专利名称：日本血吸虫1zd11基因的克隆的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及日本血吸虫(中国大陆株)1ZD11基因的核苷酸序列、日本血吸虫(中国大陆株)1ZD11基因的克隆。
背景技术：
血吸虫病是由血吸虫感染引起的分布广泛、危害严重的人兽共患寄生虫病。是亟待解决的严重的公共卫生问题。目前血吸虫病的主要防治策略是在易感地区大规模化疗、灭螺及健康教育，但由于治疗药物不能解决血吸虫病重复感染的难题，使得人、畜的重复感染问题突出，特别是本病的主要传染源家畜的重复感染，难以实现对该病的长期有效控制。因此，人用特别是家畜用的抗血吸虫病疫苗的研究与应用成为血吸虫病防治的重要发展战略。
血吸虫在生长发育方面的表现非常特殊、复杂，在整个生活史循环过程中，呈现显著的生物学和形态学变化。这种不同发育阶段的形态学上和生物学上的变化必然伴随着不同的基因差异表达模式，导致血吸虫独特的代谢和发育过程，同时也使血吸虫的抗原性十分复杂，血吸虫疫苗的研制也因此成为一个世界性难题。为从分子水平探索血吸虫生长、发育、生殖及与宿主的相互作用等生命活动的机理，增加对病原体重要的功能分子的了解，以使血吸虫疫苗的开发能有所突破，开展了日本血吸虫发育期别差异表达基因的筛选研究工作。首先应用抑制性消减杂交和cDNA微阵列分析获得了不同发育阶段的差异表达基因的基础材料，选择一批克隆测序获得了相应基因的ESTs(表达序列标签)，经同源性分析证实与数据库中已有的数据无明显同源性的，可视为血吸虫新基因。新基因的获取、鉴定以及所编码蛋白的功能研究，有助于发现与血吸虫的生长发育、致病性等密切相关的功能分子，可为血吸虫高效疫苗、诊断制剂以及新药的开发开拓新途径。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于应用抑制性消减杂交技术，以日本血吸虫尾蚴为实验组，日本血吸虫成虫为驱动组构建了尾蚴消减质粒文库，经cDNA微阵列分析获得了日本血吸虫尾蚴阶段高表达的1ZD11基因，并对其进行了克隆和核苷酸序列分析。
本发明提供了日本血吸虫(中国大陆株)1ZD11基因的基因序列，它具有序列1的核苷酸序列及相应的氨基酸序列。
本发明的另一目的是提供了日本血吸虫(中国大陆株)1ZD11基因的核苷酸序列的筛选方法，该方法是以日本血吸虫尾蚴为实验组，成虫为驱动组，构建日本血吸虫尾蚴消减质粒文库，由消减文库随机挑克隆定制cDNA微阵列，经cDNA微阵列杂交分析后再挑选克隆测序，获得了1ZD11基因的表达序列标签。
本发明应用抑制性消减杂交技术，以日本血吸虫尾蚴为实验组，成虫为驱动组，构建了尾蚴消减质粒文库，由该文库挑选克隆定制cDNA微阵列，经杂交分析，获得一批在尾蚴和成虫间差异表达的cDNA克隆。选择部分克隆进行了ESTs测序，然后利用NCBI的BLAST进行基因序列的同源性分析，结果发现一个基因克隆与数据库中已有的数据无显著同源性(Score值＜50bits)，表明该基因为一血吸虫新基因，命名为1ZD11。以该基因的ESTs序列为模板，应用RACE技术对这一基因的cDNA片段分别进行了3′和5′延伸。DNA序列分析表明该基因(1ZD11)的开放阅读框含261bp的序列，推测编码86个氨基酸的蛋白质。经DNAMAN软件分析，1ZD11 DNA序列分析表明该基因(1ZD11)的开放阅读框含261bp的序列，推测编码86个氨基酸的蛋白质，理论分子量为9.9249ku，等电点为7.77，为中性蛋白。有5个抗原位点，具有信号肽，推测信号肽裂解位点在24-25位氨基酸之间，具有1个典型疏水性区域，无跨膜结构。具有1个蛋白激酶C磷酸化位点，在23-82位间氨基酸与多花文昌鱼的Wnt7b蛋白具有34％的同源性，与人的Wnt7a蛋白具有33％的同源性。
本发明的又一目的是提供了日本血吸虫(中国大陆株)1ZD11基因的核苷酸序列的筛选方法，该方法获得了序列3的日本血吸虫1ZD11基因完整核苷酸序列。
其编码的蛋白具有序列2的氨基酸序列。
图1重组质粒pCR2.1-TOPO/1ZD11的EcoR I酶切鉴定电泳图谱MDNA Marker 2,000；1重组质粒的酶切产物图2重组质粒pCR2.1-TOPO/1ZD11的PCR鉴定电泳图谱MDNA Marker 2,000；1重组质粒的PCR产物具体实施方式
实施例1一、日本血吸虫尾蚴消减文库的构建及cDNA微阵列分析1.材料1.1.实验动物新西兰大白兔购自中科院上海分院实验动物中心，体重2.5kg，用作日本血吸虫中国大陆株的感染宿主。
1.2.日本血吸虫中国大陆株安徽品系尾蚴中国农科院上海家畜寄生虫病研究所钉螺室提供。
1.3.质粒、菌种pCR2.1-TOPO克隆载体购自Invitrogen公司、DH5α感受态细胞购自博大泰克公司。
1.4.主要试剂及工具酶总RNA提取试剂TRIzol、GeneRacerTMKit购自Invitrogen公司，mRNA分离试剂盒oligotex mRNA midikit为Qiagen产品。PCR-selectTMcDNA subtraction kit，Advantage cDNAPolymerase，NucleoSpinExtraction Kit为Clontech公司产品。小量质粒抽提试剂盒购自上海赛百盛基因技术有限公司。Percoll、氨苄青霉素购自华美生物工程公司。Trypsin、Collagenase II购自上海生工生物工程有限公司。限制性内切酶EcoRI、Xho I、T4DNA连接酶、ExTaq DNA高保真DNA聚合酶、DL2000marker购自宝生物工程(大连)有限公司。Cy3-dCTP和Cry5-dCTP以及random primer labeling system购自Amersham Phamacia生物技术有限公。芯片杂交试剂盒为博星基因芯片有限公司产品。cDNA微阵列的制作、探针标记、芯片杂交、芯片扫描以及数据采集委托上海博星基因芯片有限公司完成。
1.5.引物3′RACE特异引物1ZD1NP 5′ACGCTTCTCTTACACTATCCTTCCA 3′(404-428)1ZD1P 5′TTGTAACGCTTCTCTTACACTATCC 3′(399-423)5′RACE特异引物1ZD 1RP5′CACGCCATTTGAGATATCATGAATG 3′(71-95)1ZD 1NRP 5′ATCAATGATGCGATGAGGACTTTGC 3′ (41-65)RT-PCR引物Upper 5′TTGGATCCATGTTAAGTACAGCCTGC 3′(25-42)Down 5′CTCTCGAGTCACTGGCACAATTCTTTC 3′ (258-276)1ZD11P、1ZD11NP为1ZD11基因3′RACE的第一轮和第二轮PCR引物；1ZD11RP、1ZD11RNP为1ZD11基因5′RACE的第一轮和第二轮PCR引物；upper和down为扩增1ZD11基因编码区的上下游引物。括号内的数字表示该引物在此基因片段中的位置。引物由英俊生物技术有限公司合成。
2.方法2.1.日本血吸虫尾蚴和成虫的收集尾蚴的收集感染的阳性钉螺置于加满去氯水的15ml试管中，于25℃室温条件下光照过夜，次日早晨尾蚴逸出浮于水面。将含有尾蚴的水转入35mlDEPC处理过的聚丙烯离心管中，12000rpm离心10min，收集的尾蚴立即用于RNA抽提。
成虫的收集新西兰大白兔腹部贴皮感染每只2000条尾蚴，于感染后7周剖杀，以肝门静脉灌注法收集成虫。
2.2.日本血吸虫尾蚴和成虫总RNA的提取按TRIzol试剂盒操作手册进行。取少量RNA样品琼脂糖凝胶电泳分析完整性。紫外分光光度计检测RNA的浓度及纯度。
2.3.日本血吸虫尾蚴和成虫mRNA的分离利用oligotex试剂盒分离总RNA中的mRNA。操作按试剂盒使用说明书进行。取样琼脂糖凝胶电泳分析RNA样品的完整性。
2.4.尾蚴消减杂交文库构建以尾蚴为实验组，成虫为驱动组，构建尾蚴消减文库，富集尾蚴阶段高表达的转录本。具体构建方法按Clontech PCR-selectTMcDNAsubtraction kit操作手册进行。
2.5.用于芯片制备的消减杂交克隆的筛选灭菌牙签挑取消减文库中的单菌落接种于每孔含150μl LB(Kan+)的96孔细胞培养板，37℃过夜培养。以过夜培养菌液2μl为模板，用载体pCMV-SCRIPT多克隆位点两端的通用引物T3和T7进行PCR扩增，反应体系为10×PCR reaction buffer 2μl，dNTP Mix(10μM)1μl，T3primer和T7primer各0.2μl(10μM)，Taq酶0.2μl(5U/μl)，加水至20μl。循环条件为95℃5min；30个循环94℃30sec；50℃30sec；72℃1min。1％琼脂糖凝胶电泳观察插入片断的有无及大小。为能更多的获得编码区的信息，并避免因序列过短影响芯片杂交结果，本研究选择插入片断大于500bp的克隆用于cDNA微阵列制作。
2.6.cDNA微阵列的制作对于被选择用于微阵列制作的克隆，循环参数保持不变，放大PCR扩增体系以便获得足够的产物。以琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，确证插入片断的存在并估计PCR产物的量。所得PCR产物经过柱纯化后，溶解于含3×SSC溶液的缓冲液中。然后用Omnigrid Arrayer点样仪将此含PCR产物的溶液点到硅化玻片上，每个样品点一次。该玻片置70％湿度条件下水合2hr，室温干燥并紫外耦合30min后，于室温条件下依次在0.2％SDS溶液中浸泡10min，灭菌水浸泡10min，0.2％NaBH4溶液浸泡10min，再经室温干燥后，cDNA微阵列制作完毕。
2.7.芯片杂交实验2.7.1.芯片预杂交1)配制预杂交液杂交试剂1加入到Eppendorf管中，振荡混匀后，加入杂交试剂2混匀；2)将配制好的预杂交液放入95℃水浴锅内变性2min，将待预杂交的玻片放入95℃水浴锅内变性30sec，玻片取出后即浸入无水乙醇中30sec，晾干；
3)将已变性的预杂交液加到玻片的点样区域内，盖上盖玻片，放入杂交箱内42℃预杂交5～6hr。
2.7.2.荧光标记探针(以下在冰浴中进行)经过反转录标记荧光探针，以Cy5-dCTP标记成虫RNA，以Cy3-dCTP标记虫卵RNA。具体操作步骤如下1)于一已灭菌的1.5mL Eppendorf管内依次加入以下试剂(反应终体积为50μL，以下试剂均为RNase-free)ddH2O23μL逆转录引物 5μL总RNA 50～100μg振荡混匀，置于70℃水浴10min。取出后，迅速置于冰上；2)再分别加入以下试剂逆转录酶缓冲液 10μLDTT(1mM) 5μLdNTPs(10μM) 4μL3)而后在暗室中加入以下试剂逆转录酶 2μLCy5-dCTP或Cy3-dCTP 3μL4)用手指弹打管壁以混匀样品，手浴2min。将Eppendorf管置于42℃水浴2hr；5)依次在Eppendorf管中加入标记试剂I 4μL，65℃水浴10min后加入标记试剂II 4μL。混匀，合并对照组、实验组。避光，真空抽干至50μL左右；6)使用DNA纯化柱(或乙醇沉淀)纯化DNA；7)将柱体在旋涡混合器上剧烈振荡摇匀，悬浮其中的树脂。将柱顶端的小帽旋松四分之一圈，掰断柱下端的密封头；8)将柱置于一个1.5mL的Eppendorf管中，以3000rpm离心1min将柱置于另一个新的1.5mL Eppendorf管中，去掉顶端的帽，将样品慢慢加到树脂上表面的中间，注意不要搅动柱体。以3000rpm离心2min，经纯化的样品流出，被收集在支持用的Eppendorf管中；9)加入标记试剂III 8μL，真空抽干。
2.7.3.芯片杂交1)在抽干的探针管中加6.5μL杂交试剂I，充分混匀，使探针溶解。再加入6.5μL杂交试剂II，混匀备用；2)将预杂交的玻片取出，用ddH2O冲去盖玻片；3)将探针置于95℃水浴中变性2min；玻片置于95℃水浴中变性30sec，玻片取出浸无水乙醇30sec，探针取出后迅速置于冰上；4)将探针置于芯片上，用盖玻片覆盖，置于杂交舱中，用Parafilm密封，放入42℃杂交箱内杂交过夜(16～18h)。
2.7.4.洗片1)用0.5％的洗涤液1冲洗玻片，去除盖玻片；2)准备两个染色缸，分别装有0.5％的洗片试剂1+2％的洗片试剂2、5％的洗片试剂3，放入60℃水浴锅中备用；3)将玻片依次浸入以上两个染色缸中洗涤10min；4)用0.5％的洗涤液1冲洗玻片，晾干后扫描。
2.8.芯片扫描及数据处理用ScanArray 4000扫描仪在610nm和590nm两个波长下对芯片进行扫描，设置LaserPower80，PMT Value80。分别检测Cy3和Cy5发射光，获得芯片灰度扫描图。芯片上每个点在两个波长下的光强分别代表Cy3-dCTP和Cy5-dCTP的量。然后采用GenePix Pro 3.0图像处理软件提取Cy3、Cy5荧光信号强度，用GenePix Pro 3软件的比值中位数法计算并分析Cy5/Cy3值。
2.9.差异表达基因的测序和生物信息学分析芯片杂交后，根据杂交结果选择差异表达克隆进行测序。测序引物为载体pCMV-SCRIPT多克隆位点两端的T3或T7通用引物。测序委托上海申能博采生物科技有限公司完成。获得的EST序列去除载体后用BLASTn(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)在GenBank/EMBL/DDBJ的EST数据库中，以及GenBank/EMBL/DDBJ/PDB的非冗余性核酸数据库中分别进行同源性搜索。再用InterPro release 9.0软件(http//www.ebi.ac.uk/interpro/)在PDBdata数据库中在线查询，预测该序列编码的蛋白质分子可能参与的生物学过程及可能的分子功能。
2.10.日本血吸虫中国大陆株1ZD11全长基因的克隆及测序1)3′RACEA.反转录合成第一链cDNA，体系如下
65℃5min以解离RNA二级结构。冰上冷却至少1min后，加入下列试剂
温和混匀，55℃反转录60min。立即70℃15min，灭活反转录酶。再向反应体系中加入1μl RNase H(2U)，37℃20min，去除杂交体中的mRNA。
B.第一轮PCR，体系如下
循环参数
C.第二轮PCR通过第二轮PCR扩增可大大增加RACE产物的特异性和产量，体系如下
循环参数
取10μl物，1％琼脂糖凝胶电泳分析RACE产物。
2)5′RACEA.mRNA的去磷酸化，反应体系如下
反应条件50℃1hr。结束后迅速离心，冰上暂放。加酚∶氯仿抽提，乙醇沉淀后，溶于7μl DEPC水中，进行下一步反应。
B.mRNA去帽子结构，反应体系如下
反应条件37℃反应1hr。反应结束后迅速离心，冰上暂放。加酚∶氯仿抽提，乙醇沉淀后，溶于7μl DEPC水中。
C.Oligo RNA与去帽mRNA的连接，反应体系如下将步骤B制备的7μl去除帽子结构的RNA加入到含有冻干GeneRacerRNA Oligo(0.25μg)的离心管中，轻轻吹打混匀，65℃5min使RNA的二级结构解离。置冰上冷却至少2min后，加入下列试剂
反应条件37℃反应1hr。置冰上冷却后，加酚∶氯仿抽提，乙醇沉淀，溶于10μl DEPC水中，进行下一步反应。
D.反转录合成第一链cDNA，反应体系及条件与3′RACE相同。
E.第一轮及第二轮PCR。反应体系及条件与3′RACE相同。
3)RACE产物的测序及全长序列的拼接将RACE产物克隆到GeneRacer试剂盒提供的pCR2.1-TOPO载体中，挑选阳性克隆，委托英俊生物技术有限公司测序。利用GeneTool软件，查找3′、5′RACE产物序列与原ESTs序列的重叠部分，将三段序列拼接。
4)全长基因的RT-PCR扩增、克隆利用在线分析软件ORF(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析上一步骤的序列，找出cDNA的编码框区域。于cDNA序列编码框上下游区域设计上下游引物，RT-PCR扩增全长基因。产物克隆至载体pCR2.1-TOPO中。
5)阳性克隆的PCR、酶切鉴定挑取转化菌落，碱裂解法小量制备质粒DNA，-20℃保存备用。PCR鉴定取5μl质粒溶液作为PCR模板以1ZD11基因的特异引物进行PCR扩增。取5μl PCR扩增产物于1％的琼脂糖凝胶上电泳。同时用EcoRI对制备的质粒进行酶切鉴定，酶切产物于1％的琼脂糖凝胶上电泳分析。经鉴定为重组的质粒再用Sangers双脱氧核糖核酸末端终止法测序。
6)全长基因编码蛋白的生物信息学分析利用DNAMAN软件计算编码蛋白的理论分子量、等电点。利用SignalP3.0在线分析软件(http//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析编码蛋白有无信号肽。ProtScale在线分析软件(http//www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl)分析编码蛋白的疏水性。TMHMM服务器(http//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分析编码蛋白有无跨膜结构。BLASTp软件(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)及FASTA软件(http//www.ebi.ac.uk/fasta33/)用于同源蛋白搜索。Motif_scan软件(http//myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif scan)、PROSITE软件(http//au.expasy.org/prosite/)、InterproScan综合分析软件(http//www.ebi.ac.uk/InterProScan/)及CDD等在线分析软件用于分析编码蛋白(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)的结构功能域。
3.结果3.1.差异表达基因的ESTs测序芯片杂交后，根据杂交结果选择差异表达克隆测ESTs序列。利用NCBI的Blast进行基因序列的同源性搜索，获得一序列与数据库中已有序列无显著同源性(Score值＜50bits)，为血吸虫新基因序列，命名为1ZD11基因。
3.2.RACE扩增1ZD11全长基因序列及序列分析经3′、5′RACE对1ZD11ESTs片段分别向3′及5′方向延伸，获得1ZD11基因的全长序列，见序列1。DNA序列分析表明该基因(1ZD11)的开放阅读框含261bp的序列，推测编码86个氨基酸的蛋白质，理论分子量为9.9249ku，等电点为7.77，为中性蛋白。有5个抗原位点，具有信号肽，推测信号肽裂解位点在24-25位氨基酸之间，具有1个典型疏水性区域，无跨膜结构。具有1个蛋白激酶C磷酸化位点，在23-82位间氨基酸与多花文昌鱼的Wnt7b蛋白具有34％的同源性，与人的Wnt7a蛋白具有33％的同源性。
3.3.1ZD11编码区的基因克隆的PCR及酶切鉴定如图1、图2所示，经酶切及PCR鉴定，重组子插入片段约250bp，与1ZD11编码区长度相符，表明已获得1ZD11编码区基因的阳性克隆。
3.4.核苷酸序列测定经过PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒，以Sangers双脱氧核糖核酸末端终止法测序，序列结果见序列3。
序列表SEQUENCE LISTING<110>中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所农业部动物寄生虫学重点开放实验室上海动物生物技术研究中心<120>日本血吸虫1ZD11基因的克隆<130>说明书 权利要求书<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>655<212>DNA<213>日本血吸虫(中国大陆株)1ZD11基因的基因序列<220>
<221>CDS<222>(25)..(282)<223>
<400>1ctccaataag ccaaaattaa aaca atg tta agt aca gcc tgc aaa gtc ctc 51Met Leu Ser Thr Ala Cys Lys Val Leu1 5atc gca tca ttg att gtt tca ttc atg ata tct caa atg gcg tgt aat99Ile Ala Ser Leu Ile Val Ser Phe Met Ile Ser Gln Met Ala Cys Asn10 15 20 25tcg aat tgt cca tgt gaa aat cga gat tgt gat aag tat tgc ttc aaa 147Ser Asn Cys Pro Cys Glu Asn Arg Asp Cys Asp Lys Tyr Cys Phe Lys30 35 40cag ggt tac gat aac tgt cac cca ttc ttt cca tgg caa ttt agt tta 195
Gln Gly Tyr Asp Asn Cys His Pro Phe Phe Pro Trp Gln Phe Ser Leu45 50 55aaa cta aaa cga tgc gat gac tgc ttc aca agc tgc tta aat aaa acc 243Lys Leu Lys Arg Cys Asp Asp Cys Phe Thr Ser Cys Leu Asn Lys Thr60 65 70caa acc ata tgc ttg gaa aaa acg aaa gaa ttg tgc cag tgatgtaagt292Gln Thr Ile Cys Leu Glu Lys Thr Lys Glu Leu Cys Gln75 80 85ggtatgccgg accactagag aatagtaaca aactatcaga actgtgttgt tgaacactat 352ttcaattatt ttaactgtgg ataatttgaa catttcattt caatgattgt aacgcttctc 412ttacactatc cttccaagtt tttatgtatt cttattatgc tgtcacttac aatgaactac 472aattcactgg ttgtgtacaa gtaatctcta ttcactgaca ctattttctt tgttctgttt 532taatgataat ttcctaattg gtatgctgtg ttgtctgctt tgatataaat acaaacgaat 592gtttgaaata taatcaaatt ctgtctgttc gctctataaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 652aaa 655<210>2<211>86<212>PRT<213>日本血吸虫(中国大陆株)1ZD11基因的基因序列<400>2Met Leu Ser Thr Ala Cys Lys Val Leu Ile Ala Ser Leu Ile Val Ser1 5 10 15Phe Met Ile Ser Gln Met Ala Cys Asn Ser Asn Cys Pro Cys Glu Asn20 25 30
Arg Asp Cys Asp Lys Tyr Cys Phe Lys Gln Gly Tyr Asp Asn Cys His35 40 45Pro Phe Phe Pro Trp Gln Phe Ser Leu Lys Leu Lys Arg Cys Asp Asp50 55 60Cys Phe Thr Ser Cys Leu Asn Lys Thr Gln Thr Ile Cys Leu Glu Lys65 70 75 80Thr Lys Glu Leu Cys Gln85<210>3<211>655<212>DNA<213>日本血吸虫(中国大陆株)1ZD11基因的核苷酸序列<400>3ctccaataag ccaaaattaa aacaatgtta agtacagcct gcaaagtcct catcgcatca 60ttgattgttt cattcatgat atctcaaatg gcgtgtaatt cgaattgtcc atgtgaaaat 120cgagattgtg ataagtattg cttcaaacag ggttacgata actgtcaccc attctttcca 180tggcaattta gtttaaaact aaaacgatgc gatgactgct tcacaagctg cttaaataaa 240acccaaacca tatgcttgga aaaaacgaaa gaattgtgcc agtgatgtaa gtggtatgcc 300ggaccactag agaatagtaa caaactatca gaactgtgtt gttgaacact atttcaatta 360ttttaactgt ggataatttg aacatttcat ttcaatgatt gtaacgcttc tcttacacta 420tccttccaag tttttatgta ttcttattat gctgtcactt acaatgaact acaattcact 480ggttgtgtac aagtaatctc tattcactga cactattttc tttgttctgt tttaatgata 540atttcctaat tggtatgctg tgttgtctgc tttgatataa atacaaacga atgtttgaaa 600tataatcaaa ttctgtctgt tcgctctata aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 65权利要求
1.一种编码日本血吸虫中国大陆株1ZD11基因的核苷酸序列，其特征在于它具有序列1的核苷酸序列及相应的氨基酸序列。
2.一种如权利要求1所述的日本血吸虫(中国大陆株)1ZD11基因的核苷酸序列的筛选方法，其特征在于以日本血吸虫尾蚴为实验组，成虫为驱动组，构建日本血吸虫尾蚴消减质粒文库，由消减文库随机挑克隆定制cDNA微阵列，经cDNA微阵列杂交分析后再挑选克隆测序，获得了1ZD11基因的表达序列标签。
3.一种如权利要求1所述的日本血吸虫(中国大陆株)1ZD11基因的核苷酸序列的克隆方法，其特征在于获得日本血吸虫1ZD11基因完整ORF的核苷酸序列，所设计的引物有下列核苷酸序列Upper5′TTGGATCCATGTTAAGTACAGCCTGC 3′Lower5′CTCTCGAGTCACTGGCACAATTCTTTC 3′。
4.一种如权利要求1所述的日本血吸虫(中国大陆株)1ZD11基因的完整ORF具有序列3的核苷酸序列。
全文摘要
本发明提供了日本血吸虫(中国大陆株)1ZD11基因的基因序列筛选方法和克隆。本发明应用抑制性杂交技术，以日本血吸虫尾蚴为实验组，成虫为驱动组，构建了尾蚴消减质粒文库，由该文库挑选克隆定制cDNA微陈列，经杂交分析，获得一批在尾蚴和成虫间差异表达的cDNA克隆。
文档编号C07K14/44GK1940071SQ20051003020
公开日2007年4月4日 申请日期2005年9月29日 优先权日2005年9月29日
发明者苑纯秀, 林矫矫, 陆珂, 冯新港, 傅志强, 刘金明, 蔡幼民 申请人:中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所, 农业部动物寄生虫学重点开放实验室, 上海动物生物技术研究中心