产生高度有效抗体的sars疫苗和方法

专利名称：产生高度有效抗体的sars疫苗和方法
产生高度有效抗体的SARS疫苗和方法
本申请要求2005年5月31日提交的尚未获得美国序列号的申请和 2004年6月2日提交的美国序列号60/576,118的申请的优先权，这两个 申请的全文内容并入本申请中。
本申请引用了许多出版物。为了更充分地描述本发明所属的技术领域 的状态，因而通过引用，将这些出版物的完整内容并入本申请中。
背景技术：
严重急性呼吸道综合征(SARS), —种新出现的感染疾病，由SARS-相关的冠状病毒(SARS-CoV)引起[l-7]，其可能源于一些野生动物[8]。 2002/2003年的SARS全球暴发导致数千病例和数百例死亡，严重地威胁 全世界的公共健康。在2003年年末和2004年年初，在中国报道了几例新 的SARS-CoV感染，其毒株不同于那些造成2002/2003年大流行的 SARS-CoV毒株[9]。在台湾、新加坡和中国报道了由于SARS-CoV分离 株的意外释放而引起的一些单独的发作(http:〃www.who.int/csr/sars/en)。这 些结果表明，SARS流行病可能在将来的任何时候复发，其通过SARS-CoV 由动物到人的传播或通过从实验室样品溢出的病毒导致发生。因此，迫切 需要开发有效的和安全的疫苗用于保护受威胁的人群。
目前，在中国，应用灭活SARS-CoV的一种候选疫苗正处于I期临床 实验[9, 10]。尽管已经表明所述灭活的SARS-CoV有效地保护动物免受 SARS-CoV的攻击，但是它在人中的功效尚不清楚。由于病毒体中的一些 抗原可以引起不中和而是增强病毒感染的抗体，因此，关于它的安全性存 在重要的关注[IO]。 一些病毒蛋白可以诱导有害的免疫和炎性反应，这是 SARS发病机理的潜在的起因和应用免疫抑制剂(例如，类固醇)用于 SARS治疗的基本原理[11，12](对这种治疗方案还有很大的争议)。最近， 据报道，雪貂的SARS-CoV感染引起轻微的肝脏炎症，并且如果雪貂在病毒攻击之前第一次用基于牛痘病毒的SARS疫苗免疫的话，所述肝脏损 伤变得严重得多[13]。
冠状病毒S蛋白负责病毒结合、融合和进入，并且是中和性抗体的主 要诱导剂[14-16]。此外，它们在病毒发病机理和毒性中起着重要的作用 [17]。 SARS-CoVS蛋白对于病毒功能和抗原性也是重要的[18, 19]。它是 由两个结构域，S1和S2组成的I型跨膜糖蛋白[18](图l)。 Sl负责病毒 与靶细胞上的受体结合。已经证明血管紧张肽转变酶2 (ACE2)是 SARS-CoV的功能受体[20-23]。位于Sl中间区域的片段是受体结合结构 域(RBD) [24-26]。 S2结构域，其含有推定的融合肽和2个七残基重复序 列(HR1和HR2)区域(

图1)，负责病毒和靶细胞膜之间的融合。如同衍 生于HIV-1 gp41 HR2区域的抗-HIV肽[27， 28]，衍生于SARS-CoV S蛋白 HR2区域的肽被鉴定为SARS-CoV感染的抑制因子[29]。 HR1和HR2区 域可以缔合形成六螺旋束结构[29， 30]，类似于HIV中gp41 [31]和其它冠 状病毒，诸如小鼠肝炎冠状病毒(MHV)中的S蛋白[32， 33]的融合活性核 心结构。这些结果表明， 一旦病毒S蛋白上的RBD结合于靶细胞上的 ACE2， S2就通过HR1和HR2区域之间的相互作用而改变构象，从而形 成融合核心结构并且使得病毒和靶细胞膜紧密接近，导致病毒融合和进入 [29]。这表明含有S蛋白上的功能结构域的片段可以用作抗原，用来诱导 阻碍病毒结合或融合的抗体。
一些编码SARS-CoV S蛋白的活的减毒的和遗传工程疫苗已经处于 临床使用前期的研究中。最近，Nabd和同事[34]报道了编码S蛋白的DNA 疫苗候选物诱导T细胞和中和性抗体的反应(中和性抗体滴度在从l: 50 到1: 150的范围)，并且保护小鼠免受SARS-CoV攻击，如由呼吸道中 减少的SARS-CoV滴度所表明的那样。他们证明所述保护由中和性抗体 而不是T细胞依赖型机制而介导。目前，Moss同合作者[35]证明，用包 含编码全长SARS-CoV S蛋白的基因的高度减毒修饰的疫苗病毒载体病 毒Ankara (MVA) (MVA/S)从鼻内或肌内接种小鼠，可产生具有SARS-CoV 中和活性的S特异性抗体(平均中和滴度是l: 284)，并且在从免疫小鼠 转移血清后保护小鼠免受SARS-CoV感染。这些数据表明，S蛋白可以诱 导保护性的中和性抗体，尽管所述中和性抗体滴度相对较低。
含有连接到人IgG-Fc片段(用于辅助RBD纯化)上的RBD的重组 融合蛋白作为抗原(称为RBD-Fc，见图1)用于免疫小鼠和兔，可以在 免疫动物中诱导高度有效的中和性抗体反应(平均中和滴度1: 〉10,000)， 并且所述抗体可以结合RBD并阻碍RBD同ACE2的结合。这表明，RBD 可以作为预防SARS的亚单位疫苗进行应用。
本发明公开一种重组融合蛋白或分离的多肽，其含有连接到人IgG-Fc 片段(用于辅助RBD纯化)的RBD，作为可以在免疫动物中诱导高度有 效中和性抗体反应(平均中和滴度对于兔是1: 15,360和对于小鼠是1: 12,553)的抗原(称为RBD-Fc，见图1)，这表明RBD可以作为预防SARS 的亚单位疫苗进行应用。
发明概述
严重急性呼吸道综合征(SARS)冠状病毒(CoV)的突起蛋白(spike protein， Sproteiii)， 一种I型跨膜包膜糖蛋白，由分别负责病毒结合和融 合的Sl和S2结构域组成。Sl含有受体结合结构域(RBD)，其可以特异 性结合血管紧张肽转变酶(ACE2)—靶细胞上的受体。
本发明提供包括有效量的分离的多肽或重组蛋白的疫苗，所述分离的 多肽或重组蛋白含有严重急性呼吸综合征(SARS)相关的冠状病毒突起 蛋白中的RBD序列，或其功能片段。
本发明还提供一种包括有效量的核酸分子的疫苗，所述核酸分子包括 一个片段的序列，其编码严重急性呼吸综合征相关的冠状病毒突起蛋白中 的RBD序列，或其功能片段。
本发明还提供一种重组融合蛋白，其含有严重急性呼吸综合征相关的 冠状病毒突起蛋白中的RBD序列，或其功能片段，和人IgGFc片段(称 为RBD-Fc)的序列，或其功能片段。
RBD-Fc可以在免疫动物，包括兔和小鼠中诱导高度有效的抗体反应。 所述抗体识别严重急性呼吸道综合征相关的冠状病毒突起蛋白中Sl结构 域上的RBD序列，严重急性呼吸道综合征相关的冠状病毒突起蛋白中Sl 结构域的序列，以及严重急性呼吸道综合征相关的冠状病毒突起蛋白的序 列。
来自用RBD-Fc免疫的动物(例如，兔和小鼠)的抗体有效地阻滞严 重急性呼吸道综合征相关的冠状病毒突起蛋白中的RBD或Sl结构域同可 溶ACE2分子或细胞上表达的ACE2的结合。
来自用RBD-Fc免疫的动物(例如，兔和小鼠)的抗体有效地中和 SARS-CoV和HIV/SARS-CoV S假病毒的感染，具有比由编码全长 SARS-CoV S蛋白的DNA疫苗和痘苗病毒载体诱导的小鼠抗血清的中和 滴度更高出约50-300倍的中和滴度。
从抗血清中消除抗Fc抗体没有影响中和活性。
这表明，严重急性呼吸道综合征相关的冠状病毒突起蛋白中Sl结构 域上的RBD序列可以诱导高度有效的中和性抗体反应，并且可以被开发 成为用于预防SARS的有效的和安全的亚单位疫苗。
连接RBD的IgG Fc可以显著地增强RBD的免疫原性，以产生高水 平的特异性针对RBD的抗体。连接IgG Fc与抗原的方法可以用于诱导高 水平的针对相应抗原的抗体。
本发明提供用于增加抗原免疫原性的组合物，其包括有效量的抗原和 IgGFc结构域，它的功能片段，或含有IgGFc结构域或它的功能片段的 物质。在一个实施方案中，所述抗原和IgG Fc是连接的。在另一实施方 案中，它们连接形成融合蛋白。
最后，本发明还提供将任何上述组合物用于免疫的方法。在一个实施 方案中，它们用作疫苗。
附图详述
图1. SARS-CoVS蛋白和重组融合蛋白RBD-Fc的示意图。S蛋白由 Sl和S2结构域组成。存在位于S蛋白N端的信号肽(SP)。 Sl结构域含 有受体结合结构域(RBD)。 S2结构域含有胞质结构域(CP)，跨膜结构域 (TM)禾卩由推定的内融合肽(FP)和七残基重复序列1和2 (HR1和HR2)区 域组成的胞外结构域。RBD-Fc由RBD和人IgG-Fc片段组成。Sl-C9含 有S蛋白Sl结构域和C9片段。
图2.小鼠抗血清含有结合于SARS-CoV S蛋白Sl结构域上的RBD 的高滴度的抗体。(A)通过从免疫前小鼠(免疫前)和每次增强后4天的 小鼠收集的抗血清(1:10，000)结合于RBD-Fc; (B)通过以连续5倍稀释 第三次增强后4天收集的小鼠抗血清结合于RBD-Fc;和(C)通过以连续 5倍稀释第三次增强后4天收集的小鼠抗血清结合于Sl-C9蛋白。所有的 样品进行两次检测，并且显示的数据是两次检测的平均值(对下述附图同 样)。
图3.兔抗血清含有结合于RBD的高滴度的抗体。(A)通过从免疫前 兔(免疫前)和每次增强后10天的兔收集的抗血清(1:10,000)结合于 RBD-Fc; (B)通过以连续5倍稀释第一次增强后IO天收集的兔抗血清结 合于RBD-Fc;和(C)通过以连续5倍稀释第一次增强后10天收集的兔抗 血清结合于S1-C9蛋白。
图4.通过针对RBD-Fc的小鼠抗血清中和SARS-CoV感染。(A)定 量连续2倍稀释的小鼠抗血清对由SARS-CoV在Vero E6细胞单层中复制 诱导的CPE的抑制。从应用来自小鼠M8的抗血清的实验获得的结果显 示于此作为实例。在显微镜下记录CPE，并且计算病毒中和滴度；和(B) 通过连续2倍稀释的小鼠抗血清中和HIV/SARS-CoV S假病毒的感染。在 萤光素酶检测中确定对表达ACE2的293T细胞单周期感染所述假病毒的 抑制。
图5.检测兔抗血清对由在Vero E6单层中SARS-CoV感染诱导的 CPE的抑制，如图4A所描述的那样进行检测。
图6.兔抗血清中和HIV/SARS-CoV S假病毒感染。在萤光素酶检测 中确定对表达ACE2的293T细胞单周期感染所述假病毒的抑制。
图7.从兔抗血清中消除抗-Fc抗体对结合Sl-C9和病毒中和活性的作 用。通过ELISA测定消除抗-Fc的和未处理的兔抗血清与人IgG (A)和 Sl-C9 (B)的结合能力。将消除抗-Fc的兔血清针对HIV/SARS-CoV S假病 毒的中和活性与未处理的兔抗血清的中和活性相比较(C)。
图8.小鼠和兔抗血清阻滞含有RBD的Sl与ACE2的结合。通过 ELISA测定小鼠抗血清(A)和兔抗血清(B)对Sl-C9与可溶的ACE2的结合 的抑制。通过流式细胞术测定兔抗血清对Sl-C9与细胞表达的ACE2的结 合的抑制(C)。在阳性对照中，不添加兔血清，而在阴性对照中，兔血清 和Sl-C9都没有添加。兔抗血清以剂量依赖型方式抑制Sl-C9与表达
ACE2细胞的结合(D)。 发明详述
本发明提供一种包括有效量的分离的多肽和重组蛋白的疫苗，所述分 离的多肽或重组蛋白含有严重急性呼吸综合征相关的冠状病毒突起蛋白
的受体结合结构域(RBD)或其功能片段。在一个实施方案中，适当的佐 剂与本发明所描述的所述疫苗一起应用。在另一实施方案中，所述疫苗是 偶联的。
当用于本文时，功能片段是行使所述功能的RBD的部分。在一个实 施方案中，所述功能是结合受体。
具有RBD序列的肽或多肽或蛋白
本发明提供包括严重急性呼吸系统综合征相关的冠状病毒突起蛋白 中的受体结合结构域序列或其功能片段的分离的肽或多肽或蛋白，其可以 用作用于预防严重急性呼吸道综合征相关的冠状病毒感染的疫苗。
在一个实施方案中，RBD具有下述序列
n工tn:lcpfgevfnatkfpsvyawerkk工sncvadysv:lynstffs tfkcygvsatklndlcfsnvyadsfwkgddvrqiapgqtgvia dynyklpddfmgcvlawntrnidatstgnynykyry:lrhgklrpferdis nvpfspdgkpctppalncywpiindygfytttgigyqpyrvwlsfeiinap atv (seq id no: 1)。
本发明意欲涵盖下述序列或下述序列的功能片段
N工TNLCPFGEVFNATKFPSVYAWERKK工SNCVADYSVLYNSTFFS TFKCYGVSATKLNDLCFSNVYADSFWKGDD卿IAPGQTGV工A DYNYKLPDDFMGCVLAWNTRNIDATSTGNYNYKYRYLRHGKLRPFERDIS NVPFSPDGKPCTPPALNCYWPLNi)YGFYTTTGIGYQPYRVWLSFELLNAP atv(seq id no: 1)。
本发明意欲涵盖具有在目前鉴定的SARS-CoV毒株中的天然突变 [6]:诸如R344—K; F360—S; L472—P; N479—K; D480—G; T487—S，
和任何非天然突变的RBD序列。
如本领域所知，序列的突变，取代，插入和缺失是可能的，而RBD 功能或免疫原性保持不变。本发明的目的是包括所述突变，取代，插入和缺失。
编码RBD序列的核酸片段
核酸疫苗提供了用完全基于基因的、由受者自身细胞表达的物质进行 免疫的新机会。在免疫过程中有更大的可控制性。所述疫苗可以在皮肤或 肌肉施用。其它分子，诸如细胞因子，可以共同表达。另外，免疫刺激性 DNA序列可以用来调节应答类型(Thl或Th2)。应答的持续时间可以通过
重复暴露于基因而进行控制，通过各种递送机制，诸如直接注射；电穿 孔；黏膜递送等，使得所述基因瞬时表达。严格按照合理设计制备DNA 分子的能力使得可能避免对于产生有效疫苗的数年的研发。这些疫苗在宿 主中表达并且存在，形成胞内抗原的理想的模拟物。参见美国专利号 6,339,068Bl; 6,821，957B2。
DNA分子，其包括编码严重急性呼吸道综合征相关的冠状病毒突起 蛋白中的受体结合结构域序列或其功能片段的核酸片段(例如，DNA疫 苗)，可以用作用于预防严重急性呼吸道综合征相关的冠状病毒感染的疫 苗。
包含载体的活的减毒病毒(例如，MVA)可以用作用于预防严重急 性呼吸道综合征相关的冠状病毒感染的疫苗，所述载体包括核酸片段或所 有分子，所述核酸片段或所有分子包含编码严重急性呼吸道综合征相关的 冠状病毒突起蛋白中的受体结合结构域序列或其功能片段的所述片段的序列。
含有与IgGFc结构域连接的RBD序列的融合蛋白或多肽
一种融合蛋白或分离的多肽，其包含严重急性呼吸道综合征相关的冠 状病毒突起蛋白中的受体结合结构域的序列或其功能片段，连接于物质， 所述物质包括IgG Fc结构域，其功能片段或者包含IgG Fc结构域或其功 能片段的物质，可以用作用于预防严重急性呼吸道综合征相关的冠状病毒 感染的疫苗。IgG分子可以被酶木瓜蛋白酶分解，在H链间二硫键上游位点的铰链
区产生2个Fab片段和1个Fc片段[59]。 Fc结构域主要功能之一是负责 IgG分子与细胞表面Fc受体(FcryR)的结合[60]。 IgG序列的实例示例如下-
THTCPPCPAPEUiGGPSVFLETPKPKDT皿SRTPEVTCVWDVSHEDP(2V訓WYVDGV QVH肌KTKPREQQYNSTYRWSVLTVLHQ冊LDGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLiPPSREEMTKNQVSIjTCIjVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG. (SEQ ID NO: 2) (61)。
来自不同种属的IgGFc应该作用相同。
本发明提供包括任何上述分离的多肽或任何上述融合蛋白和药用载 体的药物组合物。
本发明提供在受试者中诱导针对严重急性呼吸道综合征相关的冠状 病毒的抗体的方法，其包括给所述受试者施用任何上述疫苗或有效量的任 何上述融合蛋白或组合物的分离的多肽。
在一个实施方案中，所诱导的抗体是中和性的。
当在本文中陈述时，受试者是具有免疫应答的生物体。受试者包括但 不限于哺乳动物。所述受试者包括人，但可以是动物，诸如狗和猫。
上述方法可以产生多克隆的或单克隆的抗体。
本发明提供通过任何上述方法产生的抗体。这些抗体可以用来治疗或 预防严重急性呼吸道综合征相关的冠状病毒的感染。
抗独特型抗体
本发明提供抗独特型抗体，其应该模拟RBD，或其功能部分，针对 特异于SARS冠状病毒的RBD的单克隆抗体。
本发明还提供包括有效量的抗独特型抗体，其功能部分或可以如抗独 特型抗体一样作用的单链抗体的疫苗。
本发明提供确定包含在严重急性呼吸道综合征病毒SI中的中和表位 的方法，其包括步骤
(a)从SARS-CoV S蛋白的RBD序列产生肽；(b)用所述肽免疫动物(例如，兔，小鼠等)； (C)从所免疫的动物收集血液；和
(d)检测收集自用衍生于SARS-CoV s蛋白RBD的肽免疫的动物的抗 血清针对SARS-CoV的中和活性。
作为备选，细胞可以在体外免疫。可以收集适当的宿主的脾细胞，并 且与SARS-CoVS蛋白的RBD接触。免疫后，可以进行产生单克隆抗体 的常规流程。
表位
本发明还提供SARS-CoV S蛋白RBD的表位。在一个实施方案中， 所述表位通过上述方法确定。在另一实施方案中，所述表位是中和表位。
含有所述中和表位序列的分离的多肽或重组蛋白可以用作疫苗。
含有编码所述中和表位的序列的片段的序列的核酸片段或核酸分子， 或者包括含有编码所述中和表位的序列的片段的序列的核酸片段或核酸 分子的载体，可以用作疫苗。
本发明还提供含有所述表位的序列或构象的化合物。在一个实施方案 中，所述化合物是肽或多肽。
本发明还提供包括含有所述表位的化合物、分离的肽或多肽的组合物。
本发明还提供包括有效量的任何上述组合物的疫苗。 本发明提供在受试者中诱导针对严重急性呼吸道综合征病毒的抗体 的方法，其包括给所述受试者施用上述疫苗。
通过连接IgG Fc结构域增加免疫原性
本发明提供增加抗原免疫原性的方法，其包括将所述抗原连接于IgG Fc结构域，其功能片段或者含有IgG Fc结构域或其功能片段的物质。
本发明还提供用于增加抗原免疫原性的组合物，其包括有效量的抗 原，所述抗原连接于IgG Fc结构域或其功能片段或者含有IgG Fc结构域 或其功能片段的物质。
在上述方法或组合物的一个实施方案中，所述连接导致融合蛋白。
本发明还提供在受试者中增加抗原免疫原性的方法，其包括给所述受 试者施用抗原，所述抗原连接于IgG FC结构域或其功能片段，或者含有
IgGFc结构域或其功能片段的物质。
本发明提供用于增加抗原免疫原性的组合物，其包括有效量的抗原和 人IgGFc结构域，其功能片段，或者含有IgGFc结构域或其功能片段的 物质。所述IgGFc结构域可以来自兔、小鼠或任何其它动物。
所选择的抗原可以是任何来源的，只要它可以激发(illicit)免疫应答。 在一个实施方案中，所述抗原包括可以诱导抗体的任何抗原。在另一实施 方案中，所述抗原衍生于传染性的试剂。在另一实施方案中，它是病毒源 性的。
免疫原性的增加可以导致高水平的中和抗体，导致高滴度的针对所述 抗原的抗体或具有高结合亲和力的抗体。
适当的佐剂也可以用在所述疫苗或组合物中，以增加免疫应答。佐剂 的所述应用是本领域公知的。所述佐剂包括但不限于基于皂苷的佐剂。
本发明还提供上述组合物和药用载体，由此形成药物组合物。
本发明还提供包括上述组合和药用载体的药物组合物。对于本发明的 目的，"药用载体"意指任何标准的药用载体。适当的载体的实例是本领 域内公知的，并且可以包括，但不限于，任何标准的药用载体，诸如磷酸 缓冲盐溶液和各种湿润剂。其它载体可以包括用于片剂、粒剂和胶囊等中 的添加剂。典型地，这样的载体包含赋形剂，诸如淀粉、乳(milk)、糖、 某些类型的黏土、明胶、硬脂酸或其盐、硬脂酸镁或钙、滑石、植物脂肪 或油、树胶、二元醇或其它已知的赋形剂。这样的载体还可以包括调味和 着色添加剂或其它成分。包括这样的载体的组合物通过公知的常规方法配 制。
本发明证明，衍生于HR2区域的肽具有对SARS-CoV感染的抑制活 性，并且可以与衍生于HR1区域的肽相互作用，以形成六螺旋束，类似 于HIV中gp41的融合活性核结构。这些结果表明SARS-CoV进入靶细胞 的一种模型当Sl上的RBD结合于ACE2时，S2就通过HR1和HR2 区域之间的相互作用而改变构象，以形成融合核心结构并且使得病毒和靶 细胞膜紧密接近，这导致病毒融合和进入。这表明含有S蛋白中的功能区
域的片段可以用作免疫原，以诱导阻滞病毒结合或融合的抗体。
本发明还提供用于设计预防SARS的有效和安全的亚单位疫苗的方
法，其应用含有连接人IgG Fc片段(用于辅助RBD纯化)的RBD的重 组融合蛋白(称为RBD-Fc，见图1)作为抗原来免疫兔，并且评估了结 合RBD的抗体滴度，并且应用中和性SARS-CoV，以设计用于预防SARS 的有效和安全的亚单位疫苗。
通过下述实验详述将更好地理解本发明，但是本领域的那些技术人员 应该很容易理解，详细描述的具体实验仅仅是举例说明性的，并不是意欲 限制本文所描述的发明，其由下文所附的权利要求而定义。
实验详述 材料和方法
重组RBD-Fc和Sl-C9蛋白的表达。编码SARS-CoV S蛋白的193个 氨基酸的片段，其对应于受体结合结构域，其与人IgGl的Fc结构域融合 (RBD-Fc)的质粒，和编码在C端用C9标记的S1蛋白(残基12-672 )(S1-C9) 的质粒，先前已经描述过[21， 23]。按照制造者的方案，利用Fugene6试 剂(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)，通过用所述质粒转染293T细 胞分别表达RBD-Fc和Sl-C9。在转染后72 h收获上层清液。重组RBD-Fc 融合蛋白通过蛋白质A琼脂糖凝胶4快速柱(Amersham Biosciences, Piscataway， NJ)进行纯化，并且Sl-C9蛋白通过用抗C9小鼠单克隆抗体 (mAb) 1D4 (National Cell Culture Center, Minneapolis,画)的亲和层析进 行纯化。
用RBD-Fc免疫小鼠。将10只Balb/c小鼠(4周龄)在存在MLP+TDM 佐剂系统(Sigma, Saint Louis, MI)情况下用重悬在PBS (pH 7.2)中的10昭 纯化的RBD-Fc皮下免疫，并且在3-wk时间间隔用相同的抗原制备物增 强。作为对照的两只Balb/c小鼠以同免疫小鼠相同的方式处理，除了用 PBS代替RBD-Fc以外。在开始免疫之前收集免疫前血清，并且在每次增 强后4天收集抗血清。使用前将血清保存在4匸。
兔抗血清的产生。针对RBD-Fc的兔抗血清在Covance Research Products Inc. (Denver, PA)应用他们的标准流程而产生。简要地说，将NZW
兔在存在弗氏完全佐剂(FCA)的情况下用重悬在磷酸盐缓冲溶液(PBS, pH 7.2)中的150昭纯化的RBD-Fc皮下免疫，并且在3-wk时间间隔用免疫 原和弗氏不完全佐剂(FIA)的新鲜制备的乳剂增强。在开始免疫之前收集 免疫前血清，并且在每次增强后IO天收集抗血清。使用前将血清保存在 4°C。
酶联免疫吸附检测(ELISA)。通过ELISA确定小鼠和兔血清与各种抗 原的反应性。简要地说，分别应用l pg/ml重组蛋白(RBD-Fc或Sl-C9) 或纯化的人IgG (Zymed, South San Francisco, CA)来包被96孔微量滴定平 板(Coming Costar, Acton, MA)，在0.1 M碳酸盐缓冲液(pH 9.6)中4。C过夜。 用2%脱脂牛奶封闭后，分别将连续稀释的小鼠和兔血清加入，并且在37 。C温育lh，接着用含有0.1%吐温20的PBS洗涤4次。通过分别添加HRP-偶联的山羊抗鼠和兔IgG(Zymed)和顺序加入底物3，3',5，5'-四甲联苯胺 (TMB)检测结合的抗体。通过ELISA微孔板分析仪(Tecan US， Research Triangle Park, NC)测定450 nm吸收。
SARS-CoV感染的中和。SARS-CoV感染的中和按照先前所述进行评 估[29]。简要地说，将Vero E6细胞(5 X 104细胞/孔)接种于96孔组织培养 平板并且过夜生长。将100TCIDso(5(P/。组织培养感染剂量)的SARS-CoV BJ01毒株(登记号AY278488)分别与等体积的稀释的小鼠和兔血清混 合，并且在37。C温育lh。将所述混合物添加到单层VeroE6细胞上。按 照先前所描述[29]，在感染后第3天记录细胞病变效应(CPE)。中和滴度 代表按照Reed's方法[36]所计算在50%的孔中完全阻止CPE [34]的小鼠和 兔抗血清的稀释液。
假病毒感染的中和。具有SARS-CoV S蛋白的假型HIV (HIV/SARS-CoV S)按照先前所述而制备[23, 24]。简要地说，应用Fugene 6 试剂(Boehringer Mannheim)，将293T细胞用编码密码子优化的 SARS-CoVS蛋白的质粒和编码Env-缺陷型、表达萤光素酶的HIV-1基因 组的质粒(pNL4-3.1uc.RE)共同转染。在转染后48 h收集含有 HIV/SARS-CoV S蛋白的上层清液，并且用于ACE2-转染的293T细胞的 单周期感染。简要地说，将表达ACE2的293T细胞接种(104细胞/ 10到 96孔组织培养平板中并且生长过夜。在加入细胞之前，将假病毒分别同2 倍连续稀释的小鼠和兔血清一起在37。C预先温育1 h。 24h后将在培养板 中添加新鲜培养基，并且再温育48 h。将细胞用PBS洗涤，并且应用包 含在萤光素酶试剂盒(Promega， Madison， WI)中的裂解试剂裂解。将等试样 的细胞裂解物转移到检测发光信号的平底96孔板(Corning Costar, Corning, NY)，接着加入萤光素酶底物(Promega)。在Ultra 384微孔板分析仪(Tecan US)上立即确定相对亮度单位。
Sl蛋白与可溶ACE2结合的抑制。用2 |ig/ml重组可溶的ACE2 (R&D systems, Inc., Minneapolis, MN)于0.1 M碳酸盐缓冲液(pH 9.6)中4。C过夜 包被96孔ELISA板(Coming Costar)。用2%脱脂牛奶封闭后，将2吗/ml Sl-C9添加到分别存在2倍连续稀释的小鼠和兔血清的孔中。在37。C温育 1 h后，将mAb 1D4 (National Cell Culture Center)加入并且继续在37。C温 育l h。洗涤后，将HRP-偶联的山羊抗鼠IgG (Zymed)和底物TMB用于 检测。
通过流式细胞术测定Sl与细胞表达的ACE2的结合的抑制。将106 解离的293T/ACE2细胞用Hank's平衡盐溶液(HBSS) (Sigma, St. Louis, MO) 洗涤，然后在存在或不存在指定稀释倍数的兔血清时，将S1-C9添加到细 胞中至终浓度1 lag/ml，接着在室温温育30min。彻底洗涤后，将抗C9 mAb 1D4添加到细胞中至终浓度10pg/ml，并且在室温温育30min。将细胞用 HBSS洗涤，并且与l: 50稀释的抗鼠IgG-FITC偶联物(Sigma)在室温继 续温育30 min。洗涤后，将细胞用含1%甲醛的PBS固定，并且应用 CellQuest软件，在Becton FACSCalibur流式细胞仪(Mountain View, CA) 中分析。
实验结果
针对RBD-Fc的小鼠和兔抗血清含有结合于RBD和Sl结构域的高滴 度抗体。将10只小鼠(M1-M10)用RBD-Fc免疫，并且将2只对照小鼠(N1 和N2)用PBS处理。在免疫前(免疫前)，和在以3 wks时间间隔的每次 增强后4天收集小鼠抗血清。通过ELISA检测以1: 10，000稀释的血清样 品与重组融合蛋白RBD-Fc的结合。如在图2A中所示，第一次增强后4 天收集的血清表现出中等的结合能力。然而，这种活性在以3wks时间间
隔的第二次和第三次增强后显著地增加了 。在第三次增强后4天收集的抗
血清表现出最高的RBD-Fc结合能力。因此，我们应用这批小鼠抗血清用 于后续的抗体滴定和中和实验。这些抗血清以剂量依赖型方式结合 RBD-Fc，平均滴度(GMT)在1: 312,500 (图2B)。由于RBD-Fc还含有人 IgG-Fc片段，因此，除了RBD，小鼠血清中的抗体还可以结合Fc。因此， 我们检测了针对重组蛋白Sl-C9的小鼠抗血清的结合能力，所述抗血清含 有RBD但是没有Fc。如在图2C中所示，小鼠抗血清以与图2B中所示的 在用RBD-Fc作抗原的实验中所显示的方式相似的方式结合Sl-C9，尽管 针对Sl-C9抗体的GMT (1: 62,500)比针对RBD-Fc的更低。这表明抗RBD 抗体是小鼠抗血清主要抗体群体中的一员。
对于在免疫前(免疫前)和以3 wks时间间隔的每次增强后IO天收 集的兔抗血清，也检测它们结合RBD-Fc和Sl-C9的活性。如在图3A中 所示，第一次增强后10天收集的抗血清(1: 10，000)具有最大的与RBD-Fc 反应性，并且在第二次和第三次增强后保持所述高水平。在第一次增强后 10天收集的抗血清的GMT是1:7,812,500 (图3B)。因此，我们将这些抗 血清样品用于后续的研究。这些兔抗血清还以剂量依赖型方式结合 Sl-C9，具有1: 312,500的GMT (图3C)，与用小鼠抗血清得到的结果一 致。
针对RBD-Fc的小鼠和兔抗血清含有高滴度的SARS-CoV-中和抗体。 应用2种不同的检测系统，即，在VeroE6中感染SARS-CoV，和在表达 ACE2的293T细胞中感染具有SARS-CoV S蛋白的假型HIV (HIV/SARS-CoV S)，检测所述抗血清它们的中和活性。来自5只小鼠 1: 10，240的抗血清和来自其余5只小鼠1:5,120的抗血清完全保护VeroE6 细胞免受SARS-CoV感染(即，没有观察到CPE并且细胞单层保持完好)。 在更高的血清稀释度，细胞数目由于SARS-CoV在细胞中复制诱导的CPE 而减少。这里我们显示从小鼠M8获得的结果作为实例(图4A)。基于 Reed's方法[36]计算的平均中和性抗体滴度是1: 10,862。 1: 40稀释的免 疫前小鼠血清对SARS-CoV感染没有抑制活性。这些小鼠抗血清还高度 有效地抑制HIV/SARS CoV S假病毒的感染，具有1:13,636的50%中和 滴度(GMT)(图4B)，这表明抗RBD抗体可以抑制SARS-CoV和含有
SARS-CoV S蛋白的假病毒的感染。类似地，在第一次增强后10天收集 1: 10,240稀释的兔抗血清也完全抑制由SARS-CoV在VeroE6细胞中复制 引起的CPE，具有1: 14,482的中和GMT (图5)。这些兔抗血清也有效地 抑制HIV/SARS-CoV S假病毒的感染(图6)。在第二次和第三次增强后 10天收集的抗血清具有同等的针对SARS-CoV和假病毒感染的中和活性 (数据未显示)。
从针对RBD-Fc的抗血清中消除抗Fc抗体没有影响RBD结合和中和 活性。由于重组融合蛋白RBD-Fc还含有人IgG Fc片段，所以期望这种 抗原也将诱导抗Fc抗体。事实上，兔抗血清(1:100)与在平板孔中包被的 人IgG-Fc起反应(图7A)。然而，由于消除抗Fc的抗血清在ELISA中 不与人IgG反应(图7A)，所以，通过将所述抗血清通过用人IgG偶联的 柱子，抗Fc抗体可以从所述抗血清中消除。消除抗Fc的抗血清保留了 RBD结合活性(图7B)和针对HIV/SARS-CoV S假病毒感染的中和活性 (图7C)，同未处理的兔抗血清相当。这些结果表明，由人IgG-Fc诱导 的抗血清中的抗Fc抗体对兔抗血清的RBD结合和病毒中和活性没有贡 献。
针对RBD-Fc的小鼠和兔抗血清有效地阻滞了 RBD与ACE2的结合。 我们分别应用ELISA和流式细胞术检测小鼠和兔抗血清中的抗RBD抗体 是否阻滞RBD与可溶的和细胞相关的(cell-associated)ACE2的结合。由于 RBD-Fc还可以与抗血清中针对RBD-Fc的抗Fc抗体起反应，我们在用于 确定RBD结合的所有实验中应用只含有RBD但是没有Fc的Sl-C9。 ELISA检测中，将可溶的ACE2包被在ELISA平板的孔上，Sl-C9显著 地结合ACE2 (数据未显示)。小鼠和兔抗RBD抗血清都以剂量依赖型方 式有效地阻滞Sl与ACE2的结合，而免疫前血清没有抑制活性(图8A 禾口8B)。有趣地，来自5只小鼠(M6-M10)具有更好的抑制S1-ACE2结 合活性的血清在Vero E6细胞中具有比来自小鼠Ml-M5的抗血清更加有 效的针对SARS-CoV感染的中和活性(数据未显示)。包被在酶标板上的 可溶的ACE2可能失去天然构象，所以我们还应用了细胞表达的ACE2， 预计其保留天然构象，用来在流式细胞测定中检测结合RBD的能力。如 在图8C中所示，当用抗C9 mAb 1D4 (阳性对照)测定时，Sl-C9显著地结
合表达ACE2的细胞。如果不添加Sl-C9 (阴性对照)，只检测到背景信 号。1: 100的兔抗血清有效地阻滞S1结合细胞表达的ACE2，而相同稀 释度的免疫前兔血清没有抑制活性。兔抗血清对Sl与表达ACE2的细胞 结合的抑制活性是剂量依赖性的。从兔抗血清中消除抗Fc抗体没有影响 兔抗血清对S1-ACE2相互作用的抑制活性(图8D)，这证实抗RBD活性 不是受到抗Fc抗体的介导。
结果讨论
在SARS流行的2002/2003年期间，尽管缺乏有效的和具体的治疗， 但是大多数SARS患者还是从这种急性疾病康复了，并且只有非常少数患 者可能被再次感染SARS-CoV (http:〃www.who.int/csr/sars/en)。中和性抗体 可在SARS患者康复期的血清中检测到[37]。被动给予康复期血清可用于 治疗SARS-CoV感染(http:〃www.crienglish.com/144/ 2003-5-7/11@12493. htm)。
接种来自SARS-CoV感染的[38]或用MVA/S免疫的[35]小鼠的超免疫 血清在攻击后减少了呼吸道中SARS-CoV的滴度。这些数据表明保护性 体液免疫是可获得的并且可以开发用于预防SARS的疫苗。
许多疫苗候选物正处于临床试验和临床前期的研究，包括编码 SARS-CoV S蛋白的灭活疫苗、DNA疫苗和基于牛痘病毒的疫苗[9, 10, 34， 35]。这些试剂在动物中有效地诱导保护性的中和性抗体反应[34， 35]。在 本研究中，由于RBD是负责病毒与靶细胞上受体结合的S蛋白的主要功 能结构域[24-26]，并且含有中和表位[39]，所以我们将重组融合蛋白 (RBD-Fc)用作免疫原来免疫小鼠和兔。针对其它冠状病毒，诸如MHV， 传染性胃肠炎病毒(TGEV)和人冠状病毒(HCoV-229E) S蛋白上的RBD的 抗体[40-42]，和针对所述冠状病毒受体的那些抗体[43， 44]，高度有效地 阻滞RBD受体相互作用并且中和相应的冠状病毒感染。我们发现RBD-Fc 融合蛋白在免疫的小鼠和兔中激发高度有效的中和性抗体反应，并且所述 抗血清在1:5,120-1:10,240的血清稀释度可以完全阻滞SARS-CoV感染(图 4和5)，具有1:10,381 (小鼠抗血清)和1:14,451 (兔抗血清)的平均中和滴 度，比来自用编码全长S蛋白的DNA疫苗和基于痘苗病毒的疫苗免疫的
小鼠的抗血清的平均中和滴度要高出约40-200倍[34， 35]。
由于全长S蛋白包含RBD和其它病毒功能结构域和多个中和表位， 预计它比单独RBD诱导更加有效的中和性抗体。为什么RBD实际上比全 长S蛋白激发滴度高得多的中和性抗体的一种可能的原因为，后者含有非 中和性表位，其可以激发增强性抗体，如同由HIV和埃博拉病毒的包膜 糖蛋白上的抗原位点所诱导的那些[45-48]。来自一些冠状病毒的S蛋白也 可能诱导增强性抗体。例如，用编码猫科传染性腹膜炎病毒(FIPV)的S蛋 白的牛痘病毒载体免疫猫在病毒攻击后导致病毒复制的增强[49， 50]，并 且激发增强性抗体的表位位于S蛋白中[51]。尽管在用编码SARS-CoV S 蛋白的DNA疫苗和基于痘苗病毒的疫苗免疫的小鼠中没有观察到增强的 病毒复制，但是这不可能排除这样的可能性，即，增强性抗体滴度比中和 性抗体滴度更低。在这样的情形中，增强性抗体可以抑制或"中和"中和 性抗体活性，这导致中和性抗体滴度降低。
重组融合蛋白RBD-Fc能够诱导高度有效的中和性抗体的另一种可能 性可能是由于所述抗原包含人IgG Fc片段。抗原呈递细胞(APCs)，诸如 树突细胞和单核细胞/巨噬细胞，可以将抗原捕获，处理并且呈递到T辅 助细胞，T辅助细胞调控抗体生产。已经表明，APCs表达对IgG Fc高亲 和力的受体，FqRI (也称为CD64)和低亲和力受体，FqRIII (CD16) [52,53]。通过这些受体，APCs可以促进含有抗原和抗体IgG的免疫复合 物的递呈，并且增强针对所述免疫复合物的抗体应答，从而导致自体免疫 疾病[53]。然而，通过所述抗原是病毒蛋白，诸如SARS-CoVS蛋白中的 RBD，将人IgGFc与其偶联可以促进RBD到免疫细胞的递呈，以激发高 度有效的抗RBD抗体反应并且中和SARS-CoV感染。
针对RBD的小鼠和兔抗血清有效地结合SARS-CoV S蛋白Sl结构域 上的RBD (图2和3)，并且抑制RBD与可溶的和细胞表达的ACE2的结 合(图8)。这些结果证实小鼠和兔抗血清含有特异性靶向RBD的抗体。 尽管我们没有检测小鼠和兔抗RBD抗体在动物模型中抗SARS-CoV攻击 的保护性活性，但是体外所检测的这些抗血清的高中和性滴度表明， RBD-Fc可以在动物和人中诱导强保护性的免疫作用，这是根据针对 SARS-CoV感染的有效的保护可以通过来自具有1:20到1:1，280范围的中
和性抗体滴度的SARS患者的康复期血清[37]和通过来自用具有低中和性 抗体滴度(1:50-1:284)编码S蛋白的DNA疫苗和基于痘苗病毒的疫苗免疫 的小鼠的抗血清[34，35]而获得的。
大多数冠状病毒的S蛋白，尤其是S1结构域的序列，是高度可变的 [14]，这是在研发针对具有独特的基因型和表型的病毒毒株的有效的疫苗 中的主要关注点。然而，最近的研究已经表明SARS-CoV毒株十分稳定， 并且变化没有像最初预计的那样多[IO]。在2002/2003年SARS流行病的 早期，由于在从动物(例如，果子狸(palm civet)) SARS-样-CoV到人 SARS-CoV传播过程中的正向选择压力，SARS-CoVS蛋白RBD中的193 个氨基酸中有5个是易变的。然而，在中期和后期(在这两个阶段，大多 数毒株从SARS患者分离出来)，在RBD序列中没有突变[6]。并且，即 使RBD的线性序列可能是易变的，但是RBD的构象是相对保守的，以保 证具有不同亚型的病毒与靶细胞上的特异受体结合。一个实例是单克隆抗
体B12，其识别HIV-1 gpl20上CD4结合结构域上的中和性表位，并且中 和多种亚型的HIV-1临床分离株，尽管来自相应的毒株的gpl20中CD4 结合区域的线性序列是高度易变的[54, 55]。我们的数据表明，由于所述 抗血清不与覆盖RBD序列的任何肽起反应，所以小鼠和兔抗血清中针对 RBD的抗体可能是主要识别RBD上的构象表位(He等，未发表数据)。这 些结果表明抗RBD抗体可以具有针对广谱SARS-CoV毒株的特异性的中 和活性。
综上所述，由于与灭活病毒或活的减毒病毒载体相比较，它能诱导抑 制Sl与受体的相互作用以及中和SARS-CoV感染的高度有效的抗体，并 且仅具有低水平的风险，所以重组融合蛋白RBD-Fc是理想的疫苗候选物。 因此，RBD-Fc可以进一步开发为用于SARS预防的有效的和安全的亚单 位疫苗。 参考文献
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权利要求
1.一种包括有效量的分离的多肽或重组蛋白的疫苗，其中所述分离的多肽或重组蛋白含有严重急性呼吸道综合征相关的冠状病毒突起蛋白中受体结合结构域的序列或其功能片段。
2. 权利要求1的疫苗，其中所述受体结合结构域包括含有下述序列的全部或部分序列nitnlcpfgevfnatkfpsvyawerkkisncvadysvlynstetstfkcygvsatk:lnd:lcfsnvyadsfwkgddvrqiapgqtgv工ad ynykl p ddfmgcvlawntrn工dat stgn ynykyrylrhgklrp ferdisnvp fs p dgkpct p palnc ywplndygfytttgigyqp yrvwls fellnapatv (SEQIDNO: 1)。
3. —种包括有效量的核酸分子的疫苗，其中所述核酸分子包括一个片段 的序列，其编码严重急性呼吸道综合征相关的冠状病毒突起蛋白中的 受体结合结构域的序列或其功能片段。
4. 一种分离的多肽，其不同于严重急性呼吸道综合征病毒的S1蛋白，包 括严重急性呼吸道综合征相关的冠状病毒突起蛋白中的受体结合结构 域的序列或其功能片段。
5. 权利要求4的分离的多肽，其包括含有下述序列的全部或部分序列N工TNLC P FGEVFNATKFP SVYAWERKK工SNCVADY SVLYN S T FFS TFKCYGVSATKLNDLCFSNVYADSFWKGDDVRQIAPGQTGVIA 訓YKLPDDFMGCVLAWNTRNIDATSTGNYNYKYRYIiRHGKLRPFERDIS NVP FS P DGKPCT P PALNC YWPLND YGFYTTTGIGYGP YRVWLS FELLNAPatv (SEQIDNO: 1)。
6. 权利要求4或5的分离的多肽，其连接于物质，所述物质包括IgG Fc 结构域，其功能片段或者含有IgGFc结构域或其功能片段的物质。
7. 权利要求6的连接的多肽，其包括含有下述序列的全部或部分序列 sft:lyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqks:ls:lspg (SEQ ID NO: 2)。
8. 权利要求6或7的分离的连接多肽，其中所述IgGFc是来自人、兔、 小鼠和其它动物。
9. 权利要求6或7的分离的连接多肽，其为融合蛋白。
10. —种核酸分子，其包括编码权利要求4-9中任一项的多肽的片段的序 列。
11. 一种载体，其包括权利要求10的包含片段的序列的核酸分子。
12. —种组合物，其包括有效量的权利要求4-9中任一项的分离的多肽，权 利要求10的核酸片段，或权利要求11的载体。
13. —种药物组合物，其包括权利要求4-9中任一项的分离的多肽，或权利 要求10的包括片段的序列的核酸分子，或权利要求11的载体，和药 用载体。
14. 一种用于在受试者中诱导针对严重急性呼吸道综合征病毒的抗体的方 法，其包括给所述受试者施用权利要求1或2的疫苗，或有效量的下 列各项权利要求4-9中任一项的分离的多肽，或权利要求10的包括 片段的序列的核酸分子，或权利要求11的载体，或权利要求11或12 的组合物。
15. 权利要求14的方法，其中所述抗体是中和性的。
16. 权利要求14或15的方法，其中所述受试者是人或动物。
17. 权利要求13-16中任一项的方法，其中所述抗体是多克隆抗体。
18. 权利要求13-16中任一项的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
19. 一种由权利要求13-18中任一项的方法产生的抗体。
20. —种抗独特型抗体或其功能部分，其针对权利要求18的单克隆抗体。
21. —种疫苗，其包括有效量的权利要求20的抗独特型抗体或其功能部分。
22. —种用于确定包含在严重急性呼吸道综合征病毒的S1中的中和性表位 的方法，其包括步骤(a) 从SARS CoV S蛋白的RBD序列产生肽；(b) 用所述肽免疫动物；(c) 从所免疫的动物收集血液；和 (d)检测收集自用衍生于SARS CoV S蛋白RBD的肽免疫的动物的抗 血清针对SARS-CoV的中和活性。
23. 权利要求22的方法，其中所述动物是兔或小鼠。
24. 通过权利要求22的方法确定的表位，或含有所述表位的序列或构象的 分离的肽，或包括编码所述表位的片段的序列的核酸分子。
25. —种化合物，其含有权利要求23的表位或其功能等价物。
26. —种组合物，其包括权利要求23的表位，权利要求24的分离的肽， 或权利要求25的化合物，或包括编码所述表位的片段的序列的核酸分 子。
27. —种疫苗，其包括有效量的权利要求26的组合物。
28. —种用于在受试者中诱导针对严重急性呼吸道综合征病毒的抗体的方 法，其包括给所述受试者施用权利要求27的疫苗。
29. —种增加抗原免疫原性的方法，其包括将所述抗原连接于IgG Fc结构 域，其功能片段或者含有IgGFc结构域或其功能片段的物质。
30. —种增加抗原的免疫原性的组合物，其包括有效量的抗原，所述抗原 连接到IgG Fc结构域或其功能片段或者含有IgG Fc结构域或其功能片 段的物质上。
31. 权利要求29的方法或权利要求29的组合物，其中所述抗原连接到IgG Fc结构域或其功能片段上以形成融合蛋白。
32. —种增加抗原在受试者中免疫原性的方法，其包括给所述受试者施用 所述抗原，所述抗原连接到IgGFc结构域或其功能片段，或者含有IgG Fc结构域或其功能片段的物质上。
33. —种用于增加抗原的免疫原性的组合物，其包括有效量的抗原和IgG Fc结构域，其功能片段，或者含有IgGFc结构域或其功能片段的物质。
34. 权利要求29-32中任一项的方法或权利要求33的组合物，其中所述抗 原衍生于一种传染性试剂。
35. 权利要求34的方法，其中所述免疫原性的增加导致高水平的中和抗体。
36. 权利要求29-32中任一项的方法或权利要求33的组合物，其中所述抗 原是可以诱导抗体的任何抗原。
37. 权利要求36的方法，其中所述免疫原性的增加导致高滴度的针对所述 抗原的抗体。
38.权利要求36的方法，其中所述免疫原性的增加导致具有高结合亲和力 的抗体。
全文摘要
本发明提供一种疫苗，其包括有效量的含有SARS相关的冠状病毒突起蛋白中受体结合结构域序列或其功能片段的分离的多肽或重组蛋白，或者提供一种核酸分子，其包括编码严重急性呼吸道综合征相关的冠状病毒突起蛋白中受体结合结构域序列或其功能片段的序列。本发明提供一种用于增加抗原的免疫原性的组合物，其包括有效量的抗原和IgG Fc结构域，其功能片段，或者含有IgG Fc结构域或其功能片段的物质。所述抗原和IgG Fc可以是连接的或不连接的。最后，本发明还提供将任何上述组合物用于免疫的方法。
文档编号C07K1/00GK101098710SQ200580026179
公开日2008年1月2日 申请日期2005年6月1日 优先权日2004年6月2日
发明者何玉先, 刘叔文, 姜世勃 申请人:纽约血液中心