专利名称：制备麦考酚酸和其酯衍生物的方法
技术领域：
本发明涉及麦考酚酸的分离。
背景技术：
麦考酚酸，化学名6-[4-羟基-6-甲氧基-7-甲基-3-氧代-5-phthalanyl]-4-甲基-己-4-烯酸，6-[1，3-二氢-4-羟基-6-甲氧基-7-甲基-3-氧代-5-异苯并呋喃基]-4-甲基-己-4-烯酸，分子式C17H20O6，分子量320.35，CAS登记号24280-93-1，结构为 麦考酚酸(MPA)由Gosio于1893年分离，是第一种良好鉴定的抗生素(Bentley 2001)。它由若干种青霉菌所产生，包括短密青霉(P.brevicompactum)、P.scabrum、P.nagemi、娄地青霉(P.roqueforti)、P.patris-mei和纯绿色青霉(P.viridicatum)(Clutterbuck et al.1932，Jens和Filtenborg 1983)。
MPA除了抗菌活性(Abraham 1945)，也具有抗真菌(Gilliver1946)、抗病毒(Ando et al.1968)和抗肿瘤性质(Noto et al.1969)，在临床上已被用于治疗牛皮癣(Johnson 1972)。最近，认识到其是一种强效的免疫抑制剂(Bentley 2000)。
MPA药理性质的至少一个原因是，在若干生物系统中它在单磷酸次黄嘌呤核苷脱氢酶(IMPD)水平上干扰鸟嘌呤的生物合成。因此，MPA对核酸合成具有显著的抑制效应(Franklin和Cook 1969)。IMPD的抑制作用也是MPA的淋巴细胞特异性免疫抑制效应的基础。因为淋巴细胞主要依赖于鸟嘌呤的从头生物合成，这种途径的减少导致抑制T和B淋巴细胞增殖。
MPA被撤出是因为它副作用的高发生率(原发感染如带状疱疹和胃肠副作用如胃部不适)。2-吗啉代乙酯衍生物麦考酚酸吗乙酯(CellCept)没有这些缺点，并比麦考酚酸具有更好的生物利用度。麦考酚酸吗乙酯最近被批准(1995年在美国，1996年在欧洲)用于预防接受同种肾脏移植患者的器官排斥(Shaw和Nowak 1995，Sollinger1995)。经口服给药后，酯形式快速水解为游离酸。然后MPA主要转化为非活性的葡萄糖醛酸代谢产物，其通过尿排泄被清除(Bentley2001，Wiwattanawongsa et al.2001)。
在WO 01/21607、WO 01/64931和GB 1158387中从发酵液中分离MPA。然而从发酵液中分离MPA是无效的。通过常规过程分离到的MPA具有很多的杂质。
本发明提供了分离麦考酚酸的有效方法。
发明概述本发明涉及麦考酚酸及其酯。
本发明的一个实施方案涉及分离麦考酚酸的方法，包括提供含有麦考酚酸的浓缩碱性混合物；将该混合物与第一水不混溶溶剂混合，形成水相和第一水不混溶相；分离水相；在pH小于约7下将水相与第二水不混溶溶剂混合，形成水相和第二水不混溶相；分离第二水不混溶相；浓缩第二水不混溶相；结晶麦考酚酸。
优选含有麦考酚酸的浓缩碱性混合物通过包括以下步骤的方法制备碱化含有麦考酚酸的发酵液，并去除菌丝体，获得碱性混合物；酸化碱性混合物获得酸性混合物；过滤和碱化酸性混合物获得浓缩碱性混合物。
含有麦考酚酸的浓缩碱性混合物也可通过全发酵液萃取制备。
优选浓缩的碱性混合物与第一水不混溶溶剂在pH约8至约11下混合。优选使用氨水或氢氧化钠调节pH。
优选的是，第一或第二水不混溶溶剂至少为C4-C7酯或C4-C7酮的一种。更优选的是，第一或第二水不混溶溶剂至少为乙酸乙酯、乙酸异丁酯或乙酸丁酯的一种。最优选乙酸乙酯。
浓缩的碱性混合物与第一水不相溶相混合后形成水相，优选在与第二水不混溶溶剂混合之前再萃取至少一次。
优选的是，水相和第二水不混溶溶剂在pH约5至6.5下混合。优选使用硫酸、磷酸或盐酸的至少一种调节pH。
在与第二水不混溶溶剂混合后形成的水相优选再萃取至少一次。
所得的来自萃取液的水不混溶相在结晶之前优选通过蒸馏浓缩，更优选通过过滤，最优选通过膜过滤。优选的过滤膜为塑料过滤膜。
麦考酚酸的结晶优选通过冷却浓缩物实现。
在一个优选的实施方案中，通过本发明方法分离的麦考酚酸经HPLC面积百分比测量的纯度至少为约99.5％。
本发明也包括制备含有麦考酚酸的浓缩碱性混合物的方法，包括碱化含有麦考酚酸的发酵液，并去除菌丝体，获得碱性混合物；酸化碱性混合物获得酸性混合物；在碱性pH下过滤酸性混合物获得浓缩的碱性混合物。
优选使用膜过滤进行过滤。优选的过滤膜为陶瓷膜或塑料微滤膜。
优选的是，通过过滤去除菌丝体。去除菌丝体的优选方法包括微滤膜、真空过滤器、带式过滤机、压滤器、真空吸滤过滤器(nutsfilter)、离心或无孔转鼓式离心机。
本发明还包括制备麦考酚酸酯的方法，包括提供含有麦考酚酸的浓缩碱性混合物；将该混合物与第一水不混溶溶剂混合形成水相和第一水不混溶相；分离水相；在pH小于约7下将该水相与第二水不混溶溶剂混合，形成水相和第二水不混溶相；分离第二水不混溶相；浓缩第二水不混溶相；结晶麦考酚酸；以及将麦考酚酸转化为酯。
优选该酯为吗啉代乙酯。也优选该酯为C1-C4烷基酯，更优选为甲酯或叔丁酯。
在一个实施方案中，本发明包括固态麦考酚酸，经HPLC面积百分比测量其纯度至少为约99.5％，优选至少约99.9％。
本发明也包括固态麦考酚酸，经HPLC面积百分比测量其总杂质含量少于约0.1％，优选小于约0.08％。
本发明还包括固态麦考酚酸，其熔点为约141.6℃至约144.6℃，更优选熔点为约143.1℃。
在另一个实施方案中，本发明包括包含本发明麦考酚酸或其酯和药物可接受赋形剂的药物组合物。优选的酯为吗啉代乙酯。
本发明也包括通过给予有需要的哺乳动物治疗有效量的本发明组合物，抑制哺乳动物的免疫系统的方法。
附图简述
图1A是由实施例9产生的麦考酚酸样品的粉末X射线衍射图。
图1B是对应图1A的粉末XRD值的表。
图2A是由实施例10产生的麦考酚酸样品的粉末X射线衍射图。
图2B是对应图2A的粉末XRD值的表。
发明详述本发明包括分离麦考酚酸的方法。本发明的分离方法可产生各种杂质小于约0.1％的MPA。具体而言，本发明包括从麦考酚酸的浓缩碱性混合物中纯化麦考酚酸的方法。也提供了从发酵液制备含有麦考酚酸的浓缩碱性混合物的方法。
本文使用的术语“混合物”包括异质和同质混合物，例如溶液、悬浮液或淤浆。异质混合物，例如，可在萃取期间形成，其中麦考酚酸通过碱化溶于溶剂中。因为异质混合物也可含有其它杂质，不经过滤可能不产生澄清溶液。
本文使用的术语“碱”或“碱性”是指pH大于约7。
本文使用的术语“酸性”是指pH小于约7。
本申请各处的pH值是指水相的pH。
本文使用的术语“浓缩”涉及分离之前的麦考酚酸混合物时是指麦考酚酸的浓度为约5g/l或更高。从发酵液体积计算，从1体积发酵液获得大约1/3体积或更少的浓缩溶液或异质混合物。
可试验通常为本领域已知的发酵方法，从青霉菌菌株中获得MPA，如GB 1,157,099或JP 59091891中所阐述，获得发酵液。
可通过各种方法，例如全发酵液萃取，从发酵液中制备浓缩的混合物，其中将全发酵液的萃取物浓缩成残留物。
在另外一个实施方案中，本发明提供了获得麦考酚酸的浓缩碱性混合物的方法。最初碱化发酵液，随后通过过滤去除菌丝体获得滤液。接着酸化滤液导致MPA的固化。在这个步骤中，形成结晶或悬浮液。通过使用技术人员已知的过滤器如真空鼓式过滤器、微滤膜、带式过滤机、压滤器、真空吸滤过滤器、离心机或无孔转鼓式离心机，实现MPA的浓缩。过滤之后，可将获得的固体或悬浮液添加到水性溶剂中，优选为水，然后碱化获得MPA的碱性水溶液。
优选最初碱化发酵液至pH至少约为8，pH更优选在约8至约11之间。
优选酸化滤液至pH小于约6，更优选在约4至约5.5之间。
本领域已知的常规方法可用于发酵液的过滤或该方法的其它阶段。在一个实施方案中，可通过使用微滤膜，例如陶瓷膜或塑料微滤膜进行过滤。优选的是，微滤膜含有膜通道或膜管。微滤膜技术是获得浓缩的麦考酚酸溶液或悬浮液的经济方法。
可使用任何合适的陶瓷微滤膜，如实施例4中所阐述的那些。可从下列公司获得陶瓷膜，如Atech Innovations Gmbh(Gladbeck，Germany)、US Filter(Sturbridge，MA)、CeraMem Corporation(Waltham，Massachusetts)或PALL(East Hills，NY)。可使用任何适合微滤的孔径。优选的是，孔径在约50nm至约5000nm的范围内，更优选在约100nm至约250nm的范围内。陶瓷膜可由以下材料制成，例如α氧化铝、二氧化硅或碳化硅。一般而言，膜是管状的，尽管横切面也可以是方形的。
在另外一个实施方案中，使用塑料微滤膜。可使用任何合适的微滤膜，如实施例5或实施例6所阐述的。依据所使用的塑料微滤膜的类型，孔径、膜材料或形状可有所变化。例如，由KOCH(Wilmington，MA)制造的膜MFK-617孔径小于约500nm。膜MFK-617是管状的，由PES制成。由KOCH制造的膜HFM-180截留分子量为250,000D，相当于大约100nm-250nm的孔径。HFM-180是管状的，由PVDF制成。
空心纤维型膜也是适用的，例如PM-100或PM-500，都由KOCH生产。两种膜都由PS制成。PM-100的截留分子量为100,000D。PM-500的截留分子量为500,000D。
制备浓缩的碱性混合物之后，通过上述的方法或通过全发酵液萃取，本发明提供了从混合物中分离麦考酚酸的有效方法。
可通过使用水不混溶溶剂萃取浓缩的碱性水混合物而分离MPA。在一个实施方案中，通过使用与水不混溶溶剂第一次萃取浓缩的混合物，优选在碱性pH下，以去除碱性溶液中的杂质，随后进行第二次萃取，优选在酸性pH下，以获得MPA在有机溶剂中的溶液，从而分离MPA。
在一个实施方案中，通过将浓缩的碱性水混合物与水不混溶溶剂混合以形成水相，分离水相，将该水相在pH小于约7下与水不混溶溶剂混合，形成水相和水不混溶相，分离水不混溶相，浓缩水不混溶相，从浓缩液中结晶麦考酚酸，从而分离MPA。
使用水不混溶有机溶剂可从碱性溶液或混合物的第一次萃取物中去除杂质。优选第一次萃取在碱性pH下进行，优选在至少约8的pH下，更优选在约8.3至约9.2下。该萃取步骤优选进行至少二次。
第一次萃取之后，可将水相酸化成pH小于约7，优选约5至约6.5，以使用水不混溶有机溶剂进行第二次萃取，获得麦考酚酸在有机溶剂中的溶液。也可重复第二次萃取。优选合并萃取的有机相。
本发明分离麦考酚酸的方法有效去除了MPA杂质和相关物质。通过进行一系列的碱性和酸性萃取，更容易并高纯度的获得MPA。
通过结晶可从溶液中回收麦考酚酸。在结晶之前，可浓缩溶液。例如，可通过蒸发浓缩溶液。可在常压或减压下，或任选通过加热如在回流温度下进行蒸发。也可通过膜过滤浓缩该溶液。优选在大气压力下或减压通过蒸馏浓缩溶液。术语“减压”是指压力低于一个大气压，优选低于约100mmHg。优选溶液浓缩成约100g/l至约300g/l，更优选浓缩至约200g/l。
从溶液中结晶麦考酚酸优选通过冷却进行。优选的是，通过将溶液冷却到约0℃至约-20℃的温度，更优选至约-10℃，从溶剂如乙酸乙酯中进行结晶。其它用于结晶的合适溶剂包括但不限于乙酸异丁酯、丙酮、异丙醇、水(在更高温度下)、甲苯/丙酮混合物、乙醇/水混合物或甲醇/水混合物、一般的C3-C7酯、或C3-C7酮或C1-C4醇。在结晶之前可将溶剂加热到合适的温度以溶解麦考酚酸。例如，当使用水作为结晶溶剂时，可将水加热到至少约50℃。
可干燥回收的晶体，优选在约50℃至约70℃温度下干燥。优选在减压下干燥晶体，即小于一个大气压，更优选在小于约100mmHg的压力下。可任选重结晶晶体。重结晶可任选在第一次用活性炭处理后进行。
优选可使用氨水或其它合适的碱获得碱性pH。碱的实例包括，例如，有机胺、碱金属氢氧化物、碱土金属氢氧化物或碱金属或碱土金属的碳酸盐或碳酸氢盐。碱的具体实例包括，例如，1，8-双(N，N-二甲氨基)萘、三乙胺、甲醇钠、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钙或碱性氧化铝。优选的碱为氨水。
使用适合于调节溶液pH的酸，例如硫酸、磷酸或盐酸，可获得酸性pH。优选的酸包括硫酸或磷酸。
在萃取的各个阶段可独立选择水不混溶有机溶剂。可使用任何适用于萃取MPA的水不混溶溶剂。合适溶剂的实例包括但不限于C4-C7酯或酮的至少一种。更具体而言，合适酯具有通式R1-C(O)O-R2，其中R1为H或线性或支链C1-6烷基，R2为线性或支链C1-6烷基。合适酯的实例包括但不限于乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸正丙酯、乙酸异丙酯、乙酸正丁酯、乙酸异丁酯、乙酸叔丁酯、甲酸甲酯、甲酸正丙酯、甲酸异丙酯、甲酸正丁酯或甲酸异丁酯。更具体而言，合适的脂族酮具有通式R1-C(O)-R2，其中R1和R2独立为线性或支链烷基，每一个都具有1-4个碳原子。脂族酮的实例包括但不限于甲基乙基酮或甲基异丁基酮。此外，也可使用溶剂如二氯甲烷或二氯乙烷。
本发明的麦考酚酸进行100％测定。测定是指测定纯度或测定存在的物质量，如欧洲药典所述(“EP”)。欧洲药典第四版，欧洲理事会，斯特拉斯堡，2001。使用高效液相色谱(“HPLC”)进行测定。
在一个实施方案中，本发明提供的MPA的熔点为约141.6℃至约144.6℃，更优选为约143.1℃。
在另一个实施方案中，本发明提供的MPA的纯度为至少约99.5％，更优选至少约99.9％。经HPLC面积百分比测量，优选MPA的总杂质含量小于约0.2％，更优选小于约0.08％。
可将本文制备的麦考酚酸转化为酯，如C1-C4烷基酯如甲酯、乙酯或丁酯。一个优选的实施方案为酸的吗啉代乙酯。通过本领域已知的方法可进行麦考酚酸的酯化。参见例如美国专利第4,753,935号、第5,543,408号和第5,247,083号、WO 00/34503和WO 02/100855。
本发明的药物制剂含有麦考酚酸或其酯或盐。本发明也包括通过给予有需要的哺乳动物治疗有效量的药物组合物，抑制哺乳动物免疫系统的方法。
药物组合物可只含有单种多晶形，或各种晶形的混合物，有或没有无定形形式。除了活性成分，本发明的药物组合物可含有一种或多种赋形剂或辅料。制剂科学家依据经验、考虑标准程序和参照本领域的著作，可轻易地决定赋形剂的选择和量。
稀释剂增加了固体药物组合物的体积，可使得含有组合物的药物剂型较易被患者和护理人员处理。用于固体组合物的稀释剂包括，例如，微晶纤维素(例如Avicel)、超细纤维素、乳糖、淀粉、预胶化淀粉、碳酸钙、硫酸钙、蔗糖、葡萄糖结合剂、糊精、右旋糖、二水合磷酸氢钙、磷酸钙、高岭土、碳酸镁、氧化镁、麦芽糊精、甘露醇、聚甲基丙烯酸酯(例如Eudragit)、氯化钾、粉状纤维素、氯化钠、山梨醇和滑石粉。
被压成如片剂的剂型的固体药物组合物，可包含赋形剂，其功能包括有助于使活性成分与其它赋形剂经压缩后结合在一起。用于固体药物组合物的粘合剂包括阿拉伯胶、海藻酸、卡波姆(例如聚羧乙烯)、羧甲基纤维素钠、糊精、乙基纤维素、明胶、瓜尔胶、氢化植物油、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素(例如Klucel)、羟丙基甲基纤维素(例如Methocel)、液状葡萄糖、硅酸镁铝、麦芽糊精、甲基纤维素、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯吡咯烷酮(例如Kollidon，Plasdone)、预胶化淀粉、海藻酸钠和淀粉。
压制的固体药物组合物在患者胃内的溶出率可通过向组合物添加崩解剂而增加。崩解剂包括海藻酸、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠(例如Ac-Di-Sol，Primellose)、胶体二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮(例如Kollidon，Polyplasdone)、瓜尔胶、硅酸镁铝、甲基纤维素、微晶纤维素、波拉克林钾、粉状纤维素、预胶化淀粉、海藻酸钠、淀粉羟乙酸钠(例如Explotab)和淀粉。
可添加助流剂以改善非压制固体组合物的流动性和改善剂量的精确度。可作为助流剂使用的赋形剂包括胶体二氧化硅、三硅酸镁、粉状纤维素、淀粉、滑石粉和磷酸钙。
当剂型如片剂是由粉末状组合物压制而制成时，组合物受到来自冲头和模(dye)的压力。一些赋形剂和活性成分趋向于黏附在冲头和模的表面，这可导致产品具有凹陷和其它的表面不规则。可向组合物添加润滑剂以降低黏附，并易于从模中释放产物。润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸钙、单硬脂酸甘油酯、硬脂酰棕榈酸甘油酯、氢化蓖麻油、氢化植物油、矿物油、聚乙二醇、苯甲酸钠、月桂基硫酸钠、硬脂酰富马酸钠、硬脂酸、滑石粉和硬脂酸锌。
调味剂和香味增强剂使得剂型对患者更加适口。可包含在本发明组合物中的药品常用调味剂和香味增强剂包括麦芽酚、香草醛、乙基香草醛、薄荷醇、柠檬酸、富马酸、乙基麦芽酚和酒石酸。
也可使用任何药物可接受着色剂对固体和液体组合物染色以改善它们的外观，和/或便于患者鉴别产品和单位剂量水平。
在本发明的液体药物组合物中，将MPA和任何其它固体赋形剂溶解于或悬浮于液体载体中，如水、植物油、醇、聚乙二醇、丙二醇或甘油。
液体药物组合物可含有乳化剂，以在组合物中均匀分散不溶于液体载体的活性成分或其它赋形剂。可用于本发明液体组合物的乳化剂包括，例如，明胶、蛋黄、酪蛋白、胆固醇、阿拉伯胶、黄蓍树胶、爱兰苔胶(chondrus)、果胶、甲基纤维素、卡波姆、十八醇十六醇混合物和十六醇。
本发明的液体药物组合物也可含有粘度增强剂以改善产品的口感和/或涂布胃肠道的内壁。这种试剂包括阿拉伯胶、海藻酸、膨润土、卡波姆、羧甲基纤维素钙或钠、十八醇十六醇混合物、甲基纤维素、乙基纤维素、明胶、瓜尔胶、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、碳酸丙烯、海藻酸丙二醇酯、海藻酸钠、淀粉羟乙酸钠、淀粉、黄蓍树胶和黄原胶。
可添加甜味剂如山梨醇、糖精、糖精钠、蔗糖、阿司帕坦、果糖、甘露醇和转化糖以改善味觉。
可在安全摄入水平上添加防腐剂和螯合剂，如醇、苯甲酸钠、丁羟甲苯、丁羟茴香醚和乙二胺四乙酸，以改善储存稳定性。
依据本发明，液体组合物也可含有缓冲剂如葡萄糖酸、乳酸、柠檬酸或乙酸、葡萄糖酸钠、乳酸钠、柠檬酸钠或乙酸钠。
本发明的固体组合物包括粉末、颗粒、凝聚物和压制组合物。剂量包括适用于口服、口颊、直肠、胃肠外(包括皮下、肌内和静脉)、吸入和眼科用药的剂量。尽管在任何特定情况下最合适的给药将依赖于待处理疾病的性质和严重性，本发明最优选的途径为口服。剂量可方便地以单位剂型呈现，并通过药学领域熟知的任何方法进行制备。
剂型包括固体剂型如片剂、粉剂、胶囊剂、栓剂、囊剂、含片和锭剂，以及液体糖浆剂、悬浮剂和酏剂。
本发明的剂型可以是在硬壳或软壳内含有组合物的胶囊剂，优选含有本发明的粉末状或颗粒状固体组合物。胶囊壳可由明胶制得，任选含有增塑剂如甘油和山梨醇，以及遮光剂或着色剂。
依据本领域已知的方法可将活性成分和赋形剂制成组合物和剂型。
可通过湿法制粒制备用于片剂或胶囊填料的组合物。在湿法制粒中，一些或所有活性成分和赋形剂以粉末形式混合，然后存在液体时进一步混合，导致粉末凝聚成颗粒，液体典型的为水。过筛和/或粉碎颗粒，干燥，然后过筛和/或粉碎得到希望的粒度。然后可将颗粒制成片，或在制片之前添加其它赋形剂，如助流剂和/或润滑剂。
可通过常规的干法混合制备压片组合物。例如，可将活性成分和赋形剂的混合组合物压成压缩块或片，然后粉碎成紧实的颗粒。随后可将紧实的颗粒压成片剂。
作为干法制粒的替代，可使用直接压片技术将混合的组合物直接压成压制剂型。直接压片法产生了更均匀的片剂而不需要颗粒。非常适合于直接压片的赋形剂包括微晶纤维素、喷雾干燥的乳糖、二水合磷酸氢钙和胶体二氧化硅。直接压片中的这些和其它赋形剂的适合用法，为本领域具有直接压片具体制剂方面的经验和技能的技术人员所已知。
本发明的胶囊填料可包含任何以上关于压片所描述的掺合物和颗粒，但它们并不经历最终的压片步骤。
实施例分析的HPLC方法使用Discovery ciano或Zorbax C8柱进行HPLC分析。洗脱液为含有磷酸和磷酸钾盐的水-乙腈混合物。可使用磷酸的三乙胺盐代替磷酸钾盐。洗脱液的pH为3.0-5.9。洗脱流速为大约1.5ml/分钟。洗脱温度为20-45℃。
实施例1麦考酚酸的纯化使用800ml浓氨水溶液调节140kg浓缩的麦考酚酸悬浮液(从620kg发酵液产生)至pH为8.3-8.5。使用80L乙酸乙酯纯化该碱性溶液。将乙酸乙酯与碱性溶液混合，搅拌30分钟，分离各相。
往获得的水相(147kg)中加入80L乙酸乙酯。用硫酸调节pH至5.8，搅拌30分钟，分离各相。
往获得的水相(150kg)中加入40L乙酸乙酯。pH调节至5.9，搅拌30分钟，分离各相。
合并两次酸性萃取的乙酸乙酯相，减压下最高70℃浓缩至大约200g/l的浓度。将浓缩的乙酸乙酯溶液加热到60-65℃，以大约3℃/小时的冷却速率冷却至-10℃，允许-10℃下结晶18小时。过滤晶体，使用冷乙酸乙酯覆洗(coverwash)。减压下最高70℃干燥晶体。晶体的质量1250g。测定99.0％。
使用活性炭处理后从乙酸乙酯中重结晶晶体。重结晶产物测定为99.6％。晶体的HPLC纯度为99.8％。任何杂质少于0.1％。
实施例2麦考酚酸的纯化将71.6L乙酸乙酯加到119.4kg浓缩的麦考酚酸悬浮液(从420kg发酵液生产)中。用浓氨水调节pH至9.1，搅拌30分钟，分离各相。
往水相(126.8kg)中加入63.4L乙酸乙酯。使用浓氨水调节pH至9.1-9.2，搅拌30分钟，分离各相。
往获得的水相(129.5kg)中加入71.6L乙酸乙酯。使用硫酸调节pH至5.6-5.7，搅拌30分钟，分离各相。
往获得的水相(130.6kg)中加入39.2L乙酸乙酯。使用浓氨水调节pH至5.9，搅拌30分钟，分离各相。
合并两次酸性萃取的乙酸乙酯相，减压下最高70℃浓缩至大约200g/l浓度。
将浓缩的乙酸乙酯溶液加热到60-65℃，以大约3℃/小时的冷却速率冷却至-10℃，允许-10℃下结晶3小时。过滤晶体，使用冷乙酸乙酯覆洗。减压下最高70℃干燥晶体。晶体的质量553g。测定98.2％。
使用活性炭处理后从乙酸乙酯中重结晶晶体。重结晶产物测定为99.2％。晶体的HPLC纯度为99.7％。任何杂质少于0.1％。
实施例3浓缩的麦考酚酸的制备调节发酵液(15kg)的pH至8.0-11.0。过滤碱性的发酵液，使用水洗涤滤出的菌丝体。滤液为37.6kg。在滤液中获得91.1％的发酵活性成分。使用硫酸调节滤液的pH至2.0-2.2。往酸性滤液中加入助滤剂(珍珠岩)，滤出沉淀物。将滤出的沉淀物悬浮悬浮于5L水中，使用氢氧化钠溶液调节悬浮液的pH至pH 8.0-11.0。过滤并洗涤碱性悬浮液，获得8L碱性的滤液。
该碱性悬浮液用于纯化麦考酚酸，如实施例1或2。
实施例4浓缩的麦考酚酸的制备调节发酵液(45kg)的pH至8.0-11.0。过滤碱性的发酵液，使用水洗涤滤出的菌丝体。滤液为113.7kg。在滤液中获得93.2％的发酵活性成分。使用稀磷酸调节滤液的pH至4.0-4.5。使用100nm-250nm孔径的微滤陶瓷膜过滤悬浮液。使用氨水溶液调节浓缩的悬浮液(约10L)至pH 7.5-11.0。
该碱性悬浮液用于纯化麦考酚酸，如实施例1或2。
实施例5浓缩的麦考酚酸的制备调节发酵液(220kg)pH至约8.0。通过微滤塑料膜(例如MFK-617和HFM-180，KOCH生产)过滤发酵液。在过滤期间不断加入水以进行稀释。获得1100kg的滤液。调节滤液pH至约4.0，将晶体的悬浮液浓缩至约70L。然后调节浓缩的酸性悬浮液的pH至pH 7.5-11.0的碱性。
该碱性悬浮液用于纯化麦考酚酸，如实施例1或2。
实施例6麦考酚酸的纯化往14m3收集的发酵液中加入等体积的饮用水，接着加入168L(1.2％)的浓氨水溶液。按起始发酵液的1％量加入助滤剂(珍珠岩)，通过添加浓的85％磷酸溶液(大约100L)调节pH在8.0-8.5之间。室温下不搅拌，将处理的发酵液保持至少6小时。使用饮用水覆洗期间在真空鼓式过滤机上进行过滤。得到42m3的滤液。发酵液过滤的收率约为90％。
通过添加20％硫酸溶液(约300L)调节过滤发酵液的pH至4.0-4.5。至少3小时后，过滤沉淀的粗晶体，在微滤膜(MFK-617，KOCH)上浓缩。将调节过pH的42m3过滤的发酵液浓缩到1/40体积(约1.0-1.2m3)。过滤时间大约为60小时。使用约2m3酸性水稀释浓缩溶液，再次将浓缩溶液浓缩到1.0-1.2m3。移去浓缩溶液后，使用0.3-0.5m3的酸性饮用水洗涤设备。沉淀和浓缩的收率约为80％。
将1.0-1.2m3浓缩液和0.3-0.5m3酸性洗涤水合并，加入0.5-0.6倍体积的乙酸乙酯(约0.8m3)，使用浓氨水溶液调节pH至9.0-9.2之间。萃取30分钟，pH调节至9.0-9.2之间。然后分离各相。
再次往水相中加入0.5-0.6倍体积的乙酸乙酯(约0.8m3)(按合并的酸性浓缩液体积计算)，使用浓氨水溶液/20％硫酸溶液调节pH至9.0-9.2之间。萃取30分钟，调节pH至9.0-9.2之间。然后分离各相。
往水相中加入0.5-0.6倍体积的乙酸乙酯(按合并的酸性浓缩液体积计算)，使用20％硫酸溶液调节pH至5.8-6.1之间。萃取30分钟，调节pH至5.8-6.1之间。然后分离各相。
往水相中加入0.25-0.3倍体积的乙酸乙酯(约0.8m3)(按合并的酸性浓缩液体积计算)，使用浓氨水溶液调节pH至6.3-6.5之间。萃取30分钟，调节pH至6.3-6.5之间。然后分离各相。
合并第三和第四次的乙酸乙酯相，减压下最高70℃蒸发至约200g/l(基于合并相的蒸发残留物)。蒸发的最终体积约为150L。萃取和蒸发的收率约为90％。
将乙酸乙酯浓缩液(约150L)冷却到-10℃至-17℃(冷却速率约为3℃/小时)，在这个温度下结晶至少2小时。使用45L冷冻的乙酸乙酯洗涤晶体，减压下最高70℃干燥。经晶体的质量约为25kg。结晶收率约为87％。
60-65℃下将晶体(25kg)溶于10倍质量体积的乙酸乙酯(250L)。使用活性炭处理溶液，然后过滤。-10℃至-17℃下结晶麦考酚酸，过滤晶体，-10℃至-17℃下使用75L乙酸乙酯覆洗。减压下最高70℃进行干燥。最终结晶的收率约为90％。
实施例7麦考酚酸的纯化发酵液过滤成3部分(3×225kg)。
往第一个225kg的发酵液中加入等体积的水，随后加入1.2％的浓氨水(据发酵液量计算)，通过添加20％磷酸溶液调节pH至8.0-8.5。不搅拌保持处理过的发酵液约6小时，40-43℃下通过微滤塑料膜过滤(MFK-617和HFM-180，KOCH)。在过滤时不断加入水以进行稀释。获得1125kg的滤液。
通过添加20％的硫酸调节滤液的pH至4.0-4.5。约3小时后，将晶体悬浮液浓缩至约70L体积。收集浓缩的麦考酚酸晶体悬浮液(约70L)，使用70L水循环洗涤微滤器。也收集洗涤液(约70L)。
通过添加浓氨水溶液调节酸性浓缩液的渗透液至pH 8.0-8.5，用于下一个225kg发酵液的稀释和过滤。
以上述相同的方式进行第二个(225kg)和第三个(225kg)发酵液的过滤和酸性沉淀浓缩，除了在第三个酸性沉淀(pH 4.0-4.5)的浓缩后，合并约70L的第一浓缩液和70L的第二浓缩液，将总量浓缩到100kg。收集晶体悬浮液，用70L水洗涤，获得74L的洗涤液。将浓缩液和洗涤液合并。
往174kg浓缩的麦考酚酸悬浮液(从675kg发酵液制得)中添加104.4L乙酸乙酯，使用浓氨水溶液调节pH至9.1。搅拌30分钟，分离各相。往水相(183kg)中加入104.4L乙酸乙酯。使用浓氨水调节pH至9.2，搅拌30分钟，分离各相。
往获得的水相中(185.4kg)添加104.4L乙酸乙酯，使用硫酸调节pH至5.9-6.0。搅拌30分钟，分离各相。往获得的水相中(176.4kg)添加43.5L乙酸乙酯，使用浓氨水调节pH至6.4，搅拌30分钟，分离各相。合并两次酸性萃取的乙酸乙酯相，减压下最高70℃浓缩至约200g/l的浓度。将浓缩的乙酸乙溶液加热到60-65℃，以约3℃/小时的冷却速率冷却到-10℃，在-10℃下结晶8小时。过滤晶体，使用乙酸乙酯覆洗，减压下最高70℃干燥。晶体的质量970g。测定99.4％。
使用活性炭处理后从乙酸乙酯中重结晶晶体。晶体的HPLC纯度为99.8％。任何杂质少于0.1％。
实施例8麦考酚酸的纯化以实施例7相同的方式纯化麦考酚酸，除了在pH 9.0-9.2纯化麦考酚酸3次。
最终的晶体测定为100％，总杂质含量为0.07％。
实施例9麦考酚酸来自实施例8的终产物的熔点为143.1℃。
X射线粉末衍射图在图1中阐述。
实施例10麦考酚酸重复实施例8。终产物的熔点为143.1℃。
X射线粉末衍射图在图2中阐述。
参照具体的优选实施方案和说明性实例描述了本发明，本领域的技术人员可以理解所描述和说明的本发明的变化，此变化不背离本说明书中公开的本发明的精神和范围。提出实施例是为了帮助理解本发明，而不为了也不应当被解释为以任何方式限制了它的范围。实施例不包括常规方法的详述。这种方法为本领域普通技术人员所熟知，并在无数出版物中得到描述。所有本文提及的参考文献通过引用整体结合到本文中。
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权利要求
1.一种分离麦考酚酸的方法，所述方法包括以下步骤a)提供含有麦考酚酸的浓缩碱性混合物；b)将所述混合物与第一水不混溶溶剂混合，形成水相和第一水不混溶相；c)分离水相；d)在pH小于约7下将水相与第二水不混溶溶剂混合，形成水相和第二水不混溶相；e)分离第二水不混溶相；f)浓缩第二水不混溶相；和g)结晶麦考酚酸。
2.权利要求1的方法，其中步骤(b)的混合在约8至约11的pH下。
3.前述权利要求任一项的方法，其中使用氨水或氢氧化钠调节pH。
4.前述权利要求任一项的方法，其中至少第一或第二水不混溶溶剂之一为C4-C7酯、C4-C7酮或其混合物。
5.前述权利要求任一项的方法，其中至少第一或第二水不混溶溶剂之一为乙酸乙酯、乙酸异丁酯、乙酸正丁酯或其混合物。
6.前述权利要求任一项的方法，其中第一或第二水不混溶溶剂为乙酸乙酯。
7.前述权利要求任一项的方法，其中通过至少重复步骤(b)一次，进一步萃取步骤(c)中的水相。
8.前述权利要求任一项的方法，其中步骤(d)的pH为约5至约6.5。
9.前述权利要求任一项的方法，其中步骤(d)的pH使用硫酸、磷酸或盐酸的至少一种调节。
10.前述权利要求任一项的方法，其中通过至少重复步骤(d)一次，进一步萃取步骤(d)中的水相。
11.前述权利要求任一项的方法，其中通过蒸馏实现步骤(f)中的浓缩。
12.前述权利要求任一项的方法，其中通过过滤实现步骤(f)中的浓缩。
13.权利要求12的方法，其中所述过滤通过膜过滤实现。
14.权利要求13的方法，其中所述过滤膜为塑料过滤膜。
15.前述权利要求任一项的方法，其中通过冷却浓缩物实现结晶。
16.前述权利要求任一项的方法，其中获得的麦考酚酸经HPLC面积百分比测量其纯度为至少约99.5％。
17.前述权利要求任一项的方法，其中所述含有麦考酚酸的浓缩碱性混合物通过全发酵液萃取制备。
18.前述权利要求任一项的方法，其中通过包括以下步骤的方法获得含有麦考酚酸的浓缩碱性混合物a)碱化含有麦考酚酸的发酵液，去除菌丝体，获得碱性混合物；b)酸化碱性混合物，获得酸性混合物；c)过滤和碱化酸性混合物，获得浓缩的碱性混合物。
19.一种制备含有麦考酚酸的浓缩碱性混合物的方法，所述方法包括以下步骤a)碱化含有麦考酚酸的发酵液，去除菌丝体，获得碱性混合物；b)酸化碱性混合物，获得酸性混合物；c)过滤和碱化酸性混合物，获得浓缩的碱性混合物。
20.权利要求19的方法，其中步骤(c)的过滤通过膜过滤实现。
21.权利要求19或20的方法，其中所述过滤膜为陶瓷膜或塑料微滤膜。
22.权利要求19-21任一项的方法，其中步骤(a)中的菌丝体通过过滤去除。
23.权利要求19-22任一项的方法，其中菌丝体通过微滤膜、真空鼓式过滤器、带式过滤机、压滤器、真空吸滤过滤器、离心或无孔转鼓式离心机去除。
24.一种制备麦考酚酸酯的方法，所述方法包括以下步骤a)提供含有麦考酚酸的浓缩碱性混合物；b)将所述混合物与第一水不混溶溶剂混合，形成水相和第一水不混溶相；c)分离水相；d)在pH小于约7下将水相与第二水不混溶溶剂混合，形成水相和第二水不混溶相；e)分离第二水不混溶相；f)浓缩第二水不混溶相；g)结晶麦考酚酸；h)将步骤(g)的麦考酚酸转化为酯。
25.权利要求24的方法，其中所述酯为吗啉代乙酯。
26.权利要求24的方法，其中所述酯为C1-C4烷基酯。
27.权利要求24或26的方法，其中所述酯为甲酯或叔丁酯。
28.固态麦考酚酸，经HPLC面积百分比测量其纯度为至少约99.5％。
29.前述权利要求任一项的麦考酚酸，经HPLC面积百分比测量其纯度为至少约99.9％。
30.固态麦考酚酸，经HPLC面积百分比测量其总杂质含量小于约0.1％。
31.前述权利要求任一项的麦考酚酸，经HPLC面积百分比测量其总杂质含量小于约0.08％。
32.固态麦考酚酸，所述麦考酚酸的熔点为约141.6℃至约144.6℃。
33.前述权利要求任一项的麦考酚酸，所述麦考酚酸的熔点为约143.1℃。
34.一种药物组合物，所述组合物包含前述权利要求任一项的麦考酚酸或其酯和药物可接受赋形剂。
35.权利要求34的组合物，其中所述酯为吗啉代乙酯。
36.权利要求34或35的药物组合物在有需要的哺乳动物中抑制免疫系统的用途，所述用途包括给予哺乳动物治疗有效量的组合物。
全文摘要
提供了制备麦考酚酸的方法。
文档编号C07D307/88GK1906186SQ200580001733
公开日2007年1月31日 申请日期2005年4月26日 优先权日2004年4月26日
发明者V·克里, Z·措维克 申请人:特瓦药厂私人有限公司