专利名称：来自盐芥的一个耐盐、抗旱基因及其编码蛋白与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物中与抗胁迫相关的基因及其编码蛋白与应用，特别涉及盐芥中的一个耐盐、抗旱基因及其编码蛋白与其在培育耐盐、抗旱性提高植物中的应用。
背景技术：
研究表明，拟南芥的一些近亲具有极强的耐逆性，并且较适宜进行遗传操作。其中，盐生植物-盐芥与拟南芥极为相似，基因序列同源性可达70-90％，不仅具有遗传学模式植物令人满意的形态、生长特性及遗传特点，还对海水的高盐浓度具有较强的耐受能力。因此，盐芥不但是一种可供研究植物自然耐盐机制的优异遗传模式植物，更是一种分离优异耐盐、抗旱相关基因的资源植物。
发明内容
本发明的目的是提供一个盐芥的耐盐、抗旱基因及其编码蛋白。
本发明所提供的耐盐、抗旱基因，名称为ST6-66，来源于十字花科植物盐芥(Thellungiella halophila)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
序列表中的SEQ ID №1由695个碱基组成，其编码序列为自5’端第50-583位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列的蛋白质。
本发明耐盐、抗旱基因所编码的蛋白(ST6-66)，也属于本发明的保护范围。它是具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列的蛋白质。序列表中的SEQ ID №2由177个氨基酸残基组成。
含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
扩增ST6-66中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
利用植物表达载体，将本发明的耐盐、抗旱基因导入植物细胞，可获得对高盐、干旱耐受力增强的的转基因细胞系及转基因植株。
所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它的可参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。
使用ST6-66构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、根部特异表达启动子等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
携带有本发明ST6-66的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水稻、小麦等单子叶植物，也可以是拟南芥、大豆、油菜等双子叶植物。
通过对转化本发明所提供的耐盐、抗旱基因ST6-66后所得到的转基因拟南芥植株进行逆境胁迫试验，证明该基因在转入植物后可显著提高植株的耐盐性。本发明为人为控制植物中抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物(特别是水稻、小麦、油菜等农作物)中发挥重要的作用。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
图1A为载体pCB2004的物理图谱图1为经100Mm NaCl胁迫处理的ST6-66转化体和野生型拟南芥的生长情况图2为经150Mm NaCl胁迫处理的ST6-66转化体和野生型拟南芥的生长情况图3为经100Mm NaCl、150Mm NaCl胁迫处理的ST6-66转化体和野生型拟南芥的生物量统计结果图4为经100Mm NaCl、150Mm NaCl、165Mm NaCl和180Mm NaCl胁迫处理的ST6-66转化体和野生型拟南芥的成活率统计结果图5A为经含250Mm NaCl的土壤胁迫处理ST6-66转化体和野生型拟南芥在中的生长情况图5B为ST6-66转化体和野生型拟南芥在不含盐的土壤环境中的生长情况图6为分别经含OMm NaCl和含250Mm NaCl土壤处理9天后的ST6-66转化体和野生型拟南芥的莲苔直径统计结果图7为分别经含250Mm NaCl土壤处理后的ST6-66转化体和野生型拟南芥所结的果荚中种子颗粒数的统计结果图8为ST6-66转基因拟南芥和野生型拟南芥在土壤中进行的干旱胁迫20天后植株的生长情况图9为ST6-66转基因拟南芥和野生型拟南芥在土壤中进行的干旱胁迫15天后莲苔直径统计结果图10为ST6-66转基因拟南芥和野生型拟南芥在土壤中进行的干旱胁迫20天后恢复浇水三天后的植株生长情况具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、盐芥耐盐基因ST6-66的获得一、盐芥cDNA文库的构建提取盐芥总RNA，反转录得到盐芥全基因组的cDNA，采用高通量构建载体的方法(Gateway Technology)(汪宗桂，郑文岭，马文丽；通路克隆系统DNA重组技术的新进展.中国生物工程杂志(2003)，第23卷第7期)，将盐芥cDNA先重组克隆到pDONR207载体(Invitrogen公司)，得到Entry cDNA文库，然后再以重组克隆将整个cDNA文库穿梭至含有35S启动子的植物过量表达双元载体pCB2004(物理图谱如图1A所示)中，得到盐芥cDNA文库。上述重组反应完全按照Invitrogen提供的实验指南进行。
二、将盐芥cDNA文库转化野生型拟南芥将步骤一构建的盐芥cDNA文库穿梭到双元载体pCB2004中，电转化至农杆菌C58，采用拟南芥花序浸花转化的方法(floral dip method)(Steven J.Clough and AndrewE.BentFloral dipa simplified method forAgrobacterium-mediatedtransformation of Arabidopsis thaliana.The Plant JournalVolume 16 Issue6 Page 735-December 1998)大规模转化拟南芥。
三、拟南芥耐盐转化体的筛选
1、拟南芥转化体库的创建在土壤中大规模播种步骤二获得的转化有盐芥cDNA文库的拟南芥转化体的种子，在种子发芽后约5天，表面喷洒浓度为0.2％的除草剂(glufosinate ammonium，商用名为Liberty，法国Aventis作物科学公司)进行筛选，以野生型拟南芥为对照。约1周后可以观察到转化体植株和野生型植株具有明显差别，野生型植株在0.2％除草剂glufosinate条件下不能存活，而转化体植物不受影响，可以正常生长。以200株转化体植株为一单位进行收种。
2、高通量方法初筛耐盐转化体植株下述各实验中所用的种子均用如下方法进行表面灭菌处理用50％消毒液(广州蓝月亮有限公司)在室温下灭菌15分钟，再用经灭菌的纯净水冲洗4-5遍。
将经消毒的步骤1收获的种子在4℃下放置3天，以使种子发芽一致。然后将种子播种于MS基本培养基(含2％蔗糖，1.5％琼脂粉，pH值5.8，高温蒸汽灭菌15分钟)上使其发芽，种子发芽生长条件为22℃，光照培养。发芽后，再将其播种于含有220mM NaCl和25mg/L除草剂glufosinate的MS培养基上高通量筛选耐盐转化体，每个培养皿播3,000粒种子。待植株生长10天后，将存活下来的转化体植株移栽到土中，并单株收种。
3、耐盐转化体的复筛对每一可能的耐盐转化体，选取其大约25至30粒种子用上述步骤2的方法进行表面灭菌后，播种于不同浓度的含盐MS培养基上，盐浓度在0-200mM NaCl之间。种子生长一周左右后进行观察并记录相应数据，观察10天后，统计存活的植株数量，计算存活植株数量和死亡植株数量，两者之间比例高于3∶1的符合分离比例，可能为耐盐株系，将存活植株移入含有25mg/L除草剂glufosinate的MS培养基上，一周后观察小苗存活情况。如果小苗全部存活，表明上述可能的耐盐株系的耐盐性状和抗除草剂基因连锁，符合筛选要求。最后，移栽以上耐盐株系到土壤中，单株收种，将种子保存备用。
四、耐盐、抗旱基因ST6-66的获得根据盐芥cDNA在载体pCB2004中插入位点的上、下游序列设计引物扩增cDNA序列，引物序列如下Omega5’TTTTTACAACAATTACCAACAACAACAA3’；attB25’-TACAAGAAAGCTGGGTTTTTTTTTTTT-3’提取步骤三筛选得到的耐盐转化体的基因组DNA，并以此为模板，在引物Omega和attB2的引导下进行PCR扩增，50uLPCR扩增体系为，0.25uL ExTaq聚合酶(宝生物工程(大连)有限公司)，2uL基因组DNA，10*PCR缓冲液5uL，dNTPs 100uM，上、下游引物各25uM，再用双蒸水将反应体系补充至50uL。用PCR技术扩增转入的盐芥cDNA。PCR反应条件为先95℃ 1min，再66℃ 1min，最后72℃ 2min，共40个循环。反应结束后，对PCR产物进行测序，测序结果表明该基因具有序列表中的SEQ ID№1的核苷酸序列，由695个碱基组成，其编码序列为自5’端第50-583位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列的蛋白质。在网站TAIR(www.arabidopsis.org)上和拟南芥基因组基因组序列进行序列比对，比对结果表明该基因与拟南芥同源基因的同源性高达79％，将该耐盐、抗旱基因命名为ST6-66。
实施例2、转化有基因ST6-66的拟南芥在培养基上的耐盐实验用实施例1的方法构建ST6-66的过量表达载体，将ST6-66克隆入含有35S启动子的过量表达双元载体pCB2004中，得到ST6-66的过量表达载体，命名为pCB2004/ST6-66。经测序鉴定正确后，将pCB2004/ST6-66用电转化法转入农杆菌，再用花序转化方法(floral dip method)转化野生型拟南芥植株。然后对转基因植株进行耐盐实验，方法为选择其中一株转基因植株(命名为ST6-66)，将其种子分别播种于含100Mm NaCl、150Mm NaCl、165Mm NaCl和180Mm NaCl的MS固体培养基上，以野生型拟南芥为对照，在常规条件下培养，观察并记录发芽及生长情况，结果如图1和图2所示(图中，黑线左侧播种的是转基因植株ST6-66，黑线右侧播种的是野生型植株(WT))，在100mM NaCl胁迫下，转化体(ST6-66)生长受到的抑制比野生型(WT)低，在150mM NaCl盐胁迫条件下，野生型生长明显受到抑制，而转化体的生长状况则显著优于野生型，表明耐盐性增强。测定转化体(ST6-66)和野生型(WT)在上述不同浓度盐胁迫下的生物量，结果如图3所示，转化体的生物量值显著高于野生型，表明其抗盐性较野生型显著增强。统计在上不同盐浓度胁迫下植株的成活率，结果如图4所示，在盐浓度不超过150mM NaCl的情况下，植株的成活不受影响，转化体与野生型无差异；当NaCl浓度达到165mM时，野生型成活率降低至20％，而转化体还保持在80％；当盐浓度至180mM时，野生型完全死亡，而转化体的存活率大约还可保持在40％。
实施例3、转化有基因ST6-66的拟南芥在土壤中的耐盐实验将实施例2获得的ST6-66转基因植株ST6-66和野生型拟南芥(WT)的种子播种于土壤中，在相同条件下培养，待生长约2周后，将两种拟南芥植株移至含0mM NaCl(对照)和含250mM NaCl的土壤中继续进行培养，观察并记录其生长情况，经盐胁迫处理1周后的植株的生长情况如图5A和图5B所示，转化体耐盐性显著强于野生型植株。经上述盐胁迫处理9天后，测定莲苔直径，结果如图6所示，野生型植物生长明显受到抑制，其植株大小显著小于转化体。经上述盐胁迫处理后对种子产量的影响也较显著，但野生型受到的影响更为严重，如图7所示，经盐胁迫后，转化体每个果夹中的种子数显著高于野生型。
实施例4、ST6-66转基因拟南芥在土壤中进行的干旱胁迫实验将ST6-66转基因植株ST6-40和野生型拟南芥(对照WT)的种子播种于土壤中，在相同条件下培养，待生长至10天大小时，实施干旱胁迫，连续20天不浇水，以正常条件下生长的ST6-40和野生型拟南芥为对照。结果如图8所示，野生型植株出现萎焉，而转基因植株只出现轻微的萎焉现象，表明ST6-66在拟南芥中表达，不但可增强其耐盐性，还可增强其耐旱性。干旱胁迫处理15天后，测定莲苔直径，结果如图9所示，野生型植物生长明显受到抑制，其植株大小显著小于转化体ST6-66。
在经过干旱胁迫处理20天后，开始灌水进行恢复实验。经过3天的浇水恢复，如图10所示，转化体明显回复到正常生长水平，但是野生性植株除有一株回复到基本正常状况外，其余植株均没有回复正常，干旱致死。
实施例5、RT-PCR检测ST6-66在拟南芥的表达情况提取ST6-66转基因植株和野生型拟南芥的RNA，并分别以两种RNA为模板，在引物attB15’-acaagtttgtacaaaaaagcaggct-3’和引物attB25’-tacaagaaagctgggtttttttttttt-3’的引导下，进行RT-PCR检测，以Tubulin为参照(扩增Tubulin的引物序列为β-tubulinP15’-CGTGGATCACAGCAATACAGAGCC-3’和β-tubulinP25’-CCTCCTGCACTTCCACTTCGTCTTC-3’)，结果转基因植株ST6-66可扩增出ST6-66，，表明ST6-66转入拟南芥后可在35S启动子作用下过量表达。
序列表<160>2<210>1<211>695<212>DNA<213>十字花科植物盐芥(Thellungiella halophila)<400>1gcaggctggg gatccaacaa aaaaaaaact atattcagcg agaaaaaaaa aaccaaaaga 60tgaacttcat ctctgatcag gaaaaaaaac tctccaaccc gaaaacggcg gagccggagc120acatcaagcc cgtcgaagga accgaaacaa ccaaaaaacc agcttcctcc gccgaggtct180gggctggggc caagattgta cccaaagctg ctcaagccgc agctcgtaac gaatccgaca240aactcgacaa gggtaaagtc gccggagcca gcgttgatat cttaaacgcc gccgagaagt300acggtaagct cgatgaaaaa agcggtgttg gtcagtacct cgagaaggcc gagaagtttc360tcaacgagta cgaatctaca cactctactt ccggcgccgg tgctcctcct ccggcggcgg420caagtcatga tgatccggcg gcggcgagtc atgaggagcc ggcagctaaa aaagccattg480aaaagtctgg tggtggtttg ggaggttatg caaagatggc tcagggtttc atgaagggat540ttgtgatctt tatttgtagt tttattcatg cgcgtaataa taagattaaa taactaagtc600cgctatttag aaattatgtt ggatcgttaa gtatggccgt atgatgaaat aataactttt660ggagatcttc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 695<210>2<211>177<212>PRT<213>十字花科植物盐芥(Thellungiella halophila)<400>2Met Asn Phe Ile Ser Asp Gln Glu Lys Lys Leu Ser Asn Pro Lys Thr1 5 10 15Ala Glu Pro Glu His Ile Lys Pro Val Glu Gly Thr Glu Thr Thr Lys20 25 30
Lys Pro Ala Ser Ser Ala Glu Val Trp Ala Gly Ala Lys Ile Val Pro35 40 45Lys Ala Ala Gln Ala Ala Ala Arg Asn Glu Ser Asp Lys Leu Asp Lys50 55 60Gly Lys Val Ala Gly Ala Ser Val Asp Ile Leu Asn Ala Ala Glu Lys65 70 75 80Tyr Gly Lys Leu Asp Glu Lys Ser Gly Val Gly Gln Tyr Leu Glu Lys85 90 95Ala Glu Lys Phe Leu Asn Glu Tyr Glu Ser Thr His Ser Thr Ser Gly100 105 110Ala Gly Ala Pro Pro Pro Ala Ala Ala Ser His Asp Asp Pro Ala Ala115 120 125Ala Ser His Glu Glu Pro Ala Ala Lys Lys Ala Ile Glu Lys Ser Gly130 135 140Gly Gly Leu Gly Gly Tyr Ala Lys Met Ala Gln Gly Phe Met Lys Gly145 150 155 160Phe Val Ile Phe Ile Cys Ser Phe Ile His Ala Arg Asn Asn Lys Ile165 170 175Lys
权利要求
1.盐芥的一个耐盐、抗旱基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的耐盐、抗旱基因，其特征在于所述基因具有序列表中SEQ ID №1的DNA序列。
3.权利要求1所述耐盐、抗旱基因的编码蛋白，是具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列的蛋白质。
4.含有权利要求1或2所述耐盐、抗旱基因的表达载体。
5.含有权利要求1或2所述耐盐、抗旱基因的转基因细胞系。
6.含有权利要求1或2所述耐盐、抗旱基因的宿主菌。
7.一种培育耐盐、抗旱植物的方法，是利用植物表达载体将权利要求1或2所述的耐盐、抗旱基因导入植物细胞，获得对高盐、干旱耐受力增强的的转基因细胞系及转基因植株。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述被转化的植物宿主为拟南芥、小麦、水稻或大豆。
全文摘要
本发明公开了来自盐芥的一个耐盐、抗旱基因及其编码蛋白。该基因可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。该基因的编码蛋白具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列。本发明的耐盐、抗旱基因将在培育耐盐性增强的植物(特别是水稻、小麦等农作物)中发挥重要的作用。
文档编号C07K14/415GK1727482SQ20051008303
公开日2006年2月1日 申请日期2005年7月12日 优先权日2005年7月12日
发明者杜金, 向成斌 申请人:中国科学技术大学