专利名称：水稻细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及水稻中第一个细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(cyclin-dependent kinaseinhibitor)基因，命名为OsICK1。
背景技术：
细胞周期是细胞生命活动的基本过程。在真核生物中，细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)是细胞周期调控的中心组分(Morgan.Principles of CDK regulation.Nature.1995 Mar9；374(6518)131-134)，对细胞周期起着核心性的调控作用。细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)能够与细胞周期蛋白(cyclin)结合，形成Cyclin-CDK复合物，激活CDK的激酶活性，使底物蛋白质磷酸化，调控细胞周期的运行。不同种类的CDK能够与不同种类的周期蛋白结合，构成不同的CDK激酶，在细胞周期的不同时期表现出活性，对细胞周期的不同时期进行调节。
细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(ICK)在细胞周期进程中起着重要的调控作用。ICK通过在细胞周期适当的时间点上抑制CDK的活性，从而对细胞周期进展起负调控作用(Coats Set al.Requirement of p27Kipl for restriction point control of the fibroblast cellcycle.Science.1996 May 10；272(5263)877-880)。ICK能够与Cyclin-CDK复合物结合，抑制CDK的活性，使细胞周期进程被阻滞，失去增殖活性，从而影响到植物的生长和发育(Yongming Zhou，Hong Wang，Susan Gilmer，Steve Whitwill，Larry C.Fowke.Effects ofco-expressing the plant CDK inhibitor ICKland D-type cyclin genes on plant growth，cell size and ploidy in Arabidopsis thaliana.Planta 2003，216604-613)。因此，ICK对细胞周期的调控作用也越来越引起人们的关注。
1997年，王宏等在拟南芥中发现了第一个植物细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，并命名为ICK1(Hong.wang，larryC.Fowke.A plant cyclin-dependent kinase inhibitor gene.Nature，1997，386(3)April)。ICK1过量表达能够使植株矮小，细胞数目减小而体积增大，抑制核内复制和减少倍数性水平(A.L.Cleary’，L.C.Fowke，H.Wang and P.C.L.John.The effect of ICK1，a plant cyclin-dependent kinase inhibitor，on mitosis in livingplant cells.Plant cell reports 20814-820)；运用花粉组织特异性启动子，使ICKI基因在花粉中表达，可以导致花粉发育能力的降低，出现雄性不育(Yongming Zhou，HongWang，Susan Gilmer，Steve Whitwill，Wilf Keller，Larry C.Fowke.Control of petal andpollen development by the plant cyclin-dependent kinase inhibitor ICK1 intransgenic Brassica plants.Planta(2002)215248-257)；有丝分裂前期和前中期之间，把ICK1微注射到个体分化的紫露草雄蕊毛细胞中，可以增加细胞有丝分裂中期的时间，从而使细胞分化变慢(A.L.Cleary’，L.C.Fowke，H.Wang and P.C.L.John.Theeffect of ICK1，a plant cyclin-dependent kinase inhibitor，on mitosis in livingplant cells.Plant cell reports 20814-820)。这表明植物ICK在研究细胞周期，生长发育和育种等方面，具有重要的作用。
单子叶植物中，玉米和水稻等是重要的粮食作物，对其ICK基因的研究有助于玉米和水稻细胞周期的调控，进而调节生长发育。Cintia M.Coelho等已经从玉米中得到了两个ICK基因(Zeama；KRP；1和Zeama；KRP；2)(Cintia M.Coelho et al.Cyclin-dependent kinaseinihibitor in Maize endosperm And their potential role in endoreduplication.Plantphysiology.August 2005，Vol.138，pp.2323-2336)随着水稻基因组测序计划的完成以及饱和物理图谱的建立(Feng Q，Zhang Y，Hao P，et al.Sequence and analysis of ricechomosome 4.Nature.2002 21；420(6913)316-320)，其功能基因组的研究已成为热点之一。
发明内容
本发明的目的在于针对目前关于水稻中细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的研究报道罕见的问题，提供一种通过RT-PCR的方法克隆得到的新的具有调控细胞周期的功能基因，即水稻中的第1个细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂基因，命名为OsICK1基因。本发明获得的水稻第1个细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂基因(OsICK1)，将祢补水稻中这方面研究的空白。
本发明的另一目的在于使OsICK1基因在水稻中过量表达，研究了该基因的功能。
本发明所说的OsICK1基因cDNA序列为ATGGGCAAGTACATGCGCAAGGCCAAGGTGGTGGTCTCCGGCGAGGTGGTGGCCGCCGCC 60GTCATGGAGCTCGCCGCGGCGCCGCTCGGGGTGCGCACCCGCGCCCGCTCCCTCGCGCTG 120CAGAAGAGGCAGGGCGGGGAGTACCTCGAGCTCAGGAGCCGCAGGCTCGAGAAGCTCCCT 180CCTCCCCCGCCGCCGCCGCCGAGGAGGAGGGCGACGGCTGCGGCTGCGACTGCTGATGCG 240ACGGCGACGGAGAGCGCGGAGGCGGAGGTGTCGTTCGGGGGGGAGAACGTCCTCGAGCTG 300GAGGCCATGGAAAGGAATACCAGGGAGACGACACCTTGCAGCTTGATCAGGGACCCCGAT 360
ACGATTAGCACCCCTGGATCTACCACAAGGCGCAGCCACTCGAGTTCTCATTGCAAGGTG 420CAAACACCCGTGCGCCACAACATTATTCCAGCATCAGCAGAGCTGGAAGCGTTCTTCGCC 480GCCGAAGAGCAACGGCAACGACAGGCTTTCATCGACAAGTATAACTTTGATCCTGTGAAT 540GACTGCCCTCTTCCCGGCCGATTTGAATGGGTCAAGCTAGACTGA 585基因编码序列全长为585bp，共编码194个氨基酸，其中1-3的ATG为启始密码子，583-585的TGA为终止密码子。
本发明所说OsICK1基因cDNA序列克隆方法为1)根据blast分析结果，以NCBI上公布的核酸序列为基础设计引物，提取水稻(9311)总RNA，运用RT-PCR的方法扩增出了585bp的核酸片断；2)回收上述核酸片断，连接到pMD-18T载体上后，测序，确证此核酸序列即为OsICK1基因。
本发明所说OsICK1基因过量表达载体的构建方法为1)按获得的OsICK1基因的两端核酸序列，合成两对引物，并在两对引物中分别引入EcoR I和BamH I酶切位点，然后PCR扩增得到编码序列；2)用EcoR I和BamH I双酶切OsICK1基因的PCR产物以及中间载体pBpF(含有启动子CaMV 35S和终止子NOS)，回收双酶切产物并连接，转化大肠杆菌感受态细胞，得到中间表达载体pBpF-OsICK1；3)用HindIII单酶切中间表达载体pBpF-OsICK1和双元表达载体1301，回收酶切目的产物并连接，转化大肠杆菌感受态细胞，得到过量表达载体1301-OsICK1；4)测序验证结果；5)抽提1301-OsICK1质粒DNA；制备农杆菌EHA105感受态细胞；6)取1301-OsICK1质粒DNA转化农杆菌EHA105感受态细胞；7)经PCR及酶切鉴定得阳性克隆，甘油保存，备用。
所述的水稻细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂基因，可应用于水稻细胞周期的调控，其过量表达可以用于限制特定组织器官的发育，所述的发育为雄蕊的超量表达控制雄蕊的发育，达到创建雄蕊不育材料。
所述的水稻细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂基因的敲除可以用于促进特定组织器官的发育，可以通过敲除OsICK1基因在叶片的表达，达到使叶片长的更大。
本发明获得的转OsICK1基因水稻的性状表现1)OsICK1基因超过量表达可影响抗性愈伤组织分化成苗。
2)OsICK1基因过量表达的转基因植株可出现植株矮化。
3)OsICK1基因过量表达的转基因植株可引起水稻种子结实率的减少。
本发明具有以下突出优点1、本发明克隆的水稻OsICK1基因是一种新的具有调控细胞周期的功能基因。
2、根据OsICK1基因序列，构建过量表达载体使OsICK1基因在水稻中过量表达，对该基因的功能进行研究。
图1为本发明转1301-OsICK1基因的再生小苗。
图2为本发明转化植株的PCR扩增结果。在图2中，1-8转基因植株；9DL 2000marker；101301-OsICK1质粒DNA；11对照植株。
图3为本发明的转化植株和对照植株(WT)的形态比较。在图3中，T7结实率较低的植株；T1O矮化的植株。
图4为本发明的转化植株(T7)和对照植株(WT)的OsICK1基因转录水平的差异。在图4中，A OsICK1基因扩增结果，11301-OsICK1质粒DNA，2对照植株(WT)，3转化植株(T7)4DNA Marker DL 2000；B内标actin扩增结果。2对照植株(WT)，3转化植株(T7)，4DNA Marker DL 2000.
图5为本发明的转化植株(T7)和对照植株(WT)的OsICK1基因蛋白表达水平的差异。
具体实施例方式
以下实施例将对本发明作进一步的说明。
实施例1以水稻品种9311的总RNA为模板，以NCBI上公布的核酸序列为基础，设计两对引物，进行PCR扩增。回收扩增产物，并取7μl回收产物与1μl的T-载体在16℃的条件下连接过夜，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，挑选重组子，进行PCR和酶切鉴定。
挑取鉴定呈阳性的重组子pMD-18T-OsICK1，送交博亚公司测序。
实施例2选取OsICK1基因两端核酸序列，合成两对引物，并在引物中分别引入EcoR I和BamH I酶切位点。然后以pMD-18T-OsICK1为模板，进行PCR扩增，PCR的扩增条件为94℃预变性5min；94℃变性45sec，55℃退火1min，72℃ 1min，36个循环；72℃延伸10min。回收PCR产物，并分别EcoR I和BamH I双酶切，回收酶切产物。将中间载体pBpF用EcoRI和BamH I双酶切，回收酶切产物。取1μlT4连接酶Buffer，6μl回收的EcoR I和BamH I双酶切的PCR产物，2μl EcoR I和BamH I双酶切的pBpF产物，10U T4连接酶，在16℃条件下连接过夜，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，挑选重组子，进行PCR和酶切鉴定后，获得中间载体pBpF-OsICK1。
挑取中间载体pBpF-OsICK1阳性重组子，在LB培养基中震荡培养过夜，抽提质粒，并用HindIII单酶切，回收酶切产物，待用。取1μl T4连接酶Buffer，7μl回收的经HindIII单酶切的中间载体pBpF-OsICK1产物，1μl双元表达载体1301 HindIII单酶切产物，10UT4连接酶，在10μl的体系下连接过夜。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，挑选重组子，进行PCR、酶切鉴定以及测序验证后，获得1301-OsICK1过量表达载体。
实施例3共培养基的制备挑取-20℃保存的甘油菌于1.5ml LB(含Kan 50μg/ml)中，28℃振荡32h后，吸取150μl农杆菌液于10ml LB(含Kan 50μg/ml)中，28℃培养24h后，离心，收集菌体，用等体积的AAM液体培养基悬浮菌体，并向菌体中加入乙酰丁香酮(AS)，使其浓度达到100μmol/L。
实施例4取日本晴幼胚，用10％的次氯酸钠表面消毒45min后；用无菌水清洗3～5遍，每次2～3min；用解剖针剥出幼胚，接种于NB培养基+2，4-D 2mg/L的诱导培养基中，在25～26℃，黑暗条件下诱导愈伤组织，15天后将愈伤组织转移至继代培养基中继代1次。
取新鲜的愈伤组织，浸泡在菌液中30min后，用镊子夹出愈伤组织，放在含有多层滤纸的培养皿中，吸干多余的菌液。然后放入NB培养基+2，4-D 2mg/L+100μmol/L AS的共培养基上暗培养3天。
用镊子夹取共培养3天后的愈伤组织，放入NB培养基+2，4-D 2mg/L+Cb 500mg/L+Hyg100mg/L的筛选培养基上进行筛选，大部分愈伤在10天内逐渐变褐，10天之后一部分褐化的组织上先后长出乳白色，略透明，松散，生长相对旺盛的抗性愈伤。
将抗性愈伤在NB培养基+ABA 2mg/L+6-BA 3mg/L+Cb 250mg/L+Hyg 25mg/L的预分化培养基中预分化1周后，抗性愈伤组织中有绿色的小芽点出现，将这些带绿点的愈伤组织转移到NB培养基+6-BA 3mg/L+NAA 1mg/L+Sorbitol 13g/L+Cb 250mg/L+Hyg 25mg/L的分化培养基上培养后，绿色小点继续分化，并相继成苗。从绿点到分化成苗所需要的时间为3～6周不等。
实施例5将分化后的小苗移栽到土壤中，待成活后，剪取叶片，进行PCR鉴定，分析转基因植株形态变化(并与转化空载体的植株比较)，进行RT-PCR定量分析和Western blotting验证。
实施例6如实例2中载体构建的方法，把启动子CaMV 35S替换成花粉组织特异性表达启动子(如Osg6B启动子)，构建osICK1基因的花粉组织特异性表达载体，通过实例4中的遗传转化方法，使osICK1基因在花粉中特异性表达，可以得到雄性不育的植株。
实施例7如实例2中载体构建的方法，通过叶片组织特异性表达启动子(如Osg6B启动子)，构建反义osICK1基因的叶片组织特异性表达载体，通过实施例4中的遗传转化方法，使osICK1基因在叶片中的表达减少，可以使转基因植株的叶片长得更大。
权利要求
1.水稻细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂基因，其特征在于其cDNA序列为ATGGGCAAGTACATGCGCAAGGCCAAGGTGGTGGTCTCCGGCGAGGTGGTGGCCGCCGCC 60GTCATGGAGCTCGCCGCGGCGCCGCTCGGGGTGCGCACCCGCGCCCGCTCCCTCGCGCTG120CAGAAGAGGCAGGGCGGGGAGTACCTCGAGCTCAGGAGCCGCAGGCTCGAGAAGCTCCCT180CCTCCCCCGCCGCCGCCGCCGAGGAGGAGGGCGACGGCTGCGGCTGCGACTGCTGATGCG240ACGGCGACGGAGAGCGCGGAGGCGGAGGTGTCGTTCGGGGGGGAGAACGTCCTCGAGCTG300GAGGCCATGGAAAGGAATACCAGGGAGACGACACCTTGCAGCTTGATCAGGGACCCCGAT360ACGATTAGCACCCCTGGATCTACCACAAGGCGCAGCCACTCGAGTTCTCATTGCAAGGTG420CAAACACCCGTGCGCCACAACATTATTCCAGCATCAGCAGAGCTGGAAGCGTTCTTCGCC480GCCGAAGAGCAACGGCAACGACAGGCTTTCATCGACAAGTATAACTTTGATCCTGTGAAT540GACTGCCCTCTTCCCGGCCGATTTGAATGGGTCAAGCTAGACTGA 585基因编码序列全长为585bp，共编码194个氨基酸，其中1-3的ATG为启始密码子，583-585的TGA为终止密码子。
2.如权利要求1所述的水稻细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂基因，其特征在于其cDNA序列克隆方法为1)根据blast分析结果，以NCBI上公布的核酸序列为基础设计引物，提取水稻(9311)总RNA，运用RT-PCR的方法扩增出了585bp的核酸片断；2)回收上述核酸片断，连接到pMD-18T载体上后，测序，确证此核酸序列即为OsICK1基因。
3.如权利要求1所述的水稻细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂基因，其特征在于其过量表达载体的构建方法为1)按获得的OsICK1基因的两端核酸序列，合成两对引物，并在两对引物中分别引入EcoRI和BamHI酶切位点，然后PCR扩增得到编码序列；2)用EcoRI和BamHI双酶切OsICK1基因的PCR产物以及中间载体pBpF(含有启动子CaMV 35S和终止子NOS)，回收双酶切产物并连接，转化大肠杆菌感受态细胞，得到中间表达载体pBpF-OsICK1；3)用HindIII单酶切中间表达载体pBpF-OsICK1和双元表达载体1301，回收酶切目的产物并连接，转化大肠杆菌感受态细胞，得到过量表达载体1301-OsICK1；4)测序验证结果；5)抽提1301-OsICK1质粒DNA；制备农杆菌EHA105感受态细胞；6)取20μg1301-OsICK1质粒DNA转化农杆菌EHA105感受态细胞；7)经PCR及酶切鉴定得到阳性克隆，甘油保存，备用。
4.如权利要求1所述的水稻细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂基因，其特征在于可应用于水稻细胞周期的调控。
5.如权利要求1所述的水稻细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂基因，其过量表达在限制特定组织器官发育中的应用。
6.如权利要求5所述的水稻细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂基因，其特征在于所述的发育为雄蕊的超量表达控制雄蕊的发育，达到创建雄蕊不育材料。
7.如权利要求1所述的水稻细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂基因，其敲除在促进特定组织器官发育中的应用。
8.如权利要求7所述的水稻细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂基因，其特征在于所述的应用是指通过敲除OsICK1基因在叶片的表达，达到使叶片长的更大。
全文摘要
水稻细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂基因，涉及水稻中第一个细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂基因，命名为OsICK1。提供一种通过RT－PCR的方法克隆得到的新的具有调控细胞周期的功能基因，即水稻中的第1个细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂基因，命名为OsICK1基因。基因编码序列全长为585bp，共编码194个氨基酸，其中1－3的ATG为启始密码子，583－585的TGA为终止密码子。其克隆方法为根据blast分析结果，以NCBI上公布的核酸序列为基础设计引物，提取水稻总RNA，扩增出585bp的核酸片断并回收连接到pMD－18T载体上测序确证。是一种新的具有调控细胞周期的功能基因。
文档编号C07K14/415GK1807626SQ20051012996
公开日2006年7月26日 申请日期2005年12月16日 优先权日2005年12月16日
发明者陈亮, 何艺宾, 沈明山, 张红心, 曾雅明, 王蕾 申请人:厦门大学