专利名称：用于治疗过敏性疾病的IgE重定位、功能性改变分子(ERFAM)的制作方法
性疾病的IgE重定^f立、功能性改变分子(ERFAM)技术领域型抑制剂的分子。所述分子是有用的，例如，用于治疗过敏症及其 4也IgE才目关的疾病。
背景技术：
世界上超过5亿人患有过敏症且过敏症的流行在快速增加，影 响的主要是儿童及年轻人。在英国，每年由过每丈症引起的医疗花费 超过10亿，在美国超过100亿，但是社会的总代价显然更高。过敏症的特点是产生特异于某一抗原(过敏原)的IgE型抗体， 引发免疫反应。 一旦所述过每文原进入体内，特异性IgE的存在引发 过敏性反应。IgE生物学及其在过敏性疾病中的作用已经被研究了。 参阅侈寸^口 Gould等户斤著的Annual Rev Immunol 2003, 21 :579—628.当 过每文原进入体内时，由于IgE在各个过每文原与过壽丈症效应细l包的活 化装置所代表的引发机制之间建立起一种连接从而引发过每文性反 应。IgE建立这种连4妄是由于其双功能结合特性在一端有两个过 壽文原特异性结合位点(F抗原结合-Fab)，在另一端，IgE的持续结 合4立点(Fc)与高亲和力IgE受体(FceRI)结合。FcsRI分子本身是双功能分子其细胞外区域与IgE结合的同 时，其细胞内区域包含能够引发活化信号级层的活性位点。在过每文 症中可能还包括低亲和力的IgE受体(FceRII/CD23)。
其他研究针对的是在过 丈原特异性免疫疗法(SIT)中IgG的作 用和诱导。研究说明，在SIT导致病原性IgE增加的同时也会导致 IgG及IgG4水平更高的上升。参阅例如DK Ledford 4十对RF Lockley 和SC Bukantz Eds.的文章过壽文原与过壽丈原免疫疗法，Marcel Dekker 1999, pp.359-371戶斤写的"i平^仑。矛J用体内皮月夫,泉杀'H式马全滴定 证明SIT之后诱导的过敏原特异性IgG的量与皮肤反应的减少有关， 进一步i正明上述研究。参阅例々n Witteman等等1996 International Archives of Allergy and Immunology 109: 369-375.确实，在开始急需 的免疫疗法几周内，当过敏原特异IgE水平依旧较高但特异IgG4 有所增加时，过敏原的临床反应有所减少。参阅例如，Lack等等1997 年在Journal of Allergy and Clinical Immunology 99: 530-538上发表 的文献。
发明内容
包4舌在本发明范围内的是至少一种结构式为A'-B'的IgE重定 位、功能性转变分子(ERFAM)构建物，其中A，代表与IgE结合的 部分，B，代表与限制性受体结合的部分。在一些实施方案中，A'和 B，被可操作的连接起来。作为选择，ERFAM的结构式也可以是 A，-X-B，，其中，A，代表与IgE结合的部分；X代表连接体部分；B， 代表与限制性受体结合的部分；其中A，-X-B，被可才喿作的连接起来。 ERFAM构建物在治疗IgE相关疾病或不适是有用的，所述IgE相关 疾病或不适包4舌对至少一种过每文原有过每文反应。在本发明的一种实 施方案中，ERFAM与IgE结合并将其转换为过每l症的抑制剂。在不 同的实施方案中，ERFAM特异地识别和结合至少一种，至少两种， 或者至少三种或三种以上抗原决定基。这也被称为至少单特异性，至少X5L特异性，或至少多特异性。在一特定的实施方案中，ERFAM 构建物的A，和B，部分提供了第一和第二特异性。在ERFAM至少是 双特异性的相关的实施方案中，第一特异性是对于IgE的，第二特 异性在功能上与IgG4抗体Fc部分相等。在相关的实施方案中，至 少双特异性的ERFAM组合物包括第一部分，该部分包括IgG4同型 的抗IgE抗体部分，其中所述组合物与至少 一种包括IgE的抗原决 定基结合〗旦是不交耳关与细胞结合的IgE。
在ERFAM是至少双特异性的可选择性实施方案中，第一特异 性是对于IgE的，第二特异性是对于结合抑制细胞表面受体的。具 体的可选才奪性的双特异性ERFAM组合物包括一种识别和结合抑制 细月包表面受体的结构，所述受体选自由包含免疫受体酪氨酸抑制性 基序的(ITIM)受体及导致凋亡受体所组成的组。
在具体实施方案中，本发明包括包含过壽文原特异性IgG4抗体的 ERFAM分子。在另一种形式的实施方案中，至少一种A，部分或至 少一种B，部分是只有在与IgE结合时能自然地线性化的环肽。在此 实施方案中，环肽特异性地与IgE分子结合使之线性化。在更具体 的实施方案中，包括至少一种IgE特异性环肽的ERFAM分子，在 与IgE结合^吏环肽线性化后，与FqR或相应的抑制性受体结合。
分子式A，-X-B，包括不同的连接体X,所述连接体X可操作的 连才妄至少一种A，部分和至少一种B，部分。在具体实施方案中，连孑妻 体X包括聚乙二醇("PEG")连接体。其他连接体X组合物包括至 少一种氨基酸， 一种多肽，或其他一些本领域所知的能够可才喿作地 连接至少两种多肽部分的化学部分。在优选的实施方案中，连接体 X组合物是非免疫原性的。在包含PEG连接体X的ERFAM组合物 中，ERFAM在体内的有延长的循环半衰期。在相关的实施方案中， 包含PEG连接体X的ERFAM组合物免疫原性减少。在某些实施方案中，ERFAM组合物在药用载体中。在伊乙选的实 施方案中提供了有效治疗剂量的ERFAM。也4是供了一种在容器中 包含至少 一种ERFAM组合物的试剂盒。
本发明还提供了使用ERFAM组合物的方法。在一种实施方案 中，所述方法包括，对需要调节与IgE相关超敏性反应作用的患者， 施用有效治疗剂量的ERFAM分子。在具体实施方案中，应用此方 法来治疗过敏症。在优选的实施方案中，施用的ERFAM分子包含 过每文原特异性IgG4 #元体部分。
最后，^是供了至少一种生产ERFAM分子的方法，其中，所述 方法包4舌生产ERFAM分子并〗夸其/人杂质中纯^^。
领域普通技术人员所理解的含义相同。尽管在实践或测试本发明时 可以 <吏用与这里描述相似或相同的方法和才才津十， <旦合适的方法和材 料在下面进行描述。这里提到的所有出版物，专利申请，专利及其 他参考文献都通过在此引i正而全部并入本文。在相冲突的情况下， 以本i兌明书，包4舌定义为准。另夕卜，材泮十，方法和实施例只是i兌明 性的，并不起到限制作用。
从后面的详细说明和权利要求书中可以清楚地得到本发明的其 他特4正和优点。
图.1是IgE重定位、功能性改变分子(ERFAM ) i殳计和活动才莫 式的表现。所述分子与IgE分子结合于其Fc区域，结合结果能够干 涉IgE与IgE受体(FcsRI和FceRII)的结合。同时，ERFAM为具有 不同功能的受体4是供了不同的结合位点，,人而将IgE转换为过每丈症抑制型抗体。由于ERFAM依赖性重定位，免疫效应细月包含有FceRI 结合的IgE及IgE结合的抑制性受体(例如FcyRIIb ),当抗原接触 到的免疫岁文应纟田月包(例如月巴大细月包或B细月包)时，FcsRI与FcyRIIb 的交联作用会导致对过每文症受动器活化作用的抑制。
图.2是柱形图，显示了利用本发明的示例性ERFAM来抑制嗜 石咸细胞的活化作用。
图.3是柱形图，显示了利用本发明的示例性ERFAM来抑制嗜 石威细力包的活4匕作用。
图.4是柱形图，显示了利用本发明的示例性ERFAM来抑制嗜 石咸细月包的活^^卡用。
具体实施例方式
本发明的ERFAM构建物
本发明提供的是能够将IgE抗体转变为过敏症的过敏原特异性 抑制剂的构建物。在此描述了几种类型的所述抑制剂，并被称为IgE 重定4立、功能'l"生改变分子(ERFAM )。
图1 一是供了 ERFAM结合的i兌明。ERFAM结合于IgE的Fc区 域。ERFAM结合的结果封闭了其他分子与IgE的Fc区域的相互作 用，从而干预IgE与IgE受体(FcsRI和FcsRII)的结合。同时，ERFAM 提供了对具有不同功能受体有特异性的第二结合位点。因此， ERFAM与IgE之间的第 一结合和ERFAM与具有不同功能受体之间 的第二结合将IgE转换成过每文原抑制性抗体。由于IgE通常是过每文原特异性的，对循环的和与肥大细胞相结
合的IgE的结合将能够允许抑制对过敏原的由IgE调节的免疫反应， 并且不干予贞7于其他j元原的反应。
另外，ERFAM与IgE的结合不是对某一过每文原为特异性的。 ERFAM可以结合任意IgE。因此，和过專丈原特异性免疫疗法及其他 已知的用于导致耐受性的抗过每文症疗法不同，ERFAM是一种有效 的疗法，能够i秀导病人^H壬意广i普过壽丈原无反应，所述广"i普过每文原 是指能够引起病人有过敏反应的、由过敏原特异性IgE调节的过敏 原。
优选地，ERFAM诱导过敏原依赖型抑制剂的产生，该抑制剂只 有在同样给予过壽l原的时候才能活化。这样能对过壽丈症治疗进行有 效的控制，避免副作用。
SIT以诱导IgG抑制性抗体的产生为目的。因此ERFAM的用法 可以绕过例如SIT,将存在的能引起过敏反应的病原IgE直接转换 为抗IgG-相似的过壽文症抑制剂。由于不包4舌施用过壽文原也不与 FcsRI交耳关，所以ERFAM不会引起在前的过每爻性风险。但是ERFAM 本身并不是免疫疗法。
在一些实施方案中，当与IgE结合时，ERFAM分子贝武予IgE过 敏症抑制性抗体例如IgG4的功能性特征。在一个实施方案中，分子 是与IgE结合的IgG4单克隆抗体。
在一些实施方案中，ERFAM是一种多功能的无致过每文性分子， 其包含一种IgE结合位点和一种结合例如IgG4的限制性受体的受体 结合位点。在某些实施方案中，ERFAM也包含一种"连4妻体"成 分。这种连4妄体成分是有用的，例如用于延长ERFAM血清半衰期。 ERFAM分子还可以用分子式A，-B，表示，其中A，表示第一功能元素(例如IgE结合位点)，B，表示第二功能元素(例如至少一种抑制性 受体的结合位点)。作为选^奪，ERFAM分子还可以用分子式A，-X-B， 表示，其中，A，表示第一功能元素(例如IgE结合位点)，X表示连 接体成分，B，表示第二功能元素(例如至少一种抑制性受体的结合 位点)。
在其他实施方案中，ERFAM分子是一种包含IgE结合位点(第 一功能)和与IgG4抗体Fc部分有相似功能结合性质的位点(第二 功能)的较小的双功能分子。这两个位点直接相连或通过第三部分 间才妄相连，所述第三部分l武予分子所需的药理学和免疫学特性。双 功能分子被公开在例如，PCT申请第WO 96/40788号，第WO 98/09638号，第WO 02/088312号和第WO 02/102320号中。
因此，在伊O选的实施方案中，ERFAM分子是一种具有以下特点 的双功能分子
(1 ) 这种分子的第一结合位点，即IgE结合位点，是一种优 选的^f旦不专属于IgG4同型的抗IgE抗体，或与IgE结合的它的片断 或一种肽或一种多肽模拟分子或一种寡核苷酸；
(2) 第二结合位点，即IgG4结合位点或其等同物，其中， 所述位点与IgG4抗体Fc部分有相似功能结合性质。在不同的实施 方案中，其是一种IgG4抗体或其Fc片断或一种抗FcyR抗体或一 种肽或一种多肽模拟分子或一种寡核苷酸适体，所有的这些有与 IgG4结合其受体相似的作用。在合适的情况下，组成第二位点的受 体部分优选地是包含免疫受体酪氨酸依赖的抑制型基序ITIM的抑 制性受体耙向分子。通常，ITIM含有与抑制性受体细胞质尾部一致 的序列{ILV}-x-x-Y-x-{LV}(序列号3)。(3 ) 可操作的连接第 一 和第二结合位点的任选的连接体部
分。所述连4妄体可以有一个或一个以上的功能，包括增加ERFAM 血清半衰期，减少降解作用，和优化立体化学。这种结合上述位点 并赋予他们所需的药理学及免疫学特性的中间物部分是一种聚乙二 醇(PEG)部分或一种功能等同分子。
利用过敏原特异性IgG4抗体表述了等同的实施方案，对过敏症 患者施用过壽文原特异性IgG4抗体以获得相似效果。ERFAM分子的 各个单独的成分在下面进行了更加全面的介绍。
ERFAM的IgE结合成分
在某些实施方案中，ERFAM包含本领域所知的IgE结合多肽序列。
已知的ERFAM多肽，抗体，适体，其他化学体及其等同物的 IgE结合4立点纟且分包i舌如下几种
(a) 抗体包括4旦不1又限于E25 ( Novartis ， 4变4又专利)， TNX-901 ( Tanox， WO 92/17207 )或其他在此描述的IgE结合抗体；
(b) 多肽包括^旦不^f义限于第WO 98/04718号(ME Digan) 和第WO 99/05271号(Gould等等)专利公开的多肽，及4壬4可其4也功 能的IgE结合多肽序列，无i仑是天然产生的或是合成的，无i仑含有 L型或D型氨基酸，无论是否含有例如糖基化，磷酸化，十二烷酰 化或类似的后翻i奪-修饰。
(c ) 适体包括但不仅限于在J Immunol 157: 221-230, 1996 中有描述的与人类IgE有高亲和力和高特异性结合的寡核苷酸，即 以35核苷平末端IGELI.2(gggaggacgaugcgg;序列号l)(Kd = 30 nM) 表示的 2'-NH2 RNA组的 A 西己基或以 37核苦平末端D17.4(ggggcacgtttatccgtccctcctagtggcgtgcccc;序歹ll号2) (Kd = 10nM) 表示的ssDNA组配基，所述寡核苷酸竟争性抑制人类IgE与FclsRI 的相互作用，并且封闭IgE调节的血清素从细胞中释放，此释放是 用IgE特异性抗原或抗IgE抗体触发的；和
(d) 拟肽包括但不仅限于例如四环化合物(参阅例如美国 专利第5,965,605号)。
可以预见的是，本发明4吏用了这些已知的IgE结合的部分，或 本领域:技术人员生产了的功能相似或等同的新部分。这里所列的一 些及其他的出版物可一见作为本说明书的 一部分。本申请中所3是及的 所有出片反物都通过在此引证而全文并入本文。
报道抗IgE无刺激性抗体的出版物包括，但不仅限于，PCT申 请第WO 92/17207号，第WO 92/21031号，第WO 99/38531号，第 WO 00/16804号和第WO 02/079257号，以及美国申i青第6,329,509 号，等等。选一奪性地，通过，例如，FcsRI a-《连片断与IgE结合的 可;容性FcsRI受体及其书亍生物包括在美国专利第6,090,384号和PCT 申请第WO 98/04718号和第WO 99/05271号中。净争另O也，第 WO98/04718号专利(ME Digan著)描述了结合与人血清白蛋白相溶 合的IgE的FcsRI a-《连片断，此片断在循环中有4支长时间的生存期 和较低的副反应发生风险。
才艮道肽或其他能够抑制IgE与其受体结合的化和物的出版物包 括但不仅限于，Cheng等人的美国专利第5,965,605号，和Heska报 道的四环类化学化合物对IgE与其受体结合的抑制；Helm等人1997 Allergy 52: 1155-1169; McDonnell等人，1996 Nature Struct Biol 3: 419-425; Iwasaki等人，2002 Biochem Biophys Res Comm. 293: 542-548.;和Wiegand等人，1996 J Immunol 157: 221-230。另外的本领域已知的，能够与IgE特异性结合的适体及其他化
学部分可以用来生产ERFAM分子。选才奪性i也，〗吏用经典方法包括r 但不仅限于单克隆抗体，噬菌体展示，和/或适体技术发现了新的IgE 结合构建物。
ERFAM的连接体成分
第一及第二 ERFAM功能性组分通过共价结合直接相连。选择 性地，第一及第二 ERFAM功能性组分通过一种连4妻体(例如下面 描述的乙二醇，多肽序列，树脂，碳水化合物，聚合物或糖组)非 直接的相连。存在或不存在连接体的共价联合体优选无免疫性的。
连接体分子例如聚乙二醇(或其他结构和化学部分)，提供了一 种骨架，在此骨架上IgE结合位点可以与结合成分可才喿作的连接以 创造最终的ERFAM分子。连接体成分可预见的功能是增加ERFAM 分子的血清半衰期，减少降解作用，增加大小，和/或^奮饰ERFAM 各成分之间的空间位置关系。例如，通过增力口 ERFAM的大小，连 4妄体可以防止其快速乂人肾脏排泄和延长其循环半衰期或赋予其他药 代动力学优点。
可以预见为本发明的 一部分，改变药物药效性质的聚乙二醇化 方法对本领域普通^支术人员是已知的。PEG聚合物是有支链的或无 支链的，包括由单一PEG亚单位或多个PEG亚单位组成的PEG聚 合物。选择性地，连接体可操作性地框内连接在多肽序列中，例如 作为灵活的枢纽。在本领域内，其他连4妻体部分及生产等同物的方 法是已知的，通常包括，例如，化学连4妻体，聚合物，肽，多肽， #唐，刚性5朱，合成的可分开的半族，石友水化合物和甘油，和更具体 的是可以包括生物素，《连亲和素，细胞因子，抗体枢纽区域，蔗糖 多聚体，聚乙二醇(PEG)，甲氧基聚乙二醇(MPEG),聚乙二醇 双酸，PEG—元胺，MPEG—元胺，MPEG肼，MPEG。米唑，甲氧基聚丙二醇，聚丙二醇和曱氧基聚丙二醇的共聚物，葡聚糖和聚乳
酸-聚乙醇酸。参阅，例如，美国专利第6,309,633号，第6,552,167 号，第6,541,610号和第6,592,847号。多肽与低分子量化合物(例 如，氨基卵-粦脂，脂肪酸，维生素B12和配糖)的结合在本领域是 已知的，参阅，例如R. Igarishi等人，刊登在Materials, 17， 366, (1990) 上名为 "Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact" 的文南史；T. Taniguchi等人刊登在Ibid 19, 104, (1992)上的文献；G. J. Russel-Jones刊登在Ibid, 19， 102, (1992)上的文献；M. Baudys等人 刊登在Ibid, 19， 210, (1992)上的文献。连接体分子是单价的，二价 的或多^介的。
连接体另外可以作为 一种间隔体，这种间隔体有合适的长度， 可能是大约10-20nm,大约20-40nm，大约40-60nm，大约60-lOOnm， 大约100nm或更长，例如大约500nm或更长至大约lfim或更长。
ERFAM的抑制性受体结合成分
在实施方案中，本发明的ERFAM分子包括能与抑制性受体相 互作用的抑制性受体结合分子。抑制性受体结合分子包括肽和抗体 Fc区域片段。在ERFAM的一些实施方案中，使用的是IgG4抗体 或其Fey片,史。选才奪寸生i也，通过4元FcyR #元体(例3口4元FcyRIIb的#元 体)或其片段，或具有等同结合性质的肽或适体来保证与FqR的 结合。FcyR輩巴向疗法在本领域内是已知的。FcyR和FcyR草巴向分子 (抗体，双功能抗体，肽)被公开在，例如美国专利第4,954,617号 (MWFanger等人7〉开了人类单核吞噬细胞上IgG的Fc受体的单克 隆抗体)；美国专利第6，365，161号(Yashwant等人^>开了包含抗Fc 受体结合剂的治疗剂化合物)；和PCT申请第WO 96/08512号(PM Hogarth等人公开了有Fc结合能力的多肽)。在优选的实施方案中，ERFAM与包含免疫受体酪氨酸抑制基序 (ITIM )的抑制性受体结合。包含ITIM的抑制性受体存在于免疫相 关细月包的表面。免疫相关细月包的非限制性实施例包4舌嗜石成细月包，月巴 大细胞，B细胞，血小板和抗原递呈细胞(APCs)。 APCs包括枝状 细胞，巨噬细胞和单核细胞。优选地，包含ITIM的抑制性受体存 在于嗜石咸细月包或月巴大细月包的表面。 一种典型的包含ITIM的抑制性 受体是CD31,也被认作存在于嗜碱细胞上的PECAM-I (血小板/ 内皮细胞黏附分子1 )(参阅Fureder等人的文献Allergy. 1994; 49: 861-5)。已经证实，由于抑制胶原糖蛋白VI受体的信号，CD31的 交耳关至少部分;也承卩制血小4反的活4匕(参阅Newman等人的文献Blood. 2001 97(8): 2351-7 )。 CD31通过CD31 ITIM也承卩制B '淋巴纟田月包上的 ^t原、受体(参阅 Wilkinson等人的文献Blood. 2002; 100(1): 184-93 )。
另一种典型的包含ITIM的抑制性受体是CD32B (也被认作 FcyRIIb)。 CD32B是IgG低亲和lib的Fc片段的受体；(记录号 NP 003992.2 )。
其他本领域已知的包含ITIM的抑制性受体包括但不仅限于 PCT申i青第WO 96/40788号(PM Guyre和M Fanger);第WO 98/09638号(Kate等人i正明gp49B 1交联FcsRI受体)；第WO 02/088317号(Saxon等人i正明FqRIIb交耳关FcsRI受体)；第WO 02/102320号(An等人i正明FcyRIIb交耳关FceRI受体)；和Daeron 等人的文南史1995, J Clin Invest 95: 577—585。可以依才居ITIMs的存在 识别包含ITIM的抑制性受体。识别这些基序的方法在本领域内是 已知的(参阅Staub等人的文献Cellular Signaling 2004, 16:435-456 )。
嗜碱细胞和肥大细胞包含大量包含I TIM的抑制性受体。本发明 提供了能够耙向分离主体的两种或两种以上ERFAM分子的用药方法。ERFAM分子是连续或同时提供的。因此通过大量ERFAM分子 之间的协同效应能够达到较强的抑制作用。
在特定的病患人口中，需要最小化ERFAM与IgG4受体或 ERFAM第二功能部分结合或把向的ITIM/抑制性受体单独结合的作 用。因此，ERFAM可以包含一种只有在结合IgE时能够同时《连4匕 (去环化)的环肽。在这种才莫式中，只有这时ERFAM才能变得能够 与Fc^R或相应的抑制受体结合。这样可以避免由于没有结合IgE的 ERFAM对FcyR的"封闭"作用。能够抑制IgE与其高亲和性受体 FceRI相互作用的合成环肽在本领i或内是已知的。参阅例如 McDormel等人的文献1996 Nat Struct Biol 3: 419-425。可以用对目似、 的方法学生产只有与IgE结合时能够^涟化的环肽。在一种实施方案 中，肽通过在末端半胱氨酸残基形成的二好a建而环化。在不同的实 施方案中，环肽是L-型氨基酸肽和/或逆对映体D-型氨基酸肽。
ERFAM的调亡i秀导受体结合成分
在实施方案中，本发明的ERFAM分子包含能与凋亡诱导受体 相互作用的凋亡诱导受体结合分子。凋亡诱导受体在本领域内是已 知的，其包括TNF相关的凋亡诱导配基受体2， TRAIL受体2, TNFR1, Fas， DR3和AIR/LARD 。
ERFAM特点
ERFAM分子包括一个或一个以上下列特点。
安全性开始时不给过敏原，降低了过敏性反应的风险。因此 纟合药时通常不要求医院环境。
功效 一旦与肥大细胞结合的ERFAM修饰的IgE抗体(似IgG4 抗体)水平达到 一种抑制结合的未修饰IgE的比例时，经过治疗的过壽文症患者可以自由的吃过壽丈性食物或暴露在过壽文性环境中而没有
嗜喘，鼻炎等等过敏症状。事实上血液中IgE水平将会快速下降， 这是因为IgE #皮ERFAM变成了 '似IgG4抗体，。
ERFAM作用^f又限于过每文原由于p眷一的輩巴向抗体是IgE，因此
下，ERFAM只与IgG4受体结合的作用是重要的。因此，在一个实 施方案中，ERFAM是一种环肽，所述环肽只有在与IgE结合时能够 自然'去环化，且随后变得能与FcyR结合。这样能够避免FcYR被 未结合IgE的ERFAM '封闭，。
ERFAM不需要专门针对过敏原由于预先存在的IgE负责过敏 原的特异性，所以无"i仑过壽丈原，ERFAM对所有IgE调节的过敏症都 是有效的。事实上，致病过壽l原甚至不需要被识别；唯一的i貪断程 序是确i人过敏症是由于IgE引起的，即，IgE的水平升高了。
ERFAM不需要专门针对病人IgE-Fc是相对常量，最终的多形 性不会影响它与ERFAM的结合。但是如果这种多形性阻止了特定 IgE与ERFAM的结合，则此IgE是不能与其天然配基，即高亲和性 FceRI配基结合的，从而不发生过敏反应。另夕卜，FqR可能也含有 多形性。对于这种情况，与包含IgG4 Fc部分的ERFAM相比，ERFAM 的第二功能成分由针对这种多形性受体的肽、适体和/或单克隆抗体 构成时，该ERFAM 一皮i正明更为有岁丈。
ERFAM是快速作用的由于被治疗的患者体内ERFAM结合 IgE/IgE的比率上升，在治疗后几小时或几天之内过敏症状就会消 失。在一种实施方案中，ERFAM被应用于过敏性反应和哞喘发作 的情况以停止抗原导致的肥大细胞脱粒。ERFAM制剂可以单独施 用也可以与抗组胺剂联合施用。只需要一个短期的疗程在有限的时间内服用少剂量就足够了 。 这样可以排除长时间每天或季节性的服药。 一 旦在循环中结合 ERFAM的IgE成为主要过壽丈原特异性4元体，其半衰期优选;也与天然 IgG4半衰期相配。此外，ERFAM的药代动力学通过聚乙二醇化或 其他修饰方法改变。
作用力持久(长期)即敏感症不会复发。由于ERFAM修饰的IgE 的存在，几乎不会有过敏反应的风险，通常用重复暴露于过敏原的 方法来免疫调节T细胞，保证IgG4的生产，从而用IgG4的生产取 ^^抗原特异性IgE的生产。长期过4文原耐受感应的治疗方法可以与 一种或 一种以上 <吏用ERFAM的治疗耳关合4吏用。
容易接受的ERFAM不是疫苗，不包括基因接种疫苗或其他有 问题的药物。事实上，ERFAM简单的将患者自己的'致病，IgE转 变成与自然存在的保护性IgG4相似的抗体。
低成本肽通常比抗体小，根据长度肽的分子量是几千道尔顿， 与此相比，单克隆IgG抗体的分子量是150,000道尔顿。这样带来 大规才莫的效益。第一，当抗体的治疗剂量是mg/kg时，肽等效的剂 量是微克/kg。第二，肽的合成比抗体生产便宜。另外，肽的合成与 例如单克隆抗体的抗体生产相比相对简单且需要较少的复杂装置。
活性依赖于过每文原的存在ERFAM分子与其它治疗过41疾病的
发的，因此，引起抑制作用聚类，活化受体。除非特异性IgE和过 敏原都存在，否则分子不会具有抗过4丈活性。因此继续自然的暴露 会产生长时间的耐受性。没有其它治疗过每l病的分子具有这种依赖 于特异性抗原存在的活性。
ERFAM活'l"生的定量
19用本领域4支术人员已知的方法量化ERFAM活性。例如，通过 测量与IgE结合的ERFAM来量化ERFAM活性。选4爭性地，可以 通过测量与抑制性受体结合的ERFAM、活性、或抑制性受体来量 化ERFAM活性。也有 一些试-验可以测量ERFAM活性的下游影响。
在本发明的实施方案中，在体外系统中，通过评价ERFAM限 制人类嗜碱细胞活性的容量来检测ERFAM活性，其中所述人类嗜 石咸细胞是抗原依赖的，IgE调节的。这种体外模型系统在本领域内 是已知的，可以用来复制过每文反应过程中体内发生的事件。
在系统中，,人血液中纯嗜石威细l包，例jo通过<吏用购自Milteny Biotec (Bergisch Gladbach，德国，编目号130-053-401)^>司的嗜石威
细月包分离试剂盒。
如果嗜碱细胞是从过敏供体中纯化出来的，在检测中应用时就 不用进一步处理。选择性地，如果嗜碱细胞是从无过敏症个体的血 液中纯化出来的，就要在有过每丈原特异性IgE抗体存在条件下培养 激活，所述过每文原特异性IgE抗体或者是包含在过每文供体的血浆中， 或者是从过敏供体的血浆中纯化出来的。
嗜碱细胞与ERFAM共同培养，再在包含在过敏供体的血浆中， 或者是乂人过每文供体的血浆中纯化出来的有过壽文原特异性IgE抗体存 在条件下培养。在这一步骤中，ERFAM在血浆中与IgE结合并与嗜 石威细月包上的FcyR结合。在嗜石威细月包制备和活化/脱斗立过程中加入过 壽文原，利用市售ELISA试剂盒(德国海尔登堡O卬egen Pharma ^〉司 的产品Basotest(r),或其j也^L胺ELISA i式齐'J盒，Neogen /〉司编目号 为#409010的产口口口或Research Diagnostics Inc 7>3#RDI— RE59201 产品或Immunotech 乂>司#2015产品)或i文射性免疫测定通过组胺津斧 》文定量法测定抗原。选4奪性地，通过流式细力包术评〗介嗜石威细J!包的活化，在此系统中，通过ERFAM抑制嗜石成细月包脱粒的容量决定ERFAM 的功效。
抗体成分
这里4吏用的术语"抗体"涉及免疫^求蛋白分子和免疫球蛋白分 子的免疫活性部分，即包含某种抗原结合位点能与某种抗原特异性 结合(发生免疫反应)的分子。这种抗体包括但不仅限于，多克隆
抗体，单克隆抗体，嵌合抗体，单链抗体，Fab, Fab,和F(ab)2片段和
Fab表达库。通常，从人体获得的抗体分子涉及IgG, IgM， IgA， IgE 和IgD几类，这几类抗体之间的区别在于分子中天然存在的重链不 同。确定的种类有3口下子集，例3口IgGl,IgG2， IgG3,IgG4及其4也。 而且，在人类体中，轻4连是Kappa《连或Lambda 4连。关于抗体的参 考文献包括对人类抗体种所有种类，子集和型号的引证。
术语"抗原决定基"包括对免疫球蛋白或T细胞受体具有特异 性结合能力的任意蛋白决定簇。抗原决定簇通常由分子(例如氨基 酸或糖侧链)的化学活性表面基团组成，通常有三个特异性空间结 构特点和特异性电荷特点。这里的多肽或片断包括至少 一 种抗原决
定基。例如，本发明的抗-IgE抗体能特异性结合IgE，通过本领域 技术人员已知的试验(例如放射性受体结合分析试验或类似的试验) 测定这里的结合平4軒常凄丈(KD)是< 1 juM的，优选〈100nM，更优 选〈10nM，最优选〈100pM到大约lpM。
这里使用的术语"抗原"，"抗原的"，"过敏原"和"引起过敏
可能包括一种单一免疫原抗原决定簇或一种多免疫原抗原决定簇， 所述多免疫原抗原决定簇是可一皮B细胞受体(即B细胞细力包膜上的 抗体)或T细胞受体识別的。因此，这里4吏用的术语涉及任意能引起免疫反应的物质(例如，花生过4t原，猫皮毛过^:原等等)和本
领域技术人员已知的在适当条件下有致抗原性的半抗原。
本发明的构建物或其书f生物，片断，同源类々乂物或直向同源物
:故作为耐受原用于发生免疫反应，该免疫特异性结合抗原成分。例
如，当与过敏原特异性IgE抗体结合时，ERFAM将非直接结合过敏原。
生产直冲妄抗本发明所述IgE、或其书f生物、片断、同源类似物 或直向同源物的多克隆或单克隆抗体的多种方法在本4页i或内是已知 的。参阅侈'J^口 Harlow E禾口 Lane D在1988年写的，纟丑约Cold Spring 港Cold Spring Harbor实-睑室印刷的"抗体实-验室手册"，该书在 jt匕i^ii引i正f ^^f入^t。
本发明包括多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体(或人类抗 体)Fab片断(和单链抗体)，双特异性抗体(是能特异性结合至少 两个不同的抗原的单克隆抗体，优选人类抗体或人源化抗体)，和复 共辄对复合物抗体(由两个共〗介连4妄的抗体组成的抗体)的应用。 本发明还包括对抗体功能受动器的^奮饰，乂人而纟是高，例如，抗体在 治疗过敏症时的效力。本发明也适合于包括一种结合抗体的免疫复 合物，所述结合抗体的分子式是A'-B'或A'-X-B'。用多种双功能蛋 白耦合剂(例如3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP )， 亚氨基四氢參吩(IT),双功能酰亚胺酯类衍生物(例如二曱氧苯丙 氨盐酸盐)，活化酯(例如二琥珀酰亚胺基辛二酸盐)，醛(例如戊 二醛)，双叠氮化合物(例如双(p-叠氮苯甲酰)己二胺)，双重盐 书f生物(例如双(p-重氮苯曱酰)-乙二胺)，二异氰酸盐(例如甲 苯2,6-二异氰酸盐)和双活性氟化合物(例如1,5-二氟苯基-2,4-二 硝基苯))构成由A，和B，部分组成的所述复合物。例如，利用Vitetta 等人在文献Science, 238: 1098 (1987)中描述的方法可以制备 ERFAM构建物。ERFAM的i貪断应用
ERFAM用于本领域已知的蛋白质定位和/或定量4支术方法(例 如，用于测量合适生理^f品的蛋白质水平，用于i貪断方法，用于成 <象等等)中。在给定的实施方案中，包含抗原结合区域的抗IgE或 抑制性受体的抗体，蛋白质或其衍生物，片段，类似物或同源物被 用作药学活性成分。例如，当应用于成^f象时，抗体与可冲企测物质的
耦合(即物理连接)可以促进检测。可检测物质的例子包括多种酶， 酶活辅基，荧光材料，发光材料，生物发光材料，和放射性材料。 合适的酶的例子包括山葵过氧化物酶，碱性磷酸酶，(3-牛乳糖酶或 乙酰胆碱酯酶；合适的荧光材料包括7-羟基香豆素，荧光素，异硫 氰酸荧光素，玫瑰精，双氯均三漆胺，丹磺酰氯或藻红蛋白； 一种 发光材料的例子包括发光氨；生物发光材料的例子包括荧光素酶， 虫荧光素和发光蛋白质，合适放射性材料的例子包括1251, 131I, 35S或 3H。
ERFAM疗法
本发明的ERFAM构建物，包4舌多克隆、单克隆、人源^匕和全 人类抗体，均一皮考虑为治疗剂。这种治疗剂通常用于治疗或预防患 者的疾病或病原。 一种优选的使用是用于治疗过敏原调节的过敏反 应。对患者施用抗体制剂，通常通过抗体与目标物结合起作用。这 种作用有两种， 一种依赖于已知抗体分子与目标问题抗原之间相互 作用的特异性本能。在第一个实施例中，施用抗体可能消除或抑制 IgE与FcsRI的自然结合。在这种情况下，ERFAM分子通过FcsRI a 亚族位点结合IgE Fc区域，妨碍IgE的结合。因此，ERFAM分子 通过于肥大细胞结合的IgE交联减少了级层反应。
选一奪性地，另一种作用是ERFAM分子得出的一种生理结果， 此生理结果是通过与能抑制过壽文反应的效应体结合位点结合而得出的。发明人不希望受其限制的一种可预期的才几制是，ERFAM分子 的IgG4部分为Fc受体复合物补充抑制性亚族，从而调控级层，导 致对其结合的刺激免疫细月包的抑制作用，而不是活化作用。
抗体的治疗有效剂量通常与达到治疗目标所需要的量有关。需 要用药的量进一步依赖于ERFAM分子与其特异性抗原/受体的结合 亲和力，还依赖于施用的ERFAM分子/人:帔用药主体的血清中消一毛 的速率。抗体或抗体片段的治疗有效剂量的常用范围是，作为非限 制性实施例，乂人大约0.1mg/kg体重到大约50mg/kg体重，常用用药 频率范围可能(例如)乂人每天两次到每周一次。在优选的实施方案 中，ERFAM分子药丸以单注射剂形式施用，然后用SIT治疗引起 持久的耐受力，且没有例如过敏性休克的副作用风险。
药物纟且合物
本发明的抗体构建物以及本领域技术人员容易识别的相关分子 可以4姿药物组合物的形式施用，用于治疗各种疾病。已有文献一是供 了生产这种组合物的原理和需要考虑的事，以及选4奪成分的指导， 例如在文献REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY 19th ed. (Alfonso R. Gennaro,等人编辑)Mack Pub. Co., Easton, Pa. 1995; Haxwood Academic 出片反的 DRUG ABSORPTION ENHANCEMENT: CONCEPTS, POSSIBILITIES, LIMITATIONS, AND TRENDS, Langhorne, Pa., 1994;和纽约M. Dekker 的文献PEPTIDE AND PROTEIN DRUG DELIVERY (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991。
包括ERFAM构建物的肽可通过化学合成和/或通过DNA重组 才支术生产。参阅例如Marasco等人的文献Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)。制剂中可包含处理特歹未指示所需的一个以上 活性化合物，优选那些有互补活性，彼此之间不会有反作用的制剂。选择性地，或另外，组合物可能包括一种能够提高其功能的制剂，
例如象IL-2，IFN-y, IL-IO和/或TGF-(3，或能与游离的IL-4或IL-13 结合的制剂。这些分子以合适的结合物存在，施用量要能够达到预 期的目的。
活性成分可以包裹在微嚢中，所述微嚢是通过例如凝聚技术或 通过表面聚合作用制备的，例如，在月交体症合药系统(例如脂质体， 白蛋白微球，微乳，纳米颗粒和纳米微囊)或粗乳液中分别为羟曱 基纤维素或明胶微囊及聚甲基丙烯酸甲酯微嚢。
体内用药的制剂是无菌的。这可以通过除菌滤膜过滤4艮容易的 实现。
可以制备緩释制剂。緩释制剂适当的实施例包括包含抗体的固 体疏水聚合物的半透明基质，所述基质有特定的形状，例如膜型， 或微嚢。緩释基质的实施例包括聚酯，水凝胶(例如聚2-羟乙基甲 基丙烯酸)，或聚乙烯醇，聚交酯(美国专利第3,773,919号)，L-谷氨酸与y-乙烷基-L-谷氨酸的共聚物，不可降解的乙烯-乙酸乙烯 酯，可降解的乳酸_乙醇酸共聚物例如LUPRON DEPOT TM (由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射的樣i球体)，和聚-D-(-) -3-羟基丁酸。虽然有些聚合物(例如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇 酸)能够在超过100天的时间里释放分子，但也有些水凝胶能够在 较短的时间内释放蛋白。
本发明的ERFAM构建物及其书f生物，片,殳，类似物或同源物 可以并入适于用药的药物组合物中。这种组合物通常包4舌ERFAM 构建物和药学可接受载体。这里"药学可接受的载体"包括与药事 管理学相一致的任意的和所有的溶剂，分散介质，包衣料，抗菌剂 和抗真菌剂，等渗和延緩吸收的制剂等等。最新版的Remington's Pharmaceutical Sciences 中描述了合适的载体，Remington'sPharmaceutical Sciences是该领域标准参考文献，在这里通过引证并
finger's溶液，葡萄糖溶液，和5%人血清白蛋白。可以使用脂质体 和非水相媒介物(例如不易挥发的油)。使用这种媒介物或制剂作为 药学活性物质在本领域内是已知的。除了那些已知与活性成分不协 调的常用々某介物或制剂，其他的均可于本发明的组合物。补充性的 活性化合物也可加入到组合物中。
药物组合物的制剂i殳计要与其目标用药途径相一致。用药途径 的实施例包4舌注射用药(例如，"l争"永用药，皮内用药，皮下用药， 口月l用药(例如吸入用药)，透皮给药)和直肠用药。用于注射用药， 皮内用药或皮下用药的溶液或悬浮液包括下列成分 一种无菌稀释 剂例如注射用水，盐溶液，不挥发油，聚乙二醇，甘油，丙二醇或 其j也合成〉容剂；抗菌剂例如依;也酸钙钠(EDTA);纟爰沖液例如醋酸 盐，柠檬酸盐或磷酸盐，和能够调节肌肉弹性的试剂例如氯化钠或 葡萄糖。通过酸或石咸，例如盐酸或氬氧化钠调节pH值。注射用制 剂可以装入由玻璃或塑料制成的安咅瓦， 一次性注射剂或多剂量并瓦中。
适于注射用的药物组合物包4舌无菌水;容液(水可;容情况)或分 散系和可以随时制成注射用无菌溶液或分散系的无菌4分末。对于静 脉用药，适合的载体包括生理盐水，抑菌注射用水，Cremophor EL (BASF 乂>司，Parsippany， NJ,)或石粦酸纟爰冲液(PBS )。在所有情况下， 将组合物灭菌，其流动性达到易于注射的程度。在生产和储藏条件 下，载体是稳定的，免受例如细菌或真菌孩i生物的污染作用。载体 可以是一种溶剂或是分散々某介，包含例如，水，乙醇，多羟基化合 物(例如甘油，丙二醇和液态聚乙二醇等等)和他们之间合适的混 合物。通过使用例如卵磷脂之类的包衣料，通过维持悬浮液中要求 的颗粒大小及通过使用表面活性剂可以维持合适的流动性。通过使 用不同的抗菌剂及抗真菌剂(例如苯曱酸酯，三氯^又丁醇，苯酚，抗坏血酸，局部抗菌剂等等)可以预防微生物作用。在一些情况下，优选在组合物中包括等渗试剂，例如糖，多元醇(例如木糖醇)，山梨醇，氯化钠。可以通过在组合物中加入延IC吸收试剂(例如单硬—脂酸铝和明月交)的方法延长注射用组合物的P及收时间。
将一种或几种上述成分按照需要结合，得到合适的溶剂，将此
〉容剂与所需量的ERFAM构建物混合，然后过滤灭菌，制备无菌注
射用溶液。通常，将活性成分与无菌载体混合制备分散剂，所述无菌载体包含一种基本分散介质和上面提到得其他一些所需成分。对于制备无菌注射用无菌4分末的情况，制备方法是通过真空干燥或冷冻干燥乂人之前过滤干燥后的溶液中产生活性成分与附加的所需成分的粉末。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食性载体。他们可以被装入明月交胶嚢中，也可以压制成片剂。为了达到口服i合药的目的，活性成分可以与赋形剂混合，以普通片，口含片或胶嚢的形式被使用。也可以用流化载体制备口服组合物用作漱口药物，其中流化载体中的化合物是口服使用的，漱口后吐出或咽下。药学上相协调的粘合剂和/或辅助材料可以作为组合物的一部分被包括。普通片，丸剂，
胶嚢剂，口含片等等可以包含下列任意成分或其天然相似化合物粘合剂(例如微晶纤维素，黄蓍胶或明胶)；赋形剂(例如淀粉或乳糖)；崩解剂(例如藻酸，羟乙酸淀粉钠或玉米淀粉)；润滑剂(硬脂酸镁)；助流剂(微粉硅胶)；甜味剂(例如蔗糖或糖精)；或佐味剂(薄荷油，水杨酸甲酯或橘子香精)。
在一个实施方案中，与能够保护化合物不,人体内快速排出的载体一起制备活性化合物，例如控制释放制剂，包括植入剂和微嚢化给药系统。4吏用可生物降解的，生物相容性好的聚合物，例如，乙烯-乙酸乙烯酯，聚酸酐，胶原，聚原磷酯和聚乳酸。这些制剂的制备方法对本领域技术人员是已知的。这些材料也可以从Alza公司和诺华制药公司购得。
将ERFAM组合物设计成单位剂量形式的制剂是有利的，可以方便给药和保证剂量一致性。这里用到的"单位剂量形式"涉及适合治疗主体单一剂量的体内不连续单位；每个单位包含产生所需治疗效果的预先确定量的活性成分和必需的药用载体。直4妄4艮据活性成分独特的性质，所达到的特殊治疗效果和4吏用此活性成分组合治疗个体时的内在局限性来身见定单位剂量形式的^f吏用方法。
药物组合物与用药说明一起可以i文入容器，包裹，试剂盒或自动售货4几中。在某一实施方案中，ERFAM与抗组胺剂一起包裹在试剂盒中，在另一实施方案中，ERFAM制剂包含抗组胺剂。理想的情况是，在主体暴露于过敏原之前或之后片刻施用ERFAM制剂。包含抗组胺剂的ERFAM制剂可以包装为非处方药物被过敏症患者使用来抑制过敏反应。
结合聚合物的ERFAM构建物治疗剂
基于本发明的公开，本领域技术人员可以制备经过化学修饰(例如结合聚合物)的ERFAM构建物。最适于加入ERFAM构建物的化学部分(如涉及的ERFAM构建物的衍生物)包括水可溶性聚合物。水可溶性聚合物的优势在于与它结合的蛋白质在水相环境中不会沉淀。在一些实施方案中，此聚合物是在制备治疗产品或组合物时药学可接受的聚合物。
尽管可以予贞见一个以上聚合物分子可以与ERFAM结合，如果需要的i舌，也可以用单一的聚合物分子与ERFAM构建物结合。在一些实施方案中，使用两个，三个或四个聚合物分子进行结合，例如，第一及第二聚合物分子结合在ERFAM的每个N-末端的氨基酸上，第三聚合物分子结合在内部的氨基酸上(例如无末端氨基酸)。
结合的ERFAM组合物在体内和非体内应用时都有功效。另夕卜，乂>i人的是适于末端应用的结合聚合物可以使用其他基团，部分或其他结合类型。给聚合物共价结合某种功能性部分从而赋予聚合物抵抗紫外降解能力，或抗氧化能力，或持续的血清保持力，或其他性质和特点，通过实施例证明，这些应用是有用的。作为进一步的实施例，在一些应用过程中使聚合物功能化赋予它反应特点或可交联特点，从而提高结合材料整体性质和特点是有用的。因此，聚合物可能包含很多功能，重复基团，联结或其他特征结构不排除以结合ERFAM组合物为目的的功-文。
本领域普通技术人员基于考虑结合聚合物/蛋白是否用于医疗，如果是的话，考虑所需剂量，循环时间，对蛋白酶的4氐抗力或其他有待考虑的事项能够选择所需的聚合物。衍生物的效力通过以所需形式(例如，通过;参透泵，或通过注射或灌lt,或进一步i史计成口服制剂，肺部用药制剂或其它给药途径)施用衍生物来探知并确定。
合适的水可溶性聚合物包括^旦不仅限于聚乙二醇，二曱苯与丙二醇的共聚物，羟曱基纤维素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚1,3-二氧戊烷，聚1,3,6-三恶烷，乙烯/苯酐共聚物，聚氨基酸(可以是均聚物也可以是随机共聚物)，和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇，聚丙二醇均聚物，聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物，聚氧乙烯多羟基化合物(例如，甘油)，聚乙烯醇，或他们的混合物。由于在水中的稳定性，聚乙烯醇丙醛在制备过程中更有优势。
聚合物是任意适合的分子量大小，可以是有支链的，也可以是无支纟连的。
对于聚乙二醇(PEG)来讲，为了方便处理和制备，优选的分子量在约2KDa到约100KDa之间(这里使用的术语"大约"是指在制备聚乙二醇过程中，有些分子比规定的分子量较重，有些较轻)。依据所需达到的治疗状态(例如所需控制释》支的持续时间；对生物
活性有作用(如果有的话)；容易处理；缺乏抗原性程度及聚乙二醇对蛋白或其他治疗剂的其它已知作用)，使用其他大小的聚合物。在一些实施方案中，优选的分子量是大约10KDa。
所附上的聚合物分子数量是变化的，本领域技术人员可以确定其对功能的作用。 一种书f生物可能是相同或不同化学部分(例如，不同质量的聚乙二醇聚合物)的单衍生物，或者是双衍生物，三衍生物，多衍生物或这些衍生物的结合。聚合物分子与蛋白质(或多肽)分子的比率及其在反应混合物中的浓度是变化的。总的来说，多种因素可以决定最适比率(依据反应效率，没有多余的未反应的蛋白质或聚合物存在)，例如所需的衍生程度(例如，单衍生，双衍生，三衍生，等等)，所选聚合物分子量，聚合物是否有支链及反应条件。
在某种实施方案中，考虑蛋白质功能区域或抗原区域的作用，给蛋白质分子附上聚乙二醇分子(或其它化学基团)。本领域技术人员可以4吏用多种附着方法。参阅例如，欧洲专利第401384号"夸PEG与G-CSF诔禺合)；Malik等人的文南史Exp. Hematol. 20: 1028-1035， 1992 U艮道了用三氟代乙烷石黄酰氯4吏GM-CSF聚乙二醇化)。
例如，聚乙二醇通过反应基(例如一种自由氨基或羟基基团)与氨基酸残基共价结合。所述反应基是指活性聚乙二醇分子结合的基团。含有自由氨基的氨基酸残基可能包括赖氨酸残基及N -末端氨基酸残基。含有自由羟基基团的氨基酸残基包括天氡氨酸残基，谷氨酸残基和C -末端氨基酸残基。巯基基团也可以用作附着聚乙二醇分子的反应基。在一些附着氨基酸基团的实施方案中，以治疗为目的优选N -末端基团或赖氨酸基团。如果需要连接受体的话，就应当避免附着受体主要连接的残基。某种情况可能明确需要一种N-末端化学修饰的蛋白质。以聚乙二醇分子作为现有的ERFAM组合物的例证，所述情况可以选择不同的聚乙二醇分子(不同分子量，支链等等)，反应混合物中聚乙二醇分子与蛋白质(或多肽)分子不同的比率，所需完成的不同聚乙二醇化类型，及获得选#奪性N-末端聚乙二醇化蛋白质不同的方法。获得N-末端聚乙二醇化蛋白的方法(即，如果需要的话将此部分与单聚乙二醇化部分分开)是通过从大量聚乙二醇化蛋白质分子中纯化N-末端聚乙二醇化材^K通过还原烷基化完成选4奪性N-末端化学修饰，从而开发特殊蛋白质中可用于衍生的前体氨基酸(赖氨酸相对N-末端氨基酸)不同类型的不同反应。在适当的反应条件下，可以得到N-末端用含有羰基的聚合物充分选择性衍生的蛋白质。利用赖氨酸残基的epsilon-氨基(e-氨基)与蛋白质N-末端残基的alpha-氨基(a-氨基)的pka不同，在某一 pH值下进行选择性N-末端聚乙二醇化。通过这种选择性衍生可以控制水溶性聚合物对蛋白质的附着作用聚合物的联结作用主要发生在蛋白质的N末端，其他反应基(例如赖氨酸侧4连氨基基团)并没有发生明显的^务饰作用。
通过还原烷基化作用，水溶性聚合物成为上述类型，且含有一种单反应性醛基，能够于蛋白质耦合。可以4吏用含有单反应性醛基的聚乙二醇丙醛。
本发明包括原核表达的，真核表达的或合成的ERFAM的使用。
通过本领域已知的聚乙二醇化反应进行聚乙二醇化。参阅，例^口，文南史Focus on Growth Factors, 3 (2): 4-10, 1992;区欠;;州专矛J第0 154316号；欧洲专利第0 401 384号及这里引用的其他关于聚乙二醇化的出版物。通过反应性聚乙二醇分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应进行聚乙二醇化。通过酰化反应进行的聚乙二醇化主要包括聚乙二醇(PEG)活化酯衍生物的反应。使用任意已知的或充分发现的反应性聚乙二醇
分子进行聚乙二醇化。优选的活性聚乙二醇酯是将PEG酯化为N-羟基丁二酰亚胺(NHS )。这里使用的术语"酰化反应"包括但不仅限于下列蛋白治疗剂与水溶性聚合物(例如PEG)的连接类型氨基化合物，氨基甲酸盐，聚氨酯等等。参阅文献Bioconjugate Chem.5: 133-140, 1994.选4奪任意已知的聚乙二醇化反应条件或完全反应的条件，避免选择阻止聚合物结合ERFAM构建物活性的温度，溶剂和pH^f直。
通过酰化作用完成的聚乙二醇化主要产生一种聚聚乙二醇化ERFAM产品。在一些实施方案中，连接体是氨基。另外，在一些实施方案中，产物完全是(例如>95%)单，双或三聚乙二醇化衍生物。根据使用的特异性反应条件大量生成高聚乙二醇化程度的产品。如果需要的话，通过标准的纯化工艺(包括透析，盐析，超滤，离子交换色谱，凝"交过滤色镨和电泳)将更纯的聚乙二醇化产品/人混合物(例如未反应物)中分离出来。
通过烷基化作用完成的聚乙二醇化通常包括末端醛基化的PEG在还原剂存在条件下与ERFAM发生反应。通过夂克基化作用完成的聚乙二醇化也可以产生聚聚乙二醇化ERFAM产品。另外，可以控制反应条件使聚乙二醇化只发生在ERFAM分子N-末端的一个氨基基团上(例如， 一种单聚乙二醇化蛋白)。在单聚乙二醇化或聚乙二醇化情况下，PEG分子通过-CH2-NH-基团附着在蛋白质分子上。要特别说明一下-CH2-基团，这里涉及的这类连接键是一种烷基连接键。
发可用于衍生的前体氨基酸(赖氨酸相对N-末端氨基酸)不同类型的不同反应。利用赖氨酸残基的e-氨基与蛋白质N-末端残基的a-氨基的pka不同，在某一pH值下进行反应。通过这种选择性衍生 作用，控制包含反应基，例如乙醛，的水溶性聚合物与蛋白质的附 着作用聚合物主要结合与蛋白质的N末端且对其他反应基，例如 赖氨酸侧链氨基基团，没有发生明显的^奮饰作用。
水溶性聚合物。修饰选择的聚合物使之含有单一反应基，例如，一 种可以进行酰化反应的活性酯基或可以进行烷基化反应的醛基，以 便于控制本方法提供的聚合反应程度。可仿效的反应性醛基化PEG 是水溶性聚乙二醇丙醛，或者它的单C1-C10烷氧化或芳氧化衍生 物(参阅美国专利第5,252,714号)。聚合物可以是有支^i的也可以 是无支链的。选择含有单一反应酯基基团的聚合物进行酰化反应。 选捧含有单一醛基基团的聚合物进行还原烷基化反应。通常，水溶
性聚合物不会选自天然糖残基，因为这种糖残基通常较为容易的得 自哺乳动物重组表达系统。聚合物可以是任意分子量的，可以是有
支《连的也可以是无支纟连的。
这里用到的可仿效的水溶性聚合物是聚乙二醇。这里使用的聚 乙二醇是指包括用于衍生蛋白质的所有形式的PEG，例如单(C1-C10) 烷氧化或芳氧化聚乙二醇。
通常，在能够使生物活性底物与活性聚合物分子发生反应的任 意适合条件下完成化学衍生作用。制备聚乙二醇化ERFAM的方法 通常包括以下步-骤a)在能够4吏分子附着一个或一个以上PEG基 团的条件下，ERFAM蛋白或多肽与聚乙二醇(例如反应性PEG酉旨 化或醛基化书f生物)发生反应，和b)得到反应产物。通常酰化作 用最佳的反应条件是由已知参数和所需结果一件件决定的。例如， PEG与蛋白的比率越大，聚聚乙二醇化产品的百分比越大。生成充分均一化单聚合物/ERFAM分子的还原烷基化作用通常 包括以下步骤a)在还原烷基化条件下，在允许ERFAM氨基末端 进行a-氨基基团选择性修饰的pH值下，ERFAM蛋白或多肽与反应 性PEG分子反应；及b)获得反应产物。
pH值还影响聚合物与使用的蛋白的比例。通常，如果pH较低， 则需要相对于蛋白较多的过量聚合物(即反应性N末端a-氨基基团 越少，达到最适情况所需的聚合物越多)。如果pH较高，则聚合物 蛋白质的比例不需要很大(即可以使用的反应性基团越多，需要的 聚合物分子越少)。为了达到本发明的目的，pH值的范围通常是3-9, 优选3-6。
另一个需要重点考虑的地方是聚合物的分子量。通常，聚合物 的分子量越大，附着在蛋白质上的聚合物分子越少。相似的，在优 化这些参数的过程中要考虑到聚合物的支链。通常，分子量越大(或 支链越多)，聚合物:蛋白的比例越大。通常，进行这里预见的聚乙 二醇化反应，优选的平均分子量是大约2KDa到大约100KDa。优选 的平均分子量是大约5KDa到大约50KDa，例力。大约10KDa。
在一些实施方案中，ERFAM通过多肽上的末端反应基连接聚合 物。选4奪性;也，或另夕卜，ERFAM通过内在的赖氨酸残基，例如引 入用来构造ERFAM分子的天然氨基酸序列的赖氨酸残基的侧链氨 基连接。因此结合物可以从无末端反应基中分出。有反应基的聚合 物在这里被指定为"活性聚合物"。反应基与蛋白质上的自由氨基或 其他反应基发生选一奪性反应。
活性聚合物可能在ERFAM可利用的氨基上发生附着作用，引 入ERFAM多肽氨基酸序列的残基或它们的变量，所述氨基例如赖 氨酸残基的a-氨基基团或e-氨基基团。ERFAM分子(可利用)的自由羧基基团，合适活性的羰基基团，羟基，胍基，咪唑基，氧化 醣基基团和巯基基团也可以作为附着位点。
根据蛋白浓度，通常每摩尔蛋白质要使用大约1.0到约IO摩尔 的活性聚合物。最终所得量是当最小化产品非特异性修饰时的最大 反应程度与在此同时，能够维持最适活性，如果可能的话同时，优 化蛋白的半衰期的界定化学之间的平衡。在一些实施方案中，蛋白 质至少保留了 50%的生物活性，在其他的实施方案中，几乎保留了
100%。
聚合物可以通过本领域内已知的方法与ERFAM多肽耦合。例 如，在某些实施方案中，聚烃基乙二醇与ERFAM或ERFAM变异 一朱中的赖氨酸基团耦合。与赖氨酸基团的连接可以通过例如聚乙二 醇琥珀酸琥珀酰亚胺(ss-PEG )和聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酯 (SPA-PEG)的N-羟基琥珀酰亚胺活性酯(NHS)完成。合适的聚 烃基乙二醇基团包括，例如，羧曱基-NHS，正亮氨酸-NHS， SC-PEG, tresylate,醛基，环氧化物，羰基咪唑，和PNP碳酸盐。
附加的氨基反应性PEG连接体可被琥珀酰亚胺酯取代。所述琥 珀酰亚胺酯包括，例如，异硫氰酸盐，硝基苯碳酸盐，环氧化物， 和石友酸苯并三唑。在一些实施方案中，选l奪条件4吏选冲奪性，程度和 反应力最大化。
如果需要的话，ERFAM分子可包含一种标"i己，例如随后能够一皮 蛋白水解酶释放的标记，例如可以被肠激酶分裂位点分离的组氨酸 标记(即10组氨酸)。因此，赖氨酸基团可以通过组氨酸标记与低 分子量连接体的第一反应而选4奪性修饰，所述低分子量连接体例如 能与赖氨酸和N-末端发生反应随后释放组氨酸标记的Traut's试剂 (Pierce )。之后，多肽会含有一种自由SH基团，该基团能被包含硫 醇反应性头部基团的PEG分子选择性修饰，所述硫醇反应性头部基团例如马来酰亚胺基团，乙烯石风基团。卣代醋酸盐基团，或自由或 一皮保护的SH基团。
Traut，s试剂可以被任意能够为附着PEG产生特异位点的连接体 代替。通过实施例，Traut，s试剂一皮SPDP, SMPT, SATA,或SATP (都可购自Pierce)代替。相似的，蛋白质与嵌入马来酰亚胺(例如 SMCC， AMAS9 BMPS, MBS， EMCS, SMPB, SMPH， KMUS,或 GMBS ),囟^a醋酸盐基团(例如SBAP, SIA, SIAB )或乙烯石风基团 的氨基反应性连接体反应，将反应产物与包含自由SH的PEG反应。 对^吏用的连接体唯一的限制是对其大小的限制，它不能妨碍随后的 N-末端标记的移出。
因此，在其^也实施方案中，聚烃基乙二醇与ERFAM分子或 ERFAM变异4朱的半光氨酸基团耦合。z使用例如马来酰亚胺基团， 乙烯砜基团，卣代醋酸盐基团和硫醇基团可以影响耦合作用。
在一些实施方案中，iE合物中聚合物连4妻的ERFAM相7于于没 有聚合物存在的变异株多肽，具有更长的血浆半衰期。选择性地， 或另夕卜，组合物中结合聚合物的ERFAM连接GFR,活化RET，使 神经元细胞改变规格化，或提高神经元细胞存活率，或使他们生理 功能相结合。
在一些实施方案中，组合物作为一种稳、定的，水相可;容的聚合 物结合的ERFAM,或聚合物结合ERFAM的变异抹被提供，并与聚 乙二醇基团耦合。如果需要的话，ERFAM或ERFAM变异4朱构建物 通过不稳定粘合剂与聚乙二醇分子相连。不稳、定粘合剂可以:故例如 生化水解，蛋白水解，巯基裂解分裂。例如，粘合剂在体内(生理 学上的)条件下可以被分裂。本领域技术人员可以确定其4也例如溶剂，反应时间，温度等等 反应参lt和纯〗t产品的方法。
ERFAM构建物的合成和分离
ERFAM变异体可以用本4贞i或已知的方法进4亍分离。应用标准蛋 白纯化方法可以从免疫细胞，杂种瘤或组织源中分离出自然生成的 ERFAM子集。选4奪性地，ERFAM变异体可以通过标准肽合成技术 化学合成。在肽领域内，已经很好的建立了短氨基酸序列的合成方 法。参阅例如Stewart等人所著的固相多肽合成(2d ed., 1984年)。
在另一种实施方案中，ERFAM构建物通过重《且DNA4支术生产。 例如，其中连4姿体部分是一种多肽连"l妄体的，编码ERFAM的核酸 分子可以一皮插入一种载体，例如， 一种表达载体，之后将核酸引入 细月包中。合适的细胞包括，例如哺乳动物细胞(例如人类细月包或中 华仓鼠卵巢细胞)，真菌细胞，酵母细胞，昆虫细胞和病毒细胞。在 重组细胞中表达时，细胞在允许ERFAM构建物表达的条件下培养。 如果需要的话，可以乂人细月包悬浮液中回收ERFAM构建物。这里4吏 用的"回收"的意思是将回收步骤之前存在于细胞或培养基中的多 肽变异体从这些成分中分离出来。回收步骤可能包括一步或一步以 上复折叠或纯化步骤。
4吏用 一些本领域已知的方法构造ERFAM构建物。定点突变是 这些方法之一，在此过禾呈中， 一个特定的核酸(或，如果需要的话 一小部分特定的核酸)发生改变乂人而改变了编码ERFAM构建物的 序列中的一个氨基酸(或者，如果需要的话，一'j、部分预定的氨基 酸残基)。本领域技术人员可以认识到定点突变是一种常规的，普遍 应用的才支术。事实上，可以购得4艮多定点突变的试剂盒。其中之一 是Clontech实-验室 (Palo Alto, Calif.)出售的"Transformer Site Directed Mutagenesis Kit"。除非特别指出，本发明实践所使用的是细胞生物学，细胞培养，
分子生物学，孩i生物学，重组DNA,蛋白质化学和免疫学常^见的4支 术，包括在本领域」技术范围内。这些才支术在文献上也有描述。参阅， 例如参阅1989年Sambrook， Fritsch和Maniatis等人编專尋的Cold Spring Harbor实验室出版的"分子克隆实验室手册"，第二版； DNA克隆，巻I和II ( D.N. Glover编辑，1985 ); MJ. Gaitl984年 编辑的"寡聚核苷酸合成"；Mullis等人的美国专利第4,683,195号; B.D.Haines禾口 SJ. Higgins1984年纟扁丰尋的"才亥酉吏杂交，，；B.D. Hames 和SJ. Higgins 1984年编辑的"转录与翻i奪"；Alan R. Liss ^>司R丄 Freshney 1987年编辑的"动物细胞培养"；IRL 1986年出版的"免 疫细胞和酶"；B. Perbal 1984年所著的"分子克隆实践指导"；纽 约学术出版社出版的Wu等人编辑的"发酵学方法"巻154和155; Cold Spring Harbor实验室J.H. Miller和M.P. Calos 1987年编辑的 "哺乳动物细胞基因转移载体"；学术出版社1987年出版的Mayer 和Walker编辑的"细J包核分子生物学中的免疫化学方法"；D.M. Weir和CC. Blackwell 1986年编辑的"免疫学实-验手册"巻I-IV; Cold Spring Harbor实验室1986年出版的"鼠胚胎操作"。
聚合物结合的ERFAM构建物
如果需要的话，聚合物结合的ERFAM构建物可以作为融合蛋 白#皮提供。蛋白的融合多肽衍生物包括保持生物活性前体蛋白的多 种结构形式。这里4吏用的"融合"是指通过各自的肽骨架，例如通 过在相同阅读窗(即在阅读窗内)内编码这些蛋白的聚核苦酸分子 的基因表达而共线性，共i^介连4妻两个或两个以上蛋白或其片断。优 选不同来源的蛋白或其片4史。因此， 一些融合蛋白包括与不是 ERFAM变异体的第二部分共^介结合的ERFAM变异体构建物或片 断。在一些实施方案中，第二部分是由包含单体的多肽衍生出来的， 足够赋予ERFAM构建物提高的溶解性和/或生物利用度。包含聚合物结合ERFAM的药物组合物
本发明还提供了包含聚合物结合ERFAM的药物组合物。这里 使用的"药物组合物"定义为包括本发明的ERFAM构建物或结合 体，分散在生理学上可4妄受的载体中，4壬选地包含一种或一种以上 生理学可相容成分。因此，药物组合物可能包含一种l武形剂，例如 水， 一种或一种以上孩i量元素，#唐，去污剂和一种或一种以上例如 惰性蛋白(例如肝磷脂或白蛋白)之类的载体。
ERFAM构建物本身可以用药也可以以药学可4妄受的酯，盐，和 其生理功能性书f生物的形式用药。在这种药学或医学制剂中，修饰 的ERFAM构建物与一种或一种以上药学可4妻受的载体和其他任选 的治疗剂成分一起〗吏用。
药学可接受的载体的意思是与制剂中其他成分是相容的，且不 会对使用者产生不适当的毒性。为了达到所需的药理学效果或医学 有益效果，提供足够量的ERFAM构建物，同时，如这里所描述的， 为了达到所需体内剂量或浓度的生物利用度，要给予合适的量。
制剂包括适于肠胃外用药的制剂和肠胃用药制剂，和包括口服 用药，直肠用药，口腔粘膜用药，局部用药，鼻部用药，眼部用药， 皮下用药，肌肉用药，静脉用药，透皮用药，推管用药，动脉用药， 关节用药，虫朱网力莫下用药，支气管用药，'淋巴用药，阴道用药，宫 腔用药的特殊的用药方式。优选适于作为局部或系统的气雾剂或肠 胃外用药的制剂。
当在包4舌液体;容剂的制剂中^吏用ERFAM构建物时，制剂有利 于进行口服用药，支气管用药或肠胃外用药。当制剂中液体悬浮物 或生物相容性载体制剂中的粉末^吏用了 ERFAM构建物时，制剂有 利于进行口服用药，直肠用药或支气管用药。选^^性地，通过气化载体气体中的粉末形成粉末的气体悬浮液，可以经鼻用药或支气管 用药，病人可以乂人包括一种合适的气化装置的呼吸器中吸入4分末。
包括本发明蛋白质的制剂可以方<更的以单位剂量形式存在，用 药剂学领域已知的多种方法制备。这些方法通常包括将活性成分引
代表性地，通过将活性成分均一地且密切地加入到液态载体， 细碎的固态载体或两者之中，与之结合制备制剂，然后如果需要的 话，可以将产品定形成所需制剂的剂量形式。
适于口服用药的本发明制剂可以以不连续的单位存在，例如胶 囊，直肠用胶嚢，片剂，菱形片，每种单位含有预定量的活性成分
粉末或颗粒；也可以以水相液体或无水相液体中的悬浮物形式存在， 例如，#唐浆，酏剂，乳液或顿力良剂。
适用于肠胃外用药的制剂包括活性结合体的无菌水相产品，该 产品与受试者的血液(例如，生理盐水溶液)等渗。这种制剂可能 包括悬浮剂，增稠剂或其他将血液成分或一个或一个以上器官设计 为化合物目标的微颗粒系统。制剂可能以单剂量或多剂量形式存在。
鼻用喷雾制剂包括含有防腐剂和等渗试剂的纯化的活性结合物 水溶液。可以调整这种制剂的pH^直和渗透压^f吏之与鼻粘膜相一致。
适于直肠用药的制剂可以以含有合适载体的栓剂的形式存在， 所述合适的载体例如可可油，氢化油脂，氢化油脂羧基酸。通过与 鼻用喷雾剂相似的方法可以制备例如滴眼液的眼用制剂，区別是要
调整pH〗直和渗透压与眼部的粘力莫相配。局部用药的制剂包括溶解或悬浮于一种或一种以上介质中的结 合体，所述介质例如矿物油，石油，多羟基醇，或其他用作局部药 物制剂的基质。
除了上述成分之外，本发明制剂进一步包括一种或多种选自稀 释剂，緩沖剂，调味剂，崩解剂，表面活性剂，增稠剂，润滑剂， 防腐剂(包括抗氧化剂)等等的附加成分。前面的事项也用到了
ERFAM融合蛋白(侈'H口， ERFAM-HAS融合蛋白)。
因此，作为本发明i兌明性应用，本发明包4舌为〉容液中ERFAM 构建物体外稳定性^是供合适的融合蛋白。可以使用融合蛋白来，例 如增力口 ERFAM构建物多肽部分对酶降解作用的抵抗力，和提供改 善^诸藏时间，室温稳、定性等等的方法。应当理解，上述注意事项也 使用了本发明的ERFAM-构建物血清白蛋白融合蛋白(包括人/人源 化ERFAM-构建物血清白蛋白融合蛋白)。
治疗方法
聚合物结合的ERFAM构建物，聚合物结合的ERFAM构建物变 异体和^豆《连聚合物结合的ERFAM构建物可以用来治疗或纟爰解活体 动物体，优选哺乳动物体，更优选包括人的灵长类动物体由于响应 免疫抑制型活性而引起的不适或疾病症状。优选的症状是治疗患者 的不适当的过敏性反应。
产生活性分子的方法
前面叙述了通过噬菌体展示(WO 90/ 02809 )和适体产生(WO 92/14843 )来生产肽配体的方法。试剂盒(噬菌体及其各自的寡核 苷酸基因库)可以,人许多/〉司购得，目前已在研究中广泛应用。4吏用ERFAM或IgG4治疗过每文症的方法
在需要治疗的过每丈反应过程中或反应之外，对患有IgE-i秀导的 过敏症的患者施用ERFAM(或过敏原特异性IgG4)。本领域技术人 员4艮容易确定有效的治疗剂量，在这里，将^^皮治疗的病人过每丈反应 的急剧緩解或消除作为终点。经过合适的时间(例如第二天)，通过 对可疑过敏原进行皮肤点刺试验或通过过敏原诱导的嗜碱细胞脱粒 (4吏用体外血)确定ERFAM的过敏原抑制作用。如果过壽文反应确实 减少了 ，对过每文原在ERFAM ^隻盖下用药来i秀导免疫耐受力，永久 治愈过敏症。
本发明在下面的实施例中进行了进 一 步的描述，所述实施例不 限制权利要求书要求保护的范围。
实施例
下面的实施例通过非限制性例子阐明本发明的不同方面。
实施例1:通过将IgE抗体与IgG4抗体耦合获得ERFAM
从 Washington Biotechnology公司 (Simpsonville, MD)购得抗 IgE的兔类多克隆#元体，4安照KJ Dorrington和HH Bennich 1978年 在免疫学评i仑第41巻3-26页发表的文献"人免疫^求蛋白E的结构-功能关系"，该#元体通过用GVSAYLSRP SPFDLFIRKSPTITCL (序 列号1)免疫处理兔子获得，该肽段代表局限于人的IgE重链序列 的Cs3域中的335 - 359氨基酸残基。4吏用生物素酰化目标蛋白结 合AffmityPakTM固定化抗生物素蛋白色"i普4主(Pierce)将抗体,人兔血清 中亲和纯化出来，用Sartorius浓缩4义(MWCO 100,000)进一步浓缩。 用购自Pierce 乂>司的BCA蛋白分析系统确定抗体浓度。人IgG4抗 体(从人骨髓瘤细胞中亲和纯化得到)可以购自Sigma公司(编目
42号1-4683 )。用购自Pierce (23456)公司的可控蛋白-蛋白交联试剂盒 将两种抗体交耳关得到ERFAM化合物。
简要地，500孩i升二曱替曱酰胺加入并溶解于2mg N-琥珀酰亚 胺S-乙酰硫代乙酸(SATA)中，然后将28微升(表示超出10倍摩 尔量)力口入到2ml抗IgE抗体(在PBS-EDTA溶液中浓度为3mg/ml) 中，室温下培养30分来增加分子中的巯基基团。然后将5mg盐酸 羟胺溶解于IO(H鼓升结合物緩冲液(乂人试剂盒中得到)中，加入到 SATA -修饰的抗IgE抗体中用以在进一步的2小时培养中对潜在的 巯基基团脱保护。之后用Sartorius浓缩4义(MWCO 100，000)除去未反 应的化合物。在磷酸緩沖液(PBS)中用购自Pierce的BCA蛋白分 析系统测定巯基活化的抗体的浓度并将浓度调整到2mg/ml 。
利用相同试剂盒中的试剂得到的亲和纯化后的人IgG4抗体进 行马来酰亚胺活化。将2mgA乾代-琥珀酰亚胺酯4-[N-马来酰亚胺曱 酰]环己胺-1-羧酸西旨(sulfo-SMCC)溶解于2ml PBS中，然后将10 微升(超出IO倍摩尔量)加入到500微升人IgG4抗体中(在PBS 中为lmg/ml )。培养30分钟后，用Sartorius浓缩4义(MWCO 100,000) 除去未反应的sulfo-SMCC。马来酰亚胺活化的抗体浓度用购自 Pierce的BCA蛋白分析系统测定并将浓度调整到2mg/ml。
将2mg/ml等体积的巯基活化的抗IgE抗体与马来酰亚胺活化的 IgG4抗体混合，在室温下培养60分，然后用PBS稀#奪至10ml，并 用Sartorius浓缩4义(MWCO 100,000)洗涤。4吏用BCA蛋白分析试剂 盒估计ERFAM浓度并将最终浓度调整为2mg/ml。将ERFAM分装 成两份，之后向其中的 一 份中加入20微升0.5mg/ml的 GVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCL (序列号l)多肽PBS溶液，,人而 封锁抗IgE抗体结合位点，同时，向另一份中加入等体积的PBS溶 液。在使用前，将ERFAM在4。C下储藏至少24小时。乂人血液中在Histopaque-1077 (购自Sigma ^>司)层上离心分离 夕卜周血单个4亥纟田月包。进一步，用i兹J朱(购自Miltenyi Biotech 乂>司的 编目号为130-053-401的嗜石威细月包分离试剂盒)分离多形核嗜石成细 胞(PB )。 如Kleine等人在Int Arch Allergy Immunol. 2001; 126(4):277-85上发表的文献所述，通过在室温条件下，在乳酸緩冲 -液(13.4mM乳酉臾，140mM NaCl, 5mM KC1, pH3.9)中培养3.5分 钟来剥去附着在PB上的IgE分子。然后，如Shreffler等人在文献J Allergy Clin Immunol. 2004; 113(4):776-82中所述，用有NP画特异性 嵌合IgE抗体包含细胞悬浮培养基和白细胞介素3 ( 2ng/ml)存在的 AIM V细月包无血清培养基培养，对NP激活PB。
外周血单个核细胞重新悬浮(在0.1ml AIM V细胞培养基中悬 浮50,000每96孔板的小孔)，在50微升AIM V渗析的NP-特异性 嵌合IgE抗体包含细胞悬浮培养基(用来对NP激活)和20微升 2mg/mlERFAM溶液(抗IgE-IgG4 )或用封闭肽预先培养的等体积 的ERFAM溶液存在的条件下i咅养过孑复。
第二天，在每个孔中加入2(H鼓升NP-6-牛血清白蛋白(lmg/ml )， 在37。C下进一步i告养15分钟。收集悬浮物并在-20。C下冷冻用以测 量随后的组氨酸津奪力文，同时，将细胞转入5ml FACS试管中用4ml 含有1%胎牛血清和0.1%叠碳化钠的磷酸盐缓冲液洗涤。然后将PB 染色，^口Boumiza等人的文南大Clin Exp Allergy. 2003; 33(2): 259-65 所描述的，通过估定活性标记CD203c在细胞表面上的表达来确定 PB活性。用抗IgE FITC (荧光^笨针Serotec STAR96F )，抗-CD203c PE (Immunotech />司IM3575 ),含有4连亲和素-多曱藻素-氯叶素-蛋白混合物(Becton Dickinson 554064 )的抗-MHCII-生物素 (Ancelll31-030 )和抗CD45 APC ( Becton Dickinson 555485 )，在 室温下将PB染色30分。之后洗去未结合抗体，用FACS Calibur 细胞4义对PB进行流式细力包计数分析。图2显示的结果证明当肽封闭ERFAM的抑制作用减小时， ERFAM(抗IgE-IgG4 )抑制嗜石咸细胞活化(表现为IgE+表达CD203c 细月包的百分比)。
一奉状图表示了平均值+三倍测量4直标准差。抗 IgE-IgG4 ERFAM能够抑制93.95% ± 0.61%的嗜石威细月包活化作用， 如果将ERFAM与抗IgE产生的封闭肽一起预培养，就会失去抑制 活性。
实施例2:通过将IgE-结合的寡聚核苷酸与抗FcyR抗体耦合获得
ERFAM
IgE结合的寡聚核苦酸5'-GGGGCACGTTTATCCGTCCCTCCT AGTGGCGTGCCCC-3，(序歹'j号2)购自 MWG Biotech (德国 Ebersberg )。通过包含6个碳原子的间隔子将巯基附着在寡聚核苷酸 上，引入此巯基基团对5，末端进行修饰。此寡聚核苷酸的IgE结合 蛋白已经一皮Wiegand TW， Williams PB, Dreskin SC, Jouvin MH, Kinet JP, Tasset D所著的文献(人类IgE高亲和性寡聚核苷酸配体抑制与 Fc ￡受体的纟吉合)，J Immunol. 1996; 157(1): 221—30中净艮道过。
一种亲和纯化的抗人类CD32-B的羊多克隆抗体购自 Santa-Cruz生物4支术/>司(sc-13271 ),防止抗人CD32-B抗体与 CD32-B结合的相应的封闭肽(编目号SC-13271P )也购自Santa-Cruz 生物技术公司。
使用购自Pierce公司(23456)的可控蛋白-蛋白交联试剂盒将两 种寡聚核苦酸与抗人CD32-B抗体相交联生产ERFAM化合物。使 用相同试剂盒的试剂对亲和纯化后的抗-人CD32-B抗体进行马来酰 亚胺胺活化。2mg sulfo-SMCC溶解于2ml PBS中，然后3微升(超 过10倍摩尔量)力卩入到150微升抗人CD32-B抗体(在PBS中 lmg/ml )中。培养30分钟，之后用Sartorius浓缩4义(MWCO 100,000) 除去未反应的sulfo-SMCC。马来酰亚胺活4b的抗体浓度用购自Pierce的BCA蛋白分析试剂盒测定，并调整到在PBS溶液中为 2mg/ml。
将等体积的2mg/ml的包含巯基的IgE结合寡聚核苷酸与马来酰 亚胺活4匕的^i CD32-B 4元体〉'昆合，在室温下i咅养60分，然后用PBS 稀释至10ml并用Sartorius浓缩4义(MWCO 100,000洗涤。它们的浓 度用购自Pierce的BCA蛋白分析试剂盒测定，并调整到在PBS溶 液中为2mg/ml，所得化合物一皮分成两^f分。向其中的一^f分中加入20 孩i升0.5mg/ml的抗CD32-B产生的肽的PBS溶液，乂人而封闭抗 -CD32-B抗体的结合位点，同时，向另一份中加入等体积的PBS溶 液。在使用前将ERFAM在4。C下储藏至少24小时。
/人血液中在Histopaque-1077 (购自Sigma 乂>司)层上离心分离 外周血单个核细月包。进一步，用》兹J朱(购自Miltenyi Biotech ^>司的 编目号为130-053-401的嗜石威细胞分离试剂盒)分离多形核嗜石咸细 月包(PB )。唢口 Kleine等人在Int Arch Allergy Immunol. 2001; 126(4):277-85上发表的文献所述，通过在室温条件下，在乳酸緩冲 、液(13.4mM乳酉交，140mM NaCl, 5mM KC1， pH 3.9 )中i咅养3.5分 钟来剥去附着在PB上的IgE分子。然后，如Shreffler等人在文献J Allergy Clin Immunol. 2004; 113(4):776-82中所述，用有NP-净争异性 嵌合IgE抗体包含细胞悬浮培养基和白细胞介素3 ( 2ng/ml)存在的 AIM V细胞无血清培养基培养，对NP激活PB。
外周血单个核细胞重新悬浮(在0.1ml AIM V细胞培养基中悬 浮50,000每96孔板的小孑L )，在50微升AIM V渗析的NP-特异性 嵌合IgE抗体包含细胞悬浮培养基(用来对NP激活)和20微升 2mg/mlERFAM溶液(IgE结合寡聚核苷酸-抗-CD32-B )或用封闭肽 预先培养的等体积的ERFAM溶液存在的条件下培养过4支。
46第二天，在每个孔中力。入20孩吏升NP-6-牛血清白蛋白(lmg/ml )， 在37。C下进一步培养15分钟。收集悬浮物并在-20。C下冷冻用以测 量随后的组氨酸释放，同时，将细胞转入5ml FACS试管中用4ml 含有1%胎牛血清和0.1%叠石友4匕钠的石粦酸盐1￡冲液洗涤。然后一夸PB 染色,如Boumi.za R, Monneret G, Forissier MF, Savoye J， Gutowski MC， Powell WS, Bienvenu J.等人在文献(通过4企测CD203c ^R^,4企 测CD63显著改进了嗜碱细胞活化作用试验)，Clin Exp Allergy. 2003; 33(2): 259- 65所描述的，通过估定活性标记CD203c在细胞表面上 的表达来确定PB活性。用抗IgE FITC(荧光探针Serotec STAR96F ), 抗画CD203c PE (Immunotech 乂>司IM3575 )，含有4连亲和素画多曱藻 素-氯叶素-蛋白混合物(Becton Dickinson 554064 )的抗-MHCII-生 物素(Ancelll31-030 )和抗CD45 APC ( Becton Dickinson 555485 ), 在室温下将PB染色30分。之后洗去未结合抗体，用FACS Calibur 细月包4义对PB进4于流式细力包计凄t分冲斤。
图2显示的结果i正明当肽封闭ERFAM的抑制作用减小时， ERFAM (IgE-结合寡聚核苦酸-抗-CD32-B )抑制嗜碱细胞活化(表 现为IgE+表达CD203c细月包的百分比)。才奉状图表示了平均4直+三4咅 测量值标准差。IgE-结合寡聚核苷酸-抗-CD32-B ERFAM能够抑制 95.79% ± 0.51%的嗜石咸细月包活化作用，如果将ERFAM与抗CD32-B 抗体产生的封闭肽一起预培养，抑制活性会降低到34.88% ± 1.98%。
实施例3:通过一夺4元IgE 4元体与3元FcyR ^元体通过聚乙二醇l禺合获4寻
ERFAM
从Washington Biotechnology公司 (Simpsonville, MD)可以购得 抗IgE的兔类多克隆抗体，4安照KJ Dorrington和HH Bennich 1978 年在免疫学评论第41巻3-26页发表的文献"人免疫球蛋白E的结 构-功能关系"，该4元体通过用GVSAYLSRP SPFDLFIRKSPTITCL
(序列号1 )免疫处理兔子获得，该肽段代表局限于人的IgE重链序列的Cs3域中的335 - 359氨基酸残基。使用生物素酰化目标蛋白 (Sigma-Genosys 7>司合成)结合AffmityPakTM固定化抗生物素蛋白 色i普一主(Pierce)^^元体乂人兔血清中亲和纯^l出来，用Sartorius浓缩4义 (MWCO 100，000)进一步;农缩。用购自Pierce 乂>司的BCA蛋白分析 系统确定抗体浓度。 一种亲和纯化的抗人类CD32-B的羊多克隆抗 体购自Santa-Cruz生物技术^>司(sc-13271 ),防止抗人CD32-B抗 体与CD32-B结合的相应的封闭肽(编目号SC-13271P)也购自 Santa-Cmz生物技术公司。
通过使用购自Pierce ( 23456 )的可控蛋白-蛋白交联试剂盒将抗 IgE抗体与抗人CD32-B抗体交4关生产ERFAM化合物。向交耳关的抗 体中加入活化的聚乙二醇(分子量20,000道尔顿)用以产生具有附 加生物性质(免疫原性4交小，在循环过程中有4交长的半衰期)的分子。
最初，用相同试剂盒中的试剂将亲和纯化后的CD32-B抗体进 行马来酰亚胺活化。将2mg^5克代-琥珀酰亚胺酯4-[N -马来酰亚胺曱 酰]环己胺-l-羧酸酉旨(sulfo-SMCC)溶解于2ml PBS中，然后将3 樣i升(超出10倍摩尔量)加入到150孩i升抗人CD32-B抗体(在 PBS中为lmg/ml)中。培养30分钟后，用Sartorius浓缩4义(MWCO 100,000)除去未反应的sulfo-SMCC。马来酰亚胺活化的抗体浓度用 购自Pierce的BCA蛋白分析试剂盒测定并将浓度调整到在PBS中 为2mg/ml。
将等体积的2mg/ml包含巯基的抗-IgE抗体和马来酰亚胺活化 的抗CD-32-B抗体混合，在室温下培养60分，然后用10mM pH为 8.5的硼酸緩冲液稀考奪至10ml，用Sartorius浓缩4义(MWCO 100,000) 洗涤。用购自Pierce的BCA蛋白分析系统测定它们的浓度并将浓度 调整到2mg/ml。按照Beauchamp CO， Gonias SL， Menapace DP, Pizzo SV 1983年发表在Anal Biochem， 131(1): 25-33的文献"一种合成聚乙二醇-蛋白加合物的新工艺；对功能的作用，受体识别，和过氧 化物歧化酶，乳铁传递蛋白和oc-2-巨球蛋白的消除"所述的方法将 聚乙二醇(PEG, Fluka7^司购4f,编目号95172 )活4b。简要i也， 通过力口热到37。C将PEG溶解在二氧杂环乙烷(Sigma Aldrich 7>司 购得,编目号27,053-9 )中，终浓度为50mM，然后向其中加入1,1，-羰基二咪哇(Fluka公司购得，编目号21860 )终浓度为0.5M。在 37。C下将混合物水浴摇床培养2h,然后用购自NBS-Biologicals (编 目号X-I 1S-100)的MicroKros透析分离系统，先后用2 x 100ml PBS 和2x 100ml 10mM， pH 8.5的硼酸钠緩沖液将混合物析出。将O.lml ERFAM和O.lml活化PEG (两种聚合物都溶解于10mM, pH 8.5的 硼酸钠|￡沖液中)混合并在4。C下i咅养48h。 4吏用Slide-a-Lyzer迷你 透析分离系统(MWCO 3,500道尔顿，购自Pierce 乂>司，编目号 69550)将緩沖液用PBS (2x50ml，每次透析循环6h )置换出来，然 后，将聚乙二醇化的ERFAM分成两份。向其中的一份中加入20微 升0.5mg/ml的抗CD32-B抗体生产肽的PBS溶液用来封闭抗 CD32-B的结合位点，同时，向另一份中加入等体积的PBS。在使 用前将ERFAM在4。C下至少〗诸存24小时。
,人血液中在Histopaque-1077 (购自Sigma 7>司C-8889 )层上离 心分离夕卜周血单个冲亥细月包。进一步，用石兹5朱(购自Miltenyi Biotech />司的编目号为130-053-401的嗜石威细胞分离试剂盒)分离多形核 嗜石威细月包(PB)。
如Kleine Budde I, de Heer PG， van der Zee JS, Aalberse RC在文 献"剥离的嗜碱细胞组氨酸释放生物分析系统作为检测血清中过敏 原、净争异寸生IgE的工具"Int Arch Allergy Immunol. 2001; 126(4):277—85 中所述，通过在室温条件下，在乳酸緩冲液(13.4mM乳酸，14〇mM NaCl, 5mM KC1, pH 3.9 )中培养3.5分钟来剥去附着在PB上的IgE 分子。然后，如Shreffler WG， Beyer K, Chu TH， Burks AW， SampsonHA在文献"微阵列免疫测定临床历史，体夕卜IgE功能和引起过 壽丈原的花生4元原决定基的结合"J Allergy Clin Immunol. 2004; 113(4):776-82中所述，用有NP-特异性嵌合IgE抗体包含细月包悬浮 i咅养基和白细胞介素3 ( 2ng/ml)存在的AIM V细月包无血清培养基 培养，对NP激活PB。
夕卜周血单个核细月包重新悬浮(在0.1ml AIM V细月包培养基中悬 浮50,000每96孑14反的小孑L ),在50孩i升AIM V -参才斤的MP-净争异'l"生 嵌合IgE抗体包含细胞悬浮培养基(用来对NP激活)和20微升 2mg/mlERFAM溶液(抗IgE抗体-PEG-抗-CD32-B )或用封闭肽预 先培养的等体积的ERFAM溶液存在的条件下培养过夜。
第二天，在每个孔中加入20孩￡升NP-6-牛血清白蛋白(lmg/ml ), 在37。C下进一步培养15分钟。收集悬浮物并在-20。C下冷冻用以测 量随后的组氨酸释放，同时，将细胞转入5ml FACS试管中用4ml 含有1%胎牛血清和0.1%叠碳化钠的磷酸盐緩冲液洗涤。然后将PB 染色，如Boumi.za R, Monneret G, Forissier MF, Savoye J, Gutowski MC, Powell WS， Bienvenu J.等人在文南^(通过才企观'J CD203c 4戈一,才全 测CD63显著改进了嗜碱细胞活化作用试验)，Clin Exp Allergy. 2003; 33(2): 259- 65所描述的，通过估定活性标记CD203c在细月包表面上 的表达来确定PB活性。用抗IgE FITC(荧光探针Serotec STAR96F )， 抗-CD203c PE (Immunotech/>司IM3575 ),含有《连亲和素隱多曱藻 素-氯叶素-蛋白混合物(Becton Dickinson 554064 )的抗-MHCII-生 物素(Ancelll31-030 )和抗CD45 APC ( Becton Dickinson 555485 ), 在室温下将PB染色30分。之后洗去未结合抗体，用FACS Calibur 细月包4义对PB进4于流式细J包计lt分冲斤。
图2显示的结果"i正明当狀封闭ERFAM的抑制作用减小时， ERFAM (抗IgE抗体-PEG-抗-CD32-B )抑制嗜i成细胞活化(表现为 IgE+表达CD203c细胞的百分比)。棒状图表示了平均值+三倍测量^直标准差。抗IgE抗体誦PEG-抗-CD32画B ERFAM能够抑制95.2% ± 0.68%的嗜石成细胞活化作用，如果将ERFAM与抗CD32-B抗体产生 的封闭肽一起预培养，会使其失去抑制活性。
实施例4:通过将IgE结合成分(抗-IgE或其片段，多肽或寡聚核 苷酸)与抗-FcyR抗体(或它的Fab片|爻)耦合获得ERFAM。
/人Washington Biotechnology 乂>司 (Simpsonville, MD)可以购4寻 抗IgE的兔类多克隆抗体，4姿照KJ Dorrington和HH Bennich 1978
年在免疫学评论第41巻3-26页发表的文献"人免疫球蛋白E的结 构-功能关系"，该^t体通过用GVSAYLSRP SPFDLFIRKSPTITCL
(序列号1 )免疫处理兔子获得，该肽段代表局限于人的IgE重链序 列的Cs3域中的335 - 359氨基S臾残基。4吏用生物素酰化目标蛋白 (Sigma-Genosys ^>司合成)结合AffinityPak 固定化抗生物素蛋白 色谱柱(Pierce)将抗体从兔血清中亲和纯化出来，用Sartorius浓缩仪 (MWCO 100,000)进一步;农纟宿。用购自Pierce 乂>司的BCA蛋白分析 系统确定抗体浓度。 一种亲和纯化的抗人类CD32-B的羊多克隆抗 体购自Santa-Cmz生物一支术乂>司(sc-13271 )。 4吏用购自Pierce/>司 的可控蛋白-蛋白交联试剂盒将两种抗体交联制备ERFAM化合物。
简要地，500樣i升二甲替曱酰胺加入并溶解于2mg N-琥珀酰亚 胺S-乙酰硫代乙酸(SATA)中，然后将28微升(表示超出10倍摩 尔量)力。入到2ml抗IgE抗体(在PBS-EDTA溶液中浓度为3mg/ml ) 中，室温下培养30分来增加分子中的巯基基团。然后将5mg盐酸 羟胺溶解于100微升结合物緩冲液(从试剂盒中得到)中，加入到 SATA修饰的抗IgE抗体中用以在进一步的2小时培养中对潜在的 巯基基团脱^呆护。之后用Sartorius浓缩4义(MWCO 100,000)除去未反 应的化合物。在磷酸緩沖液(PBS)中用购自Pierce的BCA蛋白分 析系统测定巯基活化的抗体的浓度并将浓度调整到2mg/ml 。
51利用相同试剂盒中的试剂得到的亲和纯化后的抗人CD32-B抗 体进4亍马来酰亚胺活化。将2mg好"戈-琥珀酰亚胺酯4-[N -马来酰亚 胺曱酰]环己胺-l-羧酸酉旨(sulfo-SMCC)溶解于2ml PBS中，然后 将3微升(超出IO倍摩尔量)加入到150微升抗人CD32-B抗体中 (在PBS中为lmg/ml )。培养30分钟后，用Sartorius浓缩4义(MWCO 100,000)除去未反应的sulfo-SMCC。马来酰亚胺活化的抗体浓度用 购自Pierce的BCA蛋白分析系统测定并将浓度调整到2mg/ml。
等体积的2mg/ml巯基活化的抗IgE抗体和马来酰亚胺活化的 抗-CD32-B抗体混合并在室温下培养60分，然后将所得化合物分成 两 <分。向其中的一 4分中力口入 20 孩吏升 0.5mg/ml 的 GVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCL (序列号l)的肽,殳的PBS溶液， 用来封闭抗IgE抗体的结合位点，同时，向另 一〗分中加入等体积的 PBS溶液。在4吏用前将ERFAM在4°C下至少4诸存24小时。
从血液中在Histopaque画1077 (购自Sigma公司C-8889 )层上离 心分离夕卜周血单个4亥细月包。进一步，用石兹J朱(购自Miltenyi Biotech /〉司的编目号为130-053-401的嗜石成细胞分离试剂盒)分离多形核 嗜石成细月包(PB )。
在乳酸纟爰冲液中(13.4mM乳酸，140mM NaCl, 5mM KC1, pH 3.9)室温条件下培养3.5分钟剥离附着在PB上的IgE分子。外周 血单个核细胞重新悬浮(在o.lml AIM V细胞培养基中悬浮50,000 每96孑L板的小孔)，在50微升AIM V渗析的NP-特异性嵌合IgE 抗体包含细胞悬浮培养基(用来对NP激活)和20微升2mg/ml ERFAM溶液(抗IgE * -抗-CD32-B )或用封闭肽预先培养的等体积 的ERFAM溶液存在的条件下培养过4复。
第二天，在每个孔中力口入20樣吏升NP-6-牛血清白蛋白(lmg/ml )， 在37。C下进一步培养15分钟。收集悬浮物并在-20。C下冷冻用以测量随后的组氨酸释放，同时，将细胞转入5ml FACS试管中用4ml 含有1%胎牛血清和0.1%叠碳化钠的磷酸盐緩冲液洗涤。用抗IgE FITC (荧光才笨4十Serotec STAR96F ),抗-CD203c PE ( Immunotech 公司IM3575 ),含有链亲和素-多曱藻素-氯叶素-蛋白混合物(Becton Dickinson 554064 )的抗-MHCII-生物素(Ancelll31-030 )和抗CD45 APC (Becton Dickinson 555485 ),在室温下将PB染色30分。之后 洗去未结合抗体，用FACS Calibur细月包4义对PB进4亍流式细l包计凄t 分析。
图3显示的结果证明当肽封闭ERFAM的抑制作用减小时， ERFAM (抗IgE任选连接抗-CD32-B )抑制嗜石咸细胞活化(表现为 IgE+表达CD203c细胞的百分比)。棒状图表示了平均值+三倍测量 值标准差。
实施例5:用也能引起过敏抑制作用的过敏原特异性IgG4抗体替代
ERFAM-等〗介物。
用亲禾口色"i普4主，,J^口购自Amersham Biosciences (Little Chalfont, 英国，编目号#17-0716-01 )的HiTrap NHS-activated HP色i普柱，用 购自Sigma-Aldrich 7>司(p00le,英国)的抗人IgG4抗体将过每丈原 特异性IgG4从血浆中分离出来。之后，将经过洗堤的IgG4加入到 IgE激活的嗜^喊细胞中，使用上述方法确定过敏原特异性IgG4限制 IgE调节的嗜4^细胞脱粒的能力。
实施例6:通过将IgE结合化合物(抗-IgE或其片断，多肽或寡聚 核苷酸)与抗CD31抗体或其Fab片断耦合得到ERFAM。
乂人Washington Biotechnology 乂〉司 (Simpsonville， MD)可以购4寻 抗IgE的兔类多克隆抗体，接照KJ Dorrington和HH Bennich 1978 年在免疫学评论第41巻3-26页发表的文献"人免疫球蛋白E的结构-功能关系"，该4元体通过用GVSAYLSRP SPFDLFIRKSPTITCL
(序列号1 )免疫处理兔子获得，该肽段代表局限于人的IgE重链序 列的Cs3域中的335 - 359氨基酸残基。使用生物素酰化目标蛋白 (Sigma-Genosys 7>司合成)结合AffinityPakTM固定化抗生物素蛋白 色"i普柱(Pierce)将抗体乂人兔血清中亲和纯化出来，用Sartorius浓缩4义 (MWCO 100,000)进一步浓缩。用购自Pierce />司的BCA蛋白分析 系统确定抗体浓度。 一种亲和纯化的抗人类CD31多克隆抗体购自 Serotec ^>司(MCA 1738 )。 4吏用购自Pierce ^>司的可控蛋白-蛋白 交联:试剂盒将两种抗体交耳关制备ERFAM化合物。
筒要地，50(H鼓升二甲一辜曱酰胺加入并溶解于2mg N-琥珀酰亚 胺S-乙酰硫代乙酸(SATA)中，然后将28微升(表示超出10倍摩 尔量)力。入到2ml抗IgE抗体(在PBS-EDTA溶液中浓度为3mg/ml) 中，室温下培养30分来增加分子中的巯基基团。然后将5mg盐酸 羟胺溶解于IO(M毁升结合物緩沖液(从试剂盒中得到)中，加入到 SATA {奮饰的抗IgE抗体中用以在进一步的2小时培养中对潜在的 巯基基团脱保护。之后用Sartorius浓缩仪(MWCO 100,000)除去未反 应的化合物。在磷酸緩冲液(PBS)中用购自Pierce的BCA蛋白分 析系统测定巯基活化的抗体的浓度并将浓度调整到2mg/ml 。
利用相同试剂盒中的试剂得到的亲和纯化后的抗人CD31抗体 进行马来酰亚胺活化。将2mg碌u代-琥珀酰亚胺酯4-[N -马来酰亚胺 曱酰]环己胺-1-羧酸酯(sulfo-SMCC )溶解于2ml PBS中，然后将3 微升(超出IO倍摩尔量)加入到150微升抗人CD32-B抗体中(在 PBS中为lmg/ml)。培养30分钟后，用Sartorius浓缩4义(MWCO 100，000)除去未反应的sulfo-SMCC。马来酰亚胺活化的抗体浓度用 购自Pierce的BCA蛋白分析系统测定并将浓度调整到2mg/ml。
等体积的2mg/ml巯基活化的抗IgE抗体和马来酰亚胺活化的 抗-CD32-B抗体混合并在室温下培养60分，然后将所得化合物分成两 <分。然后向其中的 一 <分中力口入20孩吏升 0.5mg/ml 的 GVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCL (序列号l)的肽l殳的PBS溶液， 用来封闭抗IgE抗体的结合位点，同时，向另一4分中加入等体积的 PBS溶液。在4吏用前将ERFAM在4。C下至少^f诸存24小时。
乂人血液中在Histopaque-1077 (购自Sigma ^>司C-8889 )层上离 心分离外周血单个一亥细月包。进一步，用箱b朱(购自Miltenyi Biotech 乂》司的编目号为130-053-401的嗜石威细l包分离试剂盒)分离多形核 嗜石咸细月包(PB )。
在乳酸纟爰沖液中(13.4mM乳酸，140mM NaCl， 5mM KC1, pH 3.9)室温条件下培养3.5分钟剥离附着在PB上的IgE分子。外周 血单个核细胞重新悬浮(在0.1ml AIM V细胞培养基中悬浮50,000 每96孔板的小孑L )，在50孩史升AIM V渗析的NP-特异性嵌合IgE 抗体包含细胞悬浮培养基(用来对NP激活)和20微升2mg/ml ERFAM溶液(抗IgE抗体-抗-CD31 )或用封闭肽预先培养的等体 积的ERFAM溶液存在的条件下培养过4复。
第二天，在每个孔中加入2(H鼓升NP-6-牛血清白蛋白(lmg/ml ), 在37。C下进一步培养15分钟。收集悬浮物并在-20。C下冷冻用以测 量随后的组氨酸释力文，同时，将细胞转入5ml FACS试管中用4ml 含有1%胎牛血清和0.1%叠碳化钠的磷酸盐緩沖液洗涤。用抗IgE FITC (焚光探针Serotec STAR96F ),抗-CD203c PE (Immunotech 公司IM3575 ),含有链亲和素-多曱藻素-氯叶素-蛋白混合物(Becton Dickinson 554064 )的抗-MHCII-生物素(Ancelll31-030 )和抗CD45 APC ( Becton Dickinson 555485 ),在室温下将PB染色30分。之后 洗去未结合抗体，用FACS Calibur纟田月包4义只于PB进4亍流式细月包计凄t 分析。图3显示的结果证明当肽封闭ERFAM的抑制作用减小时， ERFAM (抗IgE-抗CD31)抑制嗜石咸细月包活化(表现为IgE+表达 CD203c细胞的百分比)。棒状图表示了平均值+三倍测量值标准差。
实施例7:通过将IgE结合化合物(抗-IgE或其片断，多肽或寡聚 核苷酸)与抗-抗FcyR抗体或其Fab片断耦合获得的ERFAM与另一 种通过将IgE结合化合物(抗-IgE或其片断，多肽或寡聚核苷酸) 与抗CD31抗体或其Fab片断耦合获得的ERFAM混合所得混合物
的作用。
使用上述方法制备抗IgE-抗-CD32B和抗IgE-抗-CD31两种 ERFAM分子。为了测试它们，向PB中分别加入20微升，估计所
得抑制效果。
实施例8:通过将抗IgE抗体与抗FcyR抗体的Fab片,殳耦合获
得ERFAM 。
从Washington Biotechnology公司 (Simpsonville, MD)可以购得 抗IgE的兔类多克隆抗体，4安照KJ Dorrington和HH Bennich 1978 年在免疫学评i仑第41巻3-26页发表的文献"人免疫^求蛋白E的结 构-功能关系"，该4元体通过用GVSAYLSRP SPFDLFIRKSPTITCL免 疫处理兔子获得，该肽萃殳代表局限于人的IgE重链序列的Ce3域中 的335 — 359氛基酉臾歹S基。4吏用生4勿素醜4匕目才示蛋白(Sigma—Genosys 公司合成)结合AffinityPakTM固定化抗生物素蛋白色谱柱(Pierce)将 抗体乂人兔血清中亲和纯化出来，用Sartorius浓缩4义(MWCO 100,000) 进一步浓缩。用购自Pierce公司的BCA蛋白分析系统确定抗体浓度。 从Santa-Cruz生物技术公司购买亲和纯化后的抗人CD32-B羊多克 P套抗体(sc-13271)。在购自Pierce 7>司的(catalogue number 44885) ImmunoPure Fab制备试剂盒中用木瓜蛋白酶消化此抗体。简要地， 将42mg半胱胺酸盐酸盐溶解于12ml pH为10的磷酸緩冲液中(两种试剂都来自试剂盒)制备12ml消化緩冲液。将0.2ml木瓜蛋白酶 浆倒入1.5ml Eppendorf试管中，用1ml消化緩冲液洗涤3次(1000g 下离心30秒)。移出纟爰冲液，加入IO(H敖升抗CD32B和100樣吏升 緩冲液。在37。C下摇床水浴培养Eppendorf，然后再次离心，收集 包含被消化抗体的悬浮物。将此悬浮物转入另一个1.5ml Eppendorf 试管中与0.2ml固定4t蛋白A(从购自Pierce公司，编目号为44667 的Immunopure Protein A #元体纯4匕试剂盒中4寻到)混合，室温下进 一步培养30分。通过离心收集包含Fab片段的悬浮物，在购自Pierce 乂>司的(i扁目号69550)的Slide國a-Lyzer MicroDialysis unit中用2x50ml PBS渗牙斤，每次6小时。所得Fab 〉容液用Slide-a-Lyzer浓缩 f义(Pierce 公司，编目号66528)浓缩。最后Fab的浓度用购自Pierce/>司(编 目号为23225)的BCA分析仪测定，并用pH 7.4的PBS调整到 0.5mg/ml。
用购自Pierce (23456)公司的可控蛋白-蛋白交联试剂盒将抗体 与Fab片,殳交联得到ERFAM化合物。
简要地，500微升二曱替甲酰胺加入并溶解于2mg N-琥珀酰亚 胺S-乙酰硫代乙酸(SATA)中，然后将28孩i升(表示超出10倍摩 尔量)力口入至'J 2ml抗IgE抗体(在PBS-EDTA ;容液中浓度为3mg/ml) 中，室温下培养30分来增加分子中的巯基基团。然后将5mg盐酸 羟胺;容解于10(M鼓升结合物H冲液(从试剂盒中得到)中，加入到 SATA修饰的抗IgE抗体中用以在进一步的2小时培养中对潜在的 疏基基团脱保护。之后用Sartorius浓缩4义(MWCO 100，000)除去未反 应的化合物。在磷酸纟爰冲液(PBS)中用购自Pierce的BCA蛋白分 析系统测定悉乾基活化的4元体的浓度并在PBS中将浓度调整到 2mg/ml。
利用相同试剂盒中的试剂对抗人CD32-B抗体的Fab片段进行 马来酰亚胺活化。将2mg^L代—琥珀酰亚胺酯4-[N -马来酰亚胺甲酰]环己胺-l-羧酸酯(sulfo-SMCC )溶解于2ml PBS中，然后将2微升 (超出IO倍摩尔量)力卩入到50农吏升抗人CD32-B抗体中(在PBS 中为0.5mg/ml )。培养30分钟后，用购自Pierce^>司的(编目号69550) 的Slide-a-Lyzer MicroDialysis unit除去未反应的sulfo-SMCC。
将等体积的0.5mg/ml巯基活化的抗IgE抗体与马来酰亚胺活化 的抗人CD32-B抗体的Fab片革殳混合，在室温下培养60分，然后将 所得化合物分装成两份，之后向其中的 一份中力。入20孩t升0.5mg/ml 的GVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCL (序列号l)多肽PBS 〉容液，,人 而佳-于锁^t IgE 4元体结合4立点，同时，向另一^f分中力口入等体积的PBS 溶液。在使用前，将ERFAM在4。C下储藏至少24小时。
从血液中在Histopaque誦1077 (购自Sigma公司C-8889 )层上离 心分离夕卜周血单个和细月包。进一步，用石兹5朱(购自Miltenyi Biotech 7>司的编目号为130-053-401的嗜石成细月包分离试剂盒)分离多形核 嗜石威细J包(PB )。
通过在室温条件下，在乳酸纟爰沖液(13.4mM乳酸，140mMNaCL 5mM KC1, pH 3.9 )中培养3.5分钟来剥去附着在PB上的IgE分子。 外周血单个核细月包重新悬浮(在0.1ml AIM V细月包it养基中悬浮 50,000每96孔板的小孑L ),在50微升AIM V渗析的NP-特异性嵌 合IgE抗体包含细胞悬浮培养基(用来对NP激活)和20孩吏升 2mg/mlERFAM溶液(抗IgE结合抗人CD32-B抗体的Fab片,殳)或 用封闭肽预先培养的等体积的ERFAM溶液存在的条件下培养过 夜。
第二天，在每个孔中力口入20微升NP-6-牛血清白蛋白(lmg/ml ), 在37。C下进一步培养15分钟。收集悬浮物并在-20。C下冷冻用以测 量随后的组氨酸释力文，同时，将细胞转入5ml FACS试管中用4ml 含有1%胎牛血清和0.1%叠碳化钠的磷酸盐緩冲液洗涤。然后用抗IgE FITC(焚光#1针Serotec STAR96F )，抗-CD203c PE( Immunotech 公司IM3575 ),含有链亲和素-多曱藻素-氯叶素-蛋白混合物(Becton Dickinson 554064 )的抗-MHCII画生物素(Ancell 131 -030 )和抗CD45 APC (Becton Dickinson 555485 ),在室温下将PB染色30分。之后 洗去未结合抗体，用FACS Calibur细胞仪对PB进行流式细胞计数 分析。
图4显示的结果i正明当肽封闭ERFAM的抑制作用减小时， ERFAM (抗IgE结合抗人CD32-B抗体的Fab片段)抑制嗜石威细胞 活化(表现为IgE+表达CD203c细胞的百分比)。棒状图表示了平 均《直+三^f咅测量Y直才示准差。IgE-结合寡聚核苦酸-抗-CD32-B ERFAM 能够抑制87.38% ± 1.55%的嗜碱细胞活化作用，如果将ERFAM与 抗IgE产生的封闭肽一起预培养，抑制活性会降低到30.89% ± 2.42%。
等同物
尽管这里详细的公开了具体的实施方案，但是通过实施例公开 的实施方案只是以i兌明为目的的，并不限制7>开发明的实现方式或 所附权利要求书所要求保护的范围。特别地，发明人已经考虑了， 在不背离本发明权利要求书的精神和权利要求书所定义的范围的情 况下，本发明有多种不同的代j替，改变和^奮饰。具有实施方案所述 知识的本领域普通技术人员应该相信多种改变或修饰只是一种常规 的实现方式。本发明的其他方面，有点和改进应一皮i人为包括在所附 斥又利要求4呆护的范围内。
权利要求
1. 一种组合物，其包括分子式为A’-B’的IgE重定位、功能性改变分子(ERFAM)，其中A’代表结合IgE的部分；和B’代表结合抑制性受体的部分，其中，A’可操作地连接B’。
2. 如4又利要求1所述的组合物，进一步包括可才喿作的连接A， 和B'的连接体部分。
3. 如—又利要求1所述的组合物，其中，所述组合物存在于包4舌 所述IgE，所述ERFAM和所述抑制性受体的多体组合物中。
4. 如权利要求1所述的组合物， 体Fc部分的抗原连才妄。
5. 如纟又利要求1所述的组合物，
6. 如权利要求1所述的组合物， 月包的IgE交耳关。
7. 如纟又利要求2所述的纟且合物， 醇连接体。
8. 如权利要求2所述的组合物， 所述连4妄体的ERFAM相比， 免疫原性。其中，所述B，与结合IgG4抗其中，B，是IgG4的同型抗体。 其中，所述《且合物不与结合细其中，所述连接体包括聚乙二其中，所述ERFAM与不包括 有延长的循环半衰期或减少的
9. 如权利要求1所述的组合物，其中，B，结合的受体选自由包含免疫受体酪氨酸依赖的抑制型基序(ITIM)的受体和凋亡 i秀导受体组成的组。
10. 如一又利要求9所述的组合物，其中所述(ITIM)包含受体存 在于选自由嗜石成细月包，月巴大细月包，B细月包，血小斗反和抗原存 在细力包所组成的组的细力包表面。
11. 如权利要求9所述的组合物，其中所述包含(ITIM)的受体 是CD31或CD32B。
12. 如4又利要求1所述组合物，其中A，或B，包^r能够通过与lgE 结合而线性化的环月太。
13. 如^又利要求1所述组合物，进一步包括药用载体。
14. 包括权利要求1所述组合物的试剂盒。
15. 分子式为A，-B'的组合物，其中A，包括抗IgE抗体或它们的抗IgE结合片段；和 B，包括结合包含(ITIM)的受体的抗体， 其中，A，可才喿作i也连4妄B，.
16. 如权利要求15所述组合物，进一步包括一种可操作地连接A' 和B'的连4妄体。
17. 如权利要求15所述组合物，其中所述包含(ITIM)的受体 是CD31或CD32B。
18. 治疗患有过壽丈症的患者的方法，包括对所述患者施用治疗有效剂量的分子式为A，-B，的ERFAM分子，其中 A，包括结合IgE的部分；和 B'包括结合抑制性受体的部分，其中，A，可操作地连接B，，因此治疗患有所述过敏症的 患者。
19. 如权利要求18所述方法，其中A，包括一种抗IgE抗体或其 抗IgE抗体结合片段，B，包括与包含(ITIM)的受体结合的 抗体。
20. 如权利要求18所述方法，其中ERFAM分子包括过敏原特异 性IgG4抗体。
21. 如权利要求18所述组合物，进一步包括可才喿作地连接A，和 B，的连4妄体部分。
22. 预防或减轻患者过每l反应的方法，包括在患者暴露于过壽文原 之前或同时，对患者施用有效剂量的分子式为A，-B，的 ERFAM分子，其中 A，包4舌结合IgE的部分；和B'包括结合抑制性受体的部分，其中，A，可操作地连接B，，从而预防或减轻所述患者的 过壽l性反应。
23. 如权利要求22所述方法，其中A，包括抗IgE抗体或其抗IgE 结合片段，和B，包括与包含(ITIM)的受体结合的抗体。
24. 如纟又利要求22所述组合物，进一步包4舌可4喿作地连4妻A，和 B，的连4妄体部分。
全文摘要
本发明提供了结构式为A’-B’的IgE重定位、功能性改变分子(ERFAM)构建物，其中A’代表与IgE结合的部分，B’代表与限制性受体结合的部分；另外，构建物的结构式也可以是A’-X-B’，其中，A’代表与IgE结合的部分，X代表连接体部分，B’代表与限制性受体结合的部分。本发明还提供了在治疗与IgE相关的不适，如过敏时，这些分子的使用方法。
文档编号C07K16/28GK101522714SQ200580023542
公开日2009年9月2日 申请日期2005年5月19日 优先权日2004年5月20日
发明者吉底恩·Dr·莱克, 维克托·Dr·特坎尤 申请人:圣玛莉医院国民健康保险基金;帝国学院创新有限公司