专利名称：一种从长春花中分离文多灵、长春质碱、长春碱和长春新碱的方法
技术领域：
本发明涉及一种从长春花中分离文多灵、长春质碱、长春碱和长春新碱的方法，特别涉及一种采用连续中压柱层析法和负压蒸法式析晶法生产高纯度长春花生物碱的工艺方法。
背景技术：
目前，长春碱及其类似物一般从夹竹桃科(Apocynaceae)植物长春花(Catharanthus roseus)中提取得到。
当前长春花生物碱提取方法有1、从长春花中提取抗癌活性成分的新工艺，中国专利局公开号CN1365978a；
公开日2002.08.28；申请号011319879.9，该发明涉及一种长春花全草干粉中提取长春碱、长春新碱及熊果酸的工艺方法，采用长春花干料磨粉→苯渗漉→3～10％的酒石酸液逆流萃取→酸溶物经柱层析分离→长春碱和长春新碱，从酸不溶物中获得熊果酸。
2、Process for the isolation of alkaloid components from the plant VincaRosea L.(一种从长春花中分离生物碱成分的工艺)美国专利局公开号4172077；
公开日1979.10.23；申请号[HU] RI 638，该发明涉及一种以长春花粉碎后为原料，通过不同的酸化条件来生产各种长春花生物碱的工艺方法。经原料粉碎→甲醇、2％硫酸水溶液及甲苯渗漉→浓缩渗漉液→不同条件酸化→纯化后得到产品的工艺路线。
上述长春碱的生产方法普遍存在着提取时间较长，提取率及得率均较低，生产成本高、工序复杂不易于推广等缺点。
发明内容
本发明目的在于提供一种生产周期短、提取率高、产品纯度及得率高的长春碱生产方法。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是将长春花→除杂质→鲜磨→匀浆培养→排除培养液→空化混悬固-液萃取→过滤→提取液浓缩→双水相萃取→萃取液浓缩→长春花总生物碱→连续中压柱层析梯度洗脱→得到文多灵、长春质碱、长春碱和长春新碱，长春碱经负压蒸法式析晶法得到高纯度长春碱。
本发明的优点是1.本发明生产周期短、耗能少，对环境无污染。
2.本发明取代了传统的物料干法粉碎、加热提取或机械搅拌萃取及逆流萃取等加工方法，具有方法流程简单，溶剂用量少等优点。
3.本发明实现了长春花资源的充分利用，最终产品纯度高、得率高，其中长春碱得率为0.07～0.12‰，纯度在98％以上。
具体实施例方式下面是对本发明的进一步描述本发明采用的方法流程是长春花→除杂质→鲜磨→匀浆培养→排除培养液→空化混悬固-液萃取→过滤→提取液浓缩→双水相萃取→萃取液浓缩→长春花总生物碱→连续中压柱层析梯度洗脱→得到文多灵、长春质碱、长春碱、长春新碱、脱水长春碱。
所述的鲜磨是指所述的鲜磨是指鲜长春花置于打浆机中，加入2-5倍的溶有诱导剂的培养液进行鲜磨处理，磨浆时间为2-7min，得到的物料的最终粒度为0.02～10μm，所述的培养液是指水、pH＝3.6-6.2的磷酸缓冲溶液、B5培养液及其改良配方与诱导剂的组合，所述的诱导剂是指由莽草酸，乙烯利，乙酸钠，脱落酸，裂环马钱子苷，血红蛋白，赤霉素，血红素，赤藓糖-4-磷酸，L-色氨酸，乙酰水杨酸，磷酸稀醇式丙酮酸，双氧水，细胞分裂素，茉莉酸甲酯，Ketoconazole，水杨酸，苯丙氨酸，钙调素，奎宁，辣根过氧化物酶中的一种或几种组成的混合配方。
所述的匀浆培养是指是指将经过鲜磨的物料导入能够截留组分0.02～10μm粒子的多孔微滤膜的培养罐中，每隔1-3h在负压0.06～0.1MPa吸气或正压0.1～0.6MPa进气条件下进行一次匀浆培养，每次培养时间为5-20min。
所述的空化混悬固-液萃取是指将匀浆培养后的物料与醇或酸醇提取溶剂混合，采用负压0.06～0.1MPa吸气或正压0.1～0.6MPa进气进行固-液萃取，萃取时间为20～50分钟，所述的提取溶剂为50～70％乙醇与1～10％酒石酸或1～10％硫酸的混合提取溶剂。
所述的过滤采用截留组分0.02～10μm粒子，负压0.06～0.1MPa的多孔微滤膜进行抽滤、截留组分0.02～10μm粒子，正压0.2～1MPa的多孔微滤膜进行压滤或转速1800～2400r/min，截留组分0.02～10μm粒子多孔滤膜的离心机进行离心过滤方法。
所述的双水相萃取是指浓缩液用0.5～10％硫酸或0.5～10％酒石酸将浓缩液的pH值调至1～5，在负压0.06～0.1MPa或正压为0.1～0.6MPa进气条件下混匀后静置5～10分钟，然后与萃取剂等体积混合，在负压0.06～0.1MPa条件下吸气或正压为0.1～0.6MPa进气，萃取时间为5～30分钟，进行空化混悬液-液萃取，待静止后分离，再用氢氧化钠、氢氧化钾或浓氨水将浓缩液的pH值调至8～12，然后与萃取剂等体积混合，在负压0.06～0.1MPa条件下吸气或正压为0.1～0.6MPa进气，萃取时间为5～30分钟，进行空化混悬液-液萃取，分离萃取液，所述的萃取剂采用二氯甲烷、三氯甲烷、1，2-二氯乙烷或石油醚。
所述的连续中压柱层析所采用的填料为硅胶或氧化铝，所用的洗脱剂为石油醚、二氯甲烷、三氯甲烷、1，2-二氯乙烷、甲醇、乙醇、乙腈、丙酮中的一种或几种所组成的溶剂系统，所采用的洗脱方式为梯度洗脱。
所述的负压蒸法式析晶法是以65％-100％的乙醇、甲醇或乙腈为析晶母液，在负压0.06～0.1MPa吸气或正压0.1～0.6MPa进气条件下进行结晶操作。
下面，本发明将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任一个或类似实例。
实施例1取新长春花100kg(含水率80％)分成25等份，分别置于打浆机中，加入预先配制好的培养液10kg(培养液配方为乙酸钠0.02μmol/L，乙烯利1mg/L，脱落酸0.2mg/L，L-色氨酸25μmol/L，乙酰水杨酸15μmol/L，血红蛋白50μg/L，血红素50μg/L，双氧水0.15mmol/L，苯丙氨酸3mg/L，茉莉酸甲酯0.25μmol/L，辣根过氧化物酶0.0065μmol/L)，磨浆时间为3min，物料的最终粒度为0.02～8μm。然后倒入带有滤膜的培养罐中，采用负压0.06～0.1MPa吸气或正压0.1～0.6MPa进气方式每隔2h进行一次匀浆培养，每次培养时间为10min。培养24h后，排除培养液，将剩余物料与70％乙醇提取剂100kg边混合边投入匀浆机进行匀浆萃取，负压空化混悬萃取20～50min，匀浆液经浓浆泵打入带有截留组分为0.02～10μm滤膜、负压为0.1MPa的提取罐内，物料再经70％乙醇100kg空化混悬萃取，重复此操作2～3次，合并滤液，长春碱提取率为0.09～0.14‰，滤液经温度为80～110℃，负压为0.06～0.1MPa溶剂回收塔浓缩回收乙醇，提取浓缩液进行双水相萃取，硫酸调节浓缩液pH＝2后，加入1/2体积的二氯甲烷负压空化混悬液液萃取5～10min，静置5min，分层后，排除二氯甲烷层，重复萃取三次，合并萃取液，回收二氯甲烷。用浓氨水调节水层pH＝8～12，加入1/2体积的二氯甲烷负压空化混悬液液萃取10～15min，静置5-10min，分层后排除二氯甲烷层，重复萃取三次，合并萃取液，回收二氯甲烷。得到长春花总碱40.6g，经连续中压住层析，以硅胶为填料，以正己烷∶二氯甲烷＝9-1∶1-9及二氯甲烷∶甲醇＝300-100∶1-5为洗脱剂进行梯度洗脱，得到文多灵5.69g，长春质碱2.5g，长春碱和长春新碱的混合物2.23g，将长春碱和长春新碱的混合物经过以碱性氧化铝为填料的连续中压柱层析纯化后，得到长春碱0.8g，纯度95.4％，长春新碱0.5g。将长春碱溶于90％的乙醇溶液中，使其在60℃时形成饱和溶液，在负压0.06～0.1MPa吸气的条件下实现析晶操作，经过负压蒸法式析晶法得到长春碱的纯度＞98％，得率＞95％。
权利要求
1.一种从长春花中分离文多灵、长春质碱、长春碱和长春新碱的方法，它是将长春花→除杂质→鲜磨→匀浆培养→排除培养液→空化混悬固-液萃取→过滤→提取液浓缩→双水相萃取→萃取液浓缩→长春花总生物碱→连续中压柱层析梯度洗脱→得到文多灵、长春质碱、长春碱和长春新碱，长春碱经负压蒸法式析晶法得到高纯度长春碱。
2.按照权利要求1所述的从长春花中分离文多灵、长春质碱、长春碱和长春新碱的方法，其特征在于所述的鲜磨是指所述的鲜磨是指鲜长春花置于打浆机中，加入2-5倍的溶有诱导剂的培养液进行鲜磨处理，磨浆时间为2-7min，得到的物料的最终粒度为0.02～10μm，所述的培养液是指水、pH＝3.6-6.2的磷酸缓冲溶液、B5培养液及其改良配方与诱导剂的组合，所述的诱导剂是指由莽草酸，乙烯利，乙酸钠，脱落酸，裂环马钱子苷，血红蛋白，赤霉素，血红素，赤藓糖-4-磷酸，L-色氨酸，乙酰水杨酸，磷酸稀醇式丙酮酸，双氧水，细胞分裂素，茉莉酸甲酯，Ketoconazole，水杨酸，苯丙氨酸，钙调素，奎宁，辣根过氧化物酶中的一种或几种组成的混合配方。
3.按照权利要求1所述的从长春花中分离文多灵、长春质碱、长春碱和长春新碱的方法，其特征在于所述的匀浆培养是指是指将经过鲜磨的物料导入能够截留组分0.02～10μm粒子的多孔微滤膜的培养罐中，每隔1-3h在负压0.06～0.1MPa吸气或正压0.1～0.6MPa进气条件下进行一次匀浆培养，每次培养时间为5-20min。
4.按照权利要求1所述的从长春花中分离文多灵、长春质碱、长春碱和长春新碱的方法，其特征在于所述的空化混悬固-液萃取是指将匀浆培养后的物料与醇或酸醇提取溶剂混合，采用负压0.06～0.1MPa吸气或正压0.1～0.6MPa进气进行固-液萃取，萃取时间为20～50分钟，所述的提取溶剂为50～70％乙醇与1～10％酒石酸或1～10％硫酸的混合提取溶剂。
5.按照权利要求1所述的从长春花中分离文多灵、长春质碱、长春碱和长春新碱的方法，其特征在于所述的过滤采用截留组分0.02～10μm粒子，负压0.06～0.1MPa的多孔微滤膜进行抽滤、截留组分0.02～10μm粒子，正压0.2～1MPa的多孔微滤膜进行压滤或转速1800～2400r/min，截留组分0.02～10μm粒子多孔滤膜的离心机进行离心过滤方法。
6.按照权利要求1所述的从长春花中分离文多灵、长春质碱、长春碱和长春新碱的方法，其特征在于所述的双水相萃取是指浓缩液用0.5～10％硫酸或0.5～10％酒石酸将浓缩液的pH值调至1～5，在负压0.06～0.1MPa或正压为0.1～0.6MPa进气条件下混匀后静置5～10分钟，然后与萃取剂等体积混合，在负压0.06～0.1MPa条件下吸气或正压为0.1～0.6MPa进气，萃取时间为5～30分钟，进行空化混悬液-液萃取，待静止后分离，再用氢氧化钠、氢氧化钾或浓氨水将浓缩液的pH值调至8～12，然后与萃取剂等体积混合，在负压0.06～0.1MPa条件下吸气或正压为0.1～0.6MPa进气，萃取时间为5～30分钟，进行空化混悬液-液萃取，分离萃取液，所述的萃取剂采用二氯甲烷、三氯甲烷、1，2-二氯乙烷或石油醚。
7.按照权利要求1所述的从长春花中分离文多灵、长春质碱、长春碱和长春新碱的方法，其特征在于所述的连续中压柱层析所采用的填料为硅胶或氧化铝，所用的洗脱剂为石油醚、二氯甲烷、三氯甲烷、1，2-二氯乙烷、甲醇、乙醇、乙腈、丙酮中的一种或几种所组成的溶剂系统，所采用的洗脱方式为梯度洗脱。
8.按照权利要求1所述的从长春花中分离文多灵、长春质碱、长春碱和长春新碱的方法，其特征在于所述的负压蒸法式析晶法是以65％-100％的乙醇、甲醇或乙腈为析晶母液，在负压0.06～0.1MPa吸气或正压0.1～0.6MPa进气条件下进行结晶操作。
全文摘要
一种从长春花中分离文多灵、长春质碱、长春碱和长春新碱的方法，它是将长春花→除杂质→鲜磨→匀浆培养→排除培养液→空化混悬固－液萃取→过滤→提取液负压成膜浓缩→双水相萃取→萃取液浓缩→长春花总生物碱→连续中压柱层析梯度洗脱→得到文多灵、长春质碱、长春碱和长春新碱，长春碱经负压蒸法式析晶法得到高纯度长春碱。本发明取代了传统的物料干法粉碎、加热提取或机械搅拌萃取及逆流萃取等方法，实现了长春花资源的充分利用，具有方法流程简单，生产周期短，耗能少，无污染，易操作，产物收率高、纯度高等特点。
文档编号C07D471/00GK1800189SQ20051012735
公开日2006年7月12日 申请日期2005年12月19日 优先权日2005年12月19日
发明者祖元刚, 罗猛, 牟璠松, 唐中华, 赵修华, 祖柏实, 张琳, 田 浩, 付玉杰, 张宝友 申请人:东北林业大学, 祖元刚