抑制Wnt活性的多核苷酸及其编码多肽和用途的制作方法

专利名称：抑制Wnt活性的多核苷酸及其编码多肽和用途的制作方法
技术领域：
本发明公开了一类新的编码具有抑制Wnt活化的功能的人蛋白的多核苷酸及其编码的多肽，多肽的抗体。本发明也公开了这类新的多核苷酸在宿主细胞中外源表达对Wnt活性的抑制作用的应用。本发明还公开了所述多肽、抗体在制备预防和治疗肿瘤的药物上的用途。
背景技术：
Wnt通路是一条十分保守的信号传导通路，从低等生物果蝇到高等哺乳动物，其成员都具有高度的同源性。在小鼠中，肿瘤病毒整合在Wnt之后而导致乳腺癌，命名为Int1，它与果蝇的无翅基因(Wingless，wg)有高度同源性。Wnt作为一类分泌型糖蛋白，主要通过自分泌或旁分泌发挥作用。Wnt具有生长因子特点如缺乏附加的跨膜区域，有疏水的信号肽，富含保守半胱氨酸片段，具备N端糖基化位点。目前认为的wnt通路的主要成员细胞外因子(wnt)；跨膜受体(frizzled)；胞质蛋白(β-catenin)；以及核内转录因子(TCF)等一系列蛋白。Wnt信号途径可概括Wnt→Frz→Dsh→β-catenin的降解复合体解散→β-catenin积累，进入细胞核→TCF/LEF→基因转录(如c-myc、cyclinD1)。Wnt信号在动物发育中起重要作用，其异常表达或激活能引起肿瘤。
Wnt的受体是卷曲蛋白(frizzled，Frz)，为7次跨膜蛋白，结构类似于G蛋白偶联型受体，Frz胞外N端具有富含半胱氨酸的结构域(cysteine rich domain，CRD)，能与Wnt结合。Frz作用于胞质内的蓬乱蛋白(Dishevelled，Dsh或Dvl)，Dsh能切断β-catenin的降解途径，从而使β-catenin在细胞质中积累，并进入细胞核，与T细胞因子(T cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF)相互作用，调节靶基因的表达，TCF/LEF是一类具有双向调节功能的转录因子，它与Groucho结合抑制基因转录，而与结合β-catenin则促进基因转录。Wnt还需要另外一个受体(co-receptor)，即LRP5/6，属于低密度脂蛋白受体相关蛋白(LDL-receptor-related protein，LRP)，但至今还不清楚它如何与Frz一起活化Dsh。
β-catenin的降解复合体主要由APC、Axin、GSK-3β、CK1等构成。
GSK-3β是一种蛋白激酶，在没有Wnt信号时，GSK-3β能将磷酸基团加到β-catenin氨基端的丝氨酸/苏氨酸残基上，磷酸化的β-catenin再结合到β-TRCP蛋白上，受泛素的共价修饰，被蛋白酶体(proteasome)降解。β-catenin中被GSK3磷酸化的氨基酸序列称为破坏盒(destructionbox)，此序列发生变异可能引起某些癌症。
CK1酪蛋白激酶(caseinkinase 1)，能将β-catenin的Ser45磷酸化，随后GSK-3β将β-catenin的Thr41、Ser37、Ser33磷酸化。APC是一种抑癌基因，其突变引起良性肿瘤——结肠腺瘤样息肉(adenomatous polyposis coli)，但随着时间的推移，可能发生恶变。APC蛋白的作用是增强降解复合体与β-catenin的亲和力。
Axin是一种支架蛋白，具有多个与其它蛋白作用的位点，能将APC、GSK-3β、β-catenin、CK1结合在一起。此外它还能与Dishevelled、PP2A(protein phosphatase 2A)等成分结合，其中Dsh与Axin结合能使降解复合体解体。PP2A可能引起Axin去磷酸化，而使降解复合体解体，因此属于Wnt途径的正调控因子，但PP2A至少由催化亚基和调节亚基两部分构成，其调节亚基仍算作是抑癌基因。
Wnt信号途径的其它成分GBPGSK-3β结合蛋白(Frat基因的产物)，对Wnt信号途径起正调控作用，GBP/Frat抑制GSK3-β的活性。
Dickkopf1(DKK1)是一种分泌蛋白，其与Wnt受体LRP5/6及另一类穿膜蛋白Kremen1/2结合，形成三聚体，诱导快速的细胞内吞，减少细胞膜上的LRP5/6，由此阻断了Wnt信号向胞内的传递。
sFRP分泌型Frz相关蛋白(secreted frizzled-related proteins)，含有一个CRD结构域，但缺少七次跨膜域，它可能与Frz竞争结合Wnt蛋白。其他的抑制蛋白还有Sizzled、WIF-1和Cerberus，它们也直接与Wnt蛋白结合，从而拮抗Wnt信号。
β-catenin(β-连锁蛋白，在果蝇中叫做犰狳蛋白(Armadillo)是一种多功能的蛋白质，是wnt通路关键的细胞内信号蛋白，它具有双重功能，其一是参与细胞间黏附作用；其二是Wnt信号传导过程中的重要成分，取决于他的位置在细胞膜还是细胞核。膜相关β-catenin在细胞黏附中起重要作用，它结合E-cadherin的胞内区，连接E-cadherin和α-catenin，进而连接肌动蛋白细胞骨架。有文献报导E-cadherin可以通过抑制β-catenin以黏附依赖的方式抑制细胞生长，也有报导β-catenin亦可抑制E-cadherin的表达，总之他们之间的平衡调节细胞的生长分化。正常组织中细胞内由于结肠腺性息肉基因(APC)、哺乳动物糖元合成激酶3(GSK3β)等的作用，游离的β-catenin很快即被降解，一般不会出现聚集。当细胞外因子与受体结合后，通过一系列胞质蛋白的相互作用激活Wnt信号途径后，能引起胞内在胞质内积累，当游离的β-catenin进入细胞核，与转录因子TCF/LEF形成复合物，与DNA结合，促进靶基因的持续转录。靶基因的持续转录与细胞的增殖与转化密切相关。
Wnt具有生长因子的特点如缺乏附加的跨膜区域，有疏水的信号肽，富含保守半胱氨酸片段，具备N端糖基化位点。Wnt通路的下游靶基因多数是参与细胞增生与凋亡的基因，如cylinD1、c-myc等.越来越多的研究结果表明，Wnt信号通路不仅在胚胎发育、细胞分化和增生过程中起着至关重要的作用，而且与许多人类肿瘤的发生发展也具有密切关系。
1.Wnt和发育生物学Wnt3能明显协助诱导原条和哺乳动物中结的形成，虽然没有证据证明Wnt3的表达是中胚层诱导所必须，然而胚胎头区的形成(非常关键的头部结构)需要Wnt和Bmp4活性的抑制。阻断Wnt信号通路促进骨髓MSCs进入细胞周期Wnt是1982年第一次被克隆的原癌基因，属生长因子类，与胚胎发育、肿瘤形成有密切关系。目前研究表明，Wnt信号通过膜上的Frizzled受体和共同受体LRP5、LRP6(脂蛋白相关蛋白受体)进入胞内，然后分为β-catenin信号通路、JNK信号通路、Wnt/Ca2+通路3条信号途径。在β-catenin信号通路中，激活的下游信号汇集桥梁分子，抑制糖原合成酶激酶(GSK3)，启动分化和增殖。激活的桥梁分子可激活RhOA，进一步活化JNK，调整细胞骨架；经G蛋白可致细胞内Ca2+释放，激活磷酸蛋白酶C(PKC)、磷脂酶(PLC)。在胚胎发育中，Wnt启动了器官形成和干细胞分化。成人骨髓MSCs从体内分离出后，往往经过3-5d的停滞期，随后进入细胞周期。在停滞期末，细胞自身合成分泌了Wnt信号的抑制分子Dickkopf1。Dickkopf1是在头部形成中起重要作用的新蛋白家族中一种分泌型蛋白，可拮抗Wnt信号通路，其通过降低细胞内β-catenin水平，阻断Wnt信号通路途径，而促进细胞进入细胞增殖周期。
2.Wnt与肿瘤wnt基因家族成员的wnt-1、wnt-3和wnt-10b都是由MMTV诱发小鼠乳腺癌的过程中活化的癌基因.小鼠wnt-1、wnt-2、wnt-3a、wnt-5a、wnt-7基因在体外均具有转化细胞的能力.目前虽无明确证据表明，wnt基因异常能直接导致人类肿瘤的发生，但已有大量的研究报道显示二者关系密切.例如，wnt-2在大肠癌发展的多阶段都有过度表达；wnt-5a在乳腺癌、大肠癌、肺癌、前列腺癌、黑色素瘤中过度表达，在乳腺癌及早期乳腺增生中过度表达更为明显，因此wnt-5a具有癌基因的某些特性.值得一提的是，还有研究报道，在缺失wnt-5a的膀胱癌细胞系及肾癌细胞系中导入wnt-5a基因可使恶性转化细胞表型逆转，说明wnt-5a在泌尿道肿瘤中很可能又是一个抑癌基因.所以，wnt-5a作为一个重要的生长调节基因，在不同的组织细胞中可能发挥不同的生理功能和作用。新研究表明Wnt信号控制了肠内一种特别的帕内特氏细胞的成熟和正确的位置，对抗细菌肽的分泌来说帕内特氏细胞是很重要的。对肠肿瘤细胞的观察也证实了Wnt信号维持原始细胞和引导细胞成熟的双重功能，肠肿瘤因原始细胞过度生产而造成，肠肿瘤细胞中也显示出成熟帕内特氏细胞的特征。
3.Wnt与神经干细胞分化干细胞是一类有潜力分化成各种类型细胞的全能细胞，而一个干细胞是继续进行自我扩增还是分化成身体所需的特化细胞类型则需要一个精妙的控制系统。新的研究显示干细胞变成一个神经元的决定是由附近星形细胞分泌的Wnt3信号分子控制的。Wnt3是星形细胞分泌出的“劝诱”信号分子。Wnt蛋白形成了一个在许多类型的干细胞中控制细胞扩增和命运抉择的高度保守的信号分子家族。研究人员使用基因疗法中的分子工具抑制了小鼠大脑中的Wnt3。当添加另外的Wnt3时，神经元的数量增加了。这种增加证明Wnt信号在活性状态下确实起到重要的作用。
既然很多疾病的发生和发展与Wnt及其调控异常相关，那么对某些疾病进行治疗性干预是合乎逻辑的。相关的动物实验也表明，对Wnt的封闭或者活性部位的突变于胚胎发育、肿瘤、神经系统异常等方面的改变，不过到目前为止，尚未见到有关该基因或其表达蛋白用于治疗的报导，或者是对该通路的调控进行干预用于治疗的例子。因此，Wnt信号转导及其调控机理研究对于今后很多疾病的治疗具有重要意义。

发明内容
人基因组学研究目前是国际上的热点，除大规模测序的方法外，还缺少从功能研究开始的高通量筛选具有一定功能的基因的方法。针对这种现状及现有药物或试剂的不足，本发明的目的是提供一类新的编码具有抑制Wnt活化功能的人蛋白的多核苷酸WntIF1、2、3、4、5、6、7、8。
本发明的另一目的是提供这类多核苷酸所编码的多肽。
本发明的另一目的是提供含有这类多核苷酸的载体，和这类多核苷酸及其载体转化或转导的宿主细胞。
本发明的另一目的是提供这类多核苷酸所编码的多肽的抗体和用于检测的核酸分子。
本发明的另一目的是提供这类新的多核苷酸在宿主细胞中外源表达抑制Wnt活化的应用。
本发明的另一目的是提供生产这些多核苷酸和其编码的多肽的方法以及该多核苷酸及其编码的多肽的用途。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案在本发明的第一方面，提供新颖的分离的多核苷酸，它包含编码具有抑制Wnt活化的功能的蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列选自(a)与编码含有SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ IDNO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16的氨基酸序列的多肽的多核苷酸有至少70％相似性的多核苷酸；(b)编码含有与SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16的氨基酸序列有至少70％相似性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸(c)与(a)或(b)的多核苷酸互补的多核苷酸。
较佳地，该多核苷酸编码的多肽具有选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16。
较佳地，该多核苷酸的序列与选自下组的核苷酸序列有至少85％相似性(a)SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15的编码区序列或全长序列；(b)在遗传密码简并范围内相应于(a)中提到的序列的至少一个序列；(c)与(a)或(b)中提到的序列互补的序列杂交的至少一个序列。
更佳地，该多核苷酸的序列选自SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15的编码区序列或全长序列。
在本发明的第二方面，提供了上述核苷酸所编码的多肽，它包含具有选自下组中的氨基酸序列的多肽SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16；或与以上任一氨基酸序列具有至少90％以上相似性的多肽，或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
较佳地，该多肽是具有选自下组的氨基酸序列的多肽SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、 SEQ IDNO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16。
在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞，还提供了被上述多核苷酸转化或转导的宿主细胞。
在本发明的第四方面，提供了与上述多肽特异性结合的抗体，还提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述任一多核苷酸中8-100个连续的核苷酸。
在本发明的第五方面，提供了上述多核苷酸在宿主细胞中外源表达抑制Wnt活化的应用。
在本发明的第六方面，提供了上述多核苷酸和多肽在制备预防和/或治疗神经系统的疾病或肿瘤的药物中的用途。
在本发明地第七方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明中的具有抑制Wnt活化功能的多肽及药学上可接受的载体。
在本发明的第八方面，提供了一种神经系统疾病或肿瘤的体外检测方法，利用上述抗体或核酸片段来检测宿主样品中的多肽的存在或水平。
本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域技术人员而言是显而易见的。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如果从天然状态中与共同存在的其他物质分开，则为分离纯化的。这样的多核苷酸可能是某一载体的一部分，也可能这样的多核苷酸或多肽是某一组合物的一部分，既然载体或组合物不是它们的天然环境的成分，这些多核苷酸或多肽仍然是分离的。
如本文所用，“相似性”是指核苷酸或多肽序列比对过程中用来描述检测序列和目标序列之间相同DNA碱基或氨基酸残基顺序所占比例的高低，是一种直接的数量关系，通过部分相同或相似的百分比来度量核苷酸序列或者多肽序列之间相似的程度，此相似性百分比可以通过本领域已有的比对方法来计算，例子有两两序列间的比对方法FASTA程序(Pearson，W.R.and Lipman，D.J.1988.Improved tools for biological sequence comparison.Proc.Natl.Acad.Sci.852444-2448)，BLAST程序(Altschul，S.F.，et al.1990 Basic local alignment search tool.J.Mol.Biol.215403-410)等，或多序列比对方法CLUSTAL W(CORPET，F.1998 Multiple sequencealignment with hierarchical clustering.Nucleic Acids Res.，1610881-10890)等。同源序列是指从某一共同祖先经趋异进化而形成的不同序列，根据相似性百分比可以判断比对序列间的同源性。当基因或蛋白质间相似程度很高时，表示它们具有一段共同的进化历程，从而判断它们会具有相似的生物学功能。当具有至少50％的相似程度时，比较容易推测检测序列和目标序列可能是同源序列。较佳地，具有至少70％的相似程度；更佳地，具有至少85％的相似程度；最佳地，具有至少90％的相似程度。而当相似性程度低于20％时，就难以确定或者根本无法确定其是否具有同源性。
本发明的多核苷酸包括其互补链可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。如本文所用，“编码具有诱导细胞凋亡功能的多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码序列和/或非编码序列的多核苷酸。以WntIF1所编码的多肽为例，编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO1所示的编码区序列相同或者是遗传密码简并的变异体。如本文所用，“遗传密码简并”是指一个氨基酸有几个密码子的现象。例如在本发明中WntIF1所编码的多肽的遗传密码简并的变异体指编码具有SEQ ID NO2的多肽的核苷酸，且此核苷酸与SEQ IDNO1所示的编码区序列有差别。对于其他具有抑制Wnt活化功能的多肽，可依此类推。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，它编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。该多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与本发明所述多核苷酸序列的互补序列杂交且两个序列间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与此多核苷酸序列的互补序列可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在95％以上，更好的是在97％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与本发明所述的多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明的多核苷酸序列能用本领域已有的方法获得。这些技术包括但不局限于(1)通过杂交技术分离DNA序列；(2)人工化学合成DNA序列；(3)通过构建cDNA文库大规模获得所需的多核苷酸；(4)PCR扩增技术。
第一种方法是先构建基因组文库或者cDNA文库，然后通过分子杂交等技术从基因组文库或cDNA文库中筛选出目的基因或序列。当生物基因组比较小时，此方法较易成功；当生物基因组很大时，构建其完整的基因组文库较困难，再从庞大的文库中去克隆目的基因的工程量也很大。
第二种方法是按设计好的序列一次合成100-200bp长的DNA片段，再用这些合成的片段组合连接成完整的基因。这种合成长的基因序列的方法的价格十分昂贵。此方法主要用于合成作为引物、接头等的核酸片段。
第三种方法是用本领域通常的方法构建cDNA文库，多次测序后，结合生物信息学分析技术(Ota et al.Nat Genet.2004 Jan；36(1)40-5)，大规模获得目的cDNA克隆。生物信息学分析技术包括但不限于用BLAST或BLAT与已有的公共数据库比对，如refseq数据库等；用Phred算法评估测序质量；用计算转录起始密码子ATG的出现概率的ATGpr算法筛选全长cDNA序列等。
第四种方法用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。本发明优选应用的方法是两步法通量化RT-PCR技术在混合cDNA文库中扩增得到大量的cDNA克隆。混合cDNA文库包括现有的cDNA文库和肿瘤文库。
本发明的基因，或者各种DNA片段等核苷酸序列的测定可用常规方法，如双脱氧链终止法(Sanger et al.PNAS，1977，745463-5467)；也可用商业测序试剂盒等。为了获得全长的cDNA序列，测序需要反复进行。有时需要测定多个克隆的cDNA序列，才能拼接成全长的cDNA序列。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。本发明的多肽可以是糖基化的，也可以是非糖基化的。本发明的多肽可以包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括具有抑制Wnt活化功能的多核苷酸编码的人蛋白多肽的片段、衍生物和类似物。术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持与本发明的天然具有抑制Wnt活化功能的人蛋白多肽相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物和类似物可以是(a)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优先保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(b)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(c)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物)融合所形成的多肽，或(d)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列)。
本发明的多肽可以通过常规的重组DNA技术，利用本发明的多核苷酸序列来表达或生产重组的具有抑制Wnt活化功能的蛋白多肽(Science，1984；2241431)。包括以下步骤(1)用本发明的多核苷酸(或其变异体)，或用含有此多核苷酸的表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2)在合适的培养基中培养步骤(1)得到的宿主细胞；(3)从培养基或细胞中分离、纯化所需的蛋白多肽。
本发明中的多核苷酸和多肽优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
本发明也涉及包含本发明所述多核苷酸的载体。本发明中，编码具有抑制Wnt活化功能的人蛋白多肽的多核苷酸序列可以插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒，如腺病毒、逆转录病毒，或者其他载体。在本发明中适用的载体可以是原核表达载体，也可以是真核表达载体，如在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)，在哺乳动物细胞中高表达的真核表达载体pcDNATM3.1/myc-hisB(-)(Invitrogen)，pcDNA3.1/V5-His-TOPO(Invitrogen，以下缩写为pcDT)。本发明优选pcDT，它可以直接与PCR产物连接来构建真核表达载体，大大提高了规模化生产的效率。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以应用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。用本领域的技术人员熟知的方法来构建含有本发明所述多核苷酸序列和转录/翻译控制信号的表达载体即可。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组DNA技术等(Sambrook，et al.MolecularCloning，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。
本发明的多核苷酸序列可有效地连接到表达载体中的适当的启动子上来指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体的PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体优选的包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性、或真核细胞培养用的绿色荧光蛋白(GFP)、新霉素抗性及二氢叶酸还原酶。
本发明还涉及用上述载体或者本发明的多核苷酸经基因工程产生的宿主细胞。本发明的载体和多核苷酸可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达具有抑制Wnt活化功能的蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞；293T、Hela细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常有10-300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。例子有在复制起始点下游的100-270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点下游的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域的普通技术人员都知道如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主细胞为原核细胞如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收集，用CaCl2法处理，所用步骤是本领域众所周知的。可供选择的是MgCl2处理，也可用电穿孔的方法处理。当宿主是真核细胞时，可选择以下转染方法磷酸钙共沉淀法、常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。获得的转化子可以用常规方法培养，来表达本发明的多核苷酸所编码的多肽。根据所选的宿主细胞选择合适的常规培养基，在适于宿主细胞生长的条件下培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用适当的方法如温度转化或化学诱导，来诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
上述方法中的重组多肽可包被于细胞内、细胞外或在细胞膜上表达或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其他特性通过各种分离方法分离和纯化重组多肽。这些方法是本领域技术人员所熟知的，如常规的复性处理，用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声波处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析和其它各种液相层析技术或这些方法的结合。
本发明还涉及与本发明多核苷酸的任何一部分同源的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含有15个核苷酸，较好的是至少30个核苷酸，更好的是至少50个核苷酸，最好的是至少100个核苷酸。此核酸片段通常是在本发明的核苷酸序列信息的基础上化学合成的DNA序列。上述核酸片段可以用于PCR扩增技术(如作为引物)以确定和/或分离编码具有抑制Wnt活化功能的多核苷酸；也可以作为杂交所用的探针。也可以用于RNA干扰技术。本发明的多核苷酸的一部分或全部也可作为探针固定在微阵列(Microarray)或DNA芯片上，用于分析组织中基因的差异表达和基因诊断。探针的标记可用放射性同位素，荧光素或酶(如碱性磷酸酶)等。
本发明的多肽可以直接作为药物治疗疾病，如神经系统疾病和肿瘤等；还可用于筛选促进或对抗具有抑制Wnt活化的功能的蛋白的抗体、多肽或其它配体，例如，筛选可用于促进或抑制本发明的蛋白的功能的抗体。用表达的重组的本发明的蛋白来筛选多肽库，用于寻找有治疗价值的能够促进或抑制本发明的蛋白的功能的多肽分子。
本发明的多肽可以单独使用或者与合适的药物载体组合后使用。组合物包含安全有效量的多肽或拮抗剂及不影响药物效果的载体和赋型剂。这些载体可以是水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲液、甘油及它们的组合。药物组合物可以以方便的方式给药，如通过局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内或皮内的给药途径。给药于患者的用量取决于许多因素，如给药方式、待治疗者的健康条件和诊断医生的判断。
本发明的多肽也可以通过在活体表达这些多肽来使用。例如患者的细胞可以通过在体外用编码本发明多肽的基因进行基因工程操作，然后将工程细胞提供给患者，使工程细胞在体内高表达这种多肽，从而达到治疗的目的。
具有抑制Wnt活化功能的人蛋白的多核苷酸也可用于多种治疗目的。可用在基因治疗技术中来治疗由于具有抑制Wnt活化的功能的人蛋白表达异常或活性异常导致的疾病。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成表达变异的具有抑制Wnt活化的功能的人蛋白，来抑制内源性的具有抑制Wnt活化功能的人蛋白的活性。重组的具有抑制Wnt活化功能的人蛋白基因也可包装到脂质体中转移至细胞内。
抑制本发明多肽mRNA的寡聚核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酸也在本发明的范围之内。反义RNA和DNA以及核酸可用本领域已有的方法合成。为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰，如增加两侧的序列长度，核糖核苷间的连接用磷酸硫酯键或肽键。
本发明的多肽及其片段、衍生物、类似物或表达它们的细胞可以作为抗原来生产抗体。这些抗体包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和Fab表达文库产生的抗体。本发明的多肽的抗体可用本领域公知的抗体制备方法来生产。例子有单克隆抗体可用杂交瘤技术生产(Kohler and Milstein.Nature，1975，256495-497)。多克隆抗体的生产可用本发明的多肽免疫动物，如家兔、小鼠、大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂。将人恒定区和非人源的可变区结合的嵌合抗体可用已有的技术产生(Morrison etal.PNAS，1985，816851)。单链抗体也可用已有的技术生产(U.S.Pat No.4946778)。
本发明的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活体标本中的具有诱导细胞凋亡功能的蛋白。还可以在临床上用于与具有诱导细胞凋亡功能的人蛋白相关的疾病的临床诊断、治疗、疗效评价等。例如用放射性同位素标记与本发明的多肽结合的单克隆抗体，然后注入体内跟踪其位置和分布，可以作为一种非创伤性诊断方法来定位肿瘤细胞，或判断肿瘤细胞是否转移。本发明中的抗体还可以用于治疗或预防与具有抑制Wnt活化功能的人蛋白相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断具有抑制Wnt活化功能的人蛋白的产生或活性。
本发明还涉及定量和定位检测具有抑制Wnt活化功能的蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。实验中检测的具有抑制Wnt活化功能的蛋白水平，可以用作解释具有抑制Wnt活化功能的蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断具有抑制Wnt活化功能的蛋白起作用的疾病。
具有抑制Wnt活化功能的蛋白的多核苷酸可用于具有抑制Wnt活化功能的蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，具有抑制Wnt活化功能的蛋白的多核苷酸可用于检测具有抑制Wnt活化功能的蛋白的表达与否，或在疾病状态下具有抑制Wnt活化功能的蛋白的异常表达。如具有抑制Wnt活化功能的蛋白的DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断具有抑制Wnt活化功能的蛋白的表达异常。杂交技术是本领域已公开的成熟技术，包括Southern印迹法、Northern印迹法、原位杂交等，相关的试剂盒可以从商业途径获得。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(Microarray)或DNA芯片上，用于分析组织中基因的差异表达和基因诊断。用具有抑制Wnt活化功能的蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链式反应(RT-PCR)体外扩增也可以检测具有抑制Wnt活化功能的蛋白的转录产物。
检测具有抑制Wnt活化功能的蛋白基因的突变也可用于诊断具有抑制Wnt活化功能的蛋白相关的疾病。具有抑制Wnt活化功能的蛋白基因的突变形式包括与正常野生型的具有抑制Wnt活化功能的蛋白的DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用本领域已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Westen印迹法可间接判断基因有无突变。
基因WntIF1、2、3、4、5、6、7、8在实验中所有用到的正常组织、胎儿组织、肿瘤组织中都有表达，说明其为人体自身重要的Wnt影响因子；在不同的组织中表达量高低有差别，说明其在不同的组织中发挥功能的程度不同。
以下对本发明的实施方案进一步详细说明。
本发明通过对NCBI的refseq数据库进行人功能未知预测基因检索，获得人未知功能基因序列，进一步利用Human_est数据库通过BLASTn方法进行序列校正，根据校正后得到的序列设计基因特异引物，从混合人组织cDNA文库中通过两步法通量化RT-PCR技术扩增得到目的基因的编码区cDNA片段。此编码区cDNA片段与pcDT重组构建真核表达载体。然后采用双荧光素酶报告基因法检测WntIF1、2、3、4、5、6、7、8基因对Wnt的影响。该方法采用的是体内信号转导途径顺式报导系统，其中所用的Wnt-luc报告质粒载有萤火虫荧光素酶基因，该基因的表达由合成的启动子所调控，其中包含基本的启动子元件(TATA box)，以及转录因子Wnt的结合位点，Wnt-luc报告质粒的结构图如图2所示。当细胞内的Wnt通过某种信号转导途径而被活化时，Wnt便会结合于报告质粒Wnt-luc的增强子元件，从而启动报告基因萤火虫荧光素酶基因的转录，进一步胞内翻译成荧光素酶，导致细胞内荧光素酶数量增加，活性增强；相反，当细胞内的Wnt活化受到抑制的时候，荧光素酶的表达量及活性就低。所以，通过检测荧光素酶的活性，便可以反映不同刺激物以及共转染的目的基因对细胞内Wnt是否具有促进活化或者抑制活化的功能。pRL-SV40报告质粒载体如图2所示，含有水母荧光素酶基因，该基因的表达由猿猴病毒40(SV40)增强子/启动子所调控，转染哺乳动物细胞后可以产生较强的基本水平的水母荧光素酶的表达，且表达的活性不受Wnt活化与否的调节，所以在实验中用作内对照报告基因。实验表明本发明的多肽具有显著、稳定的抑制Wnt活化的作用。
由于采用了以上技术方案，本发明具有如下优点1、提供了规模化克隆和筛选新基因的技术平台。
2、提供了人类新功能基因WntIF1、2、3、4、5、6、7、8的cDNA序列及其编码多肽；3、首次发现人类新功能基因WntIF1、2、3、4、5、6、7、8具有抑制Wnt活化的作用，并且高效、稳定；4、WntIF1、2、3、4、5、6、7、8在机体多数正常细胞表达，说明其为自身重要的Wnt调控分子。
5、基于上述的4个优点，本发明为进一步研究WntIF1、2、3、4、5、6、7、8与Wnt之间的调控关系，以及开发治疗与神经系统相关疾病或肿瘤的新药物，为开创新的临床诊断、疗效评价及预后指标奠定必要的基础。


图1、真核表达载体pcDT-WntIFx的构建示意图(x选自1、2、3、4、5、6、7、8之一)。
图2、pWnt-luc荧光素酶基因报告质粒的结构图(2A)和pRL-TK报告质粒结构图(2B)。
图3、WntIF1、2、3、4、5、6、7、8外源表达抑制氯化锂对Wnt的活化具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。这些实施例和附图仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验指南》(2002年第三版[美]萨姆布鲁克等箸，科学出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、两步法通量化RT-PCR技术扩增目的基因(1)对NCBI的refseq数据库进行人功能未知预测基因检索，获得人未知功能基因序列，并利用Human_est数据库通过BLASTn方法进行序列校正，最终得到的序列设定为下组序列SEQID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15。根据此类序列设计基因WntIF1、2、3、4、5、6、7、8的特异引物

(2)用上述引物，按目的基因的表达谱在现有的cDNA文库和肿瘤文库中选择模板，进行初扩。现有的文库包括12种人体正常组织(心、胰、睾丸、卵巢、前列腺、结肠、小肠、骨骼肌、胸腺、淋巴结、扁桃体、白细胞)；6种人肿瘤组织(肺癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌)；和8种胎儿组积(胎肺、胎心、胎肝、胎脾、胎肾、胎脑、胎骨骼肌、胎胸腺)的cDNA文库(Clonetch，K1420-1，1241-1)。初扩反应条件如下
50μlPCR反应

PCR延伸时间根据所扩目的基因的最长片段，按50sec/Kb的原则进行扩增

初扩产物纯化到30μl，以去除PCR反应体系中大量的引物及dNTPs等，并浓缩整个体系，得到对应目的基因序列的二级扩增库，作为二扩(大扩)的模板。
(3)将(2)中的纯化产物作为模板，分别对每个目的基因进行二扩，反应条件如下50μlPCR(每个基因)反应

PCR延伸时间根据所扩目的基因的最长片段，按50sec/Kb的原则进行扩增

得到的PCR产物取10μl上样电泳，挑选有扩增条带的PCR产物，进行等体积纯化(40μl)。通过两步PCR反应扩增出非单一条带的基因用Qiagen胶回收试剂盒切胶回收目的片段。扩增的结果表明，这些组织的细胞中都存在基因WntIF1、2、3、4、5、6、7、8的cDNA，说明WntIF1、2、3、4、5、6、7、8在这些组织的细胞中都产生了基因WntIF1、2、3、4、5、6、7、8的转录产物，有较广的表达图谱，在多种组织中参与转录因子的调节。
实施例2、目的基因真核表达载体的构建将二扩纯化产物和真核表达载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO(Invitrogen，缩写为pcDT)，按照试剂盒制造厂商建议的条件进行连接反应。连接产物电击法转化大肠杆菌DH5α，转化物在含氨苄青霉素的固体LB平板培养基上生长，挑选生长的单一克隆菌落，提取质粒，用EcoRI酶切，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定，挑选有插入片段的阳性克隆，通过测序(ABI PRISM 3700 DNA分析仪)选出正确的正向插入克隆，各自命名为pcDT-WntIF1、2、3、4、5、6、7、8。
同时收集培养液，用SDS-PAGE分析沉淀蛋白，获得WntIF1、2、3、4、5、6、7、8多肽。
WntIF1、2、3、4、5、6、7、8蛋白分析结果显示WntIF1、2、3、4、5、6、7、8蛋白序列如下组序列SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO10、SEQID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16所示。
实施例3、双荧光素酶报告基因法测定目的基因对氯化锂诱导Wnt活化的抑制作用。
用目的基因和报告基因pWnt-luc，pRL-TK共转染人胚胎肾293T细胞，通过分别检测两种荧光素酶活性来测定Wnt的活性。共转染的方法为阳离子非脂性转染法，采用威格拉斯生物技术(北京)有限公司，按产品说明书所述进行。
转染操作步骤如下(1)细胞培养将293T细胞(ATCC NumberCRL-11268)(2.0×104)用含10％胎牛血清的DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)培养基(Hyclone，SH0022.02)铺在96孔细胞培养板(Costar，3599)上，接种密度1.2万/孔，培养基体积100ul/孔，在5％CO2，37℃的培养箱中培养18-24小时。
(2)制备转染复合物取2.5μl生理盐水稀释40ng报告基因pWnt-luc，4ng pRL-TK和50ng目的质粒，缓慢混合均匀；同样用2.5μl生理盐水稀释适当量的vigofect(一般为0.04μl/孔)，缓慢混合均匀，在室温下放置5分钟，与稀释的DNA缓慢混合，室温放置15分钟，以形成转染复合物。
(3)转染将转染复合物缓慢滴入细胞培养板(5μl/孔)，轻微摇匀。5％CO2，37℃的培养箱中培养18-24小时。
转染18-24小时后用氯化锂(1mM，2μl/孔)刺激细胞，37℃孵箱培养。6-8小时后弃去培养液，加入Passive Lysis Buffer(Promega，E1960)，放入-80℃冰箱。检测时，取出细胞板，室温下自然解冻，使细胞完全裂解，10μl细胞裂解液移至白色荧光板，加入Dual-luciferase双报告系统检测底物，用微孔板酶标仪(Genios Pro，Tecan)检测荧光素酶活性。
设定转染pcDB空载体、氯化锂刺激时细胞内的荧光素酶活性比值(萤火虫荧光素酶荧光强度/水母荧光素酶荧光强度表示)为1，其他条件下细胞内的荧光素酶活性比值以此为标准，用相对值表示。结果参照图3，分别用待检质粒和pWnt-luc共转染293T细胞，用氯化锂刺激的293T细胞中荧光素酶的活性明显地下调，表明WntIF1、2、3、4、5在293T细胞中的表达产物对氯化锂诱导Wnt活化有强的抑制作用。
根据以上实验结果可以确定，当Wnt表达水平的上调引起与某些疾病相关基因的转录表达相应增加时，WntIF1、2、3、4、5、6、7、8对Wnt活化的抑制作用可以阻止该疾病的发生和发展。因此，本发明可以用于制备预防和治疗由于Wnt过表达而引起的神经系统疾病或肿瘤的药物。
实施例4、抗体制备抗原选用原核细胞或真核细胞表达的WntIF1、2、3、4、5、6、7、8蛋白全长或部分肽段，也可以合成多肽作为抗原。
多克隆抗体的制备免疫动物选用成年雄性新西兰兔或BALb/c小鼠，初次免疫用200ug(新西兰兔)或20ug(BALb/c小鼠)抗原与等体积弗氏完全佐剂(FCA)充分乳化后，于背部皮下多点注射。初次免疫后21、42、63天，用弗氏不完全佐剂(FIA)完全乳化的抗原蛋白，各加强免疫1次，用量同前。每次免疫后7~10天，ELISA方法检测血清效价，达到1×10-4时，放血分离血清.Western blot鉴定抗体特异性。
单克隆抗体制备免疫BALb/c小鼠同前，取脾脏制成B细胞悬液，与对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0融合，通过HAT(H次黄嘌呤；A氨基喋呤；T胸腺嘧啶核苷)选择性培养，获得杂交细胞系，再通过ELISA方法检测抗体效价，筛选出特定的杂交瘤细胞系，并得到单克隆抗体。
序列表<110>北京诺赛基因组研究中心有限公司<120>抑制Wnt活化的多核苷酸及其编码多肽和用途<130>
<160>16<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1242<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(176)..(1105)<400>1cgtgagtgcc gctgacagaa gtcaagagaa tcggctggga cggggttggg gcgacaacgg 60gccggggggg acccgacagg ccagagcccc ttggggagga gcggcggctg gaggcgcgag120gctcctccgg atgcccggag agccgcttgc gacttaactc ccgcctcttt cccag atg 178Met1ccg cgt cac tgc tcc gcc gcc ggc tgc tgc aca cgg gac acg cgc gag 226Pro Arg His Cys Ser Ala Ala Gly Cys Cys Thr Arg Asp Thr Arg Glu5 10 15acg cgc aac cgc ggc atc tcc ttc cac aga ctt ccc aag aag gac aac 274
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<221>CDS<222>(97)..(921)<400>5cactggggat ttaaagagct gccacttcct taggcctcca gagggcactg ggaagtcaca 60gctgctgagg gaccactctg ctcccccgcc taagcc atg cac ctc tgt ggg ggc 114Met His Leu Cys Gly Gly1 5aat ggg ctg ctg acc cag aca gac ccc aag gag caa caa agg cag ctg 162Asn Gly Leu Leu Thr Gln Thr Asp Pro Lys Glu Gln Gln Arg Gln Leu10 15 20aag aag cag aag aac cgg gca gcc gcc cag cga agc cgg cag aag cac 210Lys Lys Gln Lys Asn Arg Ala Ala Ala Gln Arg Ser Arg Gln Lys His25 30 35
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tcc agc ctg cag ggg tct tcc tct aag ctc agt gcc ctc cag ccc agc 690Ser Ser Leu Gln Gly Ser Ser Ser Lys Leu Ser Ala Leu Gln Pro Ser185 190 195ctc acg gcc caa act gcc cct cca cag ccc ctc gag ctg gag cat ccc 738Leu Thr Ala Gln Thr Ala Pro Pro Gln Pro Leu Glu Leu Glu His Pro200 205 210acc aga ggg aag ctg ggg tcc tct ccc gac aac cct tcc tct gcc ctg 786Thr Arg Gly Lys Leu Gly Ser Ser Pro Asp Asn Pro Ser Ser Ala Leu215 220 225 230ggg ctt gca cgt ctg cag agc agg gag cac aaa cct gct ctc tca gca 834Gly Leu Ala Arg Leu Gln Ser Arg Glu His Lys Pro Ala Leu Ser Ala235 240 245gcc act tgg caa ggg ctg gtt gtg gat ccc agc cct cac cct ctc ctg 882Ala Thr Trp Gln Gly Leu Val Val Asp Pro Ser Pro His Pro Leu Leu250 255 260gcc ttt cct ctg ctc tcc tct gct caa gtc cac ttc taa cctggtcttc 931Ala Phe Pro Leu Leu Ser Ser Ala Gln Val His Phe265 270ggagctgggt tggccccttc tttgggctca ggaagcagcc ttagcacacg ggcctctcct991ccctcactac tgggtgctgc cctgcgtggc tgaccagctg gcccaggatt tcacagtcga 1051aaaggaagcc accactgatg cctcccactg tgacaggccc tgtcaccacc aatat1106<210>6<211>274<212>PRT<213>人
<400> 6Met His Leu Cys Gly Gly Asn Gly Leu Leu Thr Gln Thr Asp Pro Lys1 5 10 15Glu Gln Gln Arg Gln Leu Lys Lys Gln Lys Asn Arg Ala Ala Ala Gln20 25 30Arg Ser Arg Gln Lys His Thr Asp Lys Ala Asp Ala Leu His Gln Gln35 40 45His Glu Ser Leu Glu Lys Asp Asn Leu Ala Leu Arg Lys Glu Ile Gln50 55 60Ser Leu Gln Ala Glu Leu Ala Trp Trp Ser Arg Thr Leu His Val His65 70 75 80Glu Arg Leu Cys Pro Met Asp Cys Ala Ser Cys Ser Ala Pro Gly Leu85 90 95Leu Gly Cys Trp Asp Gln Ala Glu Gly Leu Leu Gly Pro Gly Pro Gln100 105 110Gly Gln His Gly Cys Arg Glu Gln Leu Glu Leu Phe Gln Thr Pro Gly115 120 125Ser Cys Tyr Pro Ala Gln Pro Leu Ser Pro Gly Pro Gln Pro His Asp
130 135 140Ser Pro Ser Leu Leu Gln Cys Pro Leu Pro Ser Leu Ser Leu Gly Pro145 150 155 160Ala Val Val Ala Glu Pro Pro Val Gln Leu Ser Pro Ser Pro Leu Leu165 170 175Phe Ala Ser His Thr Gly Ser Ser Leu Gln Gly Ser Ser Ser Lys Leu180 185 190Ser Ala Leu Gln Pro Ser Leu Thr Ala Gln Thr Ala Pro Pro Gln Pro195 200 205Leu Glu Leu Glu His Pro Thr Arg Gly Lys Leu Gly Ser Ser Pro Asp210 215 220Asn Pro Ser Ser Ala Leu Gly Leu Ala Arg Leu Gln Ser Arg Glu His225 230 235 240Lys Pro Ala Leu Ser Ala Ala Thr Trp Gln Gly Leu Val Val Asp Pro245 250 255Ser Pro His Pro Leu Leu Ala Phe Pro Leu Leu Ser Ser Ala Gln Val260 265 270His Phe
<210>7<211>1036<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(131).. (661)<400>7agcggagtcc cacccgggag ccggcaggga gcggagctgc ggagccgcct ggtctcccgc 60gtccatcggt ccattcctgc gtcgttctgt ccttccgaac gcacacttca ggagcagccg 120cgagggtggc atg gca gcg agc aca gac atg gct ggg ctg gag gag agc169Met Ala Ala Ser Thr Asp Met Ala Gly Leu Glu Glu Ser1 5 10ttc cgc aag ttt gcc atc cat ggt gac ccc aag gcc agt ggg caa gag 217Phe Arg Lys Phe Ala Ile His Gly Asp Pro Lys Ala Ser Gly Gln Glu15 20 25atg aat ggc aag aac tgg gcc aag ctg tgc aag gac tgc aag gtg gct 265Met Asn Gly Lys Asn Trp Ala Lys Leu Cys Lys Asp Cys Lys Val Ala30 35 40 45gac gga aag tcc gtg aca ggg acc gat gtg gac atc gtc ttc tcc aaa 313Asp Gly Lys Ser Val Thr Gly Thr Asp Val Asp Ile Val Phe Ser Lys50 55 60gtc aag ggg aag tct gct cgg gtc atc aac tat gag gag ttc aag aag 361Val Lys Gly Lys Ser Ala Arg Val Ile Asn Tyr Glu Glu Phe Lys Lys
65 70 75gcc ctg gaa gag ctg gcg acc aag aga ttc aag ggg aag agc aag gag 409Ala Leu Glu Glu Leu Ala Thr Lys Arg Phe Lys Gly Lys Ser Lys Glu80 85 90gag gcc ttc gat gcc atc tgc cag ctg gtg gca ggc aaa gag cca gcc 457Glu Ala Phe Asp Ala Ile Cys Gln Leu Val Ala Gly Lys Glu Pro Ala95 100 105aat gtg ggc gtc act aaa gca aaa aca ggg ggt gct gta gac cgg ctg 505Asn Val Gly ValThr Lys Ala Lys Thr Gly Gly Ala Val Asp Arg Leu110115 120 125acg gac acc agc aga tac acg ggc tcc cac aag gag cgc ttc gat gag 553Thr Asp Thr Ser Arg Tyr Thr Gly Ser His Lys Glu Arg Phe Asp Glu130 135 140agc ggc aag ggc aag ggc att gcg gga cgg cag gac atc ctg gac gac 601Ser Gly Lys Gly Lys Gly Ile Ala Gly Arg Gln Asp Ile Leu Asp Asp145 150 155agt ggc tac gtg agc gcc tac aag aat gca ggc acc tac gat gcc aag 649Ser Gly Tyr Val Ser Ala Tyr Lys Asn Ala Gly Thr Tyr Asp Ala Lys160 165 170gtg aag aag tga ggcttgggaa gaccgccctg ccaagtgcgg ctgcccctgc 701Val Lys Lys175cagaggctca ggcctgggtc taaggggcac gtggagcaag agatcctggt cccctccctg 761ctggacctgc cacccagagc ttcctgccta gtcccactgg gctggcccac caggcctctg 821acccaggctg ctctgcggcc ccttcctcct cctcttcctg ctccaacttc tgtccacctg 881
gggacagtct gtgcctgtag cctcatgacc ccaacccagc cccaggcatg gctaacccct 941gactgcttgc ctcatattta agctgctgct ctggccaagt gcctaatttt aacccagacc 1001tcaataaaga caccttttgt accaaaaaaa aaaaa1036<210>8<211>176<212>PRT<213>人<400>8Met Ala Ala Ser Thr Asp Met Ala Gly Leu Glu Glu Ser Phe Arg Lys1 5 10 15Phe Ala Ile His Gly Asp Pro Lys Ala Ser Gly Gln Glu Met Asn Gly20 25 30Lys Asn Trp Ala Lys Leu Cys Lys Asp Cys Lys Val Ala Asp Gly Lys35 40 45Ser Val Thr Gly Thr Asp Val Asp Ile Val Phe Ser Lys Val Lys Gly50 55 60Lys Ser Ala Arg Val Ile Asn Tyr Glu Glu Phe Lys Lys Ala Leu Glu65 70 75 80Glu Leu Ala Thr Lys Arg Phe Lys Gly Lys Ser Lys Glu Glu Ala Phe85 90 95
Asp Ala Ile Cys Gln Leu Val Ala Gly Lys Glu Pro Ala Asn Val Gly100 105 110Val Thr Lys Ala Lys Thr Gly Gly Ala Val Asp Arg Leu Thr Asp Thr115 120 125Ser Arg Tyr Thr Gly Ser His Lys Glu Arg Phe Asp Glu Ser Gly Lys130 135 140Gly Lys Gly Ile Ala Gly Arg Gln Asp Ile Leu Asp Asp Ser Gly Tyr145 150 155 160Val Ser Ala Tyr Lys Asn Ala Gly Thr Tyr Asp Ala Lys Val Lys Lys165 170 175<210>9<211>1422<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(363).. (1091)<400>9cagaaagcga ccttgccccc gccaaggtgc ggcggggccg ggcgggggcg gggacccggg 60gcccacgggg cgagtgactg ctgcccttcc gcgcagtgag ccatcactac ggatacgggc 120
tgctggacgc cgggctgctg gtggacaccg cccgcacctg gctgcccacc cagccgcaga 180ggaagtgcgc cgtccgggtc cagagccgcc ccacccccat cctgccgctg atctacatca 240gggaaaacgt atcggcctgc gccggcctcc acaactccat ccgctcgctg gagcacgtgc 300aggcgcagct gacgctgtcc tacagccggc gcggagacct ggagatctcg ctcaccagcc 360cc atg ggc acg cgc tcc aca ctc gtg gcc ata cga ccc ttg gac gtc407Met Gly Thr Arg Ser Thr Leu Val Ala Ile Arg Pro Leu Asp Val1 5 10 15agc act gaa ggc tac aac aac tgg gtc ttc atg tcc acc cacttc tgg455Ser Thr Glu Gly Tyr Asn Asn Trp Val Phe Met Ser Thr His Phe Trp20 25 30gat gag aac cca cag ggc gtg tgg acc ctg ggc cta gag aac aag ggc 503Asp Glu Asn Pro Gln Gly Val Trp Thr Leu Gly Leu Glu Asn Lys Gly35 40 45tac tat ttc aac acg ggg acg ttg tac cgc tac acg ctg ctg ctc tat 551Tyr Tyr Phe Asn Thr Gly Thr Leu Tyr Arg Tyr Thr Leu Leu Leu Tyr50 55 60ggg acg gcc gag gac atg aca gcg cgg cct aca ggc ccc cag gtg acc 599Gly Thr Ala Glu Asp Met Thr Ala Arg Pro Thr Gly Pro Gln Val Thr65 70 75agc agc gcg tgt gtg cag cgg gac aca gag ggg ctg tgc cag gcg tgt 647Ser Ser Ala Cys Val Gln Arg Asp Thr Glu Gly Leu Cys Gln Ala Cys80 85 90 95gac ggc ccc gcc tac atc ctg gga cag ctc tgc ctg gcc tac tgc ccc 695Asp Gly Pro Ala Tyr Ile Leu Gly Gln Leu Cys Leu Ala Tyr Cys Pro100 105 110
ccg cgg ttc ttc aac cac aca agg ctg gtg acc gct ggg cct ggg cac 743Pro Arg Phe Phe Asn His Thr Arg Leu Val Thr Ala Gly Pro Gly His115 120 125acg gcg gcg ccc gcg ctg agg gtc tgc tcc agc tgc cat gcc tcc tgc 791Thr Ala Ala Pro Ala Leu Arg Val Cys Ser Ser Cys His Ala Ser Cys130 135 140tac acc tgc cgc ggc ggc tcc ccg agg gac tgc acc tcc tgt ccc cca 839Tyr Thr Cys Arg Gly Gly Ser Pro Arg Asp Cys Thr Ser Cys Pro Pro145 150 155tcc tcc acg ctg gac cag cag cag ggc tcc tgc atg gga ccc acc acc 887Ser Ser Thr Leu Asp Gln Gln Gln Gly Ser Cys Met Gly Pro Thr Thr160 165 170 175ccc gac agc cgc ccc cgg ctt aga gct gcc gcc tgt ccc cac cac cgc 935Pro Asp Ser Arg Pro Arg Leu Arg Ala Ala Ala Cys Pro His His Arg180 185 190tgc cca gcc tcg gcc atg gtg ctg agc ctc ctg gcc gtg acc ctc gga 983Cys Pro Ala Ser Ala Met Val Leu Ser Leu Leu Ala Val Thr Leu Gly195 200 205ggc ccc gtc ctc tgc ggc atg tcc atg gac ctc cca cta tac gcc tgg 1031Gly Pro Val Leu Cys Gly Met Ser Met Asp Leu Pro Leu Tyr Ala Trp210 215 220ctc tcc cgt gcc agg gcc acc ccc acc aaa ccc cag gtc tgg ctg cca 1079Leu Ser Arg Ala Arg Ala Thr Pro Thr Lys Pro Gln Val Trp Leu Pro225 230 235gct gga acc tga agttgtcagc tcagaaagcg accttgcccc cgcctgggtc 1131Ala Gly Thr240
cctgacaggc actgctgcca tgctgcctcc ccaggctggc cccagaggag cgagcaccag1191cacccgacgc ctggcctgcc agggatgggc cccgtggaac cccgaagcct ggcgggagag1251agagagagag aagtctcctc tgcattttgg gtttgggcgg gagtgggctg gggggagagg1311ctggagcacc ccaaaagcca ggggaaagtg gagggagaga aacgtgacac tgtccgcctc1371gggcaccgcg tccaacctca gagtttgcaa ataaaggttg cttagaaggt g 1422<210>10<211>242<212>PRT<213>人<400>10Met Gly Thr Arg Ser Thr Leu Val Ala Ile Arg Pro Leu Asp Val Ser1 5 10 15Thr Glu Gly Tyr Asn Asn Trp Val Phe Met Ser Thr His Phe Trp Asp20 25 30Glu Asn Pro Gln Gly Val Trp Thr Leu Gly Leu Glu Asn Lys Gly Tyr35 40 45Tyr Phe Asn Thr Gly Thr Leu Tyr Arg Tyr Thr Leu Leu Leu Tyr Gly50 55 60Thr Ala Glu Asp Met Thr Ala Arg Pro Thr Gly Pro Gln Val Thr Ser
65 70 75 80Ser Ala Cys Val Gln Arg Asp Thr Glu Gly Leu Cys Gln Ala Cys Asp85 90 95Gly Pro Ala Tyr Ile Leu Gly Gln Leu Cys Leu Ala Tyr Cys Pro Pro100 105 110Arg Phe Phe Asn His Thr Arg Leu Val Thr Ala Gly Pro Gly His Thr115 120 125Ala Ala Pro Ala Leu Arg Val Cys Ser Ser Cys His Ala Ser Cys Tyr130 135 140Thr Cys Arg Gly Gly Ser Pro Arg Asp Cys Thr Ser Cys Pro Pro Ser145 150 155 160Ser Thr Leu Asp Gln Gln Gln Gly Ser Cys Met Gly Pro Thr Thr Pro165 170 175Asp Ser Arg Pro Arg Leu Arg Ala Ala Ala Cys Pro His His Arg Cys180 185 190Pro Ala Ser Ala Met Val Leu Ser Leu Leu Ala Val Thr Leu Gly Gly195 200 205Pro Val Leu Cys Gly Met Ser Met Asp Leu Pro Leu Tyr Ala Trp Leu
210 215 220Ser Arg Ala Arg Ala Thr Pro Thr Lys Pro Gln Val Trp Leu Pro Ala225 230 235 240Gly Thr<210>11<211>1670<212>DNA<213>人<220>
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acg atg gag aag agc ccc aag agt gaa gtt gtg atc acc aca gtc cct 333Thr Met Glu Lys Ser Pro Lys Ser Glu Val Val Ile Thr Thr Val Pro20 25 30 35ctg gtc agt gag att cag ttg atg gct gct aca ggg ggt acc gag ctc 381Leu Val Ser Glu Ile Gln Leu Met Ala Ala Thr Gly Gly Thr Glu Leu40 45 50tcc tgc tac cgc tgc atc atc ccc ttt gct gtg gtt gtc ttc atc gcc 429Ser Cys Tyr Arg Cys Ile Ile Pro Phe Ala Val Val Val Phe Ile Ala55 60 65ggc atc gtg gtc acc gcg gtg gct tac agc ttc aat tcc cat ggg tct 477Gly Ile Val Val Thr Ala Val Ala Tyr Ser Phe Asn Ser His Gly Ser70 75 80att atc tcc atc ttt ggc ctg gtt gtt ctg tca tct gga ctt ttt tta 525Ile Ile Ser Ile Phe Gly Leu Val Val Leu Ser Ser Gly Leu Phe Leu85 90 95cta gcc tcc agt gcc ttg tgc tgg aaa gtg aga caa agg agc aag aaa 573Leu Ala Ser Ser Ala Leu Cys Trp Lys Val Arg Gln Arg Ser Lys Lys100 105 110 115gcc aag aga cgg gag agt caa aca gct ctc gtg gca aat cag aga agc 621Ala Lys Arg Arg Glu Ser Gln Thr Ala Leu Val Ala Asn Gln Arg Ser120 125 130ttg ttt gct tga gactgaatac gaccaaatgg gccattgggc ctggaaaacg 673Leu Phe Alatgctctgact ttgtcaccca attcacccag aaccatggtg ggagagaaca gacttggcgt 733tggagcagac tggaagaatg ggggtgggag ggtggagggg cttctccttt gtgaggaatg 793
actcatgtct tctttaacga caaacttaac cctaagggct acttctgaga ctgaaaaatc 853agctttctat ttacatgaaa cactttgggg gtcatgggag tgcacagcat tagacagtat 913ttggttcacc ctgtaaagta gccaagaaaa gatgagaaaa atcaagatag gcctggcaca 973ctagacattt gcctccaaaa gaaataacct acagtcttaa gatgtatcat aaaaatgttc 1033tgccaaggat ctaaattacc ttgggtttcg catatgtcta tgaaattctg tgataatttt 1093tttcaataca ttgattcact ggcgtctgtt ttcattttat acttttaata actcatcact 1153ggtggtactt tatcttgaaa agtaatattt tttatatttt aacattggac agtgttagcc 1213agttgtaatg atgtatcaga agtaaagaaa aacccattaa agttatagct aatagatgct 1273gttgggggtt aaattaatag taaaataatc caatatagca cttttgatga tttttatata 1333aaagtcaact gtacatttca ttcagaataa taaatactta ttgctgctaa aacttcttaa 1393atggttgttt ctgctatagt tatttctatt gcagttccaa attgccatct tcccttgtct 1453catttgcaag ttctcaattg tatttctctc aaatggacag gttccttctt tactggagga 1513tttttgtttt tatcatattg gtttttcatt acttctgaat agtcttaatt acgtttacta 1573aattctaaag gatttctgtg ctattataat taggaaatca acgtctttgg tcaggaactt 1633tataatgtgc tattaaatgt atattacatt tttgtgg 1670<210>12<211>134<212>PRT<213>人
<400>12Met Thr Glu Glu Pro Ile Lys Glu Ile Leu Gly Ala Pro Lys Ala His1 5 10 15Met Ala Ala Thr Met Glu Lys Ser Pro Lys Ser Glu Val Val Ile Thr20 25 30Thr Val Pro Leu Val Ser Glu Ile Gln Leu Met Ala Ala Thr Gly Gly35 40 45Thr Glu Leu Ser Cys Tyr Arg Cys Ile Ile Pro Phe Ala Val Val Val50 55 60Phe Ile Ala Gly Ile Val Val Thr Ala Val Ala Tyr Ser Phe Asn Ser65 70 75 80His Gly Ser Ile Ile Ser Ile Phe Gly Leu Val Val Leu Ser Ser Gly85 90 95Leu Phe Leu Leu Ala Ser Ser Ala Leu Cys Trp Lys Val Arg Gln Arg100 105 110Ser Lys Lys Ala Lys Arg Arg Glu Ser Gln Thr Ala Leu Val Ala Asn115 120 125Gln Arg Ser Leu Phe Ala130
<210>13<211>1564<212>DNA<213>人<220>
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gcc aat gta gaa ccc aac caa aca gtg gag atc aat gag caa gaa gca 410Ala Asn Val Glu Pro Asn Gln Thr Val Glu Ile Asn Glu Gln Glu Ala80 85 90ttg gaa gag aaa ttg gaa aat gtg aaa gcc att ctg cag gca tat cat 458Leu Glu Glu Lys Leu Glu Asn Val Lys Ala Ile Leu Gln Ala Tyr His95 100 105ttt aca gaa acc act ccg gat aca tca cca ttc agt ccc agt ctt cat 506Phe Thr Glu Thr Thr Pro Asp Thr Ser Pro Phe Ser Pro Ser Leu His110 115 120 125tcc cct gga aga gat agc tgc aaa ata ttt aca gac caa cat cca gca 554Ser Pro Gly Arg Asp Ser Cys Lys Ile Phe Thr Asp Gln His Pro Ala130 135 140ctt cct gtt cag tct ctg cga gta cct gaa tgc tta ctc tgg gag gaa 602Leu Pro Val Gln Ser Leu Arg Val Pro Glu Cys Leu Leu Trp Glu Glu145 150 155gta cca ggc aga ccg gct tca gag tga ctttgcagcc ctcctgactg 649Val Pro Gly Arg Pro Ala Ser Glu160 165ggcccttgca gagaaaccca ctgtgtaact tgctgtcatt tacttacaaa ctggatccag 709ggggtcagtc cttcccgttc tgtgctagat tgctgtataa ggacctcaca gcaactcttc 769ccactgacgt caccgtgaca tgtcaaggag tggaagtatt atccacttca tgggaggagc 829aacgagcatc tcatgaaact ctgttctgta cgaagccctt gcatcaagtg tttgcctcat 889ttacaagaaa aggagaaaag ttggatatga gtctggtctc ctaatagatt gttttcactg 949cactgggagc acatcagaga aataaatccc ccctcccctg ccaggtgaaa ggaaatattg1009
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Lys Gln Ser Glu Glu Leu Gln Ser Val Gln Ala Gln Glu Gly Ala Leu35 40 45Gly Thr Lys Ile His Lys Leu Arg Arg Leu Arg Asp Glu Leu Arg Ala50 55 60Val Val Arg His Arg Arg Ala Ser Val Lys Ala Cys Ile Ala Asn Val65 70 75 80Glu Pro Asn Gln Thr Val Glu Ile Asn Glu Gln Glu Ala Leu Glu Glu85 90 95Lys Leu Glu Asn Val Lys Ala Ile Leu Gln Ala Tyr His Phe Thr Glu100 105 110Thr Thr Pro Asp Thr Ser Pro Phe Ser Pro Ser Leu His Ser Pro Gly115 120 125Arg Asp Ser Cys Lys Ile Phe Thr Asp Gln His Pro Ala Leu Pro Val130 135 140Gln Ser Leu Arg Val Pro Glu Cys Leu Leu Trp Glu Glu Val Pro Gly145 150 155 160Arg Pro Ala Ser Glu165
<210>15<211>1637<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(273)..(995)<400>15ccgggaaccg aacccgatgg agaggagggg gcccccatgg atttaggggg ggaggggaaa 60gtcatggggg ggcacccccc cggaacccct ttcccaggcg cgcgttctcc gctgaaagag 120gctcagagag acactttctc cgggatctta agtgtggggg ctgctggctg gggggcccgt 180ccggcccaac gccggaggct tggaaaagag agttagcagc gggagcggac tacgtgccgg 240gccatggccc ttctgcccgg gccctggcca ca atg acc tct ttg ccc tgc ccc 293Met Thr Ser Leu Pro Cys Pro1 5ctc ccc ggc cgg gac gcc tcc aaa gct gtc ttc cca gac ctc gcc cct 341Leu Pro Gly Arg Asp Ala Ser Lys Ala Val Phe Pro Asp Leu Ala Pro10 15 20gtc ccg tcg gta gcg gct gcc tac ccg ctt ggc ttg tcc cct aca acc 389Val Pro Ser Val Ala Ala Ala Tyr Pro Leu Gly Leu Ser Pro Thr Thr25 30 35gca gcc tcc ccc aat ttg tcc tac tcc agg ccg tat ggc cac ctc ctg 437Ala Ala Ser Pro Asn Leu Ser Tyr Ser Arg Pro Tyr Gly His Leu Leu40 45 50 55
tct tac ccc tac acc gag cca gcg aac ccc gga gac tcc tac ctg tcc 485Ser Tyr Pro Tyr Thr Glu Pro Ala Asn Pro Gly Asp Ser Tyr Leu Ser60 65 70tgc cag caa ccc gcg gcg ctc tct cag ccc ctc tgc gga cct gca gag 533Cys Gln Gln Pro Ala Ala Leu Ser Gln Pro Leu Cys Gly Pro Ala Glu75 80 85cac cct cag gaa ctc gag gca gac tcg gag aag ccg cgg ctg tcc ccg 581His Pro Gln Glu Leu Glu Ala Asp Ser Glu Lys Pro Arg Leu Ser Pro90 95 100gaa ccc tcc gag cgg cgc cct cag gcc ccc gcc aaa aag ctc cgc aag 629Glu Pro Ser Glu Arg Arg Pro Gln Ala Pro Ala Lys Lys Leu Arg Lys105 110 115ccg agg acc atc tac tcc agc ctg cag ctg cag cac cta aac cag cgt 677Pro Arg Thr Ile Tyr Ser Ser Leu Gln Leu Gln His Leu Asn Gln Arg120 125 130 135ttc cag cac acg cag tac ctg gcg ctg ccc gag agg gcc cag ctg gca 725Phe Gln His Thr Gln Tyr Leu Ala Leu Pro Glu Arg Ala Gln Leu Ala140 145 150gcg cag ctc ggc ctc acc cag acc cag gta aag atc tgg ttt cag aac 773Ala Gln Leu Gly Leu Thr Gln Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn155 160 165aaa cgc tcc aag tat aag aag ctc ctg aag cag aat tct ggg ggg cag 821Lys Arg Ser Lys Tyr Lys Lys Leu Leu Lys Gln Asn Ser Gly Gly Gln170 175 180gaa ggg gac ttc cct ggg agg acc ttc tct gtg tct ccc tgc tcc cca 869Glu Gly Asp Phe Pro Gly Arg Thr Phe Ser Val Ser Pro Cys Ser Pro185 190 195
ccc ctc ccc tcc ctc tgg gat cta ccc aag gca ggg acc ctg ccc acc917Pro Leu Pro Ser Leu Trp Asp Leu Pro Lys Ala Gly Thr Leu Pro Thr200 205 210 215agt ggc tat ggc aac agc ttt gga gcc tgg tat cag cat cac tcc tca965Ser Gly Tyr Gly Asn Ser Phe Gly Ala Trp Tyr Gln His His Ser Ser220 225 230gat gtc ctg gct tcg cct cag atg atg tga atctggggaa gggcgggtca 1015Asp Val Leu Ala Ser Pro Gln Met Met235 240ggcccacagc cttcctgcaa agcccaggac ccaggcagtc cacctgcacc ccttctgggc 1075tgggaggaaa ccagctccag atgggttttc tctggaggac aagcagttag aggagaaaaa 1135ggaatggagc agagcctgta cccctaaccc taacagctaa atcaaggacc tcagccttat 1195ataatcattg tccccaccac taccatggac tggacacctt cactccagct ggacaaagac 1255tctggagaga gagccattgg ctggagttga gactgtcccc agaacccttg gtcttgccac 1315tcccccactc cttcttccct ctctcccttt ctcctctccc tgctttcttg aaaaggactg 1375aatcgccact acagcctggg tgcaaaatca gcaagaaaca ttgagtattt ttttttcttt 1435gtatgccttt ggccttgcac aacccatttg tgagcaaaag cagaagtgga ccaccatcag 1495ctcccaccca cccagcgatt tttccttgga ggtcagcccg ttacccccat aactgattta 1555cctacttacc atactgggag gtagaagaga tgcagagaaa tgtggaattt gtggacctat 1615gggtaattta tgctttcctc ct 1637<210>16
<211>240<212>PRT<213>人<400>16Met Thr Ser Leu Pro Cys Pro Leu Pro Gly Arg Asp Ala Ser Lys Ala1 5 10 15Val Phe Pro Asp Leu Ala Pro Val Pro Ser Val Ala Ala Ala Tyr Pro20 25 30Leu Gly Leu Ser Pro Thr Thr Ala Ala Ser Pro Asn Leu Ser Tyr Ser35 40 45Arg Pro Tyr Gly His Leu Leu Ser Tyr Pro Tyr Thr Glu Pro Ala Asn50 55 60Pro Gly Asp Ser Tyr Leu Ser Cys Gln Gln Pro Ala Ala Leu Ser Gln65 70 75 80Pro Leu Cys Gly Pro Ala Glu His Pro Gln Glu Leu Glu Ala Asp Ser85 90 95Glu Lys Pro Arg Leu Ser Pro Glu Pro Ser Glu Arg Arg Pro Gln Ala100 105 110Pro Ala Lys Lys Leu Arg Lys Pro Arg Thr Ile Tyr Ser Ser Leu Gln115 120 125
Leu Gln His Leu Asn Gln Arg Phe Gln His Thr Gln Tyr Leu Ala Leu130 135 140Pro Glu Arg Ala Gln Leu Ala Ala Gln Leu Gly Leu Thr Gln Thr Gln145 150 155 160Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Lys Arg Ser Lys Tyr Lys Lys Leu Leu165 170 175Lys Gln Asn Ser Gly Gly Gln Glu Gly Asp Phe Pro Gly Arg Thr Phe180 185 190Ser Val Ser Pro Cys Ser Pro Pro Leu Pro Ser Leu Trp Asp Leu Pro195 200 205Lys Ala Gly Thr Leu Pro Thr Ser Gly Tyr Gly Asn Ser Phe Gly Ala210 215 220Trp Tyr Gln His His Ser Ser Asp Val Leu Ala Ser Pro Gln Met Met225 230 235 240
权利要求
1.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸含有编码具有抑制Wnt活化的功能的多肽的核苷酸序列，该核苷酸序列选自(a)与编码含有SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQID NO14、SEQ ID NO16的氨基酸序列的多肽的多核苷酸有至少70％相似性的多核苷酸；(b)编码含有与SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16的氨基酸序列有至少70％相似性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(c)与(a)或(b)的多核苷酸互补的多核苷酸。
2.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码的多肽具有选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ IDNO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16。
3.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列与选自下组的核苷酸序列有至少85％相似性(a)SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ IDNO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15的编码区序列或全长序列；(b)在遗传密码简并范围内相应于(a)中提到的序列的至少一个序列；(c)与(a)或(b)中提到的序列互补的序列杂交的至少一个序列。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列选自SEQ ID NO1、SEQ IDNO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ IDNO15的编码区序列或全长序列。
5.权利要求1所述的多核苷酸编码的多肽，其特征在于，所述多肽包含选自下组中的氨基酸序列的多肽SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16；或与以上任一氨基酸序列具有至少90％相似性的多肽；或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
6.权利要求5所述的多肽，其特征在于，所述多肽具有选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16。
7.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求1所述的多核苷酸。
8.一种遗传工程宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自(a)用权利要求7所述的载体转化或转导的宿主细胞；(b)用权利要求1所述的多核苷酸转化或转导的宿主细胞。
9.一种抗体，其特征在于，所述抗体是能与权利要求5所述的多肽特异性结合的抗体。
10.一种核酸片段，其特征在于，所述核酸片段含有权利要求1所述的任一多核苷酸中8-100个连续的核苷酸。
11.一种分离的多核苷酸在抑制Wnt活化中的应用，其特征在于所述多核苷酸选自权利要求1所述的多核苷酸，该多核苷酸在宿主细胞中外源表达会抑制Wnt活化。
12.权利要求1所述的多核苷酸或权利要求5所述的多肽在制备预防和/或治疗神经系统疾病或肿瘤的药物中的用途。
13.一种神经系统疾病或肿瘤的体外检测方法，其特征在于，利用权利要求9所述的抗体或权力要求10所述的核酸片段来检测宿主样品中的多肽的存在或水平。
全文摘要
本发明公开了一类新的编码具有抑制Wnt活化的功能的人蛋白的多核苷酸及其编码的多肽，多肽的抗体。本发明也公开了这类新的多核苷酸在宿主细胞中外源表达对Wnt活化的抑制作用的应用。本发明还公开了所述多肽、抗体在制备预防和治疗肿瘤的药物上的用途。
文档编号C07H21/00GK1982455SQ20051013452
公开日2007年6月20日 申请日期2005年12月15日 优先权日2005年12月15日
发明者陆阳, 高霞, 邓唯唯, 马大龙, 高鹏, 于鹏, 张晨颖, 马进京, 郭金海, 程华玲, 王欣宇, 王峰, 蔡恬静, 王平章, 李娜, 童郁蓉, 石太平 申请人:北京诺赛基因组研究中心有限公司