海洋微生物发酵产生的化合物在抗生物污损中的应用的制作方法

专利名称：海洋微生物发酵产生的化合物在抗生物污损中的应用的制作方法
技术领域：
本发明提供了一种使用海洋微生物发酵生产新的抗菌和抗生物污损活性化合物以及这些化合物的实际应用方法。本发明所涉及生产抗菌和抗生物污损化合物微生物为白粉寄生菌(Ampelomycessp.)，镰孢菌(Fusarium sp.)及一种棘头海绵(Acanthellacavernosa)附生菌UST03110-009。这些化合物既有抗菌活性又有抑制幼虫附着活性，因此具有显著的抗生物污损活性。
背景技术：
海洋环境中的水下工业设施，如排水管，船体的龙骨，螺旋桨，养鱼网箱等易于受到生物污损。海洋生物如细菌，海藻，真菌以及原生动物附生在物体表面，形成群落并产生粘液层，即生物膜。生物膜的形成可以看成是一种微生物污损，生物膜不仅分泌一些诱导大型污损生物如海洋无脊椎动物的浮游态幼虫和藻类的孢子附着的化学信号物质，而且会产生一些损害钢铁的化学物质，造成生物腐蚀。长有钙质壳或管的大型污损生物如贻贝，管虫和藤壶等危害尤其大，经常阻塞管道或附着在水下物体表面而影响这些设施的运转。
无论水下设施的微生物污损还是大型生物污损都会造成工业上的巨大经济损失。降低燃料效率，增加设施的清理和维护费用以及其它一些损耗。海洋细菌和海洋无脊椎动物如管虫和藤壶是引起生物污损和生物腐蚀的主要生物。生物污损和生物腐蚀是相互伴生现象，引起航运业以及海洋水产养殖业严重的损失。生物污损会增加船体龙骨的摩擦的10％，降低螺旋桨的推动力的20％，因此要多消耗50％的燃料来保持相同的行进速度。此外，生物污损还会加快船体腐蚀速度的200％，缩短船体寿命的50％。每年由于生物污损造成的经济和环境损失达到几十亿美元。有毒抗污损涂料的生产以及废料处理又会多造成几十亿美元的损失。近三十年来，含TBT的抗生物污损涂料是最有效的防污漆，但由于毒性高和对环境的危害，联合国国际海事组织已经签署公约2003年1月1日起禁止含有TBT的海洋涂料的生产。因此迫切需要寻找新的对环境无害的抗生物污损活性化合物。
海洋微生物是可持续性利用的生物资源，为解决目前存在的问题提供了新的途径。利用微生物大规模生产生物产品比利用高等动物或植物有更大的优点。另外，由于发酵过程中人力消耗少，因此应用微生物发酵更经济。从海洋微生物分离鉴定出的抗菌和抗生物污损活性化合物，也将来可能通过更经济的工业规模的化学合成。

发明内容
本发明涉及从海洋微生物中分离鉴定出4个无毒或低毒且具有显著抗污损活性(抗菌和抗幼虫附着活性)化合物。
四个化合物如下(i)3-氯-2，5-二羟基苯甲醇(3-chloro-2，5-dihydroxy benzylalcohol，化合物1) (ii)3-苄基-六氢吡咯[1，2-a]并吡嗪-1，4-二酮(3-benzyl-hexahydropyrrolo[1，2-a]pyrazine-1，4-dione/cyclo-(Pro-Phe)，化合物2) (iii)3-甲基-N-(2-苯乙基)-丁酰胺(3-methyl-N-(2-phenylethyl)butanamide)，化合物3) (iv)琥珀酸(succinic acid，化合物4) 上述化合物及其取代产物也可以通过其它一些技术或途径制备，获得满意的抗污损活性(抗菌和抗幼虫附着活性)，例如化合物1中-Cl也可用-F替代而不影响活性。
本发明提供一个利用本发明涉及的一个或多个化合物及其功能衍生物的配方抑制水下物体表面污损生物的附着，这个方法对环境无害。
本发明提出利用本发明涉及的化合物及其衍生物制备无毒，无重金属，对环境无害的海洋防污漆。


图1是从白粉寄生菌(Ampelomyces sp.)中分离纯化3-氯-2，5-二羟基苯甲醇流程2是从菌株UST030110-009中分离纯化3-苄基-六氢吡咯[1，2-a]并吡嗪-1，4-二酮和3-甲基-N-(2-苯乙基)-丁酰胺流程3是从镰孢菌(Fusarium sp.)中分离纯化琥珀酸流程4显示化合物3-氯-2，5-二羟基苯甲醇浓度与藤壶幼虫附着率的关系图5显示化合物3-苄基-六氢吡咯[1，2-a]并吡嗪-1，4-二酮对藤壶幼虫附着的抑制作用图6显示化合物3-甲基-N-(2-苯乙基)-丁酰胺对藤壶幼虫附着的抑制作用图7化合物琥珀酸对藤壶幼虫附着的抑制作用图8显示化合物琥珀酸对藤壶幼虫死亡率的影响图9显示含琥珀酸的植物凝胶上1，2和3天形成的生物膜中的细菌密度(重蒸水为空白对照)图10显示含琥珀酸的植物凝胶上1，2和3天形成的生物膜对幼虫附着的影响图11线性图显示含琥珀酸的植物凝胶表面上的细菌密度与管虫附着的关系(实地试验)图12显示植物凝胶基质中琥珀酸的释放速率图13显示实地试验中涂布含1％和10％ of琥珀酸油漆的塑料板表面的管虫密度图14显示无毒油漆中琥珀酸的释放率具体实施方式
A.本发明涉及的制备抗菌、抗生物污损活性化合物的菌株菌株UST040128-009为从香港岸边培养6天的天然生物膜中分离到，经鉴定为白粉寄生菌(Ampelomyces sp.)。用无菌盖玻片将玻璃片上的生物膜刮下，悬浮于500ul无菌复方氯化钠溶液(Ringersolution，Oxoid)。然后用无菌复方氯化钠溶液释稀样品至10倍和100倍。取200ul样品涂布于含0.3％玫瑰红钠(Rose Bengal，Acros)和100mg/L的抗生素链霉素和青霉素G的玉米粉琼胶板上(corn meal agar，CMA，Oxoid)。将接种后的琼胶板置于25℃培养箱中培养2天。在解剖镜下观查真菌菌丝。挑取特殊的真菌菌落，转移到新玉米粉琼胶板上进一步分离纯化真菌。采用分子生物学方法测定真菌菌株的内转录间隔区(ITS)的序列，基因序列代码为序列号1(SEQ ID No1)。
菌株UST030110-009为海南三亚棘头海绵(Acanthellacavernosa)的附生菌。在水下将海绵样品从礁石上取下置于干净的塑料袋中带到水面。在实验室中将海绵切碎，然后悬浮于500ul无菌复方氯化钠溶液。然后用复方氯化钠溶液释稀样品至10倍和100倍。取200ul样品涂布于含0.3％玫瑰红钠和100mg/L的抗生素链霉素和青霉素G的玉米粉琼胶板上。将接种后琼胶板上置于25℃培养箱。培养2天后，在解剖镜下观查真菌菌丝。挑取特殊的真菌菌落，转移到新的玉米粉琼胶板上进一步分离纯化真菌。采用分子生物学方法测定真菌菌株18S rRNA和内转录间隔区序列，基因序列代码分别为序列号4(SEQ ID No4)和序列号5(SEQ ID No5)。
海洋真菌-镰孢菌(Fusarium sp.)通过分子生物学方法测定18SrRNA和内转录间隔区，基因序列代码分别为序列号2(SEQ ID No2)和序列号3(SEQ ID No3)。
B.海洋微生物制备抗菌和抗生物污损活性化合物(1)3-氯-2，5-二羟基苯甲醇(3-chloro-2，5-dihydroxy benzylalcohol)将活化的白粉寄生菌(Ampelomyces sp.)菌种接种到3L盛有2L灭菌培养基的培养瓶中。培养基组成为葡萄糖(20g/L)，蛋白胨(10g/L)，海水(800ml/L)淡水(200ml/L)。在摇床上室温培养21天，速度80转/分钟。经活性检测，菌丝体和发酵液的粗提物都有抗菌、抗生物污损活性。因此需要将菌丝体和发酵液分离，分别提取。
图1为发酵液中活性成分的提取与纯化流程。发酵结束，菌丝体和发酵液用纱布分离。滤液用乙酸乙酯提取三次(滤液∶乙酸乙酯3∶1)。合并乙酸乙酯萃取液，合并后减压浓缩。(其它合适的溶剂也可用做粗提物的提取，如二氯甲烷，氯仿，乙醚和正丁醇)。菌丝体用甲醇提取三次(此处也可用其它溶剂如乙醇，正丁醇，丙酮和乙酸乙酯)，合并甲醇提取液减压浓缩。用超声波或研钵破坏细胞壁有助于提高提取率。
乙酸乙酯和甲醇提取物部分合并，减压蒸干，获褐色粗提物3.78g。将粗提物悬浮于10倍体积的重蒸水中，然后分别用等体积的正己烷，乙酸乙酯萃取。(这一步也可用其它合适的试剂代替，获得相同的结果。如，石油醚代替正己烷，乙醚、氯仿和正丁醇代替乙酸乙酯。)将乙酸乙酯提取物过葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)柱，以甲醇为洗脱剂，流速1ml/min。每个馏分为4毫升/管，结合薄层色谱(硅胶，氯仿-甲醇5∶1)和抗生物污损活性分析每个馏分，相同部分合并。活性部分上硅胶柱(1.0×50cm，230-400目，E.Merck)，用二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂，梯度洗脱。活性部分再用二氯甲烷∶乙酸乙酯(1∶1)纯化。最后用反相高效液相色谱进一步纯化(色谱柱Lichrospher 100 RP C18EC 5，250×4mm i.d.；分离条件梯度30％甲醇-水至70％甲醇-水；流速1ml/min)。得到纯化合物。该化合物为3-氯-2，5-二羟基苯甲醇，在25℃可溶于甲醇，乙醇，丙醇，丁醇，乙酸乙酯，丙酮，乙腈。
本化合物的化学结构用核磁共振技术确定，并用电喷雾离子化质谱(Waters Micromass ZQ ESI-MS，以下同)采用负离子模式测定分子量。质谱条件探针电压2.5kV；锥孔电压18V；碎片电压2V；探针温度100℃；干燥气N2温度为300℃；干燥气流速200立升/小时。将3-氯-2，5-二羟基苯甲醇溶于甲醇-水-甲酸(90∶9.5∶0.5)，用250微升进样器以5微升/分钟导入质谱。
3-氯-2，5-二羟基苯甲醇的质谱图显示分子离子峰([M-H])在m/z172.75(100.0％)，174.72(32.6％)。在质谱图(M-H)+2峰是[M-H]峰强度的1/3，表明化合物中含有Cl。
将3-氯-2，5-二羟基苯甲醇溶于氘代甲醇采用JEOL Model JNMEX-400型核磁共振仪测定核磁共振氢谱。氢谱数据见表1表1 3-氯-2，5-二羟基苯甲醇氢谱数据(400MHz)

将3-氯-2，5-二羟基苯甲醇溶于氘代甲醇采用JEOL Model JNMEX-400型核磁共振仪测定核磁共振碳谱。碳谱数据见表2。
表2.3-氯-2，5-二羟基苯甲醇的核磁共振碳谱数据(100MHz)

(2)3-苄基-六氢吡咯[1，2-a]并吡嗪-1，4-二酮(3-benzyl-hexahydropyrrolo[1，2-a]pyrazine-1，4-dione/cyclo-(Pro-Phe))和3-甲基-N-(2-苯乙基)-丁酰胺(3-methyl-N-(2-phenylethyl)butanamide)图2是菌株UST030110-009制备化合物3-苄基-六氢吡咯[1，2-a]并吡嗪-1，4-二酮和3-甲基-N-(2-苯乙基)-丁酰胺的流程图。
将经过活化的菌种接种到3L盛有1.5L无菌培养基的培养瓶中。培养基组成为葡萄糖(20g/L)，蛋白胨(10g/L)，海水(800ml/L)淡水(200ml/L)。在摇床上室温培养15天，速度为120转/分钟。经活性检测，菌丝体和发酵液的粗提物都有抗菌、抗生物污损活性。因此需要将菌丝体和发酵液分离，分别提取。菌丝体和发酵液用纱布分离。滤液用乙酸乙酯提取三次(滤液∶乙酸乙酯3∶1体积比)。乙酸乙酯萃取液合并后减压浓缩。(其它合适的溶剂也可用做萃取溶剂，如二氯甲烷，氯仿，乙醚和正丁醇)。菌丝体用甲醇提取三次(此处也可用其它溶剂如乙醇，正丁醇，丙酮和乙酸乙酯)。用超声波或研钵加干净的砂破坏细胞壁可以提高提取效率。
乙酸乙酯和甲醇提取物部分合并，蒸干，悬浮于10倍体积的重蒸水中，然后依次用等体积的正己烷，乙酸乙酯萃取。(这一步也可用其它合适的试剂代替，如石油醚代替正己烷，乙醚、氯仿和正丁醇代替乙酸乙酯。)乙酸乙酯部分上葡聚糖凝胶LH-20柱，用甲醇洗脱，流速1ml/min，每个馏分为5毫升/管。经琼胶扩散抗菌测试，合并后减压浓缩活性组分。活性部分采用硅胶柱层析进一步纯化，洗脱剂为正己烷-乙酸乙酯(100％正己烷至100％乙酸乙酯)和乙酸乙酯-甲醇(100％乙酸乙酯至100％甲醇)。
乙酸乙酯部分结晶析出。晶体纯度用反相高效液相色谱(Lichrospher 100RP C18EC 5，250×4mm i.d.；梯度50％乙腈-水至80％乙腈-水；流速1ml/min)分析。在色谱图中只出现一个单峰，表明该晶体为纯化合物(化合物2)。
甲醇部分上键合十八烷基硅胶柱，用甲醇-水洗脱，每个馏分3毫升/管。测定每个组分的纯度与活性，最后获得纯化合物3。
采用核磁共振技术分析两个化合物的化学结构。经分析白色粉末状化合物2为3-苄基-六氢吡咯[1，2-a]并吡嗪-1，4-二酮，在25oC可溶于甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、乙酸乙酯、丙酮和乙腈。采用电喷雾离子化质谱测定分子量。用正离子模式，质谱条件探针电压2.5kV；锥孔电压18V；碎片电压2V；探针温度100℃；干燥气氮气温度为300℃；干燥气流速200立升/小时。3-苄基-六氢吡咯并吡嗪-1，4-二酮溶于甲醇-水-甲酸(90∶9.5∶0.5)，采用250L进样器以5L/min的速度导入质谱。3-苄基-六氢吡咯并吡嗪-1，4-二酮的质谱图显示分子离子峰m/z244.89(100.0％)，245.90(15.9％)。
将3-苄基-六氢吡咯[1，2-a]并吡嗪-1，4-二酮溶于氘代甲醇采用JEOL Model JNM EX-400型核磁共振仪测定核磁共振氢谱。氢谱数据见表3。
表3 3-苄基-六氢吡咯[1，2-a]并吡嗪-1，4-二酮的氢谱数据(400MHz)


将3-苄基-六氢吡咯[1，2-a]并吡嗪-1，4-二酮溶于氘代甲醇采用JEOL Model JNM EX-400型核磁共振仪测定碳谱。碳谱数据见表4。
表4 3-苄基-六氢吡咯[1，2-a]并吡嗪-1，4-二酮的核磁共振碳谱数据(100MHz)

化合物3经鉴定为3-甲基-N-(2-苯乙基)-丁酰胺，无色晶体，在25℃可溶于甲醇，乙醇，丙醇，正丁醇，乙酸乙酯，氯仿，二氯甲烷和乙腈。采用电喷雾离子化质谱正离子模式测定分子量。将化合物溶于甲醇-水-甲酸(90∶9.5∶0.5)，用250L进样器以5L/min的速度导入质谱。3-甲基-N-(2-苯乙基)-丁酰胺的质谱图显示化合物的分子离子为m/z205.8。将化合物溶于氘代氯仿，采用JEOL ModelJNM EX-400型核磁共振仪测定氢谱。氢谱数据见表5。
表5 3-甲基-N-(2-苯乙基)-丁酰胺的核磁共振氢谱数据(400MHz)


将3-甲基-N-(2-苯乙基)-丁酰胺溶于氘代氯仿，采用JEOL ModelJNM EX-400型核磁共振仪测定碳谱。碳谱数据见表6。
表6 3-甲基-N-(2-苯乙基)-丁酰胺的核磁共振碳谱数据(100MHz)

(3)琥珀酸(succinic acid)经活化的镰孢菌(Fusarium sp.)菌种接种到3L培养瓶中，培养瓶盛有1.5L无菌培养基。培养基成分葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，海水800ml/L，淡水200ml/L。置于摇床上室温培养10天，转速120转/分钟。活性测定结果表明菌丝体和发酵液中都含有抗污损活性成分。因此为有效提取琥珀酸，采用医用纱布分离菌丝体和发酵液。
图3为提取与分离琥珀酸的过程。发酵液用乙酸乙酯萃取三次(滤液∶乙酸乙酯3∶1)。合并萃取液，减压蒸干(可用其它适当溶剂如二氯甲烷，氯仿，乙醚和正丁醇替代乙酸乙酯)。菌丝体用甲醇萃取三次(乙酸乙酯可用乙醇、正丁醇、丙酮代替)。用超声波或研钵加干净的砂破坏细胞壁可以提高提取效率。
合并乙酸乙酯和甲醇粗提物减压浓缩，获得约1.6g粗提物。粗提物悬浮于10ml甲醇，然后用正己烷除去脂类(石油醚可替代正己烷)，减压浓缩甲醇相获得1g抗菌活性部分。活性部分采用硅胶柱层析，用100％二氯甲烷至100％甲醇进行梯度洗脱，得到9个馏分。活性测定结果表明15％二氯甲烷部分(600mg)具有活性。活性部分进一步用葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)柱分离获得30个组分。其中4个馏分显示抗菌活性。合并活性组分，进一步用反相高效液相色谱(Lichrospher 100 RP C18EC 5，250×4mm i.d.；梯度90％水-乙腈至10％水-乙腈，流速1ml/min)纯化。
通过核磁共振氢谱，碳谱鉴定化合物的结构。最后活性化合物确认为琥珀酸。琥珀酸的分子量采用电喷雾离子化质谱测定。质谱条件探针电压2.5kV；锥孔电压18V；碎片电压2V；探针温度100℃；干燥气氮气温度为300℃；干燥气流速200立升/小时。琥珀酸溶于甲醇-水(90∶9.5)用250L进样器以5L/min的速度导入质谱。琥珀酸的质谱显示分子离子m/z118，分子式为C4H6O4。将化合物溶于氘代甲醇，用核磁共振仪测定核磁共振氢谱和碳谱。琥珀酸及其化学位移如下

C.抗菌、抗生物污损(抑制幼虫附着)活性(1)3-氯-2，5-二羟基苯甲醇(3-chloro-2，5-dihydroxy benzylalcohol)采用琼胶扩散法测定抗菌活性。浸有50g化合物的无菌纸片(6mm i.d.)覆盖在涂布细菌的琼胶板上。浸有同样体积二甲亚砜的纸片做空白对照，加链霉素的滤纸片做阳性对照。然后将琼胶板置于30℃培养箱中培养24小时后，测量抑菌圈大小。抗菌结果见表7。表7显示3-氯-2，5-二羟基苯甲醇抗菌活性较强，不仅能杀死诱导幼虫附着的细菌而且能杀死病原菌。
表7 3-氯-2，5-二羟基苯甲醇的抗菌活性

采用24孔聚苯乙烯板测定3-氯-2，5-二羟基苯甲醇(化合物1)的抗幼虫附着活性。纯化合物溶于二甲亚砜，然后用无菌过滤海水稀释成不同的浓度。每个孔中加入1ml测试液和10±2个成熟的藤壶幼虫，每个浓度5个重复样，无菌过滤海水做空白对照。将24孔细胞培养板置于30℃培养箱中24小时。在解剖镜下统计附着的幼虫数。用社会科学统计程序(SPSS)进行统计分析。
图4显示化合物3-氯-2，5-二羟基苯甲醇在0.1g/ml已显示抗幼虫附着活性。在浓度为5g/ml时，幼虫附着率只有大约10％，空白对照的幼虫附着率为60％，明显地抑制了藤壶幼虫的附着。
按Rittschof等(1994)的方法分析抗幼虫附着活性。半数抑制有效浓度(EC50)为3.50g/ml，半数致死浓度(LC50)为266.68g/ml。化合物1的毒效比LC50/EC50为76.19，表明该化合物为无毒。有毒化合物如重金属的毒效比接近1(Rittschof et al.1992)，而无毒抗生物污损化合物的毒效比为10以上(Avelin et al.1993)。
(2)3-苄基-六氢吡咯[1，2-a]并吡嗪-1，4-二酮(3-benzyl-hexahydropyrrolo[1，2-a]pyrazine-1，4-dione/cyclo-(Pro-Phe))和3-甲基-N-(2-苯乙基)-丁酰胺(3-methyl-N-(2-phenylethyl)butanamide)采用琼胶扩散法测定抗菌活性。浸有50g化合物的无菌纸片(6mm i.d.)覆盖在涂布细菌的琼胶板上。浸有同样体积二甲亚砜的纸片做空白对照，加链霉素的滤纸片做阳性对照。琼胶板置于30℃培养箱中24小时后，测量抑菌圈大小。3-苄基-六氢吡咯并吡嗪-1，4-二酮和3-甲基-N-(2-苯乙基)-丁酰胺的抗菌结果分别见表8和表9。
表8 3-苄基-六氢吡咯[1，2-a]并吡嗪-1，4-二酮(化合物2)的抗菌活性结果

表9 3-甲基-N-(2-苯乙基)-丁酰胺(化合物3)的抗菌活性结果

采用24孔聚苯乙烯板测定3-苄基-六氢吡咯[1，2-a]并吡嗪-1，4-二酮的毒性。将纯化合物溶于二甲亚砜，用无菌过滤海水稀释成不同的浓度。每个孔中加入1ml测试液和10±2个成熟的藤壶幼虫，每个浓度5个重复样，无菌过滤海水做空白对照。将24孔细胞培养板置于30℃培养箱中24小时。在解剖镜下统计死亡的幼虫数。在50g/ml浓度下3-苄基-六氢吡咯[1，2-a]并吡嗪-1，4-二酮和3-甲基-N-(2-苯乙基)-丁酰胺幼虫没有中毒现象。
图5和图6分别为化合物3-苄基-六氢吡咯[1，2-a]并吡嗪-1，4-二酮(化合物2)和3-甲基-N-(2-苯乙基)-丁酰胺(化合物3)的抑制藤壶幼虫附着活性。
按Rittschof等(1994)的方法分析抗幼虫附着活性。3-苄基-六氢吡咯[1，2-a]并吡嗪-1，4-二酮的半数抑制有效浓度(EC50)为67.30g/ml，半数致死浓度(LC50)为114.83g/ml。化合物2的毒效比LC50/EC50为1.70。3-甲基-N-(2-苯乙基)-丁酰胺的EC50为36.45g/ml，LC50为81.35g/ml，化合物3的毒效比LC50/EC50为2.23。按照前述标准，这两种化合物为低毒化合物(Rittschof et al.1992和Avelin et al.1993)。
(3)琥珀酸(succinic acid)采用琼胶扩散法测定琥珀酸的抗菌活性。靶细菌为9株幼虫附着诱导菌Vibrio halioticoli，Micrococcus luteus，Pseudoalteromonassp.，Loktanella hongkongensis，Rhodovulum sp.(MB253)，Vibriofluvialis，Staphylococcus haemolyticus，Ruegeria CtaxMed-2，Vibriosp.(NAP-4)和5株病原菌Vibrio furnissii，Vibrio vulnificus，Shewanella algae，Staphylococcus aureus和Moraxellaphenylpyruvica。浸有100g化合物的无菌纸片(6mm i.d.)覆盖在涂布细菌的琼胶板上。加同样体积乙腈的纸片做空白对照，加链霉素的滤纸片做阳性对照。琼胶板置于30℃培养箱中24小时后，测量抑菌圈大小。
藤壶成虫采自香港(22°19’N，114°16’E)潮间带。以纤细角毛藻(Chaetoceros gracilis Schutt)为食物，在0.22-μm过滤海水中将藤壶的无节幼体培养到金星幼体阶段，每毫升2个幼虫，培养温度28℃。用产生的金星阶段幼体进行活性试验。
采用24孔聚苯乙烯板测定琥珀酸的抗幼虫附着活性。将纯化合物溶于二甲亚砜，用无菌过滤海水稀释成不同的浓度溶液(60-140μg/ml)。每个孔中加入1ml测试液和15±2个成熟的藤壶幼虫，每个浓度5个重复样，无菌过滤海水做空白对照。将24孔细胞培养板置于30℃培养箱中放置24小时。在解剖镜下统计附着的幼虫数。用社会科学统计程序(SPSS)进行统计分析。
图7琥珀酸在110gml-1浓度下显示抗藤壶幼虫附着活性。单因素方差分析分析表明琥珀酸显著地抑制藤壶幼虫附着(F9,40＝133.85，p＜0.001)。毒效比LC50/EC50为94.11，表明该化合物无毒。图8为琥珀酸浓度对藤壶幼虫死亡率的影响。
按照Harder等(2004)的方法将琥珀酸掺入植物凝胶(Phytagel)基质中。方法如下将植物凝胶溶于90℃的重蒸水中，配成4％(重量/体积)的植物凝胶溶液。冷却到70℃，加入琥珀酸的浓溶液(5.5mg ml-1)，与植物凝胶溶液在15ml离心管中混合，琥珀酸的终浓度为550μg ml-1，拧上盖子，置于60℃水浴中，使植物凝胶慢慢冷却凝固形成透明圆柱体。取出植物凝胶圆柱体，切成1厘米厚的胶片。用掺有重蒸水的胶片做空白对照。48片胶用于三天的试验18片胶用于测定模拟自然状态下植物凝胶中琥珀酸的释放速率。9片胶在试验结束后，用4％福尔马林固定进行细菌数统计，结果见图9)；12片用于抗幼虫附着活性测试(图10)。
图9为植物凝胶表面在自然海水中1，2和3天形成的生物膜上的细菌密度，用重蒸水做对照，(琥珀酸，化合物4，浓度为550μg ml-1)。资料为平均值±标准偏差，3个重复样。图10显示自然海水中植物凝胶表面1，2和3天形成的生物膜对幼虫附着的影响，(琥珀酸浓度为550μg ml-1)。资料表达为平均值±标准偏差，4个重复样。图11为线性图。表明植物凝胶表面的细菌密度与管虫附着率的相关性。图12显示植物凝胶胶片浸入海水中一定时间后琥珀酸残留量。按照下列方法将琥珀酸加入无毒油漆中测定抗幼虫活性将琥珀酸掺入无毒油漆(Levis Ferro Vernis)中，浓度分别为(10％mg/ml和1％ mg/ml)。无毒油漆和抗污油漆(International.Interspeed Ultra biocidal paint)用做对照。将油漆涂到5个塑料板(大小100cm2)上，置于野外海水中。定期取出塑料板，统计附着的管虫数(Hydroides elegans)，换算成每平方米管虫个数。在实验室中测定油漆中琥珀酸释放速率试验。
图13显示现场试验结果，显示涂有含1％和10％琥珀酸油漆平板上的管虫数。用抗污油漆和无毒油漆做空白和阳性对照。图14显示实验室试验中无毒油漆中琥珀酸释放率。
D.活性衍生物的制备本发明涉及的4个抗菌、抗生物污损活性化合物的共同特征是a.都由海洋微生物产生，b.都对动物低毒或无毒，可作为对环境无害的抗污损(抗菌、抗幼虫附着)活性物质的范例，以天然化合物为前体，经化学修饰可以提高活性，降低成本以及其它优点。
另外，上述本发明涉及的化合物可以制备成各种旋光异构体、对映异构体或非对映异构体等形式，还可以与有机酸等成盐，也可合成一些衍生物如N-氧化物，药物前体和生物等排体。药物前体即化合物的无活性形式，即无活性化合物在体内代谢过程中，从母体分子消去一个或几个保护基团而转化为活性化合物。生物等排性是化合物的一个原子或一组原子可以用类似的一个或一组原子替代，而活性不改变。生物等排体是合成具有与母体化合物生物活性性质相同的新化合物。立体化学或拓扑结构不同也可产生生物等排体。本发明的技术权利范围还包括制备药物前体、生物等排体和N-氧化物及其盐类或化合物的各种异构体。因此本发明还包括上述化合物的所有各异构形式、盐和衍生物。
本发明涉及的术语“功能衍生物”为上述化合物的药物前体、生物等排体、N-氧化物，盐类以及各种异构体，与母体化合物相比在某些方面有优势。可以通过各种高通量化学合成方法如通过组合化学制备功能衍生物，与高效生物活性筛选技术结合，扩大抗菌、抗生物污损活性化合物库。
E.抗生物污损涂料的制备选取本发明涉及的抗生物污损活性成分，采用现有技术制备抗污涂料，例如，将活性成分掺入或扩散于成膜天然树脂，氯乙烯醋酸乙烯共聚物以及其它可水解，可溶或不溶性树脂等聚合物中。抗污涂料应释放出足量有效的活性成分至表面防止生物污损。
在本发明正文中涉及的术语“有效量”即在特殊环境中达到抗污损效果(抗菌或抗幼虫附着)的活性成分的量。
本发明制备抗菌药物和抗污涂料首选活性成分嵌入基质的方法，但是本发明并不局限于上述实例描述的嵌入方法，其它掺入基质的方法也属本发明的权利要求范围。
序列表<110>香港科技大学<120>海洋微生物发酵产生的化合物在抗生物污损中的应用<160>5<210>1<211>514<212>DNA<213>白粉寄生菌(Ampelomyces sp)<223>序列位置第二内转录间隔区<400>1GTACTGCGGA AGGATCATCA CTAGANGTAG TAGGCTTTGC CTGCTATCTC TTACCCATGT60TTTTGAGTAC CTTACGTTTC CTCGGTGGGT CCGCCCACCG ATTGGACAAA TTTAAACCCT120TTGCAGTTGA AATCAGCGTC TGAAAAAACT TAATAGTTAC AACTTTCAAC AACGGATCTC180TTGGTTCTGG CATCGATGAA GAACGCAGCG AAATGCGATA AGTAGTGTGA ATTGCAGAAT240TCAGTGAATC ATCGAATCTT TGAACGCACA TTGCGCCCCT TGGTATTCCA TGGGGCATGC300CTGTTCGAGC GTCATTTGTA CCTTCAAGCT CTGCTTGGTG TTGGGTGTTT GTCTCCTGTA360GACTCGCCTT AAAACAATTG GCAGCCGGCG TATTGATTTC GGAGCGCAGT ACATCTCGCG420CTTTGCACTC ATAACGACGA CATCCAAAAG TACATTTTTA CACTCTTGAC CTCGGATCAG480GTAGGGATAC CCGCTGAACT TTAGCATATC AATA514<210>2<211>661<212>DNA<213>镰孢菌(Fusarium sp.)<223>序列位置18S rRNA<400>2TTGGGGCTGT ACAAAGNCTG AGTATGATTA TAGGGACAGT CGGGGGCATC AGTATTCAAT60TGTCAGAGGT GAAATTCTTG GATTTATTGA AGACTAACTA CTGCGAAAGC ATTTGCCAAG120GATGTTTTCA TTAATCAGGA ACGAAAGTTA GGGGATCGAA GACGATCAGA TACCGTCGTA180GTCTTAACCA TAAACTATGC CGACTAGGGA TCGGACGGTG TTATTTTTTG ACCCGTTCGG240CACCTTACGA GAAATCAAAG TGCTTGGGCT CCAGGGGGAG TATGGTCGCA AGGCTGAAAC300TTAAAGAAAT TGACGGAAGG GCACCACCAG GGGTGGAGCC TGCGGCTTAA TTTGACTCAA360CACGGGGAAA CTCACCAGGT CCAGACACAA TGAGGATTGA CAGATTGAGA GCTCTTTCTT420GATTTGTGGG TGGTGGTGCA TGGCCGTTCT TAGTTGGTGG AGTGATTTGT CTGCTTAATT480GCGATAACGA ACGAGACCTT AACCTGCTAA ATAGCCCGTA TTGCTTTGGC AGTAACGCTG540GCTTCTTCAG AGGGACTATC GGCTCAGCCG ATGGCAAGTT TGAGGGCAAT AAACCAGGGT600CCTGTGATGC CCTTAGATGT TCCTGGGGCC GGACGCAGCG CTACACTGGC CGGAAGCCCG660T661<210>3<211>532<212>DNA<213>镰孢菌(Fusarium sp.)<223>序列位置内转录间隔区<400>3
AATANTCAGC AGAGGGAGGG ATCATTACGA GTTTACAACT CCCAAACCCC TGTGAACATA60CCTATACGTT GCCTCGGCGG ATCAGCCCGC GTCCCCGTAA AACGGGACGG CCCGCCCGAG120CGACCCCTAA ACTCTGTTTT CTAGTGGAAC TTCTGAGTAA AACAAACAAA TAAATCAAAA180CTTTCAACAA CGGATCTCTT GGTTCTGGCA TCGATGAAGA ACGCAGCAAA ATGCGATAAG240TAATGTGAAT TGCAGAATTC AGTGAATCAT CGAATCTTTG AACGCACATT GCGCCCGCCA300GTATTCTGGC GGGCATGCCT GTTCGAGCGT CATTTCAACC CTCAAGCTCA GCTTGGTGTT360GGGACTCGCG GTAACCCGCG TTCCCCAAAT CGATTGGCGG TCACGTCGAG CTTCCATAGC420GTAGTAATCA TACACCTCGT TACTGGTAAT CGTCGCGGCA CGCCGTTAAA CCCCAACTTC480TGAATGTTGA CCTCGGATCA GGTAGGAATA CCCGTGAATT AAGCATATCA TA532<210>4<211>734<212>DNA<213>海洋真菌UST03110-009<223>序列位置18S rRNA<400>4CGNNGGCTGT ATTTATGTGG TTTCGTATGA CTGCGTAATG ATTAATAGGG ACAGTCGGGG60GCATCAGTAT TCAATTGTCA GAGGTGAAAT TCTTGGATTT ATTGAAGACT AACTACTGCG120AAAGCATTTG CCAAGGATGT TTTCATTAAT CAGTGAACGA AAGTTAGGGG ATCGAAGACG180ATCAGATACC GTCGTAGTCT TAACCATAAA CTATGCCGAC TAGGGATCGG GCGGTGTTTC240TATTGTGACC CGCTCGGCAC CTTACGAGAA ATCAAAGTGT TTGGGTTCTG GGGGGAGTAT300GGTCGCAAGG CTGAAACTTA AAGAAATTGA CGGAAGGGCA CCACCAGGCG TGGAGCCTGC360GGCTTAATTT GACTCAACAC GGGGAAACTC ACCAGGTCCA GATGAAATAA GGATTGACAG420ATTGAGAGCT CTTTCTTGAT TTTTCAGGTG GTGGTGCATG GCCGTTCTTA GTTCGTGGGG480TGACTTGTCT GCTTAATTGC GATAACGAAC GAGACCTTAA CCTGCTAAAT AGCCAGGCTA540GCTTTGGCTG GTCGCCGGCT TCTTAGAGGG ACTATCGGCT CAAGCCGATG GAAGTTTCGA600GGCAATAACA GGTCTGTGAT GCCCTTAGAT GTTCTGGGCC GACGCGCGCT ACACTGACAG660AGCCAACGAG TTCTTTTCCC TTGGCCGGAA GGTCTGGGTA ATCTTGTTAA AACTCTGTCG720TGCTGGGGAT AGAC 734<210>5<211>651<212>DNA<213>海洋真菌UST03110-009<223>序列位置内转录间隔区<400>5TCCGTATAGA TGCAGCTAGA CGGAGGGATC ANNGACATTG TTCAGCAANC AAGCGATGGC60GTCGTCCTTA GAACCGTCTC CGTGCGGCTC GGGGCGGCGT TTCATCAGCG GGCACGTCGC120GGCTTCCTGT TTTCAGGAAG TAATCCCATC TAGAATGGAC TCACGCGGGG TCGTCTGAAT180CCTTAACTTT ACGAGAACTC CCCATACTCC TTCGGTGGGG TGACCTGCCG TTGGAACCAA240CAAAAACCTT TTTTTTGCAT CTAGCATTAC CTGTTCTGAT ACAAACAATC GTTACAACTT300TCAACAATGG ATCTCTTGGC TCTGGCACTC GATGAAGAAC GCAGCGAAAT GCGATAAGTA360GTGTGAATTG CAGAATTCAG TGAATCATCG AATCTTTGAA CGCACATTGC GCCCCTTGGT420ATTCCATGGG GCATGCCTGT TCGAGCGTCA TCTACACCCT CAAGCTCTGC TTGGTGTTGG480GCGTCTGTCC CGCCTCCGCG CGTGGACTCG CCCCAAATTC ATTGGCAGCG GTCTTCTTGC540CCCCCTCTCG CGCAGCACAT TGCGTTCTCG AGGGGTGGCG GGGCCCGGTC CACGAAGCCA600ACATTCACCC GTTCTTTGAC CTCGGATCAG GTAGGGATAC CGTGATTAGC G 65权利要求
1.一种用于水下结构表面之防微生物污损和/或防大型生物污损的方法，包括给所述水下结构表面涂覆一种抗污涂料，其中所述抗污涂料中添加了选自3-氯-2，5-二羟基苯甲醇、3-苄基-六氢吡咯并吡嗪-1，4-二酮、3-甲基-N-(2-苯乙基)-丁酰胺和琥珀酸及其功能衍生物的抗污损成分。
2.权利要求1所述的方法，其中所述涂料中添加了3-氯-2，5-二羟基苯甲醇。
3.权利要求1所述的方法，其中所述涂料中添加了3-苄基-六氢吡咯并吡嗪-1，4-二酮。
4.权利要求1所述的方法，其中所述涂料中添加了3-甲基-N-(2-苯乙基)-丁酰胺。
5.权利要求1所述的方法，其中所述涂料中添加了琥珀酸。
6.一种具有抗菌和/或抗幼虫附着活性的抗污涂料，其包括成膜成分和一种抗污损活性成分，其中所述抗污损活性成分是3-氯-2，5-二羟基苯甲醇或3-苄基-六氢吡咯并吡嗪-1，4-二酮或3-甲基-N-(2-苯乙基)-丁酰胺或琥珀酸和/或其功能衍生物。
7.权利要求6所述的方法，其中所述成膜成分是可水解、可溶和不溶树脂中的一种或几种聚合物。
8.权利要求7所述的方法，其中抗污损活性成分是3-氯-2，5-二羟基苯甲醇。
9.权利要求7所述的方法，其中抗污损活性成分是3-苄基-六氢吡咯并吡嗪-1，4-二酮。
10.权利要求7所述的方法，其中抗污损活性成分是3-甲基-N-(2-苯乙基)-丁酰胺。
11.权利要求7所述的方法，其中抗污损活性成分是为琥珀酸。
全文摘要
海洋微生物发酵产生抗生物污损(抗菌和/或抗幼虫附着)化合物。所产生的活性化合物为3－氯－2，5－二羟基苯甲醇，3－苄基－六氢吡咯[1，2－a]并吡嗪－1，4－二酮，3－甲基－N－(2－苯乙基)－丁酰胺和琥珀酸。这些化合物为无毒或低毒无重金属物质。这些活性化合物可以单独或组合用于生产对环境无害的抗污损涂料活性成分。
文档编号C07C229/34GK1800273SQ20051013701
公开日2006年7月12日 申请日期2005年12月16日 优先权日2004年12月16日
发明者钱培元, 李宪璀, 邝福宁, 杨丽红, 瑟盖·弗拉迪米罗维克·多布雷特索维 申请人:香港科技大学