专利名称：抗hiv1/2抗原的单链抗体及其快速检测试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗HIV1/2抗原的单链抗体及利用该单链抗体的快速检测试剂。
背景技术：
自1983年人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)首次分离成功以来，HIV在全球范围迅速流行，2000年12月为止全世界有3810万人感染HIV，每年530万新增感染人数。绝大部分HIV感染者在感染后10年内发展为艾滋病(Acquired Immure Deficiency Syndrome，AIDS)，病死率极高。目前我国大陆的HIV感染人数已超过100万，新感染人数每年以30％的速度增长。由于目前还没有根治HIV病毒感染的方法，对HIV感染人群进行监测，防止其由特殊人群向一般人群传播就成了控制人群HIV感染率的唯一方法。
针对HIV检测的方法众多，包括分子生物学、病原学、基因芯片、血清抗体等方法，但目前最主流的检测方法还是血清抗体、抗原的检测。有研究结果表明，HIV感染后前期(4-6周)抗体检测为阴性，但此时患者体内病毒已存在，且具有很强的传染性，为了提高HIV携带者的检出率，应同时予以其它方法的检查以缩短“窗口期”(HIV感染者在感染HIV至检出HIV特异性抗体之间的时间)，如PCR、病原学、抗原等方法检查，但PCR和病原学的检测时间长，费用高，实验条件苛刻，应用性差，而快速抗原检测试剂由于简便、快速、特异性高，得以广泛应用。但目前国内市场上的快速抗原检测试剂普遍存在特异性差、抗干扰能力差等问题，阻碍了快速抗原检测试剂在我国的推广应用，而进口抗原检测试剂由于价格昂贵，也导致无法在我国推广使用，从而造成HIV携带者漏检率高的难题，因此如何提高特异性、增强抗干扰能力、缩短“窗口期”是目前快速抗原检测试剂中急需解决的技术问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种抗HIV1特异性核衣壳蛋白的单链抗体、提供一种抗HIV2特异性核衣壳蛋白的单链抗体以及提供一种利用本发明单链抗体制作的用于检测血清中HIV1/2抗原的胶体金快速检测试剂，用以提高检测试剂的特异性、增强抗干扰能力、缩短“窗口期”，以便快速检测试剂的推广应用，从而有效解决HIV携带者漏检率高的难题。
本发明的实现方法获取HIV的p24和p32全长DNA片段，合成第二链后，克隆到相关真核质粒中，免疫小鼠，连接扩增系列抗体的重链和轻链基因，获得单链抗体基因；再用噬菌体展示文库技术筛选亲和力高的单链抗体基因，高效表达、纯化获取HIV1/2单链抗体；最后利用HIV1/2单链抗体，制备胶体金快速HIV1/2抗原试剂并进行性能的检测和临床的试用。
以下叙述本发明的主要内容一种抗HIV-1特异性核衣壳蛋白p24的单链抗体，其特征在于该单链抗体具有如序列表中<210>1所示的基因序列，共计726个核苷酸，划线部分为接头序列共45个核苷酸，接头前为重链序列共354个核苷酸，接头后为轻链序列共327个核苷酸。
一种抗HIV-2特异性核衣壳蛋白p32的单链抗体，其特征在于该单链抗体具有如序列表中<210>2所示的基因序列，共计726个核苷酸，划线部分为接头序列共45个核苷酸，接头前为重链序列共357个核苷酸，接头后为轻链序列共324个核苷酸。
一种用于检测血清中HIV1/2抗原的胶体金快速检测试剂，其特征在于该试剂含有上述两种单链抗体。
抗原检测中的抗原实质上是HIV在增殖的过程中合成的特异性蛋白，检测到这些蛋白也就表明体内存在HIV。p24是HIV1特异性核衣壳蛋白，该蛋白在急性感染数天后即可出现，是最早在血清中出现的HIV特异性蛋白，该蛋白的检测能够缩短HIV1检测的窗口期。而p32蛋白是HIV2特异性核衣壳蛋白，对p32的检测同样能够缩短对HIV2检出的窗口期。
本发明实施的过程中，成功地应用了基因工程及其试剂制作的新技术①基因免疫又称DNA疫苗，由编码病原体抗原的基因和质粒DNA组成，这种重组质粒被直接导入免疫对象体内。进入机体后，质粒DNA不与宿主染色体整合，但编码病原体抗原的基因可利用宿主细胞的转录系统在其中合成抗原蛋白，继而诱导宿主产生对该抗原蛋白的体液免疫和细胞免疫。核酸疫苗与传统疫苗的区别主要在于核酸疫苗的抗原蛋白是在免疫对象体内产生的，无需纯化抗原，避免了繁琐复杂的纯化过程以及在纯化过程中可能出现天然构象丧失的问题，该技术的应用可避免产生非特异性、低亲和力抗体的产生，而且把数月至数年的免疫细胞的获取缩短为数星期。②单链抗体是继单克隆抗体后新一代基因工程抗体，它在DNA水平上将轻、重链可变区基因用一段适当的寡核苷酸(接头)连起来，使之在适当的生物体中表达成为一条单一的肽链，最易于在原核细胞进行表达和批量生产。优点是研制和生产周期短，成本低，产量高，便于抗体的基因改造。③噬菌体表面展示技术是一种筛选高亲和力抗体的技术，该技术通过PCR将全套抗体H链和L链V区基因克隆出来，以噬菌体为载体，在cpI-II或cpVIII衣壳蛋白的N端插入外源基因，形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的膜表面，使噬菌体表面表达异源性分子，经筛选后获得特异性抗体。形成的融合蛋白不影响和干扰噬菌体的生活周期，同时其保持的外源蛋白的天然构象也能被相应的抗原或受体所识别。经辅助病毒感染后，借助cpIII的信号肽穿膜作用，进入宿主外周基质，在正确折叠后被包装于噬菌体尾部，随后携带有表达载体的宿主菌就会释放出带有抗体片段的噬菌体颗粒。这一技术的主要特点是将特定分子的基因型(含有抗体基因片段)和表型(与抗原特异结合)统一在同一病毒颗粒内。④免疫复合物解离分析技术，是指用酸、碱或加热的方法使免疫复合物发生解离，从而提高对p24抗原和p32抗原检测的敏感性和检出的阳性率，处理后样品的检测与标准检测方法相同。⑤免疫胶体金技术是四大免疫标记技术之一，具有简单、快速、准确和无污染等优点，在医学、动植物检疫、食品安全监督各领域得到了日益广泛的应用。本试剂盒采用了该技术两种基本方法中的斑点免疫层析法，只需将试纸条下端浸入检测液中，数分钟即可得检测结果。
开发出检测p24和p32抗原的试剂，有巨大的临床价值1、为检测处在HIV感染窗口期的患者和AIDS病人临床治疗效果提供了检测手段；2、为确定HIV感染产妇的婴儿是否携带HIV提供检测手段；3、为HIV携带的确诊提供手段。
实验证明，本发明具有下述优点1、本发明的抗HIV1单链抗体效价高，抗干扰能力强，特异性好且能识别不同HIV1分离株。
2、本发明的抗HIV2单链抗体效价高，抗干扰能力强，特异性好且能识别不同HIV2分离株。
3、本发明的胶体金快速检测试剂检测谱广，能同时检测HIV1/2；敏感度高，采用了高亲和力的单链抗体及其免疫复合物解离分析技术。
下面通过实施例进一步说明本发明。
图1是重组真核质粒pIRES-p24的构建示意图。
图2是重组质粒pIRES1-p24的鉴定电泳图，图2中1、Marker；2、pIRES1-p24质粒双酶切；3、重组质粒PCR产物。
图3是VH、VL扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，图3中1、VL PCR产物；2、VH PCR产物；3、Marker。
图4是单链抗体基因构建示意图。
图5是单链抗体基因的扩增、酶切和纯化示意图。
图6是单链抗体基因的富集和筛选示意图。
图7是重组质粒pET24-scFv-p24酶切电泳图，图7中1、pET24-scFv-p24质粒双酶切；2、scFv-p24PCR产物；3、Marker。
图8是pET24-scFv-p24蛋白的表达、纯化电泳图，图8中1、scFv-p24亲和层析洗脱液；2、scFv-p24包涵体；3、Marker；4、scFv-p24超声上清。
图9是胶体金快速检测HIV1/2抗原检测板，图9中1、加样孔；2、观察孔；3、检测线1；4、检测线2；5、控制线；6、废液收集海绵。
具体实施例方式
本发明通过基因免疫、高亲和力单链抗体基因的获取、单链抗体蛋白的制备、胶体金快速检测试剂的研制等实施例加已说明，但是并不是将本发明局限于此。那些应用于本发明的技术有许多非关键性的参数，要获得相似的结果，可以对这些参数进行修改或变化。实施方式以p24单链抗体的获取为例，p32单链抗体类同p24单链抗体的获取。
实施例1HIV1真核质粒的构建及其基因免疫(见图1)(1)目的基因的获取已获取HIV1总cDNA，根据NCBI已知的p24序列，设计分别带Cla I和BstxI酶切位点的引物，PCR获取目的基因；(2)PCR产物和质粒酶切、纯化和连接A.反应体系cDNA模板约100ng，Cla I酶2.5IU，BstxI酶2.5IU，10×通用Buffer 2μl，加水至总反应体系20μl；B.酶切产物纯化酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，切出含目的片段的胶块，放入Ep管中，加入TE约200μl，再加等体积的Tris饱和酚于70℃融化，12000rpm/min离心10min，等体积的酚∶氯仿(1∶1)、氯仿各抽提一次，加2倍体积的无水乙醇和1/10体积3mol/L NaAc(pH5.2)沉淀DNA，回收片段溶于10μlTE中；C.连接PCR酶切片段约100ng，真核质粒酶切片段约100ng，10×T4Buffe2μl，T4连接酶5U，加双蒸水至20μl，放置16℃连接过夜；(3)感受态细胞的制备A.接种环刮取冻存的E.coli DH5α菌种，接种于LB琼脂平板，37℃培养16h；B.挑取单菌落，接种到4ml LB培养基中，37℃、200rpm/min振摇培养，取0.1ml培养物接种于5ml LB液体培养基中，37℃振荡培养2h至OD600为0.5；C.再将1ml细菌培养物转移到预冷的EP管中，冰浴10min，4℃、5000rpm/min离心10min，弃上清，以0.5ml冰预冷的100mmol/L CaCl210mmol/LTris·Cl(pH8.0)的溶液重悬沉淀；D.冰浴20min，4℃、5000rpm/min离心10min，弃上清，以0.2ml冰浴预冷的100mmol/L CaCl2-甘油溶液重悬沉淀细胞，即为感受态细胞；E.将感受态细胞分装于无菌微量离心管中，每管200μl，标明菌株、日期，置-80℃冰箱冻存备用该基因和pIRES1neo真核质粒用Cla I和BstxI酶切后连接，转入E.coli DH5α后，扩增工程菌，提取并纯化重组质粒；(4)转化和鉴定A.10μl连接液加入200μl感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴45min，42℃水浴1min，重新放入冰浴15min，加LB培养基至1ml，37℃，200rpm/min振摇培养1h，取200μl上述培养物，含将转化菌涂布于含50μg/ml neo的LB平板上，37℃培养14-16h，出现转化菌落；B.挑取菌落扩增，再PCR酶切的方法鉴定(见图2)；(5)基因免疫把该质粒免疫Balb/c小鼠，隔一星期注射一次，共四次，完成基因免疫。
实施例2HIV1单链抗体基因的获取(见图4)(1)小鼠脾细胞mRNA提取、cDNA合成及PCR扩增VH和VL(见图3)A.摘取免疫鼠脾脏，提取mRNA，反转录合成cDNA；B.用鼠抗体重、轻链可变区特异性引物，反转录合成的cDNA为模板；C.用PCR方法扩增VH和VL片段。PCR条件为94℃55s，55℃110s，72℃110s，共计25个循环；D.琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收扩增片段；(2)VH、VL与Linker的连接A.紫外分析VH、VL和Linker引物的浓度，使其摩尔浓度大致相等，采用重叠延伸拼接法(gene splicing by overlap extension，SOE)重组成单链抗体基因；B.反应体系为50μl反应体积中加入VH和VLcDNA各约150ng、Linkerprimer4ul、10mmol/L dNTP 5μl、25mmol/L MgCl225μl、PCR 10×buffer 5μl、Taq5U。反应条件为94℃55s，61℃4min，8个循环反应完后；
C.再加入含酶切位点的起始primer 4μl、10×PCR buffer 5μl、10mmol/LdNTP 5μl、Taq 5U，补水至100μl。PCR反应条件为94℃55s，55℃110s，72℃110s，总计30个循环。通过引物扩增，组装出的ScFv cDNA的5’及3’端分别带上了Sfi I和Not I的酶切位点，电泳回收扩增片段(见图5)；实施例3p24噬菌体抗体库的构建及其单链抗体基因的富集、筛选(1)构建p24 ScFv的克隆及表达质粒A.SfiI、NotI双酶切回收片段，电泳纯化回收(见图5)；B.相应双酶切pCANTAB5E载体电泳纯化回收，PCR片段和载体物质的量之比约为5∶1；C.连接反应T4DNA连接酶8U，10×T4buffer 2μl，反应总体积20μl，16℃连接过夜；(2)构建鼠脾细胞噬菌体抗体库A.20μl连接反应物转化200μl新鲜制备的E coli TG1感受态细胞，感受态细胞制备及转化方法如实施例1；B.转化后的菌液涂布于6块含50μg/ml氨苄青霉素的SOBAG平皿上，37℃培养24h；C.用2×YT培养基洗下全部转化菌落，并于2×YT-AG培养基中把菌液稀释至A600nm＝0.2，37℃摇床培养至A600nm＝0.6，加入M13K07使其终浓度为1010pfu/ml，继续培养2h；D.菌液5000rpm/min，离心15min，弃上清，用2×YT-AK重悬菌体，37℃，200rpm/min摇床培养过液。6000rpm/min，离心15min，收集上清，PEG/NaCl沉淀噬菌体，电泳估计噬菌体浓度，用PBS调整浓度约为1012pfu/ml的悬液；(3)抗p24的scFv的富集及筛选(见图6)
A.购买的p24蛋白(5μg/ml)3ml包被在25cm2的塑料培养皿内，1％牛血清白蛋白(BSA)封闭；B.将已制备好的噬菌体悬液100μl加等体积的1％BSA，37℃孵育1h；C.倒去培养皿内的封闭液，再加入已封闭好的噬菌体，37℃孵育3h；D.然后用PBS和PBS Tween20各洗皿10次，再加入处于对数生长期的TG11ml，37℃培养80min，转入5ml 2×YT-AG中再培养1h；E.加入M12K07至终浓度为1010pfu/ml，继续培养1h。用同样的方法制备噬菌体，再进行下一轮免疫亲和富集。如此反复3次，每次富集所得噬菌体感染的TG1均涂布于SOBAG上，37℃培养过夜；F.抗p24scFv的筛选从SOBAG上挑选单菌落，重新制备重组噬菌体，109菌落形成单位(pfu)加到预先包被p24的微孔板上，用ELISA方法检测各克隆产生的重组噬菌体；G.scFv进行鉴定、测序对筛选出的阳性克隆用起始引物进行PCR扩增，Sfi I、Not I双酶切鉴定；H.确证后的阳性克隆，提质粒后用双脱氧末端终止法测序。根据载体设计测序引物如下F1 5’-AACGTGAAAAAATTATTATTC-3’R1 5’-GAGTATGTCTTTTAAGTAAAT-3’实施例4HIV1单链抗体基因的表达及其纯化(1)表达质粒的构建A.同实施例1相同的方法构建表达质粒，不同的是原来引物的Cla I和BstxI酶切位点替换为Nde I和Xhol I，质粒替换为pET24b(见图7)；(2)外源基因在大肠杆菌中表达含重组质粒pET24-scFv-p24的E.coliBL21(DE3)于37℃在平皿中长出单斑后，转入2ml左右Amp的LB中，37℃，200rpm/min，培养至对数生长期，用1μmol/ml IPTG，37℃诱导2h左右，离心收集菌体，超声波破碎菌体，再离心后的上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳；SDS-PAGE电泳分析等常规分子生物学技术详见金冬雁等译的《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社相关章节。
(3)scFv-p24蛋白的复性A.包涵体的分离与洗涤将细菌沉淀悬浮于PBS中，超声破碎。4℃离心9000rpm/min、15min，弃上清，先以含1M尿素的包涵体洗涤液洗涤沉淀3次，再以含2M尿素的洗涤液洗涤；B.包涵体的变性溶解于已洗涤的包涵体沉淀中加入1ml 8M尿素，混匀，37℃水浴作用1h，测定蛋白浓度；C.纯化蛋白的复性用稀释液(1.7mM NaH2PO4，18mM Na2HPO4，0.5M NaCl)将蛋白连续稀释后，将溶液装入透析袋中，于4℃对透析液I(0.5M尿素，20mMTris.Cl，pH8.0，1mm EDTA)透析36h后，再对透析液II(20mM Tris.Cl，pH8.0，1mM EDTA，2mM GSH，0.2mM GSSG)透析36h；D.浓缩将透析袋包埋在PEG20000中，于4℃冰箱进行浓缩，分别于浓缩至初始体积的2/3、1/2、1/3、1/6及1/12时收集样品，4℃离心10000rpm/min，5min，取上清50μl于BeckmanDU600上测定可溶性蛋白质的浓度，SDS-PAGE分析；(4)scFv-p24蛋白的纯化(见图8)A.取Ni2+-NTA琼脂糖装柱，用Binding buffer(5mmol/L imidazole，0.5mol/L NaCl，1mmol/L PMSF，20mmol/L Tris-Cl，pH8.0)平衡。透析液缓慢过柱后，用Binding buffer洗柱，再用6ml的Wash buffer(0.5mol/L NaCl，60mmol/L imidazole，20mmol/L Tris-HCl，pH 7.9)洗柱，最后用Elute Buffer(1mol/L imidazole，0.5mol/L NaCl，20mmol/L Tris-HCl，pH 7.9)洗脱蛋白；B.把含目的蛋白的洗脱液上样于已用20mmol/L NaH2PO4-Cit缓冲液(pH 6.8)平衡的Sephadex G 100，继续以NaH2PO4-Cit缓冲液(pH 6.8)缓冲液洗脱，收集峰蛋白，冻干得到纯品，SDS-PAGE电泳鉴定；C.ELISA测定蛋白含量具体步骤参照沈关新、同汝麟等编著的《现代免疫学实验技术》湖北科学技术出版社，第121-123页。
实施例5用于检测血清中HIV1/2抗原的胶体金快速检测试剂的制备一种检测HIV1/2抗原的快速诊断试剂(见图9)，HIV1/2抗原快速检测板由上盖、底板和试纸条组成，试纸条夹于上盖和底板之间；按样品流动的顺序分为四个区域，交联区、分析区、对照区、废液收集区；上盖上有样品加入孔和反应观察孔，底板上留有用于固定试纸条的挡板；试纸条以硝酸纤维膜为基体，在其一端，位于加样孔下固定吸收海绵，其上方有两层薄膜，上面的为晶体吸附膜，起到调节样品pH值的作用，下面的为吸附scFv-p24和scFv-p32的薄膜；在硝酸纤维膜的中间分析区(反应观察孔区)，先后点样HIV1单链抗体的反应线1，HIV2单链抗体的反应线2；p24和p32抗原的控制线；试纸的另一端固定海绵作为废液收集区。检测样品时控制线呈现红色为有效，反应线1和反应线2任何一条或两条呈现红色为阳性结果，检测时间在五分钟内。
(1)胶体金颗粒的制备应用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，100ml双蒸水加热至沸腾，加入质量分数为1％的HAuCl 41ml，加入质量分数为1％柠檬酸三钠1.5ml(胶体金颗粒直径25nm)，加热30min，至溶液颜色变为酒红色，冷却，4℃避光保存；
(2)胶体金最低蛋白稳定量的确定采用分光光度计测定法，利用比色法确定金标记最适pH为8.2，用0.1mol/L K2CO3调节胶体金pH值为8.2，p24或p32单链抗体溶液高速离心除去聚集物，抗体用0.01的PBS缓冲液(pH7.8)稀释至0.2mg/ml，稀释后的抗体与其他试剂按下表操作，加入试剂后，静止2h，含蛋白质量小的管呈现出由红变蓝的聚沉现象，而加入蛋白质达到或超过最低稳定量的试管中的溶液则保持红色不变。使红色保持不变的蛋白含量即为蛋白质最适保护量，在此基础上增加20％为稳定胶体金的蛋白质的实际用量，实验确定蛋白用量为18μg/ml胶体金；表1胶体金最低蛋白稳定量加样表
(3)免疫胶体金的标记用质量分数为1％的K2CO3调节100ml胶体金溶液pH为8.2，p24单链抗体用0.01mol/L的PBS缓冲液稀释至0.2mg/ml，10000rpm/min，4℃离心1h；取上清，加入相应体积的稳定胶体金的最小蛋白质量(18μg/ml胶体金)，快速搅拌下将抗体逐滴加入胶体金中，放置10min；(4)胶体金标记蛋白纯化先用低速离心，弃去沉淀；将上清以30000g、4℃下离心60min，弃上清。取沉淀物重悬于0.02M PBS(pH8.2内含1％BSA或聚乙二醇)，高速离心洗三次，最后将胶体金标记物悬于原液体积1/10的TBS中，电镜检查后，加入0.05％叠氮钠防腐，保存于4℃冰箱中备用；(5)免疫层析测试条的制备样品垫、结合垫(加入标记好的胶体金，干燥)、硝酸纤维素膜(检测带6mg/ml，1μl/cm；质控带2mg/ml，1μl/cm)、吸水垫依次贴上带有粘合剂的底衬卡，切成0.4cm的条，干燥室温贮存备用。
实施例6HIV1/2抗原检测试剂方法学评价包括对HIV1/2抗原检测试剂的灵敏性、特异性的检测及其方法对比试验(1)HIV1/2抗原检测试剂灵敏性检测用购买的标准p24和p32蛋白配成标准液，分别加入质控血清中配成已知p24和p32浓度的标准血清，每个浓度检测三次，结果相同见下表表2HIV1抗原灵敏度的测试
表3HIV2抗原灵敏度的测试
(2)干扰试验A.向含0.8pg/mL p24和1pg/mL p32抗原的质控血清加抗坏血酸，分别至100μmol/L，300μmol/L，500μmol/L，HIV1/2检测试剂的HIV1和HIV2检测线均显示为阳性；B.向含0.8pg/ml p24和1pg/ml p32抗原的质控血清加抗胆红素分别至70μmol/L，140μmol/L，280μmol/L，560μmol/L HIV1/2检测试剂的HIV1和HIV2检测线均显示为阳性；C.向含0.8pg/ml p24和1pg/ml p32抗原的质控血清加血红蛋白，分别至2.5g/L，5g/L，10g/L，20g/L，HIV1/2检测试剂的HIV1和HIV2检测线均显示为阳性；D.向含0.8pg/ml p24和1pg/ml p32抗原的质控血清加葡萄糖，分别至20mmol/L，100mmol/L，200mmol/L，HIV1/2检测试剂的HIV1和HIV2检测线均显示为阳性；E.向含0.8pg/ml p24和1pg/ml p32抗原的质控血清分别加至终浓度为100g/L草酸钾，100g/L草酸钠，1000μmol/L尿酸，1000μmol/L肌酐，HIV1/2检测试剂的HIV1和HIV2检测线均显示为阳性；以上干扰物浓度均超出人血清所能达到的最高限，结果表明常见的干扰物对测定结果无影响。
(3)方法对比实验与Abbott公司p24抗原酶免疫测定(EIA)检测试剂盒作方法对比试验表4Abbott公司HIV1抗原灵敏度的测试
重复三次结果相同，由此可知本试剂对HIV1抗原检测的灵敏度0.8pg/ml要高于与Abbott公司p24抗原酶免疫测定(EIA)灵敏度1.0pg/ml。
序列表<110>王贤俊<120>抗HIV1/2抗原的单链抗体及其快速检测试剂<160>3<210>1<211>726<212>DNA<213>逆转录病毒科，慢病毒属(Retroviridae，Lentivirus)<220>
<221>mat_pept ide<222>(1)…(726)<400>1atgggccagt gtgtgattct gcagcagtca ggggcagagc ttgtgaagcc agtggcctca 60gtcaagttgt ccacagcttc tggcttcaac attaaagaca cctatatgca ctgggtgagg 120cagaggcctg aacagatact ggagtggatt ggaaggattg atcctgcgaa tggtaatact 180gactatgacc cgaagttcca gggcaaggca ctataacagc agacacatcc tccaacacag 240cctacctgca gctcagcagc ctgcatctgg gacatggccg tctattactg tggtaggtac 300gactatgcta tggactactg gggccaaggg accacggtca ccttcgtctc ctcaggtgga360ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt ggcggatcgg acatcgagct cactcagacc420tctccaggag agcgcaggga tttgccaggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 480ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc 540tatggaaaaa cgccagcaac gcggctttac ggttggcctt cgctgggtgg ccttttgctc 600acatgttctt tctttcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt 660gagctgattc cgctcgccgc agccgaacga ccgcggagag cggccgcaaa agaagcgcgg 720atcgcg726
<210>2<213>逆转录病毒科，慢病毒属(Retroviridae，Lentivirus)<211>726<212>DNA<220>
<221>mat_pept ide<222>(1)…(726)<400>2atgatagcac agtgtgtgat tctgcagcag tcaggggagc ttgtgaagcc agtggcctca 60tttttgaagt ccacagcttc tggcttcaac attaaagaca cctatatgca ctgggtgagg 120cagaggcctg aacagatact ggagtggatt ggaaggattg atcctgcgaa tggtaatact 180gactatgacc cgaagttcca gggcaaggca cagctataac agacacatcc tccaacacag 240cctacctgca gctcagcagc ctgcatctgg gacactgccg tctattactg tggtaggtac 300gactatgcta tggactactg gggccaaggg atgacggtca actacgtctc ctcaggaggt360ggaggcggtt caggcggagg tggctctggc ggtggcggat cgctcgagga cactcagacc 420tctccaggag agcgcaggga ttttccaggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 480ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcgccatc 540tatggaaaaa cgccagcaac gcggctttct tacggttggc cttttggtgg ccttgcgctc 600acatgttctt tcctgcgttc tgccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt 660gagctgattc cgctcgccgc agccgaacga ccgcggagag cggccgcaaa agaagcgatc 720cggttg 72权利要求
1.一种抗HIV1特异性核衣壳蛋白的单链抗体，其特征在于该单链抗体具有如下所示的基因序列ATGGGCCAGT GTGTGATTCT GCAGCAGTCA GGGGCAGAGC TTGTGAAGCC AGTGGCCTCAGTCAAGTTGT CCACAGCTTC TGGCTTCAAC ATTAAAGACA CCTATATGCA CTGGGTGAGGCAGAGGCCTG AACAGATACT GGAGTGGATT GGAAGGATTG ATCCTGCGAA TGGTAATACTGACTATGACC CGAAGTTCCA GGGCAAGGCA CTATAACAGC AGACACATCC TCCAACACAGCCTACCTGCA GCTCAGCAGC CTGCATCTGG GACATGGCCG TCTATTACTG TGGTAGGTACGACTATGCTA TGGACTACTG GGGCCAAGGG ACCACGGTCA CCTTCGTCTC CTCAGGTGGAGGCGGTTCAG GCGGAGGTGG CTCTGGCGGT GGCGGATCGG ACATCGAGCT CACTCAGACCTCTCCAGGAG AGCGCAGGGA TTTGCCAGGG GAAACGCCTG GTATCTTTAT AGTCCTGTCGGGTTTCGCCA CCTCTGACTT GAGCGTCGAT TTTTGTGATG CTCGTCAGGG GGGCGGAGCCTATGGAAAAA CGCCAGCAAC GCGGCTTTAC GGTTGGCCTT CGCTGGGTGG CCTTTTGCTCACATGTTCTT TCTTTCGTTA TCCCCTGATT CTGTGGATAA CCGTATTACC GCCTTTGAGTGAGCTGATTC CGCTCGCCGC AGCCGAACGA CCGCGGAGAG CGGCCGCAAA AGAAGCGCGGATCGCG共计726个核苷酸，划线部分为接头序列共45个核苷酸，接头前为重链序列共354个核苷酸，接头后为轻链序列共327个核苷酸。
2.一种抗HIV2特异性核衣壳蛋白的单链抗体，其特征在于该单链抗体具有如下所示的基因序列ATGATAGCAC AGTGTGTGAT TCTGCAGCAG TCAGGGGAGC TTGTGAAGCC AGTGGCCTCATTTTTGAAGT CCACAGCTTC TGGCTTCAAC ATTAAAGACA CCTATATGCA CTGGGTGAGGCAGAGGCCTG AACAGATACT GGAGTGGATT GGAAGGATTG ATCCTGCGAA TGGTAATACTGACTATGACC CGAAGTTCCA GGGCAAGGCA CAGCTATAAC AGACACATCC TCCAACACAGCCTACCTGCA GCTCAGCAGC CTGCATCTGG GACACTGCCG TCTATTACTG TGGTAGGTACGACTATGCTA TGGACTACTG GGGCCAAGGG ATGACGGTCA ACTACGTCTC CTCAGGAGGTGGAGGCGGTT CAGGCGGAGG TGGCTCTGGC GGTGGCGGAT CGCTCGAGGA CACTCAGACCTCTCCAGGAG AGCGCAGGGA TTTTCCAGGG GAAACGCCTG GTATCTTTAT AGTCCTGTCGGGTTTCGCCA CCTCTGACTT GAGCGTCGAT TTTTGTGATG CTCGTCAGGG GGGCGCCATCTATGGAAAAA CGCCAGCAAC GCGGCTTTCT TACGGTTGGC CTTTTGGTGG CCTTGCGCTCACATGTTCTT TCCTGCGTTC TGCCCTGATT CTGTGGATAA CCGTATTACC GCCTTTGAGTGAGCTGATTC CGCTCGCCGC AGCCGAACGA CCGCGGAGAG CGGCCGCAAA AGAAGCGATCCGGTTG共计726个核苷酸，划线部分为接头序列共45个核苷酸，接头前为重链序列共357个核苷酸，接头后为轻链序列共324个核苷酸。
3.一种用于检测血清中HIV1/2抗原的胶体金快速检测试剂，其特征在于该试剂含有权利要求1和权利要求2所述的单链抗体。
全文摘要
本发明公开了一种抗HIV1/2抗原的单链抗体及利用该单链抗体的快速检测试剂，该抗HIV1/2抗原的单链抗体具有特定的基因序列，利用本发明抗HIV1/2抗原的单链抗体可以制作用于检测血清中HIV1/2抗原的胶体金快速检测试剂，从而提高检测试剂的特异性、增强抗干扰能力、缩短“窗口期”，便于快速检测试剂的推广应用，因此可以有效解决HIV携带者漏检率高的难题。
文档编号C07K16/42GK1803841SQ20051011081
公开日2006年7月19日 申请日期2005年11月24日 优先权日2005年11月24日
发明者王贤俊 申请人:王贤俊