保护植物免受致病真菌侵害的方法

专利名称：：保护植物免受致病真菌侵害的方法
技术领域：
：本发明涉及通过使用具有抗真菌活性的多肽和编码这些多肽的核酸序列保护植物免受真菌病原体侵害的方法.本发明的方法利用这些多肽和核酸序列控制植物真菌病原体并增强植物对真菌病原体的抗性.本发明还包括转基因植物和种子.背景抹术植物中的疾病由生物的和非生物的原因引起.细胞内过程的宿主使得植物能够防御由致病剂引起的疾病.这些过程明显地形成了完整的一套抗性机制，该机制由初始感染激活并随后限制入侵的致病生物体的进一步扩散，在识别了植物病原体之后，植物可以激活一系列生化应答.一般地，植物通过在感染位点周围迅速地诱导细胞内的一些局部反应产生应答。在非宿主和种(race)特异性相互作用中观察到的最常见的抗性应答被称作"过敏应答"(HR).在过敏应答中，病原体接触的细胞以及通常邻近的细胞迅速地崩塌(collapse)和干燥形成坏死斑点(necroticfleck)。其它应答包括胼胝质的沉积，由木质化引起细胞壁的物理增厚，以及各种抗生素小分子和蛋白质的合成.在宿主和病原体中的遣传因子决定了这些局部应答的专一性，这在限制感染扩散中非常有效.传统上，植物疾病的发生已通过农艺手段得到控制，这些手段包括轮作、农用化学品的使用和常规的培育技术。但是将化学品用于控制植物病原体增加了农民的成本并对生态系统造成有害的影响.消费者和政府管理者等正越来越关注与用于保护植物免受病原体侵害的合成农用化学品的生产和使用相关的环境危害.由于这些关注，管理者们已经禁止或限制了一些最危险的化学品的使用.通过培育抗性农作物，真菌疾病的发生已经得到了一定程度的控制.但是，传统的培育方法是耗时的，并且随着病原体进化，需要持续的努力以维持疾病抗性.见例如GroverandGowthaman(2003)Cm/t.Sci'.84:330-340,因此，对于控制植物病原体的新型替代法存在着明显的需求，这些替代法具有更低的污染和环境危害的风险(而这些风险正是典型的基于农用化学品的传统方法的特征)，并且比传统的培育技术更简便.最近，农业科学家已通过遗传改造植物以表达抗致病原体蛋白，开发出了具有提高的病原体抗性的农作物植物.例如经遣传改造从而产生抗真菌内切几丁质醉蛋白的马铃茅和烟草植物显示出对叶真菌病原体和土壤传播的真菌病原体呈现出增强的抗性.见LoritoWa/.(1998)尸wc.7Va".4cflrf.5，c/.95:7860-7865,此外，也已经开发了对秆锈菌具有抗性的转基因大麦.见Horvath""/.(2003)iVoc.7Vfl汰爿carf.5W.100:364-369.识别抗致病剂和遣传改造疾病抗性植物的持续的努力还在继续.，已经尝试了各种病原体控制方法，包括生物体的使用，这些生物体典型地是希望被控制的物种的"天然捕食者".这些捕食者可包括其它昆虫、真菌和细菌(例如苏云金芽杆苗(5ad//"sr/r/7>ig&its&)).可替换地，有害昆虫的大型群落已被封闭飼养、绝育并被释放到环境中，希望绝育昆虫和多产的野生昆虫之间进行的交配能减少昆虫的数量.尽管这些方法已经取得了一些成功，它们需要相当高的费用并具有一些主要的困难，例如，将生物体应用到大面积上以及使这些活生物体在延长的时间内维持在被处理区域或被处理植物物种上都是困难的.捕食昆虫可以迁移，真菌或细菌可以被雨水从植物上冲下或从被处理区域冲走.因此，尽管这些生物学控制的应用具有人们需要的特性且已经获得了一些成功，但实践中这些方法还不能实现控制病原体对农作物的侵害的目标.生物技术的进步已经为通过遣传工程控制病原体带来了新的机遇.特别地，植物遗传学的进步伴随对天然生成的植物防御化合物或试剂的鉴定，提供了制造转基因农作物植物的机会，所述植物能够生成这些防御试刑并因此保护植物免遭疾病.很多植物疾病，包括但不限于玉米秆腐病和穗腐病，可由多种病原体引起。例如，秆腐病是最具破坏性和广泛传播的玉米疾病之一.该疾病由在接近植物成熟时攻击和降解秆的真菌和细菌的联合体引起.由于弱化的秆的形成以及未成熟植物的死亡，可发生显著的产量减少.玉米秆腐病典型地由多于一种的真菌引起，但由玉蜀黍赤霉wne)引起的赤審菌秆腐病(Gibberellastalkrot)、由轮状镰刀菌(F"sa〃'"mve/"rt'ci'肌wV/es)、串珠镰刀菌(F./rdy^m似m)或FjM6g/M""a附引起的镰刀菌秆腐病(Fusarhimstalkrot)、以及由禾生炭疽菌(G>//e^//7'cAmg/vi/m7ii'co/fl)引起的炭疽秆腐病(Anthracnosestalkrot)是最常被报道的(SmithandWhite(1988);Diseasesofcorn,pp.701-766inCornandCornImprovement,AgronomySeries#18(3rded.)，Sprague，C.F.andDudley,J.W.，eds.Madison,WI).鉴于植物疾病可由病原体的联合体引起的亊实，需要广谗抗性以有效调节疾病控制.因此，对靶向多种秆腐病和穗腐病致病病原体的抗真菌组合物存在显因此，鉴于植物真菌病原体对农作物产量和质量的巨大影响，人们需要用于保护植物免受这些病原体侵害的新方法.
发明内容本发明的具体实施方式提供了对真菌病原体具有提高的抗性的转基因植物，每种植物都包含编码下述多肽的多核苷酸，所述多肽包含与SEQIDNOs:l、2、4、5、7或8至少95%相同的氨基酸序列，其中所述植物对至少一种植物致病真菌具有提高的抗性.该植物可以是单子叶植物或双子叶植物.本发明还提供了这些转基因植物的种子.类似地，具体实施方式提供了对真菌病原体具有提高的抗性的单子叶或双子叶转基因植物和种子，其中该植物包含与SEQIDNOs:3、6或9至少95%相同的多核苷酸序列，其中所述植物对至少一种植物致病真菌具有提高的抗性.在转基因植物中表达的多肽可以包含或不包含信号序列，本发明的具体实施方式还提供了提高植物对真菌病原体抗性的方法，该方法包括将下述表达盒引入植物细胞，所述表达盒包含与启动子可操作性连接的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQIDNOs:3、6或9具有至少95%的一致性，或其中所述核苷酸编码下述多肽，所述多肽包含与SEQIDNOs:l、2、4、5、7或8相同或高度相同的氨基酸序列，且其中所述多肽对至少一种植物致病真菌具有活性.植物细胞被用于再生转化的植物，其中在经转化的植物中，真菌病原体抗性水平与不包含所述表达盒的植物相比被提高.这些具体实施方式的多肽可包含或不包含信号肽.具体实施方式的表达盒中使用的启动子选自组成型、組织特异性、根特异性、可诱导和病原体诱导启动子.在某些具体实施方式中，对植物真菌病原体具有活性的多肽包含信号序列.在某些具体实施方式中，多肽缺乏信号序列.在某些具体实施方式中，信号序列是分泌信号序列，而在其它具体实施方式中，信号序列是细胞器和/或质体信号序列.具体实施方式本发明的具体实施方式提供了用于提高植物真菌病原体抗性的组合物和方法，具体实施方式提供了编码抗真菌多肽的氨基酸序列的多核苷酸.特别地，本发明提供了具有SEQIDNOs:1、2、4、5、7和8所示的氨基酸序列的抗真菌多肽以及它们的变体和片段.本发明还提供了经分离的核酸分子以及它们的变体和片段，这些分子包含编码SEQIDNOs:l、2、4、5、7和8中所示氨基酸序列的核苷酸序列，本发明提供了编码SEQIDNOs:l、2、4、5、7和8的多肽的核苷酸序列.这些核苷酸序列示于SEQIDNOs:3、6和9中.已针对在大肠杆菌(E.coli)中的表达对这些核苷酸序列中的一些进行了优化.本文也公开了包含下述核苷酸序列的植物、植物细胞、种子和微生物，所述核苷酸序列编码具体实施方式的抗真菌多肽.本发明还提供了包含经分离的抗真菌多肽的抗真菌组合物或表达具体实施方式中的多舦的微生物.具体实施方式的组合物在生成真菌抗性植物和保护植物免受植物致病真菌侵害中发挥作用.本文公开的多肽对广泛的植物致病真菌呈现出抗真菌活性，所述真菌例如爿to7i肌Vi6ra柳Wco/a、Fiwar/M/wve/t/ci7/iWto、g/Yi/mVti'co/a、F"sa/7'wm狄yspofM附和Fe/*""7//"mdttWeie.这些抗真菌多肽的来源的物种为植物物种.特别地，多肽SEQIDNOs:l和2的来源是中国辣椒(Cfl/wi'CM附cWwe附e).SEQIDNOs:4、5、7和8的多肽的来源是西红神(L^co!persicwi(yco/em'C0W)."抗真菌组合物"或"抗真菌多肽"意在表示具体实施方式的组合物或多肽具有抗真菌活性，且因此能够遏制、控制和/或杀死入侵真菌.具体实施方式的抗真菌多肽能将由真菌感染引起的疾病症状减少至少大约5%至大约50%、至少大约10%至大约60%、至少大约30%至大约70%、至少大约40%至大约80%、至少大约50%至大约90%或更大程度.因此，具体实施方式的方法可被用于保护植物免受致病真菌的侵害.具体实施方式的多核苷酸和多肽可用于在植物中诱导真菌病原体抗性的方法.因此，本文公开的组合物和方法可用于保护植物免受致病真菌的侵害."真菌病原体抗性"意在表示植物避免由于植物-真菌相互作用产生的疾病症状.具有"提高的真菌病原体抗性"或"增强的真菌病原体抗性"的植物意在表示已经过具体实施方式的核酸分子转化且表达具体实施方式的多肽的植物，较之不包含所述核酸分子的植物例如野生型植物，其呈现出对真菌病原体增强水平的抗性或耐受性.也就是说，在经转化的植物中，真菌被阻止引起植物疾病和相关疾病症状，或可替换地，由真菌引起的疾病症状被最小化或被减弱，例如胁迫和相关的产量损失的减轻.抗性可以在下述范围内变化从对真菌病原体作用的耐受力的微弱增强到完全抗性，由此植物不受到真菌病原体存在的影响.对特定真菌或对更广谱的真菌的提高的抗性水平可以构成抗真菌活性和提高的真菌抗性.具体实施方式的植物与未经转化的植物相比呈现了至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少卯％、至少95%、或直至100%的提高.这样的提高可以通过本领域已知的任何合适的方法加以测量，例如但不限于对植物上的真菌伤口计数、测量真菌生物量、比较植物产量和在以下段落中描述的其它方法.测量抗真菌活性的实验是本领域普遍已知的，在真菌病原体感染后对植物的疾病抗性定量的方法同样如此.见例如，美国专利号5,614,395，通过引用将其并入本文.这些技术包括在一段时间中测量平均伤口直径、病原体生物量以及腐烂植物组织的总百分比.例如，和没有暴露于抗真菌组合物的对照植物相比，表达抗真菌多肽或其表面被施加抗真菌组合物的植物在真菌病原体感染后显示出组织坏死(即伤口直径)的减少或植物死亡的减少.可替换地，可以通过真菌生物量的降低来测量抗真菌活性.例如，用感兴趣的真菌病原体感染表达抗真菌多肽或暴露于抗真菌组合物的植物.在一段时间中，获取来自真菌病原体接种组织的组织样品并提取RNA.特异的真菌病原体RNA转录本相比于植物特异转录本水平的百分比可以确定真菌生物量的水平.见，例如ThommaCa/.(1998)尸/"W95:15107-15111,其通过引用并入本文.此外，体外抗真菌实验包括例如将不同浓度的抗真菌组合物添加至纸盘上并将所述的盘放在含有感兴趣的真菌病原体悬浮液的琼脂上.在培养后，在含有有效浓度的抗真菌多肽的盘周围生成明显的抑制区(LiuWfl/.(1994)尸/朋r所o/o砂91:1888-1892，其通过引用并入本文).此外，可以使用显微分光光度分析测量组合物的体外抗真菌性质(HuWtf/.(1997)户/fl拟M"34:949-959和CamueCa/.(1992)义所"0^肌267:2228-2233，两文献均被在此参考引用).专门测量抗真菌活性的实验也是本领域公知的.见例如DuvickWa/.(1992)/.丑!V/.C/te267:18814-18820;LacadenaWa/.(1995)rcA.oc/reA^.324:273-281;XuWfl/.(1997)尸/a"fMo/.所o/.34:949-959;Lee"a/.(1999)i》cAewt价V/^".Owim.263:646-651;Vila"a/.(2001)/flWM/cr由/"te,W,14:1327-1331;Moreno"a/.(2003)一/;a^/.93:1344-1353;Kaiserer"a/.(2003)JrcA.180:204-210;和美国专利号6,015,941.具体实施方式公开了用编码抗真菌蛋白的核酸分子转化的植物.组合物可用于在植物中诱导真菌病原体的抗性和保护植物免受真菌侵害的方法.本领域技术人员将认同本文公开的组合物和方法可与本领域可获得的用于保护植物免受真菌病原体攻击的其它组合物和方法组合使用，在特定方面，用于在植物中诱导真菌抗性的方法包括将至少一种表达盒引入植物中，其中所述表达盒包含编码具体实施方式的抗真菌多肽的核苷酸序列，该序列与能在植物中驱动表达的启动子可操作性连接。植物表达该多肽，由此在攻击位点将真菌暴露于多肽.具体实施方式的多肽的表达可被把向特定的植物组织，其中在这些组织真菌抗性特别重要，例如根、叶或茎，这样的组织偏好表达可通过根偏好、叶偏好、雄管组织偏好、茎偏好或种子偏好的启动子来实现，此外，具体实施方式的多肽还可被靶向至植物细胞中的特定亚细胞位点，或可替换地，从细胞中分泌，如下文所述.正如具体实施方式的多肽的表达可通过使用合适的启动子被靶向至特定的植物组织或细胞类型一样，通过靶向信息或"靶向标记"的使用，多肽的表达也可被定位至细胞内的不同位点.与在转录水平发挥作用的启动子不同，这样的靶向信息是初始翻译产物的一部分.取决于真苗病原体感染的模式或组织或细胞类型的代谢功能，蛋白在细胞的不同区室的定位可使其对给定的病原体更有效或使其更少地干扰细胞功能.例如，通过在构建体(即表达盒)中包括进编码信号肽的序列(这样的序列也可被称作"信号序列")，人们可以制备由信号肽引导的蛋白，信号肽将翻译产物导向内质网.使用的信号序列可以是例如与编码多肽的基因相连的序列，或该序列可来自另一基因.在文献中描述了很多信号肽，且它们在很大程度上可以相互交换(RaikhelandChrispeels，"Proteinsortingandvesicletraffic"inBuchananWa/.，eds，(2000)丑/oc/ieym's^vawdAfoZeci^arB/o/ogy/Vfl/i纽(AmericanSocietyofPlantPhysiologists,Rockville，MD)，其通过引用并入本文).信号肽的添加将导致转录产物进入内质网(在该过程中信号肽本身被从多肽上去除)，但蛋白最终的胞内定位取决于其它因子，可以对这些因子加以操纵，从而产生对真菌病原体和细胞类型最合适的定位.默认通路，即如果没有包括其它靶向标记的情况下多肽所采用的通路，导致多肽穿过细胞膜向质外体(apoplast)中分泌(RaikhelandChrispeels，同上).质外体是胞质膜系统外的区域，其包括细胞壁、胞间间咪和木质部导管，木质部导管形成连续的透过性系统，水和溶质可在其中移动.这通常将成为合适的位点.通过将肽定位在细胞内而非细胞膜外可更有效地对抗其它真菌病原体.通过例如将内质网留置(retention)信号编码序列添加到基因序列上可以实现这一点，用于完成该操作的方法和序列在上文RaikhelandChrispeels中有所描述；例如，将按顺序编码氨基酸K、D、E和L的序列或在文献中描述的其变体添加到多肽的蛋白质编码部分的末端将实现这一点.ER留置序列是本领域公知的.见例如DeneckeWa/.(1992).五MffO乂11:2345-2355;Wandelte"/.(1992)iVaW2:181-192;Denecke"a/.(1993)/.Jjcp.BW.44:213-221;Vitale等(1993)/五jcp.Bo"44:1417-1444;GomordWfl/.(1996)尸/fl"/尸/y^》/.34:165-181;Lehmanne,a/.(2001)iVaW127(2):436-449,当在本文中使用时，"核酸"包括指单链或双链形式的脱氧核糖然核苷酸重要性质的类似物(例如肽核酸)，因为它们能以与天然发生的核苷酸相似的方式与单链核酸杂交.术语"多肽"、"肽"和"蛋白质"在本文中可互换使用，用于指氨基酸残基的聚合物.这些术语用于下述氨基酸聚合物，这些聚合物中一或多个氨基酸残基是相应的天然发生的氨基酸的人造化学类似物，这些术语也用于天然发生的4^基酸聚合物.具体实施方式的多肽可从本文公开的核酸分子制备，或通过使用标准的分子生物学技术制备.例如，具体实施方式的截短蛋白质可通过在合适的宿主细胞中表达具体实施方式的重组核酸分子来制备，或可替换地，通过离体(exvivo)步骤(例如蛋白酶消化和纯化)的組合来制备.当在本文中使用时，当用于特定的核酸分子的上下文中时，术语"编码"或"被编码"指核酸分子包含引导核苷酸序列翻译成特定蛋白质的必要信息.编码蛋白质的信息通过密码子的使用加以确定.编码蛋白质的核酸分子可在核酸序列的翻译区内包含非翻译序列(例如内含子)或可缺乏这样的插入(intervening)非翻译序列(例如在cDNA中)，术语"氨基酸"指天然发生的和合成的氨基酸，以及以与天然发生氨基酸相似的方式行使功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物.天然发生的氨基酸是那些由遗传密码编码的氨基酸以及那些随后被修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和O-轔酸丝氨酸.氨基酸在本文中可由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的通常所知的单字母符号或三字母符号表示.同样地，核苷酸可通过通常被接受的它们的单字母代码表示.具体实施方式包括使用经分离的或高度纯化的多核苷酸或蛋白质组合物的方法。"经分离的"或"纯化的"多核苷酸或蛋白质或它们的生物学活性部分与下述组分实质性或基本分离，这些组分是被发现在天然发生的环境中通常与多核苦酸或蛋白质相随或相互作用的.因此，由重组技术制备时，经分离的或纯化的多核苷酸或蛋白质高度去除了其它细胞物质或培养基，当化学合成时高度去除了化学前体或其，且除非另外限定，其包括已知的具有天它化学药品，最优地，"经分离的"多核苷酸不含有在从中获取该多核苷酸的生物体的基因组DNA中天然側翼于所述多核苷酸的序列(即位于多核苷酸5，和3，端的序列)(最优地，蛋白编码序列).例如，在多种具体实施方式中，经分离的多核苷酸可包含在从中获取该多核苷酸的细胞的基因组DNA中天然側翼于该多核苷酸的少于大约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb、O.lkb的核苷酸序列.高度去除了细胞物质的蛋白质包括含有少于大约30%、20%、10%、5%或1%(干重)的污染蛋白的蛋白质制刑.当具体实施方式的蛋白质或其生物活性部分是重组制备的时候，最优地，培养基具有少于大约30%、20%、10%、5%或1%(干重)的化学前体或非感兴趣的蛋白质的化学药品.公开的核苷酸序列和由其编码的蛋白质的片段和变体也被具体实施方式包含。"片段"意在表示核苷酸序列的一部分或由核苷酸编码的氨基酸序列和蛋白质的一部分.核苷酸片段可编码保持了天然蛋白质生物学活性且因此具有抗真菌活性的蛋白质片段.可替换地，可用作杂交探针的核苷酸序列片段通常不编码保持生物学活性的片段蛋白质.因此，核苷酸序列的片段可从至少大约20个核苷酸、大约50个核苷酸、大约100个核苷酸变化直至编码具体实施方式的多肽的全长核苷酸序列.编码具体实施方式的抗真菌多肽的生物学活性部分的核苷酸序列片段将编码存在于具体实施方式的全长抗真菌多肽中的至少15、25、30、40、50、60、70、80、90或100个连续氨基酸或直至全部数量的氨基酸(例如，SEQIDNO:1中的107个氨基酸).用作杂交探针或PCR引物的核苷酸序列的片段通常不需要编码抗真菌蛋白质的生物学活性部分.当在本文提到特定多核苷酸时，"全长序列"用于表示具有天然序列的整个核酸序列."天然序列"意在表示内源性序列，即在生物体基因组中发现的非工程改造序列，因此，具体实施方式的核苷酸序列的片段可编码抗真菌多肽的生物学活性部分，或其可以是下述片段，所述片段使用下文公开的方法可被用作杂交探针或PCR引物.可以通过分离具体实施方式的核苷酸序列之一的一部分、表达抗真菌蛋白质的编码部分(例如通过体外重组表达)、并评估抗真菌蛋白编码部分的活性，来制备抗真菌多肽的生物学活性部分.是具体实施方式的核苷酸序列片段的核酸分子包含至少15、20、50、75、IOO或150个连续核普酸，或直至存在于本文公开的全长核苷酸序列中的核苷酸的数目."变体"意在表示高度相似的序列.对于多核苷酸，变体包含在天然多核苷酸内的一或多个内部位点的一或多个核苷酸的删除和/或添加和/或在天然多核苷酸的一或多个位点的一或多个核苷酸的取代.当在本文中使用时，"天然的"多核苷酸或多肽分别包含天然发生的核普酸序列或氨基酸序列.本领域技术人员将认识到具体实施方式的核酸序列的变体将以使得开放阅读框得以保持的方式被构建.对于多核苷酸，保守变体包括由于遣传密码的简并性，编码具体实施方式的抗真菌多肽之一的氦基酸序列的那些序列.可使用公知的分子生物学技术(例如下文概述的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术)来鉴定诸如这些的天然发生的等位变体.变体多核普酸还包括通过合成获得的多核苷酸，例如通过定点诱变生成的但仍然编码具体实施方式的抗真菌蛋白质的多核苷酸.一般而言，具体实施方式的特定多核苷酸的变体与该特定多核苷酸将具有至少大约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列一致性，所述一致性是如本文其它地方说明的序列比对程序和参数所确定的.也可以通过比较由变体多核苷酸编码的多肽和由参照多核苷酸编码的多肽之间的百分比序列一致性，对具体实施方式的特定多核苷酸(即参照多核苷酸)的变体进行评价.因此，例如，公开了编码与SEQIDNOs:1、3、5、7和9的多肽具有给定的百分比序列一致性的多肽的经分离多核苷酸.任何两条多肽之间的百分比序列一致性可以通过使用在本文其它地方说明的序列比对程序和参数计算得出.在通过比较多核苷酸编码的两条多肽之间的百分比序列一致性来对具体实施方式的任何给定的多核苷酸对进行评价时，两条被编码的多肽之间的百分比序列一致性是至少大约40%、45°/。、50°/。、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列一致性."变体"蛋白意在表示通过在天然蛋白的一或多个内部位点的一或多个氨基酸的删除或添加和/或在天然蛋白的一或多个位点的一或多个氨基酸的取代、从天然蛋白获得的蛋白质.具体实施方式包含的变体蛋白是有生物学活性的，也就是说它们仍然具有人们想要的天然蛋白的生物学活性，即在此所述的抗真菌活性，这些变体可因为例如遗传多态性或或因为人为搮纵产生.如通过在本文其它地方说明的序列比对程序和参数所确定的，具体实施方式的天然抗真菌蛋白的生物学活性变体将具有与天然蛋白的氨基酸序列至少大约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、910/"92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列一致性.具体实施方式的蛋白质的生物学活性变体与该蛋白质的区别将少至1-15个氨基酸残基、少至1-10个例如6-10个、少至5个、少至4个、少至3个、少至2个或甚至少至1个氨基酸残基.具体实施方式的蛋白质将通过多种方式被改变，包括氨基酸取代、删除、截短和插入.这些处理的方法是本领域普遍已知的.例如，可以通过在DNA中的突变制备抗真菌蛋白质的氨基酸序列变体和片段。诱变和多核苷酸改变的方法是本领域公知的.见例如Kimkel(1985)iVaf/.爿c(w/.Sc/.82:488-492;Kunkel"d/.(1987)MW/^rfs,Vt五"zymo/.154:367-382;美国专利号4,873,192;WalkerandGaastra，eds.(1983)recA/t/《Me^fVtMo/ecw/ar(MacMillanPublishingCompany,NewYork)以及其中引用的参考文献，关于不影响感兴趣的蛋白质的生物学活性的合适的氨基酸取代的指导，可见DayhoffWa/.(1978)y^/as尸rWeiVijS^《Mewcefl/irf5^rwc似"(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)的模型，该文献通过引用并入本文.保守取代，例如将一个氨基酸与另一个具有相似性质的氨基酸交换，是最优的."经保守修饰的变体"用于氨基酸和核酸序列.对于特定的核酸序列，经保守修饰的变体指编码相同或基本相同氨基酸序列的那些核酸，或当核酸不编码氨基酸序列时，指基本相同的序列，由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任意给定的蛋白质.例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸.因此，在丙氨酸由密码子确定的每一个位点，密码子可以变化成任何所述的相应的密码子而不改变编码的多肽.这样的核酸变异是"沉默变异"，它们是一类经保守修饰的变异.本文中编码多肽的每种核酸序列也描述核酸的每种可能的沉默变异.技术人员将认识到核酸中的每种密码子(除了AUG,该密码子通常是甲硫氨酸的唯一密码子)都可被修饰，而能生成功能相同的分子.因此，编码多肽的核酸的每种沉默变异都包含在各所述序列中.关于氨基酸序列，技术人员将认识到当改变导致氨基酸被化学相似的氨基酸取代时，在核酸、肽、多肽或蛋白质序列中改变被编码序列中的单个氨基酸或一小部分氨基酸的各种取代是"经保守修饰的变异".提供功能相似氨基酸的保守取代表是本领域公知的.以下六组每组都包含相互之间为保守取代的氨基酸1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R)、赖氨酸(K);5)异亮氨酸(1)、亮氨酸(L)、甲硪氨酸(M)、纈氨酸(V);以及6)苯丙氨酸(F)、輅氨酸(Y)、色氨酸(W).(见例如Creighton，/VWei'附(1984)).因此，具体实施方式的基因和多核苷酸包括天然发生序列和突变体形式.同样地，具体实施方式的蛋白质包括天然发生的蛋白质及其变体和经修饰形式.这些变体将仍然具有人们想要的抗真菌活性.明显地，将在编码变体的DNA中进行的突变应当不会将序列置于阅读框之外，且最优地将不会产生能够形成mRNA二级结构的互补区域.见例如EP专利号0075444.在自然界中，一些多肽作为复合前体被生成，除了靶向标记(例如在本申请中其它地方讨论的信号肽)之外，这些前体还包含其它的肽片段，这些片段在蛋白质成熟过程中的某些点被去除(被加工)，产生与初始翻译产物不同的多肽的成熟形式(除了信号肽的去除)."成熟蛋白"指经翻译后加工的蛋白；即任何存在于初始翻译产物中的前肽(prep印tide)或肽原(prop印tide)已被去除的蛋白."前体蛋白"或"前肽原(prepropeptide)"或"前蛋白原(prepeoprotein)"均指mRNA的翻译初始产物；即前肽和肽原仍然存在.前肽和肽原可包括但不限于胞内定位信号.在本命名法中的"前(pre)"通常指信号肽.仅信号肽被去除但还没有进一步加工的翻译产物的形式被称作"肽原"或"蛋白原(proprotein)".将被去除的片段或片断本身也可被称作"肽原".因此蛋白原或肽原已将信号肽去除，但含有肽原(在此称为肽原部分)和将形成成熟蛋白的部分.取决于将在其中表达蛋白的物种以及所需要的胞内定位，技术人员能够确定通过使用仅编码蛋白成熟形式的基因构建体、编码具有信号肽的成熟形式的基因构建体或编码具有信号肽的蛋白原(即包含肽原的形式)的基因构建体是否可以获得更高的表达水平.为了在植物或真菌中进行最优表达，前肽或肽原序列可能是需^"的.肽原片断可能在帮助正确的肽折叠中发挥作用.本文中包含的蛋白序列的删除、插入以及取代预期不对蛋白特性产生剧烈变化.但是，当在进行取代、删除或插入前难以预计这么做的准确效果时，本领域技术人员将知道:将可以通过常规筛选实验对该效果加以评估.即，可以通过测量抗真菌活性的实验对活性进行评价，例如抗真菌板实验和在本公开文本中其它地方说明的其它方法.见，例如Duvicke"/.(1992)丄5/"267:18841-18820,其通过引用并入本文.变体多核苷酸和蛋白还包含通过诱变和重组步稞(例如DNA重排(shuffling))获得的序列和蛋白质.使用这样的步稞，一或多种不同的抗真菌蛋白编码序列可被搮纵，以制造出具有理想性质的新的抗真菌蛋白.通过该方法，从一组相关的序列多核苷酸生成重组多核苷酸文库，这些多核苷酸包含具有相当的序列一致性且能够在体外或体内同源重组的序列区域.例如，使用该方法，编码感兴趣的结构域的序列基元(motif)可以在编码具体实施方式的抗真菌蛋白的基因和其它已知的编码抗真菌蛋白的基因之间重排，以获得编码下述蛋白的新基因，所述蛋白具有改良的感兴趣的性质，例如提高的抗真菌活性.这些DNA重排的策略是本领域已知的，见例如Stemmer(1994)Pwc.7Vfl".5W.f/A491:10747-10751;Stemmer(1994)iVfl似re370:389-391;CrameriWa/.(1997);Vfl似re15:436-438;MooreWa/,(1997)乂Mo/.所o/.272:336-347;Zhang"a/.(7997)7Va汰^cwf.fASL494:4504-4509;CrameriWa/.(1998)iVa似re391:288-291;以及美国专利号5,605,793和5，837，458.具体实施方式的多核苷酸可被用于从其它生物体特别是其它植物中分离相应的序列.在该方式中，例如PCR、杂交等方法可被用于鉴定这样的序列，所述鉴定基于它们与本文示出的序列的序列同源性.基于它们与本文示出的完整序列或其变体和片段的序列同源性分离的序列包含在具体实施方式中.这些序列包括是公开序列的直系同源基因(ortholog)的序列."直系同源基因"意在表示下迷基因，它们来自共同的祖先基因，且由于物种形成(speciation)在不同的物种中被发现.当它们的核苷酸序列和/或它们所编码的蛋白质序列具有至少60%、70%、75%、80%、85%、卯％、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列一致性时，在不同物种中发现的基因被认为是直系同源基因.直系同源基因的功能在物种间常常是高度保守的.因此，编码抗真菌蛋白且在严格条件下与本文公开的序列或其变体或片段杂交的经分离的多核苷酸包含在具体实施方式中.在PCR方法中，可以设计寡核苷酸引物用于PCR反应，以从由任何感兴趣的生物体中提取的cDNA或基因组DNA扩增相应DNA序列。设计PCR引物和PCR克隆的方法是本领域普遍已知的且在Sambrooke,a/.(1989)Mo/mi/a/*C7owi'"g..41fl6or她/^Mawua/(2ded.，ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview，NewYork)中公开，也见Innis""/.，eds.(1990)PC及iVotocofo:^似M"A油朋rf々p/f'cWo附(AcademicPress，NewYork);InnisandGelfand，eds.(1995)PC及Ara^fes(AcademicPress,NewYork);以及InnisandGelfand，eds.(1999)PC及^f"Ao必il/a"a/(AcademicPress,NewYork),已知的PCR方法包括但不限于使用成对引物、嵌套引物、单一特异性引物、简并引物、基因特异性引物、栽体特异性引物、部分错配引物等的方法.在杂交技术中，已知的多核苷酸的全部或部分被用作探针，该探针能与存在于来自选定生物体的经克隆的基因组DNA片段或cDNA片段群(即基因组或cDNA文库)中的、其它下述相应的多核普酸选择性杂交.杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，且可用可检测基团例如32P或任何其它可检测标记对其进行标记.因此，例如，可通过对基于具体实施方式的多核苷酸的合成寡核苷酸进行标记，来制备杂交探针.制备杂交探针和构建cDNA和基因组文库的方法是本领域普遍已知的且在SambrookWfl/.(1989)Mo/ec/arC7ow/wg.'^Lfl6orflto/yMflwwa/(2ded.，ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview，NewYork)中公开，例如，本文公开的完整多核苷酸或其一或多个部分可被用作为能够与相应的多核苷酸和信使RNAs特异性杂交的探针.为了在各种条件下实现特异性杂交，此类探针包含在抗真菌多核苷酸序列中特有的、且最优至少有大约IO个核苷酸的长度的序列，最最优地具有至少大约20个核苷酸的长度.这样的探针可被用于通过PCR从选定的生物体扩增相应的多核苷酸.该技术可被用于从理想的生物体中分离其它的编码序列或被用作诊断实验以确定编码序列在生物体中的存在，杂交4支术包括铺盘DNA文库(platedDNAlibrary)的杂交筛选(噬菌斑(plaque)或菌落；见例如Sambrook"a/.，见上)，这些序列的杂交可在严格条件下进行."严格条件"或"严格杂交条件"意在表示下述条件在该条件下探针将和其靶向序列以相比于其它序列可观测的更高的水平杂交(例如，至少是背景的2倍).严格条件是序列依赖性的且在不同环境下将不同.通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定出与探针100%互补的靶序列(同源探测)，可替换地，可以调节严格条件从而允许序列的一些错配由此检测到更低的相似度(异源探测).通常，探针小于大约1000个核苷酸长度，优选地小于500个核苷酸长度.典型地，严格条件将是这样的条件，其中盐浓度小于大约1.5MNa离子，典型地大约0.01至l.OMNa离子浓度(或其它盐)，pH7.0至8.3，且温度对于短探针(例如10至50个多核普酸)为至少大约30TC,对长探针(例如大于50个核苷酸)为至少大约601C.严格条件也可以通过添加去稳定剂(例如甲酰胺)来实现.示例性的低度严格条件包括在30至35%甲耽胺、1MNaCl、1%SDS(十二烷基橫酸钠)的缓冲液中于37t:杂交，并在1x至2xSSC(20xSSC=3.0MNaCl/0.3M柠檬酸钠)中于50至55TC洗涤.示例性的中度严格条件包括在40至45%甲酰胺、l.OMNaCl、1%SDS中于37"C杂交，并在0.5x至lxSSC中在55至60t;中洗涤.示例性的高度严格条件包括在50%甲酰胺、1MNaCl、1%SDS中于37n杂交，并在0,1xSSC中于60至651C洗涤至少30分钟。可选地，洗涤緩冲液可包含大约0.1%至大约1%SDS.杂交持续时间通常少于大约24小时，通常为大约4至大约12小时.洗涤持续时间将至少为足够达到平衡的时间长度.典型地，特异性是杂交后洗涤的函数，关鍵因子是最终洗涤溶液的离子强度和温度.对于DNA-DNA杂交体而言，热融解点(Tm)可从MeinkothandWahl(1984)/i"a/.所ocAe附.138:267-284的方程Tm-81,51C+16.6(logM)+0.41(%GC)-0.61(%form)-500/L来估算;其中M是单价阳离子的摩尔浓度，。/。GC是DNA中乌苷和胞嘧啶的百分比，％form是杂交溶液中甲酰胺的百分比，L是杂交体的碱基对的长度.Tm是50%的互补把序列与完全配对的探针杂交的温度(在确定的离子强度和pH下)，每1%的错配，Tm降低大约lt:;因此，Tm、杂交和/或洗涤条件可被调节以与具有人们需要的一致性的序列杂交.例如，如果寻找具有>90%—致性的序列，Tm可被降低10"C.—般地，在确定的离子强度和pH下对于特定序列及其互补物而言，严格条件被选定为比Tm低51C'但是，非常严格的条件可在比Tm低l、2、3、41C时使用杂交和/或洗涤；中度严格条件可在比Tm低6、7、8、9或101C时使用杂交和/或洗涤；低度严格条件可在比Tm低11、12、13、14、15或20C时使用杂交和/或洗涤.使用方程、杂交和洗涤组合物、以及人们需要的Tm，普通技术人员将理解杂交和/或洗涤溶液的严格性的改变是被内在描述的.如果希望的错配程度导致了小于45TC(水溶液)或321C(甲耽胺溶液)的1\，最优地，提高SSC浓度使得更高的温度可被使用，关于核酸序列杂交的大量指导可在Tijssen(1993)掛&rWi'za"VmiV"c/Wc/1drfPartI，Chapter2(Elsevier,NewYork);和Ausubel"d/，，eds,(1995)C"rre"f/Vo似co/sMo/mi/ar所o/ogy，Chapter2(GreenePublishingandWiley-Interscience，NewYork)找到。见Sambrook^a/.,见上，以下的术语被用于说明两条或多条核苷酸或多肽之间的序列关系(a)"参照序列"，(b)"比较窗"，(c)"序列一致性"和(d)"序列一致性百分比"。(a)当在本文中使用时，"参照序列"是作为序列比较的基础被使用的确定序列.参照序列可以是特定序列的一部分(subset)或全部；例如，作为全长cDNA或基因序列的片断，或完整的cDNA或基因片断，(b)当在本文中使用时，"比较窗"指多核苷酸序列的连续的特定片断，其中，为进行对两条多核苷酸的最优比对，在比较窗中的多核苷酸序列与参照序列(该序列不包含添加或删除)相比可包含添加或删除(即缺口(gap)).通常，比较窗是长度为最少20个的连续核苷酸，可选地可以是30、40、50、100个或更长.本领域的技术人员明白为了避免由于在多核苷酸中包括缺口造成的与参照序列的高度相似性，典型地，引入缺口惩罚，其从配对数目中减除.用于比较的序列比对法是本领域公知的.因此，任何两条序列之间的百分比序列一致性的确定可以使用数学算法完成.这些数学算法的非限定性例子是MyersandMiller(1988)C45/OS4:11-17的算法；Smith"a/.(1981)爿rfv.J/;/;/.Ma狄.2:482的局部比对算法；NeedlemanandWunsch(1970)/Mo/.所o/.48:443-453的全局(global)比对运算；PearsonandLipman(1988)尸roc.Mi汰5W.85:2444-2448的搜索局部比对(search-for-localalignment)法；KarlinandAltschul(1990)iVoc.iVa比Jcarf.5W.tAJ/l872264的算法，如KarlinandAltschul(1993)尸,oc，JVa".Sd.CAS^90:5873-5877中改进的算法.这些数学算法的计算机实现可被用于序列的比较以确定序列一致性.这样的实现包括但不限于PC/Gene程序中的CLUSTAL(获自Intelligenetics，MountainView,California);ALIGN程序(2.0版)和GCGWisconsinGenetics软件包，版本10中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA(获自AccelrysInc.,9685ScrantonRoad，SanDiego,California,USA).使用这些程序的比对可使用默认参数进行.CLUSTAL程序由HigginsWa/.(1988)G^/ie73:237-244(1988);ffigginsa,.(1989)5:151-153;Corpet等(1988)iVMc/c4c!Vfa及d16:10881-90;Huang"flA(1992)C4丑/OS8:155-65;和PearsonWa/.(1994)MeA.Mo/.24:307-331详细描述.ALIGN程序基于MyersandMiller(1988)同上的算法.当比较氨基酸序列时，PAM120权重残基表(weightresiduetable)、缺口长度惩罚12以及缺口惩罚4被用于ALIGN程序.Altschul"a/.(1990)丄Mo/.Bio/.215:403的BLAST程序基于KarlinandAltschul(1990)同上的算法，BLAST核苷酸检索可使用BLASTN程序，分值(score)-100，字长(wordlength)=12进行以获得与编码具体实施方式的蛋白质同源的核苷酸序列.BLAST蛋白质检索可使用BLASTX程序，分值-50，字长=3进行以获得与具体实施方式的蛋白质或多肽同源的氨基酸序列.为了实现带缺口比对，用于比较目的，如AltschulW(1997)WMc/e/cJa'rfs25:3389中所述，GappedBLAST(在BLAST2.0中)可被使用.可替换地，PSI-BLAST(在BLAST2.0中)可被用于进行迭代检索，该检索检测到分子间的远关联.见Altschule"/.(1997)同上.当使用BLAST、GappedBLAST、PSI-BLAST时，相应程序的默认参数(例如用于核苷酸序列的BLASTN，用于蛋白的BLASTX)可被使用.见www.ncbi.nlm.nih.gov.比对也可以通过人工观察进行.除非另外声明，在此提供的序列一致性/相似性数值指使用GAP版本10使用以下参数获得的数值使用缺口权重(GapWeight)50和长度权重(LengthWeight)3以及nwsgapdna.cmp计分矩阵获得的核苷酸序列的％—致性和％相似性；使用缺口权重8和长度权重2以及BLOSUM62计分矩阵获得的氨基酸序列的°/。一致性和％相似性的数值；或使用它们的任何等同程序获得的数值."等同程序"意在表示下述任何序列比较程序，对于任何两条待研究的序列，在与由GAP版本10产生的相应的比对比较时，该程序产生具有相同的核苷酸或氨基酸残基配对以及相同的百分比序列一致性的比对.GAP使用NeedlemanandWunsch(1970)/Mo/.所o/.48:443-453的算法以找出对两条完整序列的下述比对，所述比对将配对数量最大化且将缺口数量最小化.GAP考虑所有可能的比对和缺口位置，且创造出具有最大数量配对碱基和最少缺口的比对.它可以提供以配对碱基为单位的缺口制造惩罚(gapcreationpenalty)和缺口延伸惩罚(gapextensionpenalty).针对其插入的每个缺口GAP必须获得缺口制造惩罚数量的配对利益.如果选择大于零的缺口延伸惩罚，GAP还必须针对每个插入的缺口获得缺口长度乘以缺口延伸惩罚的利益.在GCGWisconsinGenetics软件包的版本10中对于蛋白质序列的默认的缺口制造惩罚值和缺口延伸惩罚值分別为8和2.对于核苷酸序列，默认的缺口制造惩罚是50而默认的缺口延伸惩罚是3.缺口制造和缺口延伸惩罚可被表示为选自由O至200组成的整数组中的整数，因此，例如，缺口制造和缺口延伸惩罚可以是O、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更高，GAP是最佳比对家族中的一员.该家族还有^^多成员，但没有其它成员具有更好的性质.对于比对，GAP呈现了四个优良数据质量、比率、一致性和相似性.质量是为了比对序列的最大化的基准.比率是质量除以更短片断中的械基数目.百分比一致性是真正匹配的符号的百分比.百分比相似性是相似的符号的百分比.越过缺口的符号为忽略.当一对符号的计分矩阵值大于或等于相似性阈值0.50时，相似性被计分.在GCGWisconsinGenetics软件包版本10中使用的计分矩阵是BLOSUM62(见HenikoffandHenikoff(1989)尸roc.TVa".月carf.5W.t/5L489:10915)(c)当在本文中使用时，关于两条多核苷酸或多肽序列的"序列一致性"或"一致性"指当在特定比较窗中以最大对应性进行比对时，两序列中完全相同的残基.当关于蛋白质的序列一致性百分比被使用时，将认识到不相同的残基位点常常是由于保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基由其它具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的氨基酸残基取代，因此不会改变分子的功能性质.当序列由于保守取代不同时，百分比序列一致性可被上调，以针对取代的保守性质进行校正.由于此类保守取代而不同的序列被称作具有"序列相似性"或"相似性".进行这样的调节的方法是本领域技术人员公知的.典型地，调节方法包括将保守取代计分为部分而非完全错配，由此增加了百分比序列一致性.因此，例如，当相同的氨基酸被给予1分且非保守取代被给予0分时，保守取代被给予0至1之间的分数.计算保守取代的得分，例如在程序PC/GENE(Intelligenetics，MountainView,California)中实现.(d)当在本文中使用时，"序列一致性的百分比"指通过在比较窗中比较两条最优比对的序列从而确定的数值，其中对于两序列的最优比对而言，比较窗中的多核苷酸序列的部分与参照序列(该序列不含添加或删除)相比可包含添加或删除(即缺口).通过确定在两序列中发生相同核酸碱基或氨基酸残基的位点的数量，产生配对位点的数量，将配对位点的数量除以在比较窗中的位点的总数量，并将结果乘以100，产生序列一致性的百分比，从而计算百分比，术语"多核苷酸"的使用无意于将具体实施方式限制为包含DNA的多核苷酸.本领域普通技术人员将认识到多核苷酸可包含核糖核苷酸以及核糖核苷酸与脱氣核糖核苷酸的组合.这些脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然发生的分子和合成类似物.具体实施方式的多核苷酸也包含序列的所有形式，包括但不限于单链形式、双链形式等.在一些具体实施方式中，进一步提供了下述表达盒，所述表达盒包含了与编码抗真菌多肽的具体实施方式的异源核苷酸序列可搮作性连接的启动子.具体实施方式的表达盒可用于生成转化植物、植物细胞和微生物，以及用于实现在此公开的诱导真菌病原体抗性的方法.表达盒将包括与具体实施方式的多核苷酸可搮作性连接的5，和3，调节序列."可搮作性连接"意在表示两个或多个元件之间的功能性连接。例如，感兴趣的多核苷酸和调节序列(即启动子)之间的可操作性连接是允许感兴趣的多核苷酸表达的功能性连接.被可搮作性连接的元件可以是相连的或非相连的.当用于指通过可搮作性连接将两个蛋白编码区的连接时，可搮作性连接意指编码区在相同的阅读框内，表达盒还可包含将被共转化进生物体的至少一个額外基因.可替换地，可在多重表达盒中提供额外的基因.这样的表达盒提供了用于下述多核苷酸插入的多个限制性位点和/或重组位点，所述多核苷酸编码位于调节区的转录调节下的抗真菌多肽.表达盒还可以包含选择性标记基因.表达盒将以5，-3，的转录方向包括转录起始区(即启动子)、翻译起始区具体实施方式的多核苷酸、翻译终止区以及可选地，在宿主生物体中发挥功能的转录终止区.调节区(即启动子、转录调节区和翻译终止区)和/或具体实施方式的多核苷酸可以是宿主细胞自身的/类似的或相互是自身的/类似的.可替换地，调节区和/或具体实施方式的多核苷酸可以是宿主细胞异源的或相互异源的.当在此使用时，关于序列的"异源的"是指来自其它物种的序列，或如果来自相同物种，已通过有意人为干涉在组成和/或基因组位点上从其天然形式经实质上改变的序列.例如，与异源多核苷酸可搮作性连接的启动子来自于下述物种，该物种不同于获取该多核苷酸的物种，或如果来自相同/相似物种，其中之一或两者均从它们的原始形式和/或基因组位点发生充分2修饰，或启动子不是可搮作性连接的多核苷酸的天然启动子.可选被包含的终止区可以是转录起始区本身的，可以是可搮作连接的感兴趣的多核苷酸本身的，可以是植物宿主本身的，或可以来自与启动子、感兴趣的多核苷酸、宿主不同的另一来源(即外源或异源的)，或它们的任意组合.方便的终止区域可获自根癌农杆菌(A似附e/aciV附)的Ti-质粒，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止区.也见GuerineauWa/.(1991)3fo/.Ge".262:141-144;Proudfoot(1991)。//64:671-674;Sanfacon等(1991)(e陋Z)ev.5:141-149;MogenW(1990)尸/fl似CW/2:1261-1272;Munroe"a/.(1990)91:151-158;BallasWa/.(1989)iV"c/eic17:7891-7903;以及JoshiWfl/.(1987)7V"c/e/cJaVfo及战15:9627-9639.在特定具体实施方式中，马铃薯蛋白酶抑制刑H基因(PinlI)终止子被使用.见例如Keile"/.(1986)iV"c/.Jc/必及四，14:5641-5650;和AnWa/.(1989)户/a拟Ce//1:115-122，这些文献通过引用整体并入本文.在合适的情况下，可针对提高在转化生物体中的表达对多核苷酸进行优化.例如，为了提高的表达，可以使用植物偏好密码子合成多核苷酸.关于宿主偏好密码子用法的讨论见例如CampbellandGowri(1990)P/aWiV^W.92:1-11.合成植物偏好基因的方法在本领域可获得.见例如美国专利号5，380，831和S，436，391，以及Murray"a/.(1989)iV"c/"cJciVfoW战17:477-498,这些文献通过引用并入本文.已知有其它的序列修饰能提高在细胞宿主中的基因表达.这些修饰包括将编码假多聚腺苷酸化信号、外显子-内含子拼接位点信号、类转座子重复的序列和其它此类可能对基因表达不利的充分表征的序列去除.可将序列的G-C含量调节至给定细胞宿主的平均水平，该水平通过参考在宿主细胞中表达的已知基因计算得出.在可能时，修饰序列以避免预测的发夹二级mRNA结构，表达盒可額外包含5，前导序列(leadersequences).这些前导序列可以发挥作用提高翻译.翻译前导序列是本领域已知的，其包括小核糖核酸病毒前导序列，例如EMCV先导(脑心肌炎5，非编码区)(Elroy-SteinWC(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:6126-6130);马铃薯丫病毒属(potyvirus)前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀故病毒)(Gallie""(1995)Gene165(2):233-238)、MDMV前导序列(玉米矮花叶病毒)、和人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(MacejakW(1991)Nature353:90-94);来自紫花苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA的非翻译前导序列(AMVRNA4)(Jobling"a/.(1987)Nature325:622-625);烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie"a/,(1989)inMolecularBiologyofRNA，ed,Cech(Liss，NewYork),pp,237-256)j和玉米枯黄斑点病毒前导序列(MCMV)(LommelWa/.(1991)Virology81:382-385),也见Della-CioppaW"/.(1987)PlantPhysiol.84:965-968,在制备表达盒的过程中，可以对多种DNA片段加以搮纵，由此提供正确定向以及适用的话，在正确阅读框内的DNA序列，为了这个目标，可以使用接头(adapter)或连接子连接DNA片段，或可以包含其它的操作以提供方便的限制性位点，实现多余DNA的去除、限制性位点的去除等.为了这个目的，体外诱变、引物修复、限制性酶切、退火、重取代例如转换(transition)和颠换(transversion)等可被包含.表达盒还可包含用于选择转化细胞的选择性标记基因.选择性标记基因被用于转化细胞或组织的选择.标记基因包括编码抗生素抗性的基因，例如那些编码新審素磷酸转移醉II(NEO)和潮審素磷酸转移醉(HPT)的基因，以及赋予对除草化合物抗性的基因，例如草铵鱗、溴苯腈(Bromoxynil)、咪唑啉嗣、草甘聘和2，4-二氯苯氧乙酸盐(2，4-D),其它的选择性标记包括表型标记(phenotypicmarkers)例如P-半乳糖苷酶和荧光蛋白例如绿色荧光蛋白(GFP)(Sue"/.(2004)BiotechnolBioeng85:610-9和Fetter等(2004)PlantCell16:215-28)、青色荧光蛋白(CYP)(Bolte"fl/.(2004)J.CellScience117:943-54和Kato"fl/.(2002)PlantPhysiol129:913-42)、以及黄色荧光蛋白(来自Evrogen的PhiYFP,见BolteCa/.(2004)J.CellScience117:943-54).关于其它选择性标记，一般地见Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3:506-511;ChristophersonWa/,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:6314-6318;YaoWa/.(1992)Cell71:63-72;Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6:2419-2422;Barkley"C(1980)inTheOperon，pp.177-220;Hu"fl/.(1987)Cell48:555-566;Brown"a/.(1987)Cell49:603-612;FiggeC(1988)Cell52:713-722;DeuschleWd/.(1989)Proc.Natl.Acad.Aci.USA86:5400-5404;FuerstW1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2549-2553;Deuschlee"/.(1990)Science248:480-483;Gossen(1993)Ph.D.Thesis,UniversityofHeidelberg;ReinesWfl/.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:1917-1921;LabowWa/.(1990)Mol.Cell.Biol.10:3343-3356;ZambrettiWfl/.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:3952-3956;BaimWa/,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:5072-5076;WyborskiW(1991)NucleicAcidsRes.19:4647-4653;HHlenand-Wissman(1989)TopicsMol.Struc.Biol.10:143-162;Degenkolba/.(1991)Antimicrob.AgentsChemother.35:1591-1595;Kleinschnidt1988)Biochemistry27:1094-1104;Bonin(1993)Ph.D.Thesis，UniversityofHeidelberg;Gossena/.(1992)Proc.Natl.Acad.Sd.USA89:5547-5551;Oliva"a/.(1992)Antimicrob.AgentsChemother.36:913-919;HlavkaWa/.(1985)HandbookofExperimentalPharmacology,Vol.78(Springer-Verlag，Berlin);GillWfl/.(1988)Nature334:721-724;和WO02/36782.这些iS开物通过引用并入本文.选择性标记基因的以上列表并不意味着限定.任何选择性标记基因可被用于具体实施方式.术语"启动子"指位于转录起始的上游和/或下游的区域或序列，该区域或序列涉及对RNA聚合酶和其它蛋白的识别和结合以起始转录.启动子包括转录起始位点附近的核酸序列，例如在聚合醉II型启动子的例子中，TATA元件.启动子还可选地包括远端增强或遏制元件，这些元件可位于距离转录起始位点几千个碱基对之远的位点."组成型"启动子是在大多数环境和发育条件下有活性的启动子，"可诱导"启动子是在环境或发育调节下有活性的启动子.术语"可操作性连接"指在核酸表达控制序列(例如启动子或一系列转录因子结合位点)和笫二核酸序列之间的功能性连接，其中表达控制序列引导对应于第二序列的核酸的转录.一些启动子可被用于具体实施方式的实践，包括感兴趣的多核苷酸序列的天然启动子.可根据希望的结果对启动子加以选择.广泛的植物启动子在最近的Potenza"a/.(2004)/fiK,7roCe〃Z)ev5iWiVawf^:/-"的综述中被讨论，该综述通过引用并入本文.例如，核酸分子可以与组成型的、组织偏好的、病原体诱导的或其它启动子组合以在植物中表达.这些组成型启动子包括例如Rsyn7启动子的核心启动子和在WO99/43838和美国专利号6，072，050中公开的其它组成型启动子；核心CaMV35S启动子(Odellfl/.(1985)iV加m/^313:810-812);大米肌动蛋白(McElroy"(1990)尸/a^CW/2:163-171);泛素(ChristensenCa/.(1989)尸/flW丑iVi/.12:619-632和ChristensenWfl/.(1992)尸/朋fMo/.说W.18:675-689);pEMU(LastWa/.(1991)T7^or.Xp//.81:581-588);MAS(Ve"en"W.(1984)五M丑O3:2723-2730);ALS启动子(美国专利号5,659,026)等.其它组成型启动子包括例如那些在美国专利号5,608,149;5,608,144;5,604,121;5,569,597;5,466,785;5,399,680;5,268,463;5,608,142和6,177,611中公开的启动子.一般地，从可诱导启动子特别是从病原体诱导启动子表达基因将是有益的.这样的启动子包括那些来自致病相关蛋白(PR)的启动子，这些启动子在病原体感染后被诱导；例如PR蛋白、SAR蛋白、P-l，3-葡聚糖酶、几丁质酶等.见例如RedolfiWfl/.(1983)Neth.J.PlantPathol.89:245-254;UknesWa/.(1992)PlantCell4:645-656;以及VanLoon(1985)PlantMol.Virol.4:111-116,也见WO99/43819，其通过引用并入本文.感兴趣的是在病原体感染位点或附近产生局部表达蛋白的启动子.见例如Marineauem/.(1987)所"9:335-342;Matton"a/.(1989)Mo/ecw/ariVa/i"M/cro6e/繞nicrt》/ts2:325-331;Somsischa/.(1986)/Voc.7VflZ/,Sci*.83:2427-2430;Somsischa/.(1988)Mo/.Ge".Ge/i饥2:93-98;以及Yang(1996)iVoc.7VW/.爿caA5W.93:14972-14977,也见Chen(1996)尸/a加/.10:955-966;ZhangWa/.(1994)/Voc.TVa".爿carf.5W.tASJ91:2507-2511;WarnerC1993)尸/a似/'3:191-201;Siebertz1989)尸/a"fCW/1:961-968;美国专利号5，750，386;以及在其中引用的参考文献.进一步的例子是玉米PRms基因的可诱导启动子，该基因的表达由病原体轮状镰刀菌(F麵"謂ve/tic漁Wto)谦导，(见例如Cordero"fl/.(1992)尸A戸o/.Mo/.尸/朋,Pa狄.41:189-200)。此外，当病原体通过伤口或昆虫伤口找到进入植物的入口时，伤口诱导启动子可被用于具体实施方式的构建.这类伤口诱导启动子包括马铃薯蛋白酵抑制剂(pinII)基因(Ryan和wun2，美国专利号5,428,148;winl和win2(Stanford"fl/.(1989)M"215:200-208);系统素(McGurl"fl/.(1992)5Wewce225:1570-1573);WIP1(RohmeierWfl/.(1993)尸/a似所o/.22:783-792;Eckelkampe《(1993)Z^股rj323:73-76);MPI基因(Corderoke"/.(1994)/Va"f丄6(2):141-150)等，它们通过引用并入本文.化学药品调节启动子可被用于通过使用外源化学调节刑来调节基因在植物中的表达.取决于目的，启动子可以是化学药品诱导启动子，其中使用化学药品诱导基因表达；或化学药品抑制启动子，其中使用化学药品遏制基因表达.化学药品诱导启动子是本领域已知的，其包括但不限于玉米In2-2启动子，该启动子由苯磺酰胺除草刑安全刑激活，玉米GST启动子，该启动子由被用作苗前除草刑的疏水亲电化合物激活，以及烟草PR-la启动子，该启动子由水杨酸激活，其它感兴趣的化学药品调节启动子包括类固醇应答启动子(见例如Schenae"/.(1991)P/w.iVfl汰/4cflrf.&f'.88:10421-10425和McNellis"a/.(1998)尸/nwr义14(2):247-257中的糖皮质激素诱导启动子)以及四环素诱导和四环素抑制启动子(见例如GatzW(1991)Mo/.Ge汰227:229-237，和美国专利号5,814,618和5,789,156)，它们通过引用并入本文.组织偏好启动子可被用于将具体实施方式的抗真菌多肽的提高的表达把向到特定植物组织中.例如，组织偏好启动子可被用于在其中疾病抗性是特别重要的植物组织中表达抗真菌多肽，所述组织例如根、茎或叶.组织偏好启动子包括Yamamotoe"/.(1997)尸/aW/.12(2):255-265;KawamataWfl/.(1997)尸/a拟Ce//尸/^j"/.38(7):792-803;HansenWa/.(1997)淑.GewGe/i".254(3):337-343;Russell(1997)r腦艰emc及e"(2):157-168;RinehartWa/.(1996)112(3):1331-1341;VanCamp"a/.(1996)尸/a"fiVi戸o/.112(2):525-535;Ca譜ascini"a/.(1996)尸/a/t,112(2):513-524;Yamamoto"(1994)/Va/ifCWZ尸/^戸o/.35(5):773-778;Lam(1994)及柳to/V祝CW/卿e,.20:181-196;OrozcoWa/.(1993)尸/朋,Mo/所o/.23(6):1129-1138;MatsuokaWa/.(1993)尸wcTVa".爿carf.5W.tAR490(20):9586-9590;以及Guevara-Garcia&a/.(1993)尸/a",/4(3):495-505.如果需要的话，此类启动子可以经改进以用于弱表达.维管组织偏好启动子是本领域已知的，其包括那些在例如木质部和韧皮部组织中选择性驱动蛋白表达的启动子.维管组织偏好启动子包括但不限于黑樱桃(Prw""swrW朋)野黑櫻苷水解醃基因启动子(见例如国际公开号WO03/006651),以及还在美国专利申请序列号10/109,488中发现的启动子.茎偏好启动子可被用于驱动具体实施方式的抗真菌多肽的表达.典型的茎偏好启动子包括玉米MS8-15基因启动子(见例如美国专利号5,986,174和国际公开号WO98/00533)，以及在Graham"a/.(1997)iVa似Mo/所o/33(4):729-735中发现的启动子.叶偏好启动子是本领域已知的.见例如YamamotoCa/.(1997)/Vfl"//.12(2):255-265;KwonWa/.(1994)尸AjwV/.105:357-67;Yaraamoto"a/.(1994)/Vd加CW/尸/^s/c/.35(5):773-778;GotorW"(1993)尸/a"f3:509誦18;OrozcoWa/.(1993)P/amA/o/.23(6):1129-1138;和Matsuoka"a/.(1993)尸roc.iVa".JcaASc/.t/5L490(20):9586-9590,根偏好启动子是已知的，其可选自从很多文献中可获得的启动子中，或从各种相容的物种中重新分离.见例如HireCd/.(1992)/，/aWMo/.所o/.20(2):207-218(大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因)；KellerandBaumgartner(1991)3(10):1051-1061(四季豆GRP1.8基因的根特异性控制元件)；SangerWa/.(1990)/Vfl似Mo/.14(3):433-443(根瘤农杆菌(Jgro^"eWwmto附e/"de"s)的甘露氨酸合成酶(MAS)基因的根特异性启动子)；和MiaoWfl/.(1991)CW/3(1):11-22(编码胞液谷氨酰胺合成酶(GS)的全长cDNA克隆，该cDNA在大豆的根和根痗中表达)，也见BoguszWa/.(1990)7>/a/^Ce〃2(7):633-641,其中说明了从固氮非豆科Pflras/wm'aawrf^yom'i'和相关的非固氮非豆科山黄麻(7Ve附"似me"似幼)的血红蛋白基因中分离出的两种根特异性启动子.LeachandAoyagi(1991)说明了他们关于发根农杆菌(^4gw6fl"e〃'MWr/f/wge"ey)的高度表达的roIC和rolD根诱导基因的启动子的合成(见尸/a"fSdew"(Limerick)79(1):69-76).其它的根偏好启动子包括VfENOD-GRP3基因启动子(Kuster^a/.(1995)外fl^Mo/.所o/,29(4):759-772);和rolB启动子(CapanaW(1994)尸/a"fMo/.25(4):681曙691).也见美国专利号5，837，876;5，750，386;5,633,363;5,459,252;5，401，836;5,110,732和5,023,179,"种子偏好"启动子包括"种子特异性"启动子(这些启动子在种子发育中有活性，例如种子储存蛋白的启动子)以及"种子萌发(germination)"启动子(这些启动子在种子萌发中有活性).见ThompsonC"/.(1989)fi,oEwa^s10:108,其通过引用并入本文，此类种子偏爱启动子包括但不限于Ciml(细胞分裂素诱导信息)；cZ19Bl(玉米19kDa玉米醇溶蛋白(zein));milps(肌醇-l-鳞酸合成酶)(见WO00/11177和美国专利号6,225,529;在此被参考引用).Y-玉米醇溶蛋白是优选的胚乳特异性启动子.Glob-l是优选的胚芽特异性启动子。对于双子叶植物而言，种子特异性启动子包括但不限于豆e-菜豆蛋白、油菜蛋白(napin)、P-大豆聚球蛋白、大豆凝血素、十字花科蛋白(cruciferiii)等.对于单子叶植物而言，种子特异性启动子包括但不限于玉米15kDa玉米醇溶蛋白、22kDa玉米醇溶蛋白、27kDa玉米醇溶蛋白、g-玉米醇溶蛋白、裙蛋白(waxy)、shrunken1、shrunken2、球蛋白1(globulin1)等.也见WO00/12733，其中公开了来自ewrf/和em/2的种子偏好启动子；该文献通过引用并入本文.在某些具体实施方式中，具体实施方式的核酸序列可与感兴趣的多核苷酸序列的任意组合叠加(stack)，由此生成具有人们想要的表型的植物.例如，具体实施方式的多核苷酸可与具体实施方式的任何其它多核苷酸，如SEQIDNOS:3、6和9的任何组合，或其它抗真菌基因等叠加.生成的组合也可包括任何一个感兴趣的多核苷酸的多个拷贝.具体实施方式的多核苷酸也可以与任何其它的基因或与基因的组合叠加以生成具有各种想要的性状组合的植物，这些性状组合包括但不限于对动物飼养而言，希望的性状例如高油基因(例如美国专利号6,232,529);平衡的氨基酸(例如hordothionins(美国专利号5,990,389;5,885,801;5，885，802和5,703,409));大麦高赖氨酸(WilliamsonWa/.(1987)/丑ioc/^附.165:99-106;和WO98/20122);和髙甲疏氨酸蛋白(Pedersen"a/.(1986)/所o/.CT^m.261:6279;Kirihara"a/.(1988)71:359;和MusumuraWa/.(1989)/Vd/^MW.所o/.12:123));提高的可消化性(例如改进的储存蛋白(提交于2001年11月7日的美国申请序列号10/053,410));和疏氧还蛋白(提交于2001年12月3日的美国申请序列号10/005,429)),这些公开文献通过引用并入本文.具体实施方式的多核苷酸也可与针对昆虫、疾病或杀虫刑抗性的所需性状叠加(例如苏云金芽杆菌(丑w7/"j^M/7>igie/iws)毒性蛋白(美国专利号5,366,892;5,747,450;5,737,514;5723,756;5,593,881;GeiserCa/.(1986)48:109);植物凝血素(VanDammeC(1994)iVa似Mo/.BiW.24:825);伏马菌毒素解毒基因(美国专利号5,792,931);无毒性(avirulence)和疾病抗性基因(Jones"a/.(1994)Science266:789;Martin"a/.(1993)Science262:1432;Mindrinos"a/.(1994)Cell78:1089);导致除草刑抗性的乙酰乳酸合成酶(ALS)突变体例如S4和/或Hra突变；谷氨耽胺合成醉抑制刑例如草丁鱗(phosphinothricin)或basta(例如bar基西)；以及草甘膊抗性(EPSPS基因，GAT基因如那些在美国专利申请公开号US2004/0082770以及WO02/36782和WO03/092360中公开的基因))；以及对于加工或加工产物而言所希望的性状，如高油(例如美国专利号6，232，529);改进的油(例如脂肪酸脱氩酶基因(美国专利号5,952,544;WO94/11516));改进的淀粉(例如ADPG焦砩酸化酶(AGPase)、淀粉合成醉(SS)、淀粉分支醃(SBE)和淀粉去分支醉(SDBE));以及聚合物或生物塑料(例如美国专利号5，602，321;P-酮基疏解酶、聚羟基丁酯合成酶和乙酰乙酰辅酶A还原醉(SchubertCd/.(1988)丑a"e"W.170:5837-5847)促进聚鞋基烷酸(PHAs)的表达)，这些公开文献通过引用并入本文.人们也可以将具体实施方式的多核苷酸与提供农艺学性状(例如雄性不育(例如见美国专利号5,583,210)、茎强度、花期)或转化技术性状(例如细胞周期调节或基因把向(例如WO99/61619;WO00/17364;WO99/25821))的多核苷酸组合，这些公开文献通过引用并入本文.这些叠加组合可以通过任何方法产生，所述方法包括但不限于通过任何传统的或1\^(>088@方法或遗传转化法杂交育种植物。如果通过遗传转化植物将这些性状叠加，感兴趣的多核苷酸序列可以在任何时刻以任何顺序组合.例如，包含一种或多种想要的性状的转基因植物可被用作靶植物，以通过随后的转化进一步引入性状.性状可与用转化盒的任何组合提供的感兴趣的多核苷酸在共转化步碟中同时被引入。例如，如果两个序列将被引入，该两个序列可以被包含在分开的转化盒(trans)或包含在相同的转化盒(cis)中.序列的表达可以由相同的启动子或不同的启动子驱动.在某些例子中，引入将遏制感兴趣的多核苷酸表达的转化盒是人们希望的.这可与其它遏制盒或过量表达盒的任意组合相组合，以在植物中产生想要的性状的组合.技术人员还将认识到，可以使用位点特异性重组系统将多核苷酸序列在想要的基因组位点叠加.见例如W099/25821、W099/25854、WO99/25840、W099/25855和W099/25853，所有这些文献通过引用并入本文.具体实施方式的方法包括将多肽或多核苷酸引入植物."引入"意在表示将多核苷酸呈现给植物.在某些具体实施方式中，多核苷酸将以下述方式呈现，所述方式使得序列能够进入植物细胞的内部，包括其对植物基因组的潜在插入.具体实施方式的方法不依赖于特別的将序列引入植物的方法，只要多核苷酸能够进入至少一个植物细胞即可.将多核苷酸引入植物的方法是本领域已知的，其包括但不限于稳定转化法、瞬间转化法和病毒介导法.多肽也可以以下述方式被引入植物，所述方式使得它们能够进入植物细胞的内部，或虽然保持在细胞的外部但与细胞紧密接触."稳定转化"意在表示引入植物的核苷酸构建体整合进植物基因组并能够由其后代遣传，"瞬间转化"或"瞬间表达"意在表示多核苷酸被引入植物且不整合进植物的基因组，或多肽被引入植物。转化方案以及将多肽或多核苷酸序列引入植物的方案可根据目标转化植物或植物细胞的类型(即单子叶或双子叶)而变化.将多肽和多核普酸引入植物细胞的合适方法包括微注射(CrosswayWfl/.(1986)BiWecA/i《es4:320-334)、电穿孑"RiggsWa/，(1986)iVa".hrf.5W.tASJ83:5602-5606)、农杆菌(y^w6fl"e〃'"m)-介导转化(美国专利号5，563，055和5，981，840)、直接基因转移(PaszkowskiW"/，(1984)五M50/3:2717-2722)以及弹道粒子加速(见例如SanfordWfl/.，美国专利号4,945,050;5，879，918;5，886，244;和5,932,782;Tomese"/.(1995)in尸/a"ZCW/，r/swie,Orga/iC"/似re:FM/tda附ewfa/i^/e^offc，ed.GamborgandPhillips(Springer-Verlag，Berlin);McCabeo/.(1988)丑/W"A朋/ogy6:923-926);以及Lecl转化(WO00/28058).也见Weissinger"a/.(1988)^肌及ev.22:421-477;Sanforde《a/.(1987)Pam'oi/flfeSc/e/ice朋rfre由o/柳5:27-37(洋葱)；ChristouWa/.(1988)尸/fl/if87:671曙674(大豆)；McCabe"a/.(1988)说V7Vc/i/io/ogy6:923-926(大豆)；FinerandMcMullen(1991)//iFrtroCW/Dev.所o/.27P:175-182(大豆)；Singhe"/.(1998)7%^/*.4/p/.Gew"96:319-324(大豆)；DattaWa/.(1990)JJiV^c/^oto"8:736-740(水稻);KleinWa/.(1988)尸roc.TVfl".爿carf.5W.tAS^85:4305-4309(玉米)；Klein"a/.(1988)胸ecA朋/柳6:559-563(玉米)；美国专利号5,240,855;5，322，783和5，324，646;KleinWfl/.(1988)i>Aj;siV/.91:440-444(玉米)；FrommCa/.(1990)说Vtec/wo/ogv8:833-839(玉米)；Hooykaas-VanSlogteren"a/.(1984)iVa似"(Xomto^311:763-764;美国专利号5,736,369(荞麦)；BytebierWa/.(1987)/Voc.iVarf.Jcn忒5W.tASL484:5345-5349(百合科)；DeWetW(1985)in五jc/;erime/i似/Maw(pu/a"VmOvw/e7Y柳四,ed.Chapmana/.(Longman,NewYork),pp.197-209(pollen);Ka印pler"a乙(1990)尸/fl"《Ce//及印orto9:415-418和KaepplerWa/.(1992)rAeor.J//;/.Ce"汰84:560-566(whisker曙介导转化)；D，HalluinWa/.(1992)/VaWCeW4:1495-1505(电穿孔)；LiWa/.(1993)尸/a"fCe//及印or"12:250-255以及ChristouandFord(1995)j/mafco/5Wfl/y;75:407-413(水稻)；Osjoda"C(1996)iVa似re丑/WecA/w/ogv14:745-750(通过根瘤农杆菌(爿gro6fl"en'"mmme/aci'e/is)的玉米)；所有这些文献通过引用并入本文.在特定具体实施方式中，可使用各种瞬间转化法将具体实施方式的抗真菌序列提供给植物.这些瞬间转化法包括但不限于将抗真菌蛋白或其变体及片段直接引入植物或将抗真菌蛋白转录本引入植物.这样的方法包括例如微注射或粒子轰击.见例如Crossway"a/.(1986)Mo/Ge".Ge/iW.2^2:179-185;NomuraWa/.(1986)iVa加Sd.^/:53-5S;HeplerWa/.(1994)TVfl".Jcarf.97:2176-2180和HushCfl/.(1994)77^■/wi/tw/o/Ce//Sdewce^7:775-784,所有这些文献通过引用并入本文.可替换地，可使用本领域已知技术将多核苷酸瞬间转化进植物.此类技术包括病毒栽体系统和以能防止DNA随后释放的方式进行的多核苷酸沉淀.因此，粒子结合DNA的转录可发生，但其释放整合进基因组的频率被大大降低，此类方法包括使用包被了聚乙亚胺(PEI;Sigma#P3143)的粒子，在其它具体实施方式中，通过将植物与病毒或病毒核酸接触，具体实施方式的多核苷酸可被引入植物，通常，这样的方法包括将具体实施方式的核苷酸构建体并入病毒DNA或RNA分子.技术人员将知道，具体实施方式的抗真菌多肽可首先作为病毒多聚蛋白的一部分被合成，随后可通过体内或体外的蛋白水解对该多聚蛋白进行加工，生成想要的重组蛋白.进一步地，技术人员将知道，具体实施方式的启动子也包含用于通过病毒RNA聚合醉进行转录的启动子.将多核苷酸引入植物并在其中表达由其编码的蛋白质的、涉及病毒DNA或RNA分子的方法是本领域已知的.见例如美国专利号5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367、5,316,931，和PortaW"(1996)Mo/ec"/ar5:209-221;它们通过引用并入本文，用于在植物基因组的特定位点将多核苷酸靶向插入的方法是本领域已知的.在一种具体实施方式中，多核苷酸在想要的基因组位点的插入通过位点特异性重组系统实现.见例如W099/25821、W099/25854、WO99/25840、W099/25855和W099/25853，所有这些文献通过引用并入本文.简言之，具体实施方式的多核苷酸可被包含在转移盒中，该盒由两个不引起重组的重组位点包夹.转移盒被引入下述植物，所述植物具有被稳定引入其基因组的靶位点，该位点由两个不引起重组的重组位点包夹，这些重组位点对应于转移盒的位点.提供合适的重组酶，转移盒被整合进靶位点.感兴趣的多核苷酸由此被整合进植物基因组中的特定染色体位点.可根据常规方法将已转化的细胞培养为植物.见例如McCormick^a/.(1986)尸/朋《O//及e/w他5:81-84。这些植物随后可被培养，并由相同转化林或不同林授粉，得到的具有想要的表型特征的组成型表达的后代被鉴定出来.可培养两代或更多代，以确保想要的表型特征的表达被稳定维持且被遗传，随后收获种子以确保想要的表型特征的表达已被实现.以这种方式，具体实施方式提供了经转化的种子(也被称作"转基因种子")，所述种子具有稳定整合进它们的基因组的具体实施方式的核苷酸构建体，例如具体实施方式的表达盒.当在本文中使用时，术语"植物"包括整个植物，植物细胞，植物原生质，下述植物细胞组织培养物(通过所述培养物可再生玉米植物)，植物愈伤组织，植丛(plantclump)以及在植物中完整的植物细胞或植物的部分例如胚、花粉、种子、胚乳、种皮、叶、花、花器官/结构(例如苞叶、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花粉囊和胚珠)、枝、果实、核、穗、穗轴、壳、茎、块茎、根、根尖、花粉囊、植物组织(例如维管组织、基本組织等)和细胞(例如保卫细胞、卵细胞、毛状体等)和相同的后代.谷类意在表示由商业栽培者为了生长或繁殖物种以外的目的生产的成熟种子.再生植物的后代、变体和突变体也被包含在具体实施方式的范闺内，前提是这些部分包含引入的多核苷酸.可用于具体实施方式的方法中的植物的种类通常和能够适应转化技术的高等和低等植物种类一样广泛，包括被子植物(单子叶植物和双子叶植物)、棵子植物、获类植物和多细胞藻类.植物包括不同倍体水平的植物，包括非整倍体、多倍体、二倍体、单倍体和半合子植物.具体实施方式的方法可被用于在任何植物物种中诱导真菌抗性或保护不受真菌病原体攻击，所述植物包括但不限于单子叶和双子叶植物.感兴趣的植物物种例子包括但不限于玉米(Zefl附fl^)、芸苔属(JJ/"似si'casp.)(例如甘蓝型油菜(及/tapws)、白菜(及m/")、芥菜型油菜(丑.),特别是那些用于种子油来源的芸苔属，紫花苜蓿(Me必cagos油'va)、稻(O/jzfls幼'va)、黑麦(5"ecfl/ece/*ea/e)、高梁(5^/^Am附Wa/or、SorgAnmvm/gdre)、黍(例如珍珠黍(Pew/ii'se似附g/awciim)、稷(Pa附'c謹mf7/dtceum)、谷子(5Wari'flf7a"cd)、龙爪稷(￡7eiiVieco/Yic朋a))、向曰葵(好e/Za/t狄Ksa朋MMS)、红花(d/t/ra附附《//i"o"'i/s)、小麦(7Wft'CMmae幼'vw/w)、大豆(C/戸7ie)、烟草(iWcCfl"a似6flcn附)、马铃茅(So/ami/w励e"osMw)、花生(y4rac船—/ogaea)、棉花((o輝/w'"附6a由&朋e、(aw炉'w附W簡,謂)、甘薯(印0m0ea6齒似s)、木募(Mam'AWescu/e幽)、咖啡(CojQ^ispp.)、椰子(CocosWMCiy"era)、获萝(y4/iflfiflsco附aww)、措桔树(Ci7riwspp.)、可可(rAeo6ro附acacao)、茶(Ca附e〃/flsiVie/ts/s)、香蕉(Musaspp.)、跨梨(尸erseaa附e〃'cflw")、无花果(caw.ca)、番石榴(尸s!V/i'"mg呵'ava)、芒果(Mflw7"era//irfi'cd))、橄榄()、木瓜(Car/cfl/apa")、腰果(J/iacflnfi.ii附oc"Vfew似/e)、澳洲坚果(Mac(z^im/a/w峰/7yb/iVi)、杏(iVw"MSa考g^"s)、甜菜(丑"avw/g"〃's)、甘蔗(Sacc/m/wMspp.)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和松类.蔬菜包括西红柿(Z^co/^rwcowi[ycoiperw'cwi)、莴苣(例如Z^c似caWva)、绿豆(户toeo/"sv/ga/*&)、青豆(尸to幼/"s/i'/wewsi's)、豌豆(Z^狄""sspp.)、以及甜瓜属(C"cmw&)的成员例如黄瓜(C.jarfvKS)、香瓜(C.cfl/ito/"/^附fe)和甜瓜(C.附eto),观赏植物包括杜鹃花(及/^wtorfe"rf/Y/tspp.)、A^(山花(/ryrfrafigea)、芙蓉(历6&面r纖卵"e附^)、玫瑰(及謹spp.)、郁金香(7>i/—spp,)、水仙花(iVarctowspp.)、矮牵牛花(尸""wVi一r/rfa)、康乃馨(awyo/^〃Ms)、一品红(五M//^r6!.flp/cAem'/nfl)和菊花.可用于实现具体实施方式的松类包括例如松树如火炬松(尸i'mw、湿地*》(户/mwe〃i.Wi.i')、美国黄*》(Pi7iiw/wm;tewsfl)、小杆松(i//f"jco/tto加)和插射松(rfl必Ca);花旗松(尸se"rfo加^j附ewz^w7);西部铁杉(7^g<icflfiflrfe/iw's);白云杉(iV'ceag/"nai);红杉(5^《MoiVije附/erWrewj);真片多例如银冷才多fl附aW/!'s)和冷杉(^6fes6fl/jflwea);以及雪水》例如北美乔柏(rA">/;/i'ai纽)和阿拉斯加桧柏(C/^waec^/7ari's/i卯汰ate附i's)。在特定具体实施方式中，具体实施方式的植物是农作物(例如玉米、紫花苜蓿、向日葵、芸苔、大豆、棉花、红花、花生、高梁、小麦、黍、烟草等)在其它一些具体实施方式中，玉米和大豆植物是最优的，在另一些具体实施方式中玉米植物是最优的.感兴趣的其它植物包括提供感兴趣的种子的谷类植物、油籽植物和豆科植物.感兴趣的种子包括谷物种子例如玉米、小麦、大麦、稻、高梁、黑麦等.油籽植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔、玉米、紫花苜荐、棕榈、椰子等.豆科植物包括豆(bean)和豌豆，豆包括瓜儿豆、槐豆、胡,巴、大豆、菜豆、豇豆、绿豆、青豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等.抗真菌组合物也被包含在本发明中.抗真菌组合物可包含抗真菌多肽或含有编码抗真菌多肽的核苷酸序列的经转化微生物.本发明的抗真菌组合物可应用于植物真菌病原体的环境，如下文所述，由此保护植物免受真菌病原体攻击.此外，抗真菌组合物可以与可接受的栽体配方，所述栽体例如悬浮剂、溶液、乳剂、撒布粉剂(dustingpowder)、可分散粒刑、可湿性粉剂、可乳化浓缩剂、气溶胶、浸渍粒刑、佐剂、可包被貼刑，其还可以包装在例如聚合物质中.编码具体实施方式的抗真菌多肽可根据本领域的标准方法被引入任何合适的微生物宿主.例如，可选择已知占领一种或多种感兴趣的农作物的"植物闺(phytosphere)"(叶面(phylloplane)、叶闺(phyllosphere)、根围(rhizosphere)和/或根面(rhizoplana))的微生物.选择这些微生物使得它们能够在特定环境中成功地与野生型微生物竟争，并且提供表达抗真菌蛋白的基因的穗定维持和表达.这些微生物包括细菌、藻类和真菌.特别感兴趣的是微生物如细菌,伞il如i^enrfowMmfls、￡"nvi>i/a、ye/TYift'fluJS7e^s/e//fl、Aii/^/^附omw、ift,印似mycas、(Jfls/rf/o附^c^eyyeastH9及A0rfo似rM/a、y411re06as1VWMm、iy/w/Y^0/0附yces等.特别感兴趣的微生物宿主生物体包括酵母例如及/^rfo似w/a印p.、JreotoiW"w卿，、5"accAar麵，ces柳.和5^oro6tf/o考cas卿.，叶面微生物如尸seMrfo柳"as、￡>H7>.asp/.和/7flvoftacte"'賺s/;/;.，以及其它这样的微生物,包括/^ei^/omd"asflgnigi'朋sa、/^eiirfomowas^EscAer/c似flco/,、丑w7/ms训M似等，编码具体实施方式的抗真菌蛋白的基因可被引入下述微生物中，所述微生物在植物(附生物(印iphyte))中繁殖以将抗真菌蛋白运送到潜在的靶向真菌病原体.附生物，例如，可以是革兰氏阳性或革兰氏阴性菌，根拓殖细菌(Root-colonizingbacteria),例如，可以使用本领域已知方法从感兴趣的植物中分离.特別地，拓殖在根上的蜡状芽孢杆菌(Jac///Jcere"j)菌林可以从植物的根上分离(见例如HandelsmanWfl/.(1991)v4p//.五/mro仗M/cro6iW.56:713-718).可以通过本领域已知的标准方法将编码具体实施方式的抗真菌多肽的基因引入根拓殖蜡状芽孢杆菌(5aci7/"sce/"战s)中.可以通过电转化法将编码具体实施方式的抗真菌多肽的基因引入根拓殖杆菌(5a"7/"s)中.特别地，编码蛋白的基因可被克隆进穿梭栽体(shuttlevector)例如pHT3101(LereciusWa/.(1989)FC"M5M,'cwW"Z^tt.60:211-218).含有特定蛋白的编码序列的穿梭栽体pHT3101可以例如通过电穿孔被转化进根拓殖杆菌(Lerecius"(1989)F五MSM,croW"1W汰60:211-218).本发明提供了保护植物免受真菌病原体侵害的方法，该方法包括将有效量的本发明的抗真菌蛋白或组合物施加到真菌病原体的环境中."有效量"意在表示足以控制病原体的蛋白或组合物的量.可通过本领域普通技术人员已知的方法将抗真菌蛋白和組合物应用于病原体的环境中.本发明的抗真菌组合物可通过下述方法获得添加表面活性刑、惰性栽体、防腐刑、湿润剂、摄食促进剂、引诱剂、包衮剂、粘合刑、乳化刑、染料、UV保护剂、緩冲剂、流动刑或肥料、微量营养素供应物、或其它影响植物生长的制剂.一种或多种农用化学品包括但不限于除草剂、杀虫刑、杀真菌刑、杀菌剂、杀线虫刑、软体动物杀灭剂、acaracides、植物生长调节剂、辅助收获刑(harvestaids)和肥料，其可与栽体、表面活性剂或通常用于制剂领域的佐刑组合或与其它有助于产品处理和用于特定靶向病原体的成分组合.合适的栽体和佐刑可以是固体或液体的，其对应于制剂技术中通常使用的物质，例如天然的或再生的矿物质、溶刑、分散刑、湿润刑、增粘刑、粘合剂或肥料.本发明的活性成分通常以组合物的形式应用，其可应用于待处理的农作物区域、植物或种子.例如，本发明的组合物可应用于准备储藏或正储藏在谷箱或谷筒等内的谷物上.本发明的组合物可与其它化合物同时或先后应用.应用含有本发明的至少一种抗真菌蛋白的本发明的活性成分或本发明的农用化学品组分的方法包括但不限于叶应用、种包覆和土壤应用.应用的次数和应用的速率取决于被相应真菌病原体侵袭的密度.合适的表面活性刑包括但不限于阴离子化合物例如金属的羧酸盐；长链脂肪酸的羧酸酯；N-酰基肌氨酸醋；具有脂肪醇乙氣基物的砩酸单酯或二酯或这些酯的盐；脂肪醇碟酸盐例如十二烷基磺酸钠、八烷基磺酸钠或十六坑基磺酸钠；乙氧基化脂肪醇硫酸盐；乙氣基化烷基酚硫酸盐；木质素橫酸盐；石油橫酸盐；烷基芳香基磺酸盐例如烷基苯磺酸盐或更低级的烷基萘磺酸盐例如丁基萘磺酸盐；磺基化的萘-甲S^缩合物的盐；更复杂的磺酸盐如氨基磺酸盐，例如油酸和N-甲基牛磺酸的磺基化缩合产物；或二坑基琥珀酸盐，例如磺酸钠或辛基琥珀酸盐.非离子性试剂包括脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪酸酰胺或脂肪烷基或烯基取代的的酚与环氣乙烷、多羟基醇酯的脂肪酯(例如山梨聚糖脂肪酸酯)的缩合产物，此类醋与环氣乙烷的缩合产物，例如山梨聚糖脂肪酸酯，环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物、乙炔类乙二醇例如2,4，7，9-四乙基-5-癸炔-4，7-二醇、或乙氣基化乙炔类乙二醇，阳离子表面活性剂的例子包括例如脂肪族单、双或聚胺例如醋酸盐、环烷酸盐或油酸盐；或含氧胺例如聚氧乙烯烷基胺的氨基氣化物；通过羧酸和二或聚胺的缩合制备的连接酰胺的胺；或季铵盐.惰性材料的例子包括但不限于无机矿物质例如高岭土、页硅酸盐、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐或植物性材料例如软木、粉末状玉米穗轴、花生壳、稻米壳和胡桃壳.本发明的抗真菌组合物可以是适合直接使用的形式或作为初始组合物的浓缩刑，该浓缩剂在使用前需要用合适量的水或其它稀释剂进行稀释.抗真菌多肽的浓度将根据特定制剂的性质变化，特别地，根据其是否为浓缩剂或将被直接使用而变化.组合物含有1至98%的固体或液体惰性栽体，和0至50%，最优地O.l至5%的表面活性剂.这些组合物将以商业产品的标记速率被使用，最优地，当为干燥形式时，为大约每英亩0.01lb-5.0lb，当为液体形式时，为大约每英亩0.01pts.-10pts.,在另一种具体实施方式中，只要预处理对活性没有损害，可以在配制制剂前对本发明的组合物以及经转化的微生物和抗真菌蛋白进行处理，从而在使用到把向病原体的环境中时延长抗真菌活性。此类可以通过化学和/或物理手段进行，只要处理不会有害地影响组合物的性质.化学试刑的例子包括但不限于由化剂；醛例如甲醛和戊二醛；抗感染刑例如氯化锌；醇例如异丙醇和乙醉；以及组织学固定剂例如Bouin，s固定剂和Helly，s固定剂(见例如Humason(1967)^wi'mfl/TYsswe7Vc/im'《Mes(W.H，FreemanandCo.))可通过例如喷洒、雾化、橄粉末、散播、包復或倾倒、引入土壤内或土壤上、引入灌溉水中、通过种子处理或一般使用或在病原体已经开始出现或在病原体出现之前作为保护性措施进行撒粉末，将本发明的抗真菌组合物用于植物病原体的环境.例如，可将本发明的抗真菌蛋白和/或经转化的微生物与谷物混合以在储存期间保护谷物.一般而言，在植物生长的早期实现对病原体的良好控制是重要的，因为这是植物会被最严重伤害的时期.如果认为是必须的，本发明的组合物可方便地含有杀虫剂.组合物可以以栽体和本发明的杆菌菌抹或转化微生物的死细胞的組合物的粒剂形式在种植时直接使用到土壤上.另一具体实施方式是组合物的粒刑形式，该组合物含有农用化学品例如除草剂、杀虫剂、肥料、惰性栽体和本发明的杆菌菌株或转化微生物的死细胞，本发明的组合物在保护植物、种子和植物产品中以各种方式发挥用途.例如，该组合物可被用于下述方法中，所述方法包括通过一定程序将有效量的抗真菌组合物放置在病原体的环境中，该程序选自喷洒、撒粉末、广播或种子包復(coating),在植物繁殖材料(果实、块茎、辟茎、球茎、谷、种子)特别是种子被作为商业产品售出之前，其通常经过保护性包4L处理，该包覆包括除草刑、杀虫刑、杀真菌刑、杀菌刑、杀线虫刑、软体动物杀灭刑，或若干这些制剂的混合物，如果需要，还进一步含有栽体、表面活性刑或制剂领域中惯常使用的促进应用的佐刑，从而针对由真菌病原体造成的损害提供保护.为了处理种子，保护性包覆可通过液体制刑渗透入块茎或谷物用于种子，或通过使用组合的湿试剂或干试剂包復种子而用于种子.此外，在特定情况下，用于植物的其它方法是可能的，例如针对芽或果实的处理.包含下述DNA分子的本发明的植物种子可使用种子保护性包復加以处理，所述DNA分子包含编码本发明的抗真菌多肽的核苷酸序列，所述包復包含种子处理化合物，例如克菌丹(captan)、萎锈灵(carboxin)、福美双(thiram)、methalaxyl、虫螨裤(pirimiphos-methyl)和其它通常用于种子处理的化合物.可替换地，本发明的种子包含种子保护性包覆，所述包覆包含本发明的抗真菌组合物，所述包菝被单独使用或与通常用于种子处理的种子保护性包覆之一组合使用.本发明的抗真菌多肽可被用于任何应用，包括包復表面以靶向微生物.在该方式中，靶向微生物包括人病原体或微生物.可用本发明的抗真菌多肽包復的表面包括毯子和无菌医疗设备.结合了本发明多肽的聚合物可被用于包覆表面.将具有抗微生物性质的组合物与聚合物结合的方法是本领域已知的.见美国专利号5,847,047,该专利通过引用并入本文.具体实施方式的方法可对多种植物真菌病原体有效，例如但不限jF附a/7."附gram//ieariim、F"s肌'"/w狄yspor"m和Fm做/7'"附ver,/ci'战oiVtes,主要农作物的特异性病原体包括大豆:i^^o^似/^/"flsCa附'、5We/v"/HVisc/ewrt'or"m、F"sCn附ojc"/wr"附、Z)i'flpo/t/re/^aseo/(rMmvar.s咖e(/^o附o/w/s卯乂a、D一or狄e/7/r似e0/or謂var.fni/ic(i《iim、Coo^esporflcaswco/a、iyep似ri'fl^i[yci'/ies、iV^Z/oWi.c^a卯力'cdJto7ia〃.afl"e/7i幽、尸jeM^omo/ias砂"7i^iep.v.g/戸Vieii、se/m7e""/w、尸A/fl/opAo/Yig/"eg她、G/o/e/*e//a妙c,V1e51、i^Ao/wompac^y/"/t/z,'、i^^/w'w附fltpAfl/MVfer附artim、i^MiViiMM&f'附Mm、i^^Af'"/nde6a/ja/tMm、Fiija〃'n/wf(/a/tf';油菜J/6wgocaw必V/a、J/te/7ia"'fl6ra孤'c(ze、l印^p/tae"'a附acw/a附、及/t/席似附VisCa"/、5WerW"/asc/erW/on/附、聊co印/rfle/W/a6mwi'c/co/a、/^A/"附m似附m附、尸e/Ymos/wrapa/uw',/ca、/^a/7'wmmsewm、jfterwar/aoto7ta似；紫花苜a/7/r朋fV/e/7na似m、尸/r，鄉似/rorflt附ega5pef/wa、i^rowas/w/Yi加ybWom附、尸/ro附fl/nerf/cflgiVi/svar.附e必ca^m's、Ce/"c呻ora附e必cagf'/i/s、狄"/wm附、Ferft'c〃/i'"附"/6o-"加附、A!ia/i狄o/rKmfl5ca附pe自'sp.v.60^3^wim、I^p似"/c/^7awerfi'cagi7ii.s;小麦:Psenrfomoitas砂"'wgaep.v.fl^/to'e附、t/rocj幼's绍ro/;戸'、ATfl/i,Ao/Mowascfl/npeWr/sp.v.的/is7"ce/m1、i^ewrfo附owaysyriTigaep.v.s戸Vigfle、J/te/TwiWfla/《e/7ta似、gra附/"i'sf.sp.fr射c/、尸MCci./w'agra/rn'm'sf.sp,"加"'、尸"cc/附'fl/"eco"必似f.sp.W"ci'、尸"c"."iViW,/iyirim's、/^ewOjpA0/"fl,/77/ciVepe/i似、5^p似"'fl朋rfoni/M、5^or/a加'"c/、iS印tor/aave/iae、尸se"rfocerc呻ore〃aAer/w^7'cAw'flfey、及A/zo"cm/aso/flwi'、i/'zo"o/ii'acerea/i's、Ga战ma/t朋mj;cesgrfl附iVii'svar.、/^A/wmapAamV/er附d似m、JP，Z/i/m附"/rAe/io附a/td、i^^/t/mu/n'mw附、丑(po/ariiS0ro/ri7nVWfl、C/flv/，s/mrpMrea、7Y〃e"aW"ci'、7>7/幼'"/aeWs、C/幼7agoWf/c/、77//幼Vxg/Yi/w/co/a、/^f/w'MmapAa"fV/ermaffim,向曰葵:7Vfls附o/;orflAa/Weof//、j/,e/*fl".a/re/iVm狄z'、/4to*"flWaziViwi'ae、5W;y他"Vierea、/^o附amac(/own/di'/、3fac/Y^/rowiViflp/rfl^eo/iVifl、五/jw^/je"'c/wraceflrii附、及/i&0/7Kso;yziie、及Af'zo/7MSarrA&MS、及/t/zo/7MsWo/owiyi/*、P"cci7n'flAeZ/aw^ti'、Fe/ti'ci7ftVi/mda/t//ae、J5"nWwiVicdrCov0rM附pv.cflt/v似vo/vi、/rflgfl/wgort&;玉米0//"WcA"/wg/Yi/M/"/cd/fl、F"sfl"'"/wveW"7/iWrfesvar.s<i6g/{i《iVia/is、五nvi'附Vistewflr说、Kve/t/ci7/iVw'to、、/^/r/ii附iVreg"/fl/^、/^狄i'騰rfe6fl/ya朋附、/^*'謂gm附/m.co/a、i^to/wsp/e/i^附、/^to附n/Wm画、(1/7/^/{{7^/771似拊、^45/^/^///"5/avMS、B^w/ar&ma，d/s0、TfCVcAWo6(/s/r"ero5/wp/rs^、/^//w7i狄呻or/M附ca由w繊I、II&IIIfC"oc緒o6o/iwc/i由/iMw)、五xsew/w7"附Zm/t/cm附I、II&III、/fe//w/"^tos/wr/mpe必cW/fl似m、/^S0齡脚may他、i^〃o幼'c似may船、Ka6a"W/a附fl^rf/s、卵rg似、C/幼7ago附ay他、尸nc"'m'a卯/^/'、尸"c"ViiVi/w(y卯ra、MflcropAowi'/ia/^asedVw、尸em."7/i'n/nftxaWcw附、iWg/Yw/wao/^zae、C/arfos/w"'"附/re由rn附、C"rv/a"'fl/wwafa、Cwrvn/(iri'fliTtae《Ka"s、C"rvw/a"'flpa/tescews,C7av/6a"erm/c/r/gawe附esubsp."e6ra由"se、7WcAorfermflwWrfe、C7謂.c，卵rgW、i^ewrf纖cmasavewae、JS"rH7'mVicA/ys誠/te/w'pv.卿、E簡'/n'acctrotovom、Co/7t湘wi1■sp/rop/as/Mil、ZW/;/o必fl附acros/wm、5We考緣ora/nflc/vspora、flcre卿w/"m，高梁:Jxyero緒"m似rc/c"附、C.训6〃fte0/M附、Oraw/wrasorg/'、(7/0eocerc0印oni卵rgW、Jscoc/^aw/^/fi7ia、尸senrf簡owas砂"Vigaep.v.s戶Vigflfe、Xfl/i^ro/iu"flsca附peW"'sp.v.Ao/c/co/a、/^aseo/i7ta、.iVrco/ii'fl"'r"Vifl似、F"sfl〃'm附ver"W肌o,'to、/i/te/7tfl"Via&er朋似、丑—/"r/ss0/*g/w'co/a、/^/附!>1狄呻0">|附卵rgA/co/a、Oirv/a"'aa/6oprmWaw^)、及a附u/一0,a卯rg/t/、及a附n/f'印ora卯/^/ri'co/a、卯,a"f'、y4cremom'"m、5Wco/;似Atf"a附acms/wra、冠词"一"("a"和"an")在此被用于指一或多于一个(即至少一个)的该冠词的语法对象.举例而言，"一种元件"表示一种或多种元件.单位、前缀和符号以它们的SI可接受形式表示.除非另外说明，核酸序列从左向右以5，至3，方向书写；氨基酸序列从左向右以分别从氨基至羧基的方向书写.数字范围包含了定义范围的数字.氨基酸在此可通过由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号或它们的普遍已知的三字母符号表示.同样地，核苷酸可通过它们的普遍接受的单字母代码表示.以上定义的术语通过参考整个说明书可以更充分地被限定.应当理解，本文描述的实施例和具体实施方式仅用于阐述性目的，依据它们的各种修改或变化将被提示给本领域的技术人员，且应被包含在本申请的精神和范围内以及所附权利要求书的范围内.为一切目的而言，本文引用的所有的公开物、专利和专利申请通过引用并入本文.实验实施例l:抗真苗生物实验在大肠杆菌中重组表达若干多肽，随后在抗真菌生物实验中进行筛选.生物功能性多肽的表达包括制备融合蛋白，所述融合蛋白包括麦芽糖结合蛋白(MBP)和感兴趣的多肽，随后将融合蛋白在蛋白酶识别序列处酶切以释放出感兴趣的肽.编码感兴趣的多肽的DNA在大肠杆菌(五.co/i')表达栽体pMAL中与MelE基因的C末端融合(NewEnglandBiolabs;见GuanWa/,，(7麼67:21-30(1987》和MainaWaA，74:365-73(1988))。编码蛋白酶因子Xa(FactorXa)或基因酶I(GenenaseI)的裂解位点的序列被结合进MBP和感兴趣的多肽的基因之间，组氨酸标签也可添加在MBP的N-末端，将构建的质粒栽体转化进大肠杆菌XL-1Blue细胞，在含有50ig/ral羧苄青審素的2YT培养基中培养转化物，至细胞密度O.D.卿-0,6-0.9,通过向培养基中添加IPTG至终浓度1mM诱导融合蛋白的表达，在收获前将细胞培养4-16小时至饱和.通过离心收获细胞，随后用B-PER试刑(PierceChemicals,Rockford，IL)裂解细胞以获得可溶蛋白片段，通过将细胞裂解液与Ni-NTA琼脂糖树脂一起温育20分钟至1小时，利用组氨酸标签将融合蛋白从细胞裂解液中纯化出来.用Tris緩冲液洗涤树脂以去除所有未结合的蛋白.2-巯基乙醇(10mM)被包含在裂解和洗涤緩冲液中，以允许蛋白的部分重折叠.使用含有20-40mM组氨酸的緩冲液洗脱结合的融合蛋白.为了释放感兴趣的多肽，将纯化的融合蛋白与因子Xa或基因酶I(室温，8-24小时)一同温育.随后将切下的蛋白样品用于抗真菌活性实验中.在30"C培养箱中，在马铃茅右旋葡萄糖琼脂(PDA)平板上培养和维持所有的真菌菌株.这些平板被放置在更小的二级容器中(每种真菌菌林)，用湿润的纸巾保持高湿度.在培养大约2周后，将孢子收获在1/4强度(aquarterstrenghth)的马铃薯右旋葡萄糖培养液(PDB)中，使用血球计对孢子计数且随后按小等份储存在-80TC.将冷冻孢子在1/4强度的PDB中稀释至工作浓度(对各真菌菌林按经验加以确定)，且将50Ml(每孔)加入无菌、平底96孔实验平板中.将实验平板在室温放置于湿润的盒子中5-7小时，以允许孢子萌发.随后将纯化的、经蛋白酶切割的融合蛋白样品的梯度稀释物以50Ml的体积加入实验平板中，每孔的最终实验体积为100Ml.令实验平板在湿润的盒子中在30TC温育过夜.在18至48小时后(取决于真菌菌株)对抗真菌活性计分，表l展示了了鉴定为对列举的真菌病原体中至少一种具有活性的多肽.表l<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>表2得分分析(HitCharacterization).使用经纯化及定量的本发明的多肽从刑量-应答实验中确定的IC50(Mg/mL),<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>可注意到，Dfn37、Dfn49和Dfn56每种都具有对广泛的真菌病原体强有力的抗真菌活性，如在本公开物中早先讨论的，由于植物疾病起的亊实，需要广谦抗性有效地调节疾病控制.实施例2:转基因玉米植物的转化和再生用含有下述核苷酸序列的质粒轰击来自温室供体植物的未成熟玉米胚芽，该核苷酸序列编码SEQIDNO:l中提供的抗真菌多肽，该序列与在玉米植物细胞中驱动表达的启动子和选摔性标记(例如选择性标记基因PAT(WohUebenaa/.(1988)70:25-37),该基因赋予植物对除草刑双丙氛磷(Bialaphos)的抗性)可搮作性连接.可替换地，在另外的质粒上提供选择性标记基因.转化如下进行.培养基配方按以下说明.靶组织的制备将穗去壳，在30%次氯酸钠漂白刑外加0.5%微去垢刑中表面灭菌20分钟，用无菌水漂洗两次，切割未成熟胚芽，将胚轴一側向下(盾片一側向上)放置，每盘25个胚芽，在560Y培养基上放里4小时，然后在2.5cm的靶区域内排列，为轰击做准备，DNA的制备制备含有下述核苷酸序列的质粒栽体，所迷核苷酸序列编码SEQIDNO:1中提供的抗真菌多肽，其与能在玉米细胞中驱动表达的启动子可採作性连接.使用如下的CaCl2沉淀步稞将该质粒DNA和含有选择性标记的质粒DNA(例如PAT)沉淀至1.1pm(平均直径)的钨沉淀物上100ML水中制备好的钨粒子10iiL(lMg)TrisEDTA緩冲液中的DNA(lpg总的DNA)100ML2.5MCaCl210pLO.lM亚精胺将各试刑顺序加入钨粒子悬浮液中，同时保持在多管振荡器上.对最终的混合物简单地进行超声处理，令混合物在恒定的振荡下放置IO分钟.在沉淀阶段后，将管筒单离心，去除液体，用500mL100%乙醇洗涤，并离心30秒，再一次将液体去除，并将10SmL100。/o乙醇加入最终的鵠粒子沉淀物中.为进行粒子枪轰击，对钨/DNA潁粒进行简单的超声处理，并取IOmL点样于各大栽体(macrocarrier)的中心且允许其在轰击前干燥大约2分钟。粒子枪处理在粒子枪弁HE34-1或弁HE34-2中以#4水平轰击样品平板，所有样品在650PSI下接受单次轰击，从每管经制备的顆粒/DNA中取出总计IO小等份.随后的处理在轰击后，将胚芽放置在560Y培养基上2天，随后转移至含有3mg/mL双丙氨裤的560R选择培养基中，且每2周进行亚培养(subculture).在大约10周的选择后，将选择抗性的愈伤组织克隆转移至288J培养基上以起始植物再生.在体细胞胚芽成熟(2-4周)后，将发育良好的体细胞胚芽转移至用于萌发的培养基上，转移至光照培养箱中.在大约7-10天后，将发育中的植物苗转移至管中的272V不含激素的培养基中，放置7-10天，直至苗充分形成.随后将植物转移插入含有盆栽土的平板(等同于2.5"盆)并在生长箱中生长1周，随后在温室中再生长l-2周，随后被转移至经典的600罐(pot)(1.6加仑)中，培养至成熟.对植物的真菌抗性进行监控和计分.轰击和培养用培养基轰击培养基(560Y)含有4.0g/LN6基础盐(basalsalts)(SIGMAC-1416K1.0mL/LEriksson，s维生素混合物(1000xSIGMA-1511)、0.5mg/L维生素Bl、120.0g/L蔗糖、1.0mg/L2，4-D和2.88g/LL-脯氨酸(在用KOH调节至pH5.8后用D-IH20调节体积)；2.0g/L水晶洋菜(Gelrite)(在用D-IH20调节体积后加入)；以及8.5mg/L硝酸银(在将培养基灭菌并冷却至室温后加入).选择培养基(560R)含有4.0g/LN6基础盐(SIGMAC-1416)、1.0mL/LEriksson，s维生素混合物(IOOOxSIGMA-1511)、0.5mg/L维生素Bl、30.0g/L蔗糖、和2.0mg/L2，4-D(在用KOH调节至pH5.8后用D-IHzO调节体积)；3.0g/L水晶洋菜(Gelrite)(在用D-IH20调节体积后加入)；以及0.85mg/L硝酸银和3.0mg/L双丙氨磷(均在将培养基灭菌并冷却至室温后加入)，植物再生培养基(288J)包含4.3g/LMS盐(GIBCO11117-074)、5.0mL/LMS维生素储备液(0.100g烟酸、0.02g/L维生素Bl、0.10g/L维生素B6、和0.40g/L甘氨酸，用处理后(polished)的D-IH20调节体积)(MurashigeandSkoog(1962)PA"/0/.P/a拟.15:473)、100mg/L肌醇、0.5mg/L玉米素、60g/L蔗糖和1.0mL/L的0.1mM脱落酸(在调节至pH5.6后用处理后的D-IH20调节体积)；3.0g/L水晶洋菜(在用D-1调节体积后加入)；以及1.0mg/L弓l咮乙酸和3.0mg/L双丙氨磷(在将培养基灭菌并冷却至60TC后加入).不含激素的培养基(272V)包含4.3g/LMS盐(GIBCO11117-074)、5.0mL/LMS維生素(0.100g烟酸、0.02g/L维生素Bl、0.10g/L維生素B6、和0.40g/L甘氨酸，用处理后的D-IH20调节体积)、0.1g/L肌醇、和40.0g/L蔗糖(在调节至pH5.6后用处理后的D-IHzO调节体积)；以及6g/L细菌琼脂(在用处理后的D-IH20调节体积后加入)，灭菌并冷却至60实施例3:农杆菌-介导的玉米转化和转基因植物的再生为了用含有SEQIDNO:1的多核苷酸构建体进行农杆菌64gw6fl"eri'"m,介导的玉米转化，使用Zhao的方法(美国专利号5,981,840,和PCT专利公开W098/32326;这些文献通过引用并入本文).简言之，从玉米中分离出未成熟的胚芽，将胚芽与农杆菌64g,o6acte/7'"wJ的悬浮液接触，其中该细菌能够将多核苷酸构建体转移至至少一个未成熟胚芽的至少一个细胞(步骤l:感染步骤).在该步骤中，将未成熟的胚芽浸入农杆菌6igw6a"er,'"m,悬浮液中以起始接种.将胚芽与农杆菌64g,o^icter/"附7共同培养一段时间(步骤2:共培养步骤).在感染步骤后，将未成熟的胚芽在固体培养基上培养.在该共培养步骤后，进行可选的"静止"步骤，在该静止步骤中，在至少一种抗生素的存在下培养胚芽，已知该抗生素在不加入植物转化林的选择性试刑时能抑制农杆菌6^,o^c/e,/";,的生长(步驟3:休眠步骤).在具有抗生素但没有选择性试剂的固体培养基上培养未成熟胚芽以去除农杆菌64gra^i"eri'"w>>，并为受感染细胞提供静止期.此后，在含有选择性试剂的培养基上培养经接种的胚芽，生长中的经转化愈伤组织被收集(步骤4:选择步骤)，在具有选择性试剂的固体培养基上培养未成熟的胚芽，造成经转化细胞的选摔性生长.愈伤组织随后再生成为植物(步骤5:再生步稞)，且在固体培养基上对在选择性培养基上生长的愈伤组织加以培养，以再生植物.实施例4:体细胞大豆胚芽培养物的转化和大豆植物的再生以下储备液和培养基被用于大豆植物的转化和再生储备液碟酸盐100x储备液37.0gMgS04.7H20,1.69gMnS04.H20，0.86gZnS04.7H20，0駕5gCuS04.5H20.离化物100x储备液30.0gCaCl2.2H20，0.083gKI，0.0025gCoCl2.6H20，P，B，MolOOx储备液18.5gKH2P04，0.62gH3B03，0.025gNa2Mo04.2H20FeEDTA100x储备液3.724gNa2EDTA，2.784gFeS04.7H20,2，4-D储备液10mg/mL.维生素B51000x储备液10.0g肌醇，O.lOg烟酸，0.10g维生素B6，1g疏胺.培养基(每升)SB196:以上各储备液各10mL，1mLB5维生素储备液，0.463g(NH4)2S04，2.83gKN03，1mL2，4-D储备液，1g天冬酜胺，10g蔗糖，pH5.7.SB103:1pk.Murashige&Skoog盐混合物，1mLB5维生素储备液，750mgMgCl2六水合物，60g麦芽糖，2g双丙氨磷，pH5.7。SB166:每升补充了5g活性炭的SB103.SB71-4:Gamborg，sB5盐(Gibco-BRL目录号21153-028),1mLB5维生素储备液，30g蔗糖，5gTC琼脂，pH5.7.在旋转摇床(150rpm)上于281C将大豆胚性悬浮培养物保持在35mL液体培养基(SB196)中，用荧光灯提供16小时白天/8小时夜晚循环.通过将大约35mg组织接种到35mL新鲜的液体培养基中，每两周将培养物进行亚培养.通过使用DuPontBiolisticPDS1000/He设备进行粒子枪轰击的方法(见KleinWfl/.(1987)7Vfl似re327:70-73)对大豆胚性悬浮培养物进行转化.在粒子枪轰击步骤中，可能可以使用纯化的l)整个质粒DNA或2)仅含有感兴趣的重组DNA表达盒的DNA片段.对于每八次轰击转化而言，制备30inl下述悬浮液，该悬浮液含有每DNA片段的碱基对1至90皮克(pg)的DNA片段.用于表达抗真菌基因的重組DNA质粒或片段在与选捧性标记基因分离的重组DNA质粒或片段上.按下文所述将重组DNA质粒或片段共沉淀于金粒子上.将悬浮液中的DNA加到50mL20-60mg/mL0.6m加金粒子悬浮液中，随后与50pLCaCl2(2.5M)和20mL亚精胺(O.lM)混合.将混合物脉冲振荡5次，在微离心机中离心10秒，并去除上清液.随后用150mL100%乙醇将DNA包夜的粒子洗涤一次，再次脉冲振荡并在微离心机中离心，且重悬在85yL无水乙醇中。随后将5mLDNA包度的金粒子加样至各个大栽体盘中.将大约150至250mg的2周龄悬浮培养物置于空的60mmx15mm培养皿中，使用移液管将残留液体从组织上去除.将组织放在留置筛(retainingscreen)3.5英寸处且对各组织平板轰击一次.膜破裂压力设定为650psi，箱体被抽真空至-28英寸Hg.轰击18个平板，轰击后，来自各平板的组织被分进两个烧瓶中，放回到液体培养基中，如上文所述进行培养.轰击后七天，液体培养基与新鲜的SB196培养基交换，该SB196培养基中根据转化中使用的选择性标记基罔的不同补充有50mg/mL潮審素或100ng/mL氯磺隆.选择性培养基每周或每两周被更新，轰击后7周，观察到从未经转化的坏死胚性细胞簇中生长出绿色的经转化的組织.分离出的绿色组织被取走，接种至各烧瓶中以生成新的、无性繁殖的转化胚性悬浮培养物.因此，各个新的林系被作为独立的转化亊件加以处理，这些悬浮液随后可通过亚培养得以维持为在未成熟发育阶段聚集的胚芽的悬浮液，或通过各体细胞胚芽的成熟和萌发被再生为整林植物，将经转化的胚性簇从液体培养基中移出，在不含有激素或抗生素的固体琼脂培养基(SB166)中放置一周.在261C培养胚芽，使用混合荧光和白炽光以16小时白天8小时黑夜的时间安排.一周后，将培养物随后转移至SB103培养基中，在相同的培养条件下保持额外3周，在从液体培养物转移至固体培养基上前，针对抗真菌基因的存在，用PCR或Southern分析对来自选定抹系的组织进行分析.体细胞胚芽在4周后变得适于萌发，随后从成熟培养基上将其移开，在空培养皿中干燥l至5天.随后将干燥的胚芽种植在SB71-4培养基中，在该培养基中，胚芽被允许在上述的相同的光照和发芽条件下萌发，将萌发的胚芽转移至无菌土中并培养至成熟.在说明书中提及的所有公开物和专利申请对本发明所属的
技术领域：
的技术人员的水平是有说明性的.所有的公开物和专利申请通过引用并入本文，与各公开物或专利申请被特别地、各个地通过引用并入本文一样.尽管为了清楚理解的目的，通过阐述和实施例对前文所述的发明进行了一些细节描述，但某些改变和变化可在所附权利要求书的范围内得到实现将是显而易见的.权利要求1、一种转基因植物，该植物具有稳定结合进其基罔组的多核苷酸，所迷多核苷酸编码包含与SEQIDNOs:1，2，4，5，7或8至少95%相同的氨基酸序列的多肽，其中所述植物对至少一种植物致病真菌具有提高的病原体抗性.2、根据权利要求l中所述的植物，其中所述植物是单子叶植物.3、根据权利要求l中所述的植物，其中所述植物是双子叶植物.4、根据权利要求l中所述的植物的经转化种子，其中所迷种子包含所述氨基酸序列.5、根据权利要求l中所述的植物，其中所述多核苷酸与能在所述植物的细胞中驱动表达的启动子可採作性连接，其中所迷启动子选自由以下启动子组成的组a)组成型启动子；b)组织特异性启动子；c)根特异性启动子；d)可诱导启动子；和e)病原体诱导启动子.6、根据权利要求l中所述的植物，其中所述多肽包含信号序列.7、根据权利要求l中所述的植物，其中所述多肽缺乏信号序列.8、根据权利要求6中所述的植物，其中所述信号序列是分泌信号序列.9、根据权利要求6中所述的植物，其中所述信号序列是细胞器信号序列.10、根据权利要求9中所迷的植物，其中所迷信号序列是质体信号序列.11、根据权利要求1中所述的植物，其中所述氨基酸序列选自SEQIDNOs:1，2，4，5，7和8示出的序列构成的序列组.12、一种提高植物对真菌病原体抗性的方法，所述方法包含(a)用至少一种表达盒稳定转化植物细胞，所述表达盒包含与能在所述植物的细胞中驱动表达的启动子可搮作性连接的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码与SEQIDNOs:1，2，4，5，7或8具有至少95%序列一致性的多肽，并且进一步地，其中所述多肽对至少一种植物真菌病原体具有活性；以及(b)从所述的植物细胞再生转化的植物，其中在所述植物中，对所述真菌病原体的抗性水平较之没有包含所迷表达盒的植物被提高.13、根据权利要求12中所述的方法，其中所述真菌是十字花科黑斑病菌(Jto7ifl〃'a6rajs/ci.co/a).14、根据权利要求12中所迷的方法，其中所述真菌是轮状镰刀菌(Fmw/m附veWa'肠/to)。15、根据权利要求12中所迷的方法，其中所述真菌是尖孢镰刀菌16、根据权利要求12中所述的方法，其中所迷真菌是黄萎病菌(KerftW//i'K/n).17、根据权利要求12中所述的方法，其中所迷真菌是灰霉病菌(5CWsci7ierea).18、根据权利要求12中所述的方法，其中所述真菌是禾生炭疽菌(C^//WC/7'c/rMWgm/w/rt/co/")。19、根据权利要求2中所述的方法，其中所述真菌是玉米色二孢(Z)f》/o必amay船).20、根据权利要求12中所述的方法，其中所述真菌是禾谷镰刀菌(尸Msa/7'wwgra/m'/tearn附)，21、根据权利要求12中所述的方法，其中所述核苷酸序列编码下述多肽，该多肽选自在SEQIDNOs:1，2，4，5，7和8所示的多肽序列构成的组.22、根据权利要求12中所述的方法，其中所迷启动子选自由以下启动子组成的组a)组成型启动子；b)组织特异性启动子；c)根特异性启动子；d)可诱导启动子；和e)病原体诱导启动子.23、根据权利要求12中所述的方法，其中所述多肽包含信号序列.24、根据权利要求12中所迷的方法，其中所述多肽缺乏信号序列25、根据权利要求23中所述的方法，其中所述信号序列是分泌信号序列.26、根据权利要求23中所述的方法，其中所述信号序列是细胞器信号序列，27、根据权利要求23中所述的方法，其中所述信号序列是质体信号序列.28、一种提高植物对病原体抗性的方法，所述方法包含(a)用至少一种表达盒稳定转化植物细胞，所述表达盒包含与能在所述植物的细胞中驱动表达的启动子可搮作性连接的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQIDNOs:3，6或9具有至少95%序列一致性，并且进一步地，其中所述核苷酸序列编码对至少一种植物真菌病原体具有活性的多肽；以及(b)从所述的植物细胞再生转化的植物，其中，在所述植物中，对所述真菌病原体的抗性水平较之没有包含所述表达盒的植物被提高.29、根据权利要求28中所述的方法，其中所述启动子选自由以下启动子组成的组a)组成型启动子；b)组织特异性启动子；c)根特异性启动子；d)可诱导启动子；和e)病原体诱导启动子。30、根据权利要求28中所述的方法，其中所述多肽包含信号序列.31、根据权利要求28中所述的方法，其中所述多肽缺乏信号序列32、根据权利要求30中所迷的方法，其中所迷信号序列是分泌信号序列.33、根据权利要求30中所述的方法，其中所述信号序列是细胞器信号序列.34、根据权利要求30中所述的方法，其中所述信号序列是质体信号序列.35、根据权利要求28中所述的方法，其中所述核苷酸序列选自SEQIDNOs:3，6和9示出的核苷酸序列构成的组.36、一种转基因植物，该植物具有稳定并入其基因组的、与SEQIDNOs:3，6或9至少95%相同的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列编码对植物真苗病原体具有活性的多肽，进一步地，其中所述植物对至少一种植物致病真菌具有提高的真菌病原体抗性.37、根据权利要求36中所述的植物，其中所述植物是单子叶植物.38、根据权利要求36中所述的植物，其中所述植物是双子叶植物.39、根据权利要求36中所述的植物的经转化种子，其中所迷种子包含所述多核苷酸序列.40、根据权利要求36中所述的植物，其中所述多核苷酸与能在所述植物细胞中驱动表达的启动子可操作性连接，其中所述启动子选自由以下启动子組成的组a)組成型启动子；b)组织特异性启动子；c)根特异性启动子；d)可诱导启动子；和e)病原体诱导启动子，41、根据权利要求36中所述的植物，其中所述多肽包含信号序列.42、根据权利要求36中所述的植物，其中所述多肽缺乏信号序列.43、根据权利要求41中所述的植物，其中所述信号序列是分泌信号序列.44、根据权利要求41中所述的植物，其中所迷信号序列是细胞器信号序列.45、根据权利要求41中所述的植物，其中所述信号序列是质体信号序列.46、根据权利要求36中所述的植物，其中所述多核苷酸序列选自SEQIDNO:3，6和9中示出的多核苷酸序列所构成的組.全文摘要本发明提供了保护植物免受植物致病真菌侵害的方法。本发明还提供了使用本文公开的核苷酸序列提高植物真菌病原体抗性的方法。该方法包含将下述表达盒引入植物，所述表达盒包含与核苷酸序列可操作性连接的启动子，所述核苷酸序列编码本发明的抗真菌多肽。本发明还公开了包含下述核苷酸序列的经转化的植物、植物细胞、种子和微生物，所述核苷酸编码具体实施方式的抗真菌多肽或其变体或片段。文档编号C07K14/415GK101124323SQ200580029228公开日2008年2月13日申请日期2005年6月30日优先权日2004年6月30日发明者H·阿利,M·L·穆勒,M·拉斯纳,R·J·基南,毋谷穗申请人:先锋高级育种国际公司