专利名称：一种从植物微量组织中提取rna病毒核酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种提纯病毒核酸的方法，特别是一种从植物微量组织中提取RNA病毒核酸的方法。
背景技术：
PCR和RT-PCR是DNA病毒和RNA病毒高灵敏度检测的强有力工具。对植物病毒来说，RT-PCR方法与当前的其它检测技术相比，不管在检测灵敏度、特异性还是花费时间方面都有了长足的进步。由于GenBank数据库中收录了大量的病毒核酸序列，这对病毒特异的PCR引物设计提供了得天独厚的优势。但是，组织核酸的提取在PCR和RT-PCR实验过程中是耗时且花体力的一个步骤。况且，没有一种方法可以适合所有组织核酸的提取，例如，经典的Trizol提取方法就部分草本植物而言，可以获得较为理想的结果，但是，就木本植物的叶组织而言，核酸提取的效率非常低；并且，在提取的核酸样品中往往存在RT和PCR反应的抑制因子，这样往往导致检测结果的假阴性。因此，许多工作者在核酸提取方法上作了研究。
现有的病毒核酸提纯方法主要有两类其一是大量制备病毒颗粒，然后从病毒颗粒中将核酸与病毒蛋白(主要是外壳蛋白)分离，通过苯酚/氯仿抽提等方法去除蛋白质，纯化其中的核酸；这一方法需要大量的感染病毒的组织，微微需要10g～300g组织来制备纯化病毒；同时，制备病毒粒子需要进行超速离心等条件，制备时间长、条件要求高。
其二是从组织中提取总核酸(对于RNA病毒主要是总RNA)。由于寄主组织中总RNA制备物中主要是寄主的RNA，特别是核糖体RNA。总RNA中病毒RNA的相对含量不到1％，因此对于基于病毒核酸制备的病毒检测容易造成假阳性等不可预期的结果。同时，总RNA提取液，如市售的Trizol溶液中往往含有氯仿等多种对人体和环境有害的物质，造成污染。
发明内容
针对现有技术中存在的不足之处，本发明提供一种成本低廉、操作简便、仅需微量样品就能进行RNA病毒核酸分离的从植物微量组织中提取RNA病毒核酸的方法。
本发明为达到以上目的，是通过这样的技术方案来实现的提供一种从植物微量组织中提取RNA病毒核酸的方法，依次包括以下步骤1)、将被病毒侵染的植物寄主组织，按照0.05-0.2克/100μl的比例在预冷的病毒粒子保护性缓冲溶液中研磨至匀浆，所述病毒粒子保护性缓冲溶液的pH值为5.0～9.0；2)、将上述匀浆转移到0.2-1.5ml的塑料离心管中，室温下静止10～20分钟，使病毒粒子吸附在管壁上；倒去溶液；用弱碱性缓冲溶液洗所述塑料离心管壁2～4次，洗涤完毕后，离心后吸除残液；3)、加入焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的去离子水，升温至70℃～100℃，保温1～3分钟，使病毒粒子解离，释放出病毒核酸。
作为本发明的从植物微量组织中提取RNA病毒核酸的方法的一种改进将所制备的病毒核酸直接用于RT-PCR或低温方式保存；或先将病毒核酸稀释至9～10倍的体积，并加入与稀释后病毒核酸体积比为2/3～1倍的异丙醇或体积比为3～4倍的酒精，沉淀获得纯化浓缩的病毒核酸。
作为本发明的从植物微量组织中提取RNA病毒核酸的方法的进一步改进步骤2)中将匀浆转移到塑料离心管中，先将塑料离心管低速离心或者振荡后，再室温下静止10～20分钟。
作为本发明的从植物微量组织中提取RNA病毒核酸的方法的进一步改进步骤1)中，病毒粒子保护性缓冲溶液的浓度为0.01～1.0mol/L；步骤2)中，每次使用100-200μl弱碱性缓冲溶液洗塑料离心管壁；步骤3)中，加入8μl～20μl的焦碳酸二乙酯处理的去离子水。
作为本发明的从植物微量组织中提取RNA病毒核酸的方法的进一步改进步骤1)中的病毒粒子保护性缓冲溶液是pH值为5.0～9.0的磷酸缓冲液、硼酸缓冲液、或PBST溶液；步骤2)中的弱碱性缓冲溶液为PBST溶液。
作为本发明的从植物微量组织中提取RNA病毒核酸的方法的进一步改进步骤1)中的病毒粒子保护性缓冲溶液是pH7.2的PBST溶液。
作为本发明的从植物微量组织中提取RNA病毒核酸的方法的进一步改进步骤2)中的塑料离心管为0.5-1.5ml的聚丙烯离心管、聚苯烯离心管、聚四氟离心管，特别选择为0.5-1.5ml的不进行硅烷化处理的聚丙烯离心管。
本发明的从植物微量组织中提取RNA病毒核酸的方法，具有如下优点1)、本发明方法操作简便，可以不需要低温冷冻离心机或超速离心机等仪器，提取时间为20～50分钟；而常规方法需要多次使用低温冷冻离心机或超速离心机，提取时间为1小时以上；2)、使用本发明之方法，提取核酸不使用氯仿和苯酚等有机溶剂，对环境和操作者友好；3)、本发明的最重要优点是仅需微量组织即可提取，因此制备成本极低，有利于节省成本；4)、本发明的方法能对组织中可能同时携带的病毒和基因颗粒可进行提取，用于检测。
具体实施例方式
实施例1、在半夏脱毒快繁的组织培养过程中，各取0.2g待检的半夏愈伤组织，在100μl预冷的PBST溶液、研钵中研磨至匀浆；各取100μl匀浆液分别转移到0.5ml规格的塑料离心管中，低速离心后再在室温下静止15分钟，使病毒粒子吸附在管壁上；倒去溶液；每次用100μl PBST溶液洗离心管，共洗3次，洗涤完毕后，再离心后吸除残液。分别加入8μl DEPC处理的去离子水；其中1管升温至80℃保持1分钟，使病毒粒子解离，释放核酸。
PBST溶液其配制方法为溶解8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HPO4，0.24g KH2PO4和2ml of tween-20于800ml去离子水中，用HCl调整其pH至7.2，加入0.1％焦碳酸二乙酯(DEPC)，37℃放置2小时，高温灭菌，冷却后使用。
所制备的病毒核酸直接加入黄瓜花叶病毒(CMV)CP基因扩增的RT-PCR反应体系，扩增获得CMV CP基因的片段，进一步进行杂交检测；确定是否有该病毒侵染；其中另1管升温至80℃保持2分钟，使病毒粒子解离，释放核酸；所制备的病毒核酸直接加入芋花叶病毒(DsMV)3′末端基因扩增的RT-PCR反应体系，扩增获得DsMV部分基因组的片段，进一步进行杂交检测；确定是否有DsMV的侵染。以同时侵染CMV和DsMV的半夏植株(叶片)作为对照，以通过DsMV和CMV的ELISA检测方法确定为脱病毒的种苗作为阴性对照，用本方法从同一阳性植株中同时检测出DsMV和CMV，但是阴性对照没有检测到以上2种病毒；通过脱病毒处理的预伤组织中33.7％的样品中已经脱除以上2种病毒。
实施例2、从黄瓜花叶病毒(CMV)系统侵染的番茄组织中制备CMV基因组RNA取0.1g系统侵染CMV的番茄组织，在预冷的磷酸缓冲液、研钵中研磨至匀浆；取100μl匀浆液转移到1.5ml塑料离心管中，低速离心或者振荡后再在室温下静止20分钟，使病毒粒子吸附在管壁上；倒去溶液；分别用150μl PBST溶液洗离心管3次，洗涤完毕后，再离心后吸除残液；加入20μl DEPC处理的去离子水；升温至80℃保持3分钟，使病毒粒子解离，释放核酸。
所制备的病毒核酸直接加入RT-PCR反应体系，扩增获得CMV全长基因组RNA1、RNA2和RNA3的片段。
实施例3通过免疫捕捉方法从黄瓜花叶病毒(CMV)系统侵染的番茄组织中制备CMV基因组RNA取100μl用PBST或生理盐水稀释(1500倍)的CMV抗血清加入到1.0ml塑料离心管中，室温下处理18分钟，让抗体充分吸附到离心管管壁上，然后倒去抗血清溶液，洗干；将-80℃保存的0.5g系统侵染CMV的番茄组织，在1000μl PBST溶液、研钵中研磨至匀浆；取100μl匀浆液转移到1.5ml塑料离心管离心管中，低速离心或者振荡后再在室温下静止15分钟，使病毒粒子与吸附在管壁上的抗体充分结合；倒去溶液；分别用100μl PBST溶液洗离心管3次，洗涤完毕后，再离心后吸除残液；加入8μl DEPC处理的去离子水；升温至80℃保持1分钟，使病毒粒子解离，释放核酸。
所制备的病毒核酸直接加入RT-PCR反应体系，扩增获得CMV全长基因组RNA1、RNA2和RNA3的片段。
实施例4从马铃薯X病毒、马铃薯S病毒和马铃薯Y病毒复合感染马铃薯植株中制备3种病毒核酸取0.1g同时感染马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)和马铃薯M病毒的马铃薯叶组织(去中脉)于研钵中，加入200μl硼酸缓冲液充分研磨，然后取100μl提取物于DEPC处理的离心管中，24℃放置16分钟；吸干提取物，用200μl DEPC处理的1×PBST溶液冲洗管壁2次；短暂离心之后，吸干残留的PBST溶液，并加入10ul DEPC-H2O冲洗管壁，将离心管放置80℃变性2min，放置冰上3-10min；充分涡旋后，短暂离心，管底溶液即可作为RT-PCR的模板，同时获得3条代表不同病毒核酸的条带。
实施例5从烟草花叶病毒(TMV)侵染的烟草组织种制备TMV全长基因组RNA取0.05g系统侵染TMV的烟草组织，在PBST溶液和研钵中研磨至匀浆；取100μl匀浆液转移到0.5ml塑料离心管中，室温下静止10分钟，使病毒粒子吸附在管壁上；倒去溶液；分别用100μl PBST溶液洗离心管3次，离心后吸除残液；加入8μl DEPC处理的去离子水；升温至80℃保持3分钟，使病毒粒子解离，释放核酸；所制备的病毒核酸点样到硝酸纤维素膜上，用同位素标记的TMV探针检测，检测到TMVRNA杂交信号。
实施例6从侵染菜豆黄花叶病毒(BYMV)的美人蕉叶组织中制备病毒基因组RNA取0.05g感染BYMV的美人蕉叶组织，在PBST溶液和研钵中研磨至匀浆；取100μl匀浆液转移到0.5ml塑料离心管中，室温下静止10分钟，使病毒粒子吸附在管壁上；倒去溶液；分别用100μl PBST溶液洗离心管3次，离心后吸除残液；加入15μl DEPC处理的去离子水；升温至80℃保持2分钟，使病毒粒子解离，释放核酸。
通过RT-PCR方法从制备的病毒核酸样品中检测到该病毒。
对照实施例1从200g烟草叶组织中提取黄瓜花叶病毒(CMV)，进而提取该病毒的基因组核酸取200g系统侵染CMV的烟草叶组织，加入200ml的PB缓冲液，匀浆3min，加入40ml氯仿，继续匀浆2min，离心取上清，加入总体积6％的PEG6000，4℃搅拌4h，离心弃上清，沉淀悬浮于PB缓冲液，取上清，超速离心，沉淀悬浮于0.2M PB缓冲液。SDS-PAGE电泳检测结果表明提纯获得的CMV浓度含量很低。取200ul病毒粗体液提取病毒的总核酸，经甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测，没有检测到病毒核酸的条带。
对照实施例2利用商品化TRizol试剂提取美人蕉叶组织的总RNA取0.1美人蕉叶组织，经液氮研磨后，加入1ml Trizol充分研磨，之后加入0.2ml氯仿混匀，12000rpm离心5min，取上清，加入等体积的异丙醇沉淀，最后，用50ul DEPC H2O溶解沉淀。取5ul核酸样品进行甲醛变性琼脂糖胶电泳检测。结果，多次采用这一方法提取的核酸产率极低，有的次数无法检测到核酸条带。
以上实验证明使用本发明的方法能实现从微量组织中提取病毒核酸的目的，而现有方法则不行。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.一种从植物微量组织中提取RNA病毒核酸的方法，其特征是依次包括以下步骤1)、将被病毒侵染的植物寄主组织，按照0.05-0.2克/100μl的比例在预冷的病毒粒子保护性缓冲溶液中研磨至匀浆，所述病毒粒子保护性缓冲溶液的pH值为5.0～9.0；2)、将上述匀浆转移到0.2-1.5ml的塑料离心管中，室温下静止10～20分钟，使病毒粒子吸附在管壁上；倒去溶液；用弱碱性缓冲溶液洗所述塑料离心管壁2～4次，洗涤完毕后，离心后吸除残液；3)、加入焦碳酸二乙酯处理的去离子水，升温至70℃～100℃，保温1～3分钟，使病毒粒子解离，释放出病毒核酸。
2.根据权利要求1所述的从植物微量组织中提取RNA病毒核酸的方法，其特征是将所制备的病毒核酸直接用于RT-PCR或低温方式保存；或先将病毒核酸稀释至9～10倍的体积，并加入与稀释后病毒核酸体积比为2/3～1倍的异丙醇或体积比为3～4倍的酒精，沉淀获得纯化浓缩的病毒核酸。
3.根据权利要求1或2所述的从植物微量组织中提取RNA病毒核酸的方法，其特征是步骤2)中，将所述匀浆转移到塑料离心管中，先将塑料离心管低速离心或者振荡后，再室温下静止10～20分钟。
4.根据权利要求3所述的从植物微量组织中提取病毒核酸的方法，其特征是步骤1)中，所述病毒粒子保护性缓冲溶液的浓度为0.01～1.0mol/L；步骤2)中，每次使用100-200μl弱碱性缓冲溶液洗塑料离心管壁；步骤3)中，加入8μl～20μl的焦碳酸二乙酯处理的去离子水。
5.根据权利要求4所述的从植物微量组织中提取病毒核酸的方法，其特征是所述步骤1)中的病毒粒子保护性缓冲溶液是pH值为5.0～9.0的磷酸缓冲液、硼酸缓冲液、或PBST溶液。
6.根据权利要求5所述的从植物微量组织中提取病毒核酸的方法，其特征是所述步骤2)中的弱碱性缓冲溶液为PBST溶液。
7.根据权利要求6所述的从植物微量组织中提取病毒核酸的方法，其特征是所述步骤1)中的病毒粒子保护性缓冲溶液是pH7.2的PBST溶液。
8.根据权利要求7所述的从植物微量组织中提取病毒核酸的方法，其特征是所述步骤2)中的塑料离心管为0.5-1.5ml的聚丙烯离心管、聚苯烯离心管、聚四氟离心管。
9.根据权利要求8所述的从植物微量组织中提取病毒核酸的方法，其特征是所述步骤2)中的塑料离心管为0.5-1.5ml的不进行硅烷化处理的聚丙烯离心管。
全文摘要
本发明公开了一种从植物微量组织中提取RNA病毒核酸的方法，依次包括以下步骤1)将被病毒侵染的植物寄主组织，按照0.05－0.2克/100μl的比例在预冷的病毒粒子保护性缓冲溶液中研磨至匀浆，病毒粒子保护性缓冲溶液的pH值为5.0～9.0；2)将上述匀浆转移到0.2－1.5ml的塑料离心管中，室温下静止10～20分钟，使病毒粒子吸附在管壁上；倒去溶液；用弱碱性缓冲溶液洗塑料离心管壁2～4次，洗涤完毕后，离心后吸除残液；3)加入焦碳酸二乙酯处理的去离子水，升温至70℃～100℃，保温1～3分钟，使病毒粒子解离，释放出病毒核酸。本发明的方法，仅需微量样品就能进行RNA病毒核酸分离，因此成本低廉、操作简便。
文档编号C07H21/02GK1763063SQ20051006093
公开日2006年4月26日 申请日期2005年9月28日 优先权日2005年9月28日
发明者陈集双, 杜志游, 竺锡武, 王镨, 陈绍宁 申请人:浙江理工大学