专利名称：凝胶电泳分离血清脂蛋白及其量化检测的新方法
技术领域：
本发明凝胶电泳分离血清脂蛋白及其量化检测的新方法，涉及有效表达血清脂蛋白代谢平衡状态的实用方法，广泛用于医学检测及研究。
背景技术：
血清脂蛋白具有特殊的颗粒结构，其组成复杂而不均一，在代谢过程中不断按序演变和物质交换，通常处于协调的动态平衡状态。异常脂蛋白血症与心脑血管病的关系密切，临床上非常重视。多年来检测血清脂蛋白的方法不断改进，如梯度凝胶电泳，但临床上一直缺乏有效表达血清脂蛋白代谢平衡状态的实用方法。主要存在三个问题一、由于不同种类血清脂蛋白的颗粒特性差异悬殊，使单一方法的实验条件难以兼顾，同步表达它们的能力弱，通常采用相互分立的方法分别进行检测。二、由于分析过程的参比系不统一，使分别测定的结果不能放在统一的血清脂蛋白整体中比较其相互联系。三、由于实验条件要求较高，如稳定的线性浓度梯度，难以适应临床检验工作的需要。
目前国内外研究现状
第一、血脂因素的孤立分析冠心病的病理基础是动脉粥样硬化，血脂异常是其关键的危险因素。表达血脂状态的指标很多，临床常用的有甘油三酯(TG)，总胆固醇(TC)，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)，以及载脂蛋白(Apo)和脂蛋白(a)[Lp(a)]等。从孤立的血脂因素进行分析，临床现状不容乐观。人们的平均血脂水平随生活水平的提高而有明显升高趋势。2001年调查发现我国94.9％冠心病伴高脂血症患者未能得到理想的血脂控制。部分患者的血脂水平始终不高，或者即使将血脂控制在合适范围，也难以阻止其冠脉病变发展进程。因此，理论上难以从孤立的血脂因素来解释患者的发病机制。存在如下一些问题(一)忽视了血清脂蛋白颗粒结构的完整性，血清脂蛋白在保持完整颗粒结构的前提下发挥其生理功能。不同种类脂蛋白的构成有明显差异。临床常用血脂指标只是笼统的表达，并不能反映它们在各种脂蛋白中的具体含量。孤立因素如胆固醇(Chol)并不能反映脂蛋白颗粒的全貌。同样是Chol却有好坏之分，其实质为携带之脂蛋白(如HDL和LDL)的颗粒特性有别。若脂蛋白颗粒发生异常，将Chol运输和堆积到不应该的部位(如巨噬细胞内和血管壁)，从而导致病理改变。(二)忽视了血清脂蛋白代谢的整体性，血清脂蛋白的组成复杂而不均一，其代谢通常处于协调的平衡状态。因缺乏量化表达的有效指标，调脂治疗尚未从调节血清脂蛋白代谢的整体角度着手，而局限于降低TG、TC、LDL-C和升高HDL-C等分立指标上。(三)忽视了血清游离脂肪酸(FFA)，由于脂肪酸不溶于水，整个细胞外游离脂肪酸(FFA)的运输过程主要靠非酯化脂肪酸清蛋白(AL-NEFA)来完成。AL-NEFA参与血脂代谢，具有重要的生物学意义，直接影响血小板、粒性白细胞的功能以及某些酶促活性。但临床血脂检验基本忽视了本属于血脂范畴的FFA或AL-NEFA成分。(四)针对HDL的认识和措施有限，HDL通过胆固醇逆转运(RCT)途径将外周细胞内多余的Chol转运至肝脏或固醇代谢器官，对防治动脉粥样硬化有意义。但对HDL亚组分颗粒特性的认识有限，临床上尚缺乏有显效升高HDL的措施，亟待解决。研究HDL亚组分，寻找调节RCT的新药物，是临床血脂研究发展的一大趋势。
第二、血脂因素的组合分析，由于以往孤立分析有局限性，临床血脂研究逐渐往横向发展，出现多个因素的组合分析，如“脂谱”和“脂蛋白谱”，试图从多因素的角度综合评价血脂代谢状态。其中倍受关注的是“致动脉粥样硬化性脂蛋白谱”(ALP)，它是指有一定遗传基础的几种代谢异常的综合，主要表现sLDL增多，高TG血症及低HDL-C，常伴有胰岛素抵抗为基础的代谢综合征。这些“谱”是多指标的组合，各项指标之间来源不同，单位有别，不具备“光谱”、“电泳谱”等有严谨科学含义的“谱”的特征。孤立指标组合所表达的仍然是血脂代谢的某些因素，并不能表达血清脂蛋白平衡状态的整体概貌。(一)理论认识方面(1)血液中散布的有形成分有红白细胞、血小板、脂蛋白和更细微的物质。它们在形态上逐渐由大到小，由细胞向非细胞过渡。血清脂蛋白具有特殊的颗粒结构，组成复杂而不均一，发挥着重要的生理功能。我们认为，血清脂蛋白是一组非细胞形态的结构和功能单位。临床分析应重视它们颗粒结构的完整性，而非局限于局部组成因素。(2)血清中不同种类脂蛋白颗粒的结构和功能存在明显差异，相互之间时刻进行着脂质和Apo的转移或交换。血清各种脂蛋白颗粒都有各自生成、发展和消亡的过程，其代谢受多种功能蛋白的调节而处于复杂而有序的平衡状态，维持着各自质与量的相对稳定，并随时间变化而动态改变，称为血清脂蛋白动态平衡。这种动态平衡失调是血脂异常的一种表现形式，可能是导致疾病发生和发展的一个重要环节。调脂治疗应注重整体，试以调节血清脂蛋白动态平衡为关键，而非局限于降低或升高局部因素。(二)以往方法学存在的主要问题有(1)分离方法相互分立式，难以进行同步分离。由于不同种类血清脂蛋白的颗粒特性差异悬殊，使电泳条件的设置难以兼顾，同步表达能力差。(2)分析方法无统一参比，不能进行统一比较。由于忽略了“参比系惟一性”的实验原则，使测定结果缺乏相互可比性，对血清脂蛋白代谢平衡状态无法统一地进行总体评估。我们从整体的角度探索改良方法的途径，为此，提出新的技术方案。
发明内容
本发明目的在于，提供一种凝胶电泳分离血清脂蛋白的方法，并对其进行量化检测的分析，以同步和量化表达血清脂蛋白整体的平衡关系，而非局限于某些组分或亚组分。
本发明的目的通过下述方案实现一种凝胶电泳分离血清脂蛋白方法，以三种不同浓度的分段聚丙烯酰胺凝胶作为电泳载体，在电泳槽中形成温度梯度，对血清脂蛋白及其亚组分做同步电泳分离，其中，所述的聚丙烯酰胺凝胶作为分离胶浓度分别为分离胶1为3.0％；分离胶2为3.6％；分离胶3为7.0％。本发明建立了分段浓度聚丙烯酰胺凝胶电泳(sd-PAGE)的新方法，该法以三种不同浓度的分段聚丙烯酰胺凝胶作为电泳载体，利用非线性浓度梯度来调控不同分离胶的分子筛大小，使之分别与不同颗粒大小的脂蛋白相匹配。
电泳方法的结果是将苏丹黑B预染的血清同步分离出11-12条清晰区带，按序先后为前清蛋白(pre-AL)、非酯化脂肪酸清蛋白(AL-NEFA)、高密度脂蛋白1-5(HDL1-5)、低密度脂蛋白(LDL)、中间密度脂蛋白(IDL)、极低密度脂蛋白1-2(VLDL1-2)以及在原点区内可能滞留的乳糜微粒(CM)。
在上述方案基础上，对凝胶电泳分离血清脂蛋白方法进行量化检测，即电泳结束立即取下凝胶管，用双波段飞点扫描仪和光学扫描仪分别对凝胶管进行扫描和成像，飞点扫描单色光波长为604nm，以空白凝胶为统一参比，扫描时沿凝胶管的中央轴线，从空白区向原点的方向进行，分析时以相邻电泳峰之间的拐点作为分段标志，仪器自动算出各电泳峰下面积占血清脂蛋白整体的百分含量，血清脂蛋白及其亚组分的扫描图谱和量化结果制成血清脂蛋白谱。其扫描图谱和定量数据称之为血清脂蛋白谱(SLPG)，直观而具体地表达各种血清脂蛋白的相对含量，理想地表达了它们在血清代谢中的相互平衡关系。SLPG各项指标的检测稳定性好，批内变异系数(CV)为1.20％-6.54％。
本发明优越性在于操作简便，性能优越，应用前景良好，在技术和性能上克服以往技术难题，达到了以往方法所不能达到的效果。本发明成功建立了sd-PAGE新方法和SLPG新指标，效果理想。就“谱”的特征，SLPG与目前孤立指标组合的“谱”有本质区别。通过建立本发明方法，实现了血脂脂蛋白的整体分析--血清脂蛋白代谢动态平衡。
图1.sd-PAGE分离血清脂蛋白及其亚组分图例图2.性能比较SLPG与其它同类研究的检测图例图3.基础验证SLPG电泳峰对应各种脂蛋白的颗粒大小和Apo/Cho图4.不同血脂状态下的SLPG有规律表现具体实施方式
一、试剂1、贮存液A丙烯酰胺(Acr)9.60g和甲叉双丙烯酰胺(Bis)0.25g，溶于去离子蒸馏水(DDI H2O)至100ml，过滤后用棕色瓶存于4℃，使用3个月。
2、贮存液B三羟甲基氨基甲烷(Tris)18.3g和1.0M盐酸24ml，溶于DDI H2O至100ml，pH8.8，过滤后用棕色瓶存于4℃。
3、贮存液CAcr 19.6g和Bis 0.4g，溶于DDI H2O至100ml，过滤后用棕色瓶存于4℃，使用3个月。
4、贮存液DTris 6.06g和乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)1.17g，溶于DDI H2O至100ml，pH8.8，过滤后用棕色瓶存于4℃。
5、引发剂过硫酸铵(APS)1.0g溶于DDI H2O至10ml，使用即时配制。
6、染色液苏丹黑(SB-B)0.25g溶于异丙醇25ml，37℃水浴过夜，趁热过滤，室温下保存在密封的棕色瓶内。使用前37℃水浴45分钟。
7、电泳缓冲液Tris 6.0g和甘氨酸28.8g溶于DDI H2O至1000ml，贮存于4℃，使用时用DDI H2O稀释10倍。
二、方法1、血清预染 人血清来自上海市中山医院检验科。采集隔夜空腹静脉全血，3小时内离心分离出血清。取血清100μl加染色剂1％SB-B液10μl，振荡混匀后置37℃水浴45min，离心后待测。离心条件为3000rpm，10分钟。
2、分段凝胶电泳 准备洁净的12支管状玻璃管，规格为内径6mm，外径8mm，长度10cm。用封口膜密封玻璃管一端开口，并将其垂直固定在制胶支架上。按照表1逐步制备高度分别为4.5cm、4.0cm和0.6cm的三层不同浓度的凝胶，每层凝胶在灌胶后立即轻轻注入100μl DDIH2O覆盖其表面，使胶面凝聚平整。静置30分钟后去掉水层，再灌注下一层凝胶液。将制备好的凝胶管垂直置入圆盘电泳槽(DYY-III27A，北京六一电泳仪器厂)，使分离凝胶1的下界与负极槽底面平齐。分别向正负极电泳槽内注入电泳缓冲液(正极槽600ml，负极槽400ml)。接着，将预染血清(50μl/管)缓慢地加入凝胶管内，覆盖在分离凝胶3的表面。最后，接通稳压电源(Model 1000/500，Bio-Rad)，100V电泳2.5h。
表1.分段浓度凝胶的制备分离胶3分离胶2分离胶1试剂(T7.0％，C3.0％) (T3.6％，C2.0％) (T3.0％，C2.0％)贮存液(ml) A13.70 C3.00C0.75贮存液(ml) B2.40D2.00D0.60DDI H2O(ml) 3.10 11.50 3.60TEMED(μl) 10.00 10.00 5.0010％APS(μl) 100.00 100.00 50.00总量(ml) 19.31 16.61 5.005其中四甲基乙二胺(TEMED)去离子蒸馏水(DDI H2O)过硫酸铵(APS)3、电泳区带的扫描与量化 电泳结束立即取下凝胶管，用双波段飞点扫描仪(CS-9000，Shimadzu)和光学扫描仪(PowerLook III，UMAX)分别对凝胶管进行扫描和成像。飞点扫描单色光波长为604nm，以空白凝胶为统一参比。扫描时沿凝胶管的中央轴线，从空白区向原点的方向进行。分析时以相邻电泳峰之间的拐点作为分段标志，仪器自动算出各电泳峰下面积占血清脂蛋白整体的百分含量。血清脂蛋白及其亚组分的扫描图谱和量化结果称为血清脂蛋白谱(SLPG)。
三、结果1、血清脂蛋白电泳区带的命名和表现见图1.sd-PAGE分离血清脂蛋白及其亚组分图例和图2.性能比较SLPG与其它同类研究的检测图例所示
sd-PAGE法将SB-B预染血清同步电泳分离出11-12条区带。按先后次序分别命名为血清前清蛋白(pre-AL)、非酯化脂肪酸清蛋白(AL-NEFA)、高密度脂蛋白1-5(HDL1-5)、低密度脂蛋白(LDL)、中间低密度脂蛋白(IDL)、极低密度脂蛋白1-2(VLDL1-2)。原点区出现类似的电泳峰，若界面凹陷，峰顶出现平台，宽度＞3mm，则认为存在乳麋微粒(CM)。在分离胶2、3的界面位置出现先负后正的小波，是界面折射而成的伪带，不纳入血清脂蛋白的范畴。
在分离胶3中，pre-AL和AL-NEFA泳动最快，有明显的SB-B着色。HDL1呈独立的圆弧小峰，HDL2-5呈基部相连的指状峰，通常HDL3或HDL4为主峰，HDL2和HDL5峰较低。在分离胶2中，LDL呈高大的钟形峰。根据电泳峰的特点，LDL通常有3种表现型①慢迁移型，后支出现明显脱尾；②快迁移型，区带明显前移；③中间型，分带较窄，前后对称。IDL电泳迁移在LDL和VLDL之间，呈孤立峰，其含量个体差异明显。VLDL有2种亚组分，VLDL1泳动较快，进入分离胶2，峰形高尖。在分离1中，VLDL2区带着色分布较均匀，峰形平坦。
图1中，电泳方向由上至下。泳道#1，2、#3，4和#5，6为重复实验。左侧为示意图。HDL有5种亚组分，HDL1呈孤立分带。VLDL有2种亚组分。LDL有3种电泳表现型①分带明显拖尾，②分带明显前移，③分带较窄。
2、定量检测血清脂蛋白及其亚组分的重复性sd-PAGE法分离血清蛋白及其亚组分后量化分析SLPG各指标的的批内变异(CV)分别为AL-NEFA2.79％，HDL16.54％，HDL25.14％，HDL34.06％，HDL45.89％，HDL56.03％，Total HDL2.36％，LDL1.20％，IDL4.81％，VLDL13.74％，VLDL25.58％。
在图2性能比较SLPG与其它同类研究的检测图例中，图2(a)对应图1中#1泳道的SLPG图例，各电泳区带在对应迁移位置出现电泳峰，HDL1电泳峰相对孤立。SLPG可统一量化出各种血清脂蛋白的相对含量，直观而具体地表达了它们之间的平衡关系。(b)美国Quantimetrix公司开发的Lipoprint系统检测图例(http//www.4qc.com)，示LDL被分离出7种亚组分，但未见电泳峰分别与之对应。解析图谱时各亚组分的分段位置并未按电泳峰谷来界定，且忽略了HDL和AL-NEFA。其中彩色和虚线分别表示异常和正常情况。其应用研究已发表于专业杂志，受到关注，但售价高。相比之下，SLPG检测新法具有明显的性能优势和应用前景。
本发明的技术特点一、分段的非线性浓度梯度由于聚丙烯胺凝胶浓度大小决定凝胶的交联程度，直接决定凝胶分子筛孔径的大小，从而影响电泳分离血清脂蛋白的分辨率，因此，合适的浓度设置是提高分离效果的重要条件之一。本发明一改以往单一浓度和连续浓度梯度的做法，设置3段不同浓度3.0％、3.6％和7.0％的凝胶组合，构成大落差的非连续的浓度梯度。一方面让颗粒特性差异不大的脂蛋白，如HDL亚组分，在同一浓度胶中分离。另一方面，可为颗粒特性差异悬殊的脂蛋白，如HDL、LDL和VLDL2等，在各自合适的浓度胶中分离。结果sd-PAGE将血清脂蛋白在同一时间、同一载体中同步分离开，AL-NEFA和HDL在分离胶3，LDL、IDL和VLDL1在分离胶2，VLDL2在分离胶1中分离成清晰的区带，CM留在原点内。
目前分离血清脂蛋白亚组分的电泳方法常采用连续浓度梯度凝胶为载体，浓度高达16％或30％，要求电压增至数千伏，电泳时间长达数十小时，结果对血清各种脂蛋白的同步分离效果并不理想。相比之下，sd-PAGE技术要求电压低(100V)，分离时间短(2.5h)，达到较满意的同步分离效果，满足临床检验工作的需要。
二、统一参比的量化分析方法国内外临床血脂研究大多通过分项检测后进行综合分析和诊断。sd-PAGE法以电泳后脂蛋白未到达的空白区作为参比，与所有泳动峰下面积的总和进行统一比较，算出各电泳区带的相对含量，使它们之间具有科学的可比性，符合现代实验学参比系唯一性的原则。通过扫描图谱和量化数据，可以直观而具体地观察血清脂蛋白整体的代谢平衡状态。
三、操作技巧1、管状玻璃管的规格要求内径6mm，外径8mm，长度10cm，透光好，可见光扫描不发生折射。
2、制备凝胶前用封口膜密封玻璃管一端开口，并将其垂直固定在制胶支架上。
3、逐步制备三层不同浓度的凝胶，分离胶的高度分别为4.5cm、4.0cm和0.6cm。
4、每层凝胶在灌胶后立即轻轻注入100μl DDI H2O覆盖其表面，一图(a，b)横坐标和图(c)中的序号1～10表示按电泳迁移快慢的顺序，依次编号的各种血清脂蛋白及其亚组分，分别对应图(c)中SLPG相应的电泳峰。1AL-NEFA；2HDL1；3HDL2；4HDL3；5HDL4；6HDL5；7LDL；8IDL；9VLDL1；10VLDL2.
SLPG能同步表达①AL-NEFA中游离脂肪酸(FFA)占整体血脂的相对含量，正常者大于3.0％。②HDL及其亚组分相对含量的关系，以及3种类型的HDL异常HDL1含量降低；HDL总量降低；HDL各亚组分相对含量大小的序列紊乱，包括HDL2或HDL5含量增高。③3种LDL不同表现型及其含量，反映其组成的异质性。④IDL的相对位置和含量，能够鉴别诊断高脂蛋白血症的IIb型和III型，以及是否合并IV型或I型。⑤SLPG表达VLDL亚组分的相对含量。⑥SLPG表达CM存在与否，并将其包括在内进行统一量化表达。
SLPG表达高脂血症患者的血清脂蛋白代谢状态。高Chol血症(TC＞220mg/dl)的SLPG表现LDL和/或IDL含量增高。高TG血症(TG＞150mg/dl)的SLPG主要表现VLDL含量增高。若血清TG明显增高(＞300mg/dl)，则原点增宽(＞3mm)，常出现CM。混合性高脂血症的SLPG主要表现IDL和/或VLDL含量增高，或出现CM。
SLPG表达异常脂蛋白血症患者的的血清脂蛋白代谢状态。I型高脂蛋白血症的血清电泳后在原点内可出现大量染色物质滞留，水平界面变成弧形凹陷，SLPG原点区出现平台样峰，提示存在CM。IIa型高脂蛋白血症的SLPG表现LDL含量增高；IIb型高脂蛋白血症的SLPG则以LDL和VLDL增高为特征，IDL含量正常。III型高脂蛋白血图(a，b)横坐标和图(c)中的序号1～10表示按电泳迁移快慢的顺序，依次编号的各种血清脂蛋白及其亚组分，分别对应图(c)中SLPG相应的电泳峰。1AL-NEFA；2HDL1；3HDL2；4HDL3；5HDL4；6HDL5；7LDL；8IDL；9VLDL1；10VLDL2.
SLPG能同步表达①AL-NEFA中游离脂肪酸(FFA)占整体血脂的相对含量，正常者大于3.0％。②HDL及其亚组分相对含量的关系，以及3种类型的HDL异常HDL1含量降低；HDL总量降低；HDL各亚组分相对含量大小的序列紊乱，包括HDL2或HDL5含量增高。③3种LDL不同表现型及其含量，反映其组成的异质性。④IDL的相对位置和含量，能够鉴别诊断高脂蛋白血症的IIb型和III型，以及是否合并IV型或I型。⑤SLPG表达VLDL亚组分的相对含量。⑥SLPG表达CM存在与否，并将其包括在内进行统一量化表达。
SLPG表达高脂血症患者的血清脂蛋白代谢状态。高Chol血症(TC＞220mg/dl)的SLPG表现LDL和/或IDL含量增高。高TG血症(TG＞150mg/dl)的SLPG主要表现VLDL含量增高。若血清TG明显增高(＞300mg/dl)，则原点增宽(＞3mm)，常出现CM。混合性高脂血症的SLPG主要表现IDL和/或VLDL含量增高，或出现CM。
SLPG表达异常脂蛋白血症患者的的血清脂蛋白代谢状态。I型高脂蛋白血症的血清电泳后在原点内可出现大量染色物质滞留，水平界面变成弧形凹陷，SLPG原点区出现平台样峰，提示存在CM。IIa型高脂蛋白血症的SLPG表现LDL含量增高；IIb型高脂蛋白血症的SLPG则以LDL和VLDL增高为特征，IDL含量正常。III型高脂蛋白血症的血清电泳在以往阔β带的位置出现中间带，SLPG表现IDL含量明显增高。IV型高脂蛋白血症的SLPG特征是VLDL明显增高，表现3种类型①VLDL1含量增高；②VLDL2含量增高；③VLDL1和VLDL2含量均增高。V型高脂蛋白血症的SLPG表现VLDL含量增高，并出现CM。
图4.不同血脂状态下的SLPG有规律表现，图中异常情况用不同颜色标记，红色表示含量，增高，蓝色表示含量降低。1AL-NEFA；2HDL1；3HDL2；4HDL3；5HDL4；6HDL5；7LDL；8IDL；9VLDL1；10VLDL2；11CM。
表2.图4中不同血脂状态的SLPG检测结果SLPG A B C D E FGHAL-NEFA(％) 5.05 4.20 3.80 3.16 1.22 2.00 1.57 1.76HDL1(％)1.24 0.91+1.20 0.51+0.55+1.68 1.97 1.72HDL2(％)8.60 1.62 6.96 0.86 0.93 3.31 4.61 3.20HDL3(％)15.10 2.15 15.02 2.17 2.41 6.75 3.87 10.15HDL4(％)21.86 7.43 6.15 2.48 6.72 3.50 2.78 8.11HDL5(％)2.31 8.66 4.25 7.05 14.03 2.92 4.36 2.61HDL总量(％) 49.11 20.77 33.58 13.07 24.64 18.1617.5925.79HDL亚组分序列- + - + + -+-LDL(％) 36.91 39.96 50.55+50.16+35.37 39.8227.7336.27IDL(％) 1.73 3.82 2.94 2.99 18.27+7.09 10.00+5.95VLDL1(％) 7.17 20.40 8.26 25.60+17.86 27.05+31.31+16.80VLDL2(％) 0 1.47 0.85 4.71+2.64 5.88+11.78+3.58+CM(％) 0 9.36+0 0 0 0 09.82++异常；-正常.
权利要求
1.一种凝胶电泳分离血清脂蛋白方法，以三种不同浓度的分段聚丙烯酰胺凝胶作为电泳载体，在电泳槽中形成温度梯度，对血清脂蛋白及其亚组分做同步电泳分离，其中，所述的聚丙烯酰胺凝胶作为分离胶浓度分别为分离胶1为3.0％；分离胶2为3.6％；分离胶3为7.0％。
2.根据权利要求1所述的凝胶电泳分离血清脂蛋白方法，其特征在于所述的对血清脂蛋白及其亚组分做同步电泳分离方法，是先将血清预染，系用苏丹黑B预染的血清同步分离出11-12条清晰区带，按序先后为前清蛋白、非酯化脂肪酸清蛋白、高密度脂蛋白1-5、低密度脂蛋白、中间密度脂蛋白、极低密度脂蛋白1-2以及在原点区内可能滞留的乳糜微粒。
3.根据权利要求1或2所述的凝胶电泳分离血清脂蛋白方法，其特征在于对血清脂蛋白及其亚组分做同步电泳分离的步骤，第一，先作血清预染，采集隔夜空腹静脉全血，3小时内离心分离出血清，取血清100μl加染色剂1％SB-B液10μl，振荡混匀后置37℃水浴45min，离心条件为3000rpm，10分钟，后待测；第二，分段凝胶电泳，准备洁净的管状玻璃管，用封口膜密封玻璃管一端开口，并将其垂直固定在制胶支架上，逐步制备高度分别为4.5cm、4.0cm和0.6cm的三层不同浓度的凝胶，每层凝胶在灌胶后立即轻轻注入蒸馏水覆盖其表面，使胶面凝聚平整，静置30分钟后去掉水层，再灌注下一层凝胶液，将制备好的凝胶管垂直置入电泳槽，使分离凝胶的下界与负极槽底面平齐，分别向正负极电泳槽内注入电泳缓冲液，其中，正极槽600ml，负极槽400ml，接着，将预染血清缓慢地加入凝胶管内，覆盖在分离凝胶3的表面，最后，接通稳压电源100V电泳2.5h。
4.根据权利要求1所述的凝胶电泳分离血清脂蛋白方法，其特征在于所述的分离胶1中贮藏液C0.75ml、D0.60ml、蒸馏水3.60ml、四甲基乙二胺5.00μl、10％过硫酸铵50.00μl；分离胶2中贮藏液C3.00ml、D2.00ml、蒸馏水11.50ml、四甲基乙二胺10.00μl、10％过硫酸铵100.00μl；分离胶3中贮藏液A13.70ml、B2.40ml、蒸馏水3.10ml、四甲基乙二胺10.00μl、10％过硫酸铵100.00μl，其中，所述的贮存液A为丙烯酰胺9.60g和甲叉双丙烯酰胺0.25g，溶于去离子蒸馏水至100ml，过滤后用棕色瓶存于4℃，使用3个月；贮存液B为三羟甲基氨基甲烷18.3g和1.0M盐酸24ml，溶离子蒸馏水至100ml，pH8.8，过滤后用棕色瓶存于4℃；贮存液C丙烯酰胺19.6g和甲叉双丙烯酰胺0.4g，溶于去离子蒸馏水至100ml，过滤后用棕色瓶存于4℃，使用3个月；贮存液D三羟甲基氨基甲烷6.06g和乙二胺四乙酸二钠1.17g，溶于去离子蒸馏水至100ml，pH8.8，过滤后用棕色瓶存于4℃；引发剂过硫酸铵1.0g溶于去离子蒸馏水至10ml，使用即时配制；染色液苏丹黑0.25g溶于异丙醇25ml，37℃水浴过夜，趁热过滤，室温下保存在密封的棕色瓶内，使用前37℃水浴45分钟；电泳缓冲液三羟甲基氨基甲烷6.0g和甘氨酸28.8g溶于去离子蒸馏水至1000ml，贮存于4℃，使用时用去离子蒸馏水稀释10倍。
5.利用权利要求1凝胶电泳分离血清脂蛋白方法进行量化检测方法，电泳结束立即取下凝胶管，用双波段飞点扫描仪和光学扫描仪分别对凝胶管进行扫描和成像，飞点扫描单色光波长为604nm，以空白凝胶为统一参比，扫描时沿凝胶管的中央轴线，从空白区向原点的方向进行，分析时以相邻电泳峰之间的拐点作为分段标志，仪器自动算出各电泳峰下面积占血清脂蛋白整体的百分含量，血清脂蛋白及其亚组分的扫描图谱和量化结果制成血清脂蛋白谱。
全文摘要
本发明凝胶电泳分离血清脂蛋白及其量化检测的新方法，涉及有效表达血清脂蛋白代谢平衡状态的实用方法，广泛用于医学检测及研究。本发明一种凝胶电泳分离血清脂蛋白方法，以三种不同浓度的分段聚丙烯酰胺凝胶作为电泳载体，在电泳槽中形成温度梯度，对血清脂蛋白及其亚组分做同步电泳分离，其中，所述的聚丙烯酰胺凝胶作为分离胶浓度分别为分离胶1为3.0％；分离胶2为3.6％；分离胶3为7.0％。本发明达到了以往方法所不能达到的效果，具有操作简便、性能优越、应用前景良好的特点，在技术和性能上克服以往技术难题，成功建立了sd－PAGE新方法和SLPG新指标，效果理想。实现了血脂脂蛋白的整体分析－血清脂蛋白代谢动态平衡。
文档编号C07K1/26GK1699406SQ200510026460
公开日2005年11月23日 申请日期2005年6月3日 优先权日2005年6月3日
发明者陈允钦, 尹恝 申请人:陈允钦, 尹恝