的去除、裂解、纯化和鉴定。
C末端酰胺化修饰方法C末端酰胺化的多肽合成时应选用树脂为Rink树脂。执行合成程序时应对树脂用DMF溶涨20分钟，然后从C末端第一位氨基酸开始执行合成程序，同前述Fmoc-wang树脂合成方法。
实施例五鸡IBDV VP3蛋白B细胞抗原表位与载体蛋白KLH和BSA的连接实验材料包括表位多肽；血蓝蛋白(KLH)，Pierce公司；牛血清白蛋白(BSA)，DMSO，Sigma公司；连接剂Sulfo-SMCC，Pierce公司产品。
载体蛋白KLH或BSA 4mg溶于0.5ml含5mM EDTA的PBS缓冲液，pH 7.2，加入1.0mg连接剂Sulfo-SMCC，充分溶解后在室温孵育60分钟或37℃孵育30分钟。应用Sephadex G-25脱盐柱或透析法纯化Sulfo-SMCC处理的载体蛋白，并用BCA蛋白测定试剂盒(Pierce公司)测定蛋白含量，备用。
表位多肽合成完毕后，准确称量4mg，加入0.5ml双蒸馏水溶解多肽，若多肽溶解性不好可以加适量DMSO促溶。然后将溶解后的多肽与Sulfo-SMCC处理的载体蛋白混合，4℃孵育2小时或过夜，备用。
实施例六鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B细胞抗原表位氧化实现自身的连接含半胱氨酸的表位多肽可以通过巯基的氧化反应形成自身连接。一般情况下应用DMSO介导的氧化反应实现连接，根据多肽的酸碱性，氧化反应可以在微酸或微碱性情况下进行。
微酸性环境下的氧化反应用适当浓度的醋酸水溶解多肽，使多肽的浓度在0.5-1.5mM范围内，醋酸的终浓度不超过5％，用(NH4)2CO3调整多肽溶液的pH为6.0左右，加入10-20％的DMSO，25℃反应5-25h，氧化反应的进行程度可以通过HPLC监测。然后，用1％TFA水和乙腈为流动相，制备型反相HPLC纯化氧化性多肽，备用。
微碱性环境下的氧化反应用0.01M磷酸盐缓冲液，pH7.5，溶解多肽至终浓度1.0mM，加入终浓度1％的DMSO，25℃反应过夜，氧化反应的进行程度可以通过HPLC监测。然后，用1％TFA水和乙腈为流动相，制备型反相HPLC纯化氧化性多肽，备用。
实施例七鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B细胞抗原表位应用连接剂的连接含半胱氨酸的表位多肽以及不含半胱氨酸的表位多肽通过N端α氨基或赖氨酸ε氨基应用戊二醛或碳化-二亚胺(EDC)(Fluka公司产品)等同型双功能试剂进行自身连接、相互连接或与载体连接。
称取1mg BSA用活化缓冲液(0.1M MES，0.5M NaCl，pH5.7)配成浓度为1mg/ml的溶液，加入0.4mg EDC(2mM)和0.6mg NHS(Fluka产品)，充分混合后室温反应15分钟，加入终浓度为20mM的巯基乙醇，加入1.0mg表位多肽，室温反应2小时；然后，加入0.7mg盐酸羟胺，室温反应30分钟；最后，应用Sephadex G-25脱盐纯化，以活化缓冲液为平衡洗脱溶液，280nm紫外波长检测，收集第一个流出组分为多肽连接物，经无菌过滤后4℃或-20℃保存备用。
实施例八鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B细胞抗原表位间接ELISA检测鸡IBDV抗体的试验VP3蛋白B细胞抗原表位或表位多肽与载体的连接物为包被抗原，以BSA为对照抗原，包被96孔酶标板(聚苯乙烯微孔板)。用pH9.6，0.1M碳酸盐缓冲液稀释包被抗原至终浓度1.0μg/ml，按50μl/孔加入酶标板中，4℃孵育过夜。然后用PBST洗液(PBS+0.05％Tween)洗涤酶标板6次，2％BSA洗液封闭酶标板2小时，用于检测IBDV抗体。
检测抗体时，依次进行入下操作加入待检血清(或进行倍比稀释血清用于检测抗体效价)，37℃孵育30-60分钟，PBST洗液洗涤酶标板6次；加入羊抗鸡IgG辣根过氧化物酶酶标二抗(Goat-antichicken IgG-HRP)或抗鸡IgG单抗-HRP酶标二抗，37℃孵育30-60分钟，PBST洗液洗涤酶标板6次；加入HRP底物和显色剂，室温避光孵育5-10分钟观察颜色反应；待充分显色后，加入2％硫酸终止颜色反应；用酶标仪(Bio-Rad)在波长450nm读取反应板孔的吸光值；判定结果。
判定结果时，以样品板孔的吸光值为对照板孔吸光值3倍时，判为反应阳性；以反应阳性血清的最大稀释倍数为该样品血清的抗体效价。
实施例九鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B细胞抗原表位Dot-ELISA检测鸡IBDV抗体的试验VP3蛋白B细胞抗原表位或表位多肽与载体的连接物为包被抗原，以BSA为对照抗原。用点膜仪(Bio-Dot)在硝酸纤维素膜(Millipore)上定量喷点包被抗原，1-2μg/点，37℃固定30分钟，PBST洗涤6次，10％脱脂乳洗液封闭过夜，PBST洗涤6次，即可用于抗体检测。
检测抗体时，将待检血清样品定量稀释后和抗原包被膜37℃孵育30分钟，PBST洗涤6次，加入羊抗鸡IgG辣根过氧化物酶酶标二抗(Goat-antichickenIgG-HRP)或抗鸡IgG单抗-HRP酶标二抗，37℃孵育30-60分钟，PBST洗液洗涤酶标板6次；加入AEC或DAB底物显色，室温避光孵育5-10分钟观察颜色反应。
结果判定时，以包被抗原点呈现棕红色颜色反应，对照抗原点不出现颜色反应进行判定。
实施例十鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B细胞抗原表位免疫原的制备及免疫实验鸡IBDV VP3蛋白B细胞抗原表位抗原作为免疫原制备时的抗原。首免抗原用弗氏完全佐剂(Sigma)和抗原乳化，以每条多肽5-10μg免疫动物；二、三免时应用弗氏不完全佐剂(Sigma)和抗原乳化，以每条多肽5-10μg免疫动物。免疫途径为皮下或肌肉注射。免疫时间首免为7-14日龄，二免为首免后14日，以后根据免疫抗体水平可以进行加强免疫。
实施例十一应用VP3单克隆抗体检测鸡传染性法氏囊病病毒IBDV应用VP3单克隆抗体检测鸡IBDV病毒可以采用琼脂扩散试验，双抗体夹心ELISA试验，以及双单克隆抗体免疫膜层析试纸条试验等。待检样品可取鸡法氏囊、肝脏、脾脏、肾脏等组织，将这些组织按1∶5比例用生理盐水或PBS缓冲液匀浆处理，3000rpm离心30分钟，取上清悬液待检。
琼脂扩散试验检测时，在琼脂平板中打7孔梅花孔，中间孔加入VP3单克隆抗体，周边孔加入待检样品、标准阳性样品和阴性样品等，每孔各50μl，放入湿盒中，37℃孵育12-24小时，观察结果。结果判定以标准阳性样品和VP3单克隆抗体孔之间出现沉淀线，阴性样品与VP3单克隆抗体孔之间不出现沉淀线时，样品孔与VP3单克隆抗体孔之间出现沉淀线的样品为阳性样品，否则为阴性样品。
双抗体夹心ELISA试验检测时，以一株VP3单克隆抗体为包被抗体包被酶标板，包被浓度为10μg/ml，包被方法按实施例八进行。检测时，将适当稀释的待检样品加入包被好的酶标板，50μl/孔，37℃孵育30分钟，PBST洗涤6次，然后加入HRP标记的另一株VP3单克隆抗体，50μl/孔，37℃孵育30分钟，PBST洗涤6次，用HRP底物显色，判定结果。
双单克隆抗体免疫膜层析试纸条检测时，以一株VP3单克隆抗体和胶体金偶联喷涂玻璃棉，将另一株VP3单抗及兔抗鼠IgG分别喷涂于硝酸纤维素膜上作为检测线和对照线，然后按照试纸条的组装方法将样品垫、胶金棉、硝酸纤维素膜、吸水垫按试纸条的组装方式组装成免疫膜层析试纸条(详细方法参照中国发明专利ZL99101537.1，“畜禽疫病快速检测试纸条”张改平等，1999年)，用于检测。检测时，将试纸条的测试端插入适当稀释的待检样品液中10-20秒，取出后平放1-5分钟，然后判定结果。试纸条出现两条线(检测线和对照线)时判为阳性，即该鸡感染IBDV病毒，试纸条只出现一条对照线时判为阴性。
实施例十二应用抗VP3表位多肽抗体检测鸡传染性法氏囊病病毒IBDV鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B细胞抗原表位抗体的制备同实施例十，检测鸡IBDV病毒时样品处理和检测方法参照实施例十一。
序列表<110>河南省农业科学院生物技术研究所<120>鸡IBDV VP3蛋白B细胞抗原表位II<130>seq004<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>7<212>PRT<213>禽双RNA病毒属(Avibirnavirus gen.)<400>1Lys Met Glu Thr Met Gly Ile1 5<210>2<211>17<212>PRT<213>禽双RNA病毒属(Avibirnavirus gen.)<400>2Thr Arg Ile Ser Lys Lys Met Glu Thr Met Gly Ile Tyr Phe Ala Thr1 5 10 15Pro<210>3<211>17
<212>PRT<213>禽双RNA病毒属(Avibirnavirus gen.)<400>3Arg Gly Pro Ser Pro Gly Gln Leu Lys Tyr Trp Gln Asn Thr Arg Glu1 5 10 15Ile<210>4<211>12<212>PRT<213>禽双RNA病毒属(Avibirnavirus gen.)<400>4Pro Arg Asp Trp Asp Arg Leu Pro Tyr Leu Asn Leu1 5 10<210>5<211>22<212>PRT<213>禽双RNA病毒属(Avibirnavirus gen.)<400>5Arg Phe Pro His Asn Pro Arg Asp Trp Asp Arg Leu Pro Tyr Leu Asn1 5 10 15Leu Pro Tyr Leu Pro Pro20
权利要求
1.一种鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B细胞抗原表位，其氨基酸序列为861H-Lys-Met-Glu-Thr-Met-Gly-Ile-OH 867。
2.根据权利要求1所述的鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B细胞抗原表位，其氨基酸序列向N端和C端依照鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白氨基酸序列扩展，扩展后的多肽氨基酸序列为856H-Thr-Arg-Ile-Ser-Lys-Lys-Met-Glu-Thr-Met-Gly-Ile-Tyr-Phe-Ala-Thr-Pro-OH 872。
3.一种鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B细胞抗原表位，其氨基酸序列为881H-Arg-Gly-Pro-Ser-Pro-Gly-Gln-Leu-Lys-Tyr-Trp-Gln-Asn-Thr-Arg-Glu-Ile-OH 897。
4.一种鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B细胞抗原表位，其氨基酸序列为728H-Pro-Arg-Asp-Trp-Asp-Arg-Leu-Pro-Tyr-Leu-Asn-Leu-OH739。
5.根据权利要求4所述的鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B细胞抗原表位，其氨基酸序列向N端和C端依照鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白氨基酸序列扩展，扩展后的多肽氨基酸序列为723H-Arg-Phe-Pro-His-Asn-Pro-Arg-Asp-Trp-Asp-Arg-Leu-Pro-Tyr-Leu-Asn-Leu-Pro-Tyr-Leu-Pro-Pro-OH744。
6.根据权利要求1～5中任一项权利要求所述的鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B细胞抗原表位，其特征是鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B细胞抗原表位为合成多肽。
7.根据权利要求1～5中任一项权利要求所述的鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B细胞抗原表位，其特征是鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B细胞抗原表位为翻译或转录该多肽的核苷酸序列。
8.根据权利要求1～5中任一项权利要求所述的鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B细胞抗原表位，其特征是鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B细胞抗原表位在N端或C端进行化学修饰。
9.根据权利要求8所述的鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B细胞抗原表位，其特征是所述的化学修饰为多肽链N端的自然氨基化或乙酰化，或C端的自然羧基化或酰胺化。
全文摘要
本发明属于分子免疫学领域，主要涉及鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白的系列多肽片断，特别是涉及VP3蛋白中组成B细胞抗原表位的系列多肽片断。由本发明的鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B细胞抗原表位设计的免疫原或疫苗免疫动物机体后能够产生针对IBDV的中和性抗体，并能够在体内或体外中和IBDV，阻止病毒感染动物机体。本发明的鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B细胞抗原表位或其连接物在免疫动物时产生的抗多肽抗体或抗IBDV抗体能够检测IBDV病毒或其多肽。
文档编号C07K7/06GK1687111SQ200510017450
公开日2005年10月26日 申请日期2005年3月29日 优先权日2005年3月29日
发明者张改平, 王选年, 赵东, 乔宏兴, 江涛, 席俊, 杨艳艳, 李青梅, 柴书军, 邢广旭, 杨继飞, 李学伍, 肖志军, 邓瑞广 申请人:河南省农业科学院生物技术研究所