用于从固相结合材料释放核酸的组合物和方法

专利名称：用于从固相结合材料释放核酸的组合物和方法
技术领域：
本发明涉及新型组合物在释放结合在固相材料上的核酸中的应用，该固相材料用于结合、分离或纯化核酸。
背景技术：
分子诊断学和分子生物学中的现代技术(包括反转录、克隆、限制性分析、扩增和序列分析)，要求在这些技术中使用的核酸基本上不含污染物和干扰物质。不期望的污染物包括大分子物质例如酶、其它类型的蛋白质、多糖、多核苷酸、寡核苷酸、核苷酸、脂类、低分子量酶抑制剂、或非目标核酸、酶辅因子、盐、离液剂、染料、金属盐、缓冲盐和有机溶剂。
获得用于分子生物学应用的基本上无污染物的目标核酸是困难的，原因在于目标核酸被发现于其中的复杂样品基质。此类样品包括例如来自组织的细胞、来自体液的细胞、血液、培养物中的细菌细胞、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、或从目标核酸扩增得到的溶液。样品基质经常含有显著量的污染物，在感兴趣的核酸被用于分子生物学或诊断技术之前所述污染物必须从所述核酸去除。
从上述细胞和组织产生的混合物中分离目标核酸的常规技术，需要使用有害化学品例如酚、氯仿以及溴化乙锭。酚/氯仿提取被用于此类步骤以从目标核酸和多种污染物的混合物中抽提掉污染物。可选地，根据本领域中熟知的方法，使用氯化铯-溴化乙锭梯度。参见例如Molecular Cloning，由Sambrook等编著(1989)，Cold Spring Harbor Press，pp.1.42-1.50。通常，在后面的方法之后，通过将乙醇或2-丙醇加入水相以沉淀核酸来沉淀保留在抽提的水相中的核酸物质。通常，通过离心从溶液中移出沉淀物，并且在水或缓冲溶液中重悬以作进一步使用之前，允许干燥所得到的沉淀物小球。
已经开发出更简单和更快的方法，其采用各种类型的固相，以从细胞裂解液或核酸和污染物的其它混合物中分离核酸。此类固相包括各种形状和形式例如纤维的层析树脂、聚合物和二氧化硅或玻璃基物质、过滤器以及包被的容器。当为小颗粒的形式时，有时提供磁芯，以帮助实现分离。
在分离核酸中使用的一种类型的固相包括设计用于高效液相色谱(HPLC)的多孔硅胶颗粒。用阴离子交换剂对多孔硅胶颗粒的表面进行官能化，以在某一盐和pH条件下与质粒DNA交换。参见，例如美国专利4,699,717和5,057,426。在含有高浓度盐的水溶液中洗脱结合到这些固相材料的质粒DNA。从那里洗脱的核酸溶液在其被用于下游过程之前必须被进一步处理，以除去盐。
其它硅基固相材料包括可控孔度玻璃(CPG)、包埋有二氧化硅颗粒的滤器、硅胶颗粒、硅藻土、玻璃纤维或上述的混合物。在存在离液剂例如碘化钠(NaI)、硫氰酸胍或氯化胍的情况下，在含有核酸的样品中，每一硅基固相材料可逆地结合核酸。此类固相结合并保持核酸物质，同时该固相经受离心或真空过滤以从残余样品成分中分离出基质和结合于其上的核酸物质。然后，通过用水或低盐洗脱缓冲液洗脱，从固相释放出该核酸物质。商业上可得的用于核酸分离的硅基固相材料包括例如WizardTMDNA纯化系统产品(Promega，Madison，WI)、QiaPrepTMDNA分离系统(Qiagen，Santa Clarita，CA)、High Pure(Roche)以及GFXMicro Plasmid Kit(Amersham)。
颗粒形式的聚合树脂也被广泛用于核酸的分离和纯化。羧酸盐改性的聚合颗粒(Bangs，Agencourt)是已知的。在欧洲专利申请公开第EP 1243694A1中公开了含有季铵首基(head group)的聚合物。该聚合物是具有共价连接的线型非交联聚合物的惰性载体颗粒。该类型的聚合固相一般是指触角树脂(tentacle resin)。线型聚合物掺入四烷基季铵基团。该烷基集团被指定为甲基或乙基基团(第4栏，第52-55行)。较长的烷基被认为是不期望的。
基于阴离子交换原理的其它用于结合核酸的固相材料目前正在使用中。这些包括具有DEAE首基(Qiagen)和二氧化硅-NucleoBond AX(BectonDickinson，Roche-Genopure)的硅基材料，这基于在EP0496822B1中描述的层析载体。具有聚合的三烷基铵基团的聚合物树脂被描述于EP 1243649(GeneScan)。用于DNA分离的羧基改性聚合物可以从众多的供应商获得。在高盐条件下核酸被吸引，而在低离子强度条件下核酸被释放。具有阳离子三甲胺外部的聚合微载体珠被描述在美国6,214,618中。该珠具有相对大的直径并且作为培养中细胞粘附和生长的支持物是有用的。
含有三丁基磷_(_，phosphonium)首基的聚合珠已经被描述用于三相体系中的相转移催化剂。由交联的聚苯乙烯制备该珠。(J.Chem.Soc.Perkin Trans.II，1827-1830，(1983))。具有通过亚烷基链和亚烷基醚链(alkylene ether chain)连接至交联的聚苯乙烯树脂的侧链三烷基磷_基的聚合物珠也已被描述(Tomoi，et al.，Makromolekulare Chemie，187(2)，357-65(1986)；Tomoi，et al.，Reactive Polymers，IonExchangers，Sorbents，3(4)，341-9(1985))。基于交联的聚苯乙烯树脂的混合季铵/磷_不溶性聚合物作为催化剂和抗微生物剂被公开(Davidescu，et al.，Chem.Bull.Techn.Univ.Timisoara，40(54)，63-72(1995)；Parvulescu，et al，.Reactive&FunctionalPolymers，33(2，3)，329-36(1997)。
磁响应性颗粒也已经被开发用作核酸分离中的固相。设计用于核酸分离的若干种不同类型的磁响应性颗粒在本领域中是已知的，并且可以从若干来源商业获得。可逆地直接结合核酸材料的磁性颗粒包括MagneSilTM颗粒(Promega)。也已知，磁性颗粒通过共价连接的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白可逆地结合mRNA，其中抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白具有用于与mRNA的聚腺苷酸尾杂交的连接的寡dT尾。
已知多种类型的磁响应性硅基颗粒被用作核酸结合分离法中的固相。一个这样的颗粒类型是磁响应性玻璃珠，优选具有受控孔尺寸的磁响应性玻璃珠，其作为Magnetic Porous Glass(MPG)颗粒可以从CPG，Inc.(Lincon Park，NJ)获得；或者在美国专利第4,395,271、4,233,169、或4,297,337号中描述的多孔磁玻璃颗粒。在核酸的结合和分离中有用的磁性颗粒的另一类型是通过将磁性材料掺入聚合的二氧化硅化合物基质中而产生的。(德国专利DE4307262A1)。包含包埋在具有季铵基的纤维素基质中的氧化铁纳米颗粒的磁颗粒由Cortex Biochem(San Leandro，CA)作为MagaCell-QTM商业化生产。
具有可诱导磁性性质的颗粒或珠包括小颗粒的过渡金属，例如铁、镍、铜、钴和锰，以形成金属氧化物，在磁体存在下可以使该金属氧化物具有暂时的磁性。这些颗粒被称为顺磁性的或超顺磁性的。为形成顺磁或超顺磁珠，已用在水中相对稳定的聚合物包被金属氧化物。美国专利4,554,088公开了顺磁颗粒，其包括被高分子硅烷包被包围的金属氧化物芯。美国专利5,356,713公开了可磁化的微球体，其包括被疏水乙烯基芳族单体外壳包围的可磁化颗粒芯。美国专利5,395,688公开了已经用混合的顺磁金属氧化物-聚合物层包被的聚合物芯。另一种方法采用聚合物芯以吸收金属氧化物，例如诸如在美国专利第4,774,265号中。包含用顺磁金属氧化物颗粒层包被的聚合芯颗粒的磁性颗粒被公开于美国专利5,091,206中。然后，用另外的聚合层进一步包被该颗粒，以保护金属氧化物层并提供反应性包被。美国专利5,866,099公开了在用于配位金属盐并俘获混合的金属氧化物颗粒的蛋白存在的情况下，通过两种金属盐的混合物共沉淀制备磁性颗粒。许多示例性金属盐对被描述。美国专利5,411,730描述了相似的方法，其中沉淀的混合的金属氧化物颗粒被俘获在葡聚糖——一种寡糖中。
用于不可逆地捕获DNA和RNA的氧化铝(氧化铝(aluminum oxide))颗粒被公开于美国专利6,291,166中。用于固相扩增法例如PCR的结合的核酸是可得的。
在含有高浓度盐的水溶液中洗脱结合到这些固相材料的DNA。从那里洗脱的核酸溶液在其可以被用在下游过程之前必须被进一步处理以除去盐。相反，通过用水或低盐洗脱缓冲液洗脱，从固相释放结合至硅基材料的核酸。美国专利5,792,651描述了用于核酸的色谱分离的组合物，其增强核酸在细胞中转染的能力。该组合物包括含有2-丙醇和任选地含有盐和缓冲液物质的水溶液。
据报道，又一种包括含有磁微粒芯的琼脂糖或纤维素颗粒的磁性固相材料在用含有高浓度盐和聚亚烷基二醇的组合物处理后结合并保持核酸(例如美国专利5,898,071，和PCT公开WO02066993)。随后，通过用水或低离子强度缓冲液处理释放核酸。
发明概述 本发明的目标是提供使用固相核酸结合材料和本发明的试剂组合物分离核酸的方法。本发明的另一个目标是提供用本发明的试剂组合物从固相材料结合和释放核酸的方法。
本发明的另一个目标是提供使用固相核酸结合材料、通过用本发明的试剂组合物释放结合的核酸而分离核酸的方法，所述本发明的试剂组合物含有碱性胺缓冲液和亲水性有机溶剂以及任选含有盐。
在本发明的另一个目标中，提供了用于从固相材料释放结合的核酸的试剂组合物。本发明的组合物起着从本可裂解固相材料和从其它常规固相材料释放或洗脱结合的核酸的作用，其中所述其它常规固相材料包括具有阳离子、阴离子或中性表面的那些材料。
发明详述定义 烷基——含有1-20个碳原子的支链、直链或环状烃基团，其可以用除了H以外的1个或多个取代基取代。本文中所使用的低级烷基是指那些含有高达8个碳的烷基基团。
芳烷基——用芳基取代的烷基基团。
芳基——含有1至5个碳环芳香环的含芳香环的基团，其可以用除了H以外的1个或多个取代基取代。
磁性颗粒——颗粒、微粒或珠，其对外部的磁场有响应。该颗粒本身可以是磁性的、顺磁性的或超顺磁性的。如当使用铁磁材料时，其可以被吸引到外部磁体或施用的磁场。颗粒可以具有固体芯部分，该固体芯部分是磁响应性的，并且被一层或多层非磁响应性层包围。可选地，磁响应性部分可以是周围的层或者可以是分散在非磁响应性芯内的颗粒。
寡聚物、寡核苷酸——如本文所使用的，将是指含有磷酸二酯核苷酸间键和5′-端单磷酸酯基团的化合物。核苷酸可以是正常发生的核糖核苷酸A、C、G和U或脱氧核糖核苷酸dA、dC、dG和dT。
多核苷酸——多核苷酸可以是DNA、RNA或合成的DNA类似物例如PNA。任何这三种类型的链组成的双链杂合子也可以在本术语的范围内。
引物——指用于定向连接位位点并且为起始连接过程所必需的寡核苷酸。引物的长度足以稳定地与模板杂交，并且代表模板中的独特序列。引物的长度通常为约15-30个碱基。含有可检测标记或允许固相捕获的标记的标记的引物在如本文中所使用的术语的范围内。
释放、洗脱——通过与溶液或组合物接触，除去结合至固相材料的表面或孔的大部分材料。
样品——含有或疑似含有核酸的流体。可以用在本发明的方法中的典型的样品包括体液，例如血液、血浆、血清、尿、精液、唾液、细胞裂解液、组织提取液和类似物。其它类型的样品包括溶剂、海水、工业水样、食物样品和环境样品例如土壤或水、植物材料、原核生物、真核生物来源的细胞、细菌、质粒和病毒。
固相材料——具有可以将核酸分子吸引至其上的表面的材料。材料可以是微粒、纤维、珠、膜以及其它支持物例如试管和微孔的形式。
取代的——是指用非氢原子置换基团上的至少一个氢原子。应该注意到的是，关于取代的基团，其意图是可以存在多点取代，除非明确另外指出。
模板、试验多核苷酸以及靶被互换使用，并且是指其长度将被复制的核酸。
通过各种技术，从不同的样品类型提取、分离并另外纯化核酸。这些技术的许多依赖于选择性吸附到对核酸具有一些亲和力的材料的表面上。在除去其它较弱结合的成分的洗涤步骤之后，用溶液处理固相，以除去或洗脱结合的核酸(多种核酸)。申请人已经开发出新型的试剂组合物，其可用于洗脱已结合在固相结合材料上的核酸。本组合物与之有用的固相结合材料包括常规的硅基材料，官能化二氧化硅——承载共价结合的表面官能团例如羧基、氨基和羟基，碳水化合物基材料和聚合材料以及下面和在申请人的共同未决美国申请序列第10/714,763和10/715,284号中描述的四元和三元_盐型材料，所述申请的公开内容被引入于此作为参考。
与本发明的组合物和方法一起使用的用于结合核酸的固相材料可以是颗粒、微粒、纤维、珠、膜以及其它支持物例如试管和微孔的形式。该材料进一步包括核酸结合表面，其允许捕获和结合不同长度的核酸分子。用表面不但指固相材料的外围，而且指固相材料内任何可及的多孔区的表面。
本组合物包括中性至碱性pH的一类含水缓冲液。一个组包括pH7-9的胺缓冲液的水溶液，其中胺浓度为至少0.1M并优选至少0.4M以及更优选至少1M。该类型的缓冲液不含有其它添加盐例如NaCl或KCl，这取决于达到洗脱效率的缓冲组分。可用作缓冲组分的胺包括脂族胺、脂族氨基醇和磺化脂族胺。实例性的胺包括二乙胺、三乙胺、咪唑、氨基酸(例如甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、N-(氨基甲酰基甲基(Carbamoylmethyl))亚氨基二乙酸(ADA))。
示例性的氨基醇化合物包括三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、三(羟甲基)甲基氨基丙烷(Bis-TRIS)、2-甲基-2-氨基-1-丙醇(AMP)、2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇(AMPD)、乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺。
示例性的磺化脂族胺包括3-N-吗啉代丙磺酸(MOPS)、3-N-(三羟甲基)甲基氨基丙磺酸(TAPS)、3-N-(三羟甲基)甲基氨基-2-羟基丙磺酸(TAPSO)、N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)、1，4-哌嗪双(乙磺酸)(PIPES)、4-吗啉代乙磺酸(MES)、2-(三-(羟甲基)甲氨基)乙磺酸(TES)、N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、2-(氨基甲酰基甲基氨基)-乙磺酸(ACES)、N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸(N-二(羟乙基)甘氨酸(bicine))、3-(环己氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-羟基丙磺酸)(HEPPSO)、哌嗪-N，N′-双(2-羟基丙磺酸)(POPSO)和N-三(羟甲基)-甲基甘氨酸(tricine)。
在优选的组合物中，缓冲液还含有0.1-50％的亲水性有机助溶剂，更优选1-20％的所述溶剂。关于亲水性有机溶剂意欲于包括在水中或水溶液中具有至少0.1％的溶解度的有机化合物，优选至少1％并且更优选至少10％。示例性的亲水性有机助溶剂包括C1-C4醇、乙二醇、丙二醇、丙三醇、水溶性硫醇、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、糠醇、2，2，2-三氟乙醇、丙酮、THF以及对二_烷。优选的实施方式采用含有2-巯基乙醇或二硫苏糖醇的组合物作为亲水性有机助溶剂。
另一组组合物包括pH7-9的胺缓冲液的水溶液，其中胺浓度为至少0.01M并且至少一种一价或二价卤化物盐或乙酸盐的浓度为0.1-3M。代表性的盐包括NH4以及金属Li、Na、K、Rb、Cs、Ca、Mg和Zn的卤化物和乙酸盐。优选的卤化物是氯化物。缓冲液和盐的组合浓度为至少0.1M。该类型的示例性缓冲液——作为PCR缓冲20×浓缩液出售，含有0.4M tris-HCl，pH8.4，1M KCl和0.05M MgCl2。该组组合物的成员可以任选地进一步包括0.01-50％的亲水性有机助溶剂。示例性的有机助溶剂包括C1-C4醇、乙二醇、丙二醇、丙三醇、水溶性硫醇、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、糠醇、2，2，2-三氟乙醇、丙酮、THF以及对二_烷。优选的实施方式采用含有2-巯基乙醇或二硫苏糖醇的组合物作为亲水性有机助溶剂。在另一个优选的组合物中，亲水性有机助溶剂的量为该组合物的0.1-50％。更优选地，亲水性有机助溶剂的量为溶剂的1-20％。
该新型组合物的益处是能够在许多下游分子生物学过程中直接使用洗脱的核酸的溶液，而不必首先沉淀和收集该核酸。作为从样品分离或纯化核酸的方法的一部分，使用该组合物洗脱或释放结合的核酸的方法也形成本发明的另一部分并在下面更详细地公开。
已经发现所有公开的组合物在从具有结合核酸的季_基的固相材料除去结合的核酸中都是有效的。在使用此类固相材料的核酸分离方法中的这些组合物的任何一种的使用构成本发明的一个方面。
也已经发现，通过使其与本发明的新型试剂组合物接触，结合至其它已知的核酸结合支持物的核酸可以从这些固体支持物上被释放，所述新型试剂组合物包括pH约7-9的缓冲液，其中所述缓冲组分以至少0.1M并优选至少0.4M的浓度存在，并任选地包括0.1-50％的亲水性有机助溶剂。
在本发明的一个方面中，提供了从样品分离核酸的方法，所述方法包括a)提供固相，所述固相包括基质，其选自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物和不溶的多糖，和b)混合所述固相与含有所述核酸的样品，以使所述核酸结合至所述固相；c)从所述固相分离所述样品；和d)通过使所述固相与含有pH7-9的含水缓冲液的试剂组合物接触，从所述固相释放所述核酸，其中所述缓冲液的浓度为至少0.1M，并且亲水性有机助溶剂为0.1-50％。
在可以与本洗脱组合物结合使用的常规固相材料中有二氧化硅颗粒、二氧化硅包被的表面包括膜、具有表面官能化的二氧化硅例如胺官能化和羧基官能化的二氧化硅、在核酸纯化领域中已知的合成聚合物珠和颗粒、琼脂糖或纤维素颗粒、和琼脂糖或纤维素包被的二氧化硅颗粒。用任一种前述材料包被的磁颗粒类似地起作用，并且也可以与本发明的组合物和方法结合使用。
本发明的组合物在与固相结合材料结合时特别有用，所述固相结合材料具有连接在基质表面上的式QR2+X-或QR3+X-的季_基，其中所述季_基选自三元锍基(ternary sulfonium)、季铵、和_基，其中R选自C1-C20烷基、芳烷基和芳基，并且X是阴离子。优选地，所述_基选自季_基+PR3X-，其中R如上所定义。
在本发明的另一个方面中，提供了从样品分离核酸的方法，所述方法包括a)提供固相，所述固相包括选自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物和不溶的多糖的基质，和结合至所述基质表面上的_基，所述_基选自其中R选自C1-C20烷基、芳烷基和芳基的式QR2+X-的三元锍基，其中R选自C1-C20烷基、芳烷基和芳基的式NR3+X-的季铵基，以及其中R选自C1-C20烷基、芳烷基和芳基的季_基PR3+X-，并且其中X是阴离子；b)混合所述固相和含有所述核酸的样品，以将所述核酸结合到所述固相上；c)从所述固相分离所述样品；和d)通过接触所述固相和试剂组合物从所述固相释放所述核酸，所述试剂组合物包括pH为7-9的水溶液、0.1-3M金属卤化物盐或醋酸盐以及0.1-50％的亲水性有机助溶剂。
代表性的盐包括NH4以及金属Li、Na、K、Rb、Cs、Ca、Mg和Zn的卤化物和乙酸盐。优选的卤化物是氯化物。
示例性的亲水性有机助溶剂包括C1-C4醇、乙二醇、丙二醇、丙三醇、水溶性硫醇、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、糠醇、2，2，2-三氟乙醇、丙酮、THF以及对二_烷。在优选的方法中，所述固相上的_基选自季_基+PR3X-，其中R如上所定义。
如在前述的共同未决美国申请序列第10/714,763和10/715,284中所公开，申请人已经开发出固相材料，其结合核酸并具有可裂解连接体(cleavable linker)部分，所述可裂解连接体部分可以被裂解，以释放结合的核酸。通过与本发明的组合物接触而不裂解连接体基团，这些可裂解固相材料还允许结合至其上的核酸的洗脱。该材料可以是微粒、纤维、珠、膜以及其它支持物例如试管和微孔的形式，它们具有足够的表面积以允许进行有效结合。可用于本发明方法的微粒形式的固相材料可以进一步包括磁芯部分。通常，颗粒以及磁响应性微粒在本发明中是优选的。
在本发明的方法中有用的所有固相核酸结合材料包括限制其大小、形状、孔隙率和机械性能的基质，和共价连接的核酸结合基团。三种最常用类型的基质是二氧化硅或玻璃、不溶的合成聚合物以及不溶的多糖。固相可以进一步包括磁响应性部分。
聚合物是一种或多种烯键式不饱和单体单元的均聚物或共聚物，并且可以是交联的或非交联的。优选的聚合物是聚烯烃包括聚苯乙烯以及聚丙烯酸型聚合物。后者包括多种取代的丙烯酸、酰胺和酯的聚合物，其中丙烯酸单体在2-或3-碳上可以含有或可以不含有烷基取代基。
包含在可用于本发明的方法中的可裂解和不可裂解固相结合材料中的核酸结合基团吸引并结合具有各种长度和碱基组成或顺序的核酸、多核苷酸和寡核苷酸。核酸结合基团包括羧基、胺和三元或四元_基(ternary or quaternary oniumgroups)。胺基团可以是NH2、烷基胺以及二烷基胺基团。三元或四元_基包括三烷基季铵基团(-QR3+)、_基(-QR3+)包括三烷基_或三芳基_或混合的烷基芳基_基、以及三元锍基(-QR2+)。固相可以含有一种以上类型的核酸结合基团，如本文中所述。含有其中R基团是具有至少4个碳的烷基的三元或四元_基-QR2+或-QR3+的固相材料在结合核酸中特别有效，但少如1个碳的烷基基团也如芳基那样有用。此类固相材料以高的韧度保持结合的核酸并在现有技术中已知用于洗脱的大多数条件下阻止核酸的去除或洗脱。大部分已知的高和低离子强度的洗脱条件对于除去结合的核酸是无效的。不同于含有DEAE和PEI基团的传统阴离子交换树脂，三元或四元_固相材料保持正电荷，无论反应介质的pH如何。
可裂解固相材料包括固体支持部分(solid support portion)，所述固体支持部分包括选自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物以及不溶多糖的基质，在其表面上连接有核酸结合部分，用于吸引和结合核酸，所述核酸结合部分(nucleicacid binding portion，NAB)由可裂解的连接体部分连接到固体支持部分。
或 在一个实施方式中，NAB是其中Q为S原子的式QR2+X-的三元_基或其中Q为N或P原子的式QR3+X-的四元_基，R选自烷基、芳烷基和芳基而X为阴离子。当Q是氮原子时，R基团可以每一个都含有4-20个碳原子。当Q是硫或磷原子时，R基团可以具有1-20个碳原子。
或 优选的可裂解固相来源于商业可得的聚苯乙烯型聚合物例如被称为Merrifield树脂(交联的)的那些类型。在这些聚合物中，一定百分比的苯乙烯单元含有反应性基团，通常为氯甲基或羟甲基，作为共价连接的工具。通过与硫化物(R2S)或三元胺或膦反应，置换一些氯，产生本发明的固相材料。当所有的反应性氯甲基基团已经被转化成三元或四元_基时，根据本定义制备的聚合物可以用下面的式(1)描绘。对于所有此类基团，不必须都被转化，使得本发明的聚合固相将经常含有_基和氯甲基基团的混合物。
在上式中，m、n和o表示聚合物中每一单体单元的摩尔百分比，并可以取值为m从0.1％至100％、n从0至99％、以及o从0至10％。更优选地，m从1％至20％、n从80至99％、以及o从0至10％。
在另一个实施方式中，可裂解固相来源于商业可得的交联的Merrifield树脂，其一定百分比的苯乙烯单元含有反应性氯乙酰基或氯丙酰基，用于共价连接。从这些起始聚合物制备的本发明的三元或四元_聚合物具有下式 其中Q、R、X、m、n和o如上定义。
许多其它本领域已知的聚合树脂可以被用作制备可裂解固相材料中的固体基质。聚合树脂可以从商业供应商例如Advanced ChemTech(Louisville，KY)和NovaBiochem获得。该树脂通常基于具有反应性官能团的交联的聚合颗粒。用在如Advanced ChemTech 2002 Catalog，pp.105-140中所述的固体支持的肽合成中的许多合适的聚合树脂是合适的原材料。具有反应性NH2、NH-NH2、OH、SH、CHO、COOH、CO2CH＝CH2、NCO、Cl、Br、SO2CH＝CH2、SO2Cl、SO2NH2、酰基咪唑、肟(C＝N-OH)、琥珀酰亚胺酯基团的聚合物每一个都是商业可得的，用于制备本发明的聚合固相。如在下面的多个例子所示，提供将前体聚合树脂共价接合到三元或四元_基的方法有时是必需或期望的。这将通常包括选自亚烷基、亚芳基或亚芳烷基(aralkylene)基团的1-20个原子的链或环基团。该链或环还可以含有O、S或N原子以及以酮、酯、硫代酸酯、酰胺、氨基甲酸乙酯、碳酸酯、黄原酸酯、脲、亚胺、肟、亚砜和硫酮形式的羰基基团。
如本文所使用，磁性微粒是可以被磁场吸引和操作的颗粒。用在本发明的方法中的磁性颗粒包括磁性金属氧化物芯，其通常被吸附性结合或共价结合的层包围，核酸结合层通过选择的偶联化学术被共价结合到所述层，从而用三元锍、季铵或四元磷_官能团包被微粒的表面。磁性金属氧化物芯优选是氧化铁，其中铁是Fe2+和Fe3+的混合物。无硅烷包被的上述含有氧化铁芯的磁性微粒也可以被用于本发明的方法中。如美国4,654,267所述，磁性颗粒也可以通过在多孔聚合物存在下沉淀金属颗粒以捕获磁响应性金属颗粒而形成。可制备的磁性金属氧化物从而包括Fe3O4、MnFe2O4、NiFe2O4和CoFe2O4。其它磁性颗粒也可以如美国5,411,730所述通过在寡糖葡聚糖存在下沉淀金属氧化物颗粒以捕获磁响应性金属颗粒而形成。前述的美国专利5,091,206公开了另一种磁性颗粒。该颗粒包括用顺磁性金属氧化物颗粒层包被的聚合芯颗粒以及另外的聚合层，以保护金属氧化物层并提供反应性包被层。含有氯甲基化的Merrifield树脂的磁铁矿(四氧化三铁锈层，magnetite)的制备被描述于出版物(Tetrahedron Lett.，40(1999)，8137-8140)中。
商业可得的磁性二氧化硅或磁性聚合颗粒可以被用作制备根据本发明的可裂解磁性颗粒中的原材料。具有表面羧基基团的聚合颗粒的合适类型已知为商品名SeraMagTM(Seradyn)和BioMagTM(Polysciences and Bangs Laboratories)。二氧化硅磁性颗粒的合适类型已知为商品名MagneSilTM(Promega)。在表面上具有羧基或氨基的二氧化硅磁性颗粒可以从Chemicell GmbH(Berlin)获得。
可裂解连接体部分优选选自直链、支链和环的有机基团，并包括1至100个原子并更优选1至约50个原子。该原子优选选白C、H、B、N、O、S、Si、P、卤素和碱金属。示例性的连接体基团是通过水解裂解的水解可裂解基团。羧酸酯和羧酸酐、硫代酸酯、碳酸酯、硫代碳酸酯、氨基甲酸乙酯、二酰亚胺、磺酰胺和磺酰亚胺是代表性的，磺酸酯也是代表性。连接体基团的另一个示例性类别是经受还原性裂解的那些基团。一个代表性基团是含有二硫(S-S)键的有机基团，所述二硫键通过硫醇例如乙硫醇、巯基乙醇和DTT被裂解。另一个代表性基团是含有过氧化物(O-O)键的有机基团。过氧化物键可以通过硫醇、胺和膦裂解。
尽管许多具体的结构图为方便起见仅代表四元_基，但应当理解类似的四元锍基也同样欲被表示。
示例性的光化学可裂解连接体基团包括式
的硝基取代的芳族醚和酯，其中Rd为H、烷基或苯基，并且更具体地 邻硝基苄基酯根据熟知的反应通过紫外光被裂解。
示例性的可酶切连接体基团包括通过酯酶和水解酶裂解的酯、通过蛋白酶和肽酶裂解的酰胺和肽、通过糖苷酶裂解的糖苷基。
具有包含可裂解的1，2-二氧杂环丁烷(dioxetane)部分的连接体基团的固相材料也在发明的核酸结合材料的范围之内。此类材料包含可以由化学剂或酶剂引发成片段的二氧杂环丁烷部分。除去保护基以产生氧阴离子，促进二氧杂环丁烷环的分解。根据熟知的方法，通过裂解过氧化物的O-O键以及C-C键而发生断裂。
可选地，连接的_基可以被结合到芳基Ar或结合到可裂解的基团Y。进一步可选地，与固相和三元或四元_基的连接从所示出的方向被颠倒。
在前述的示例性反应中，基团A表示稳定取代基，其选自烷基、环烷基、聚环烷基、聚环烯基、芳基、芳氧基和烷氧基。Ar代表芳环基团。优选的芳环基团是苯基和萘基。该芳环可以包含另外的取代基，具体而言，是卤素、烷氧基和胺基。Y基团是通过化学剂或酶可去除的基团或原子。合适的OY基团包括OH、其中R3选自烷基和芳基基团的OSiR33、羧基、磷酸盐、硫酸盐以及糖苷基。许多可引发的二氧杂环丁烷结构在本领域中是已知的并且已经是大量专利的主题。示例性的可裂解二氧杂环丁烷连接体和其裂解被如下描绘。
保护基Y的去除引发了二氧杂环丁烷环的断裂，并从而分开固体基质和_基。在碱性反应条件下，所得到的芳基酯经受进一步水解。
具有包含多电子的C-C双键的连接体基团的固相材料是另一组可裂解核酸结合材料，所述多电子的C-C双键可以转化成不稳定的1，2-二氧杂环丁烷部分。在该双键上的至少一个取代基(A′)利用O、S或N原子被结合到双键上。多电子双键与单态氧的反应产生不稳定的1，2-二氧杂环丁烷基团，其在环境温度下自发断裂，以产生两个羰基片段。
具有可裂解连接体基团的另一组固相材料具有乙烯酮二硫缩醛(ketenedithioacetal)作为可裂解部分，如在PCT公布WO 03/053934中所公开。乙烯酮二硫缩醛经受通过与过氧化物酶和过氧化氢的酶氧化导致的氧化性裂解。
可裂解部分具有所示的结构，包括在9，10-二氢化吖啶环上具有取代的类似物，其中Ra、Rb和Rc每一个都是有机基团，该有机基团含有1至约50个选自C、N、O、S、P、Si和卤素原子的非氢原子，并且其中Ra和Rb可以被接合在一起而形成环。
具有乙烯酮二硫缩醛可裂解连接体基团的固相材料具有下式中的任何一个 或 以及类似的结构，其中固体基质和_基结合到可裂解连接体部分的次序被从示出的次序颠倒过来。
具有可裂解连接体基团的另一组固相材料具有亚烷基作为可裂解部分，所述亚烷基具有至少一个结合到三烷基或三芳基磷_基的碳原子。

这组的材料通过与酮或醛的Wittig反应是可裂解的。在有机溶剂中季磷_化合物(季_化合物)与强碱的反应使结合到磷的碳原子脱质子化，产生磷叶立德(phosphorus ylide)。该叶立德与含羰基化合物例如酮或醛的反应形成双键和氧化膦。在该过程中磷_基和固相之间的连接断裂。
本发明进一步的方面包括使用可裂解固相结合材料分离和纯化核酸的方法。在一个实施方式中，提供了从样品分离核酸的方法，包括a)提供固相，其包括包含基质的固体支持部分，所述基质选自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物和不溶的多糖，用于吸引和结合核酸的核酸结合部分，和可裂解连接体部分；b)混合固相和含有核酸的样品，以将核酸结合到固相上；c)从所述固相分离所述样品；d)任选地，裂解所述可裂解连接体；和e)通过将所述固相和试剂组合物接触从所述固相释放所述核酸，所述试剂组合物包括pH7-9的水溶液、0.1-3M金属卤化物盐或醋酸盐以及0.1-50％的亲水性有机助溶剂。
在具有可裂解连接体的固相的优选的实施方式中，核酸结合部分是连接于基质表面的式QR2+X-或QR3+X-的四元_基，其中四元_基选自三元锍基、季铵和_基，其中R选自C1-C20烷基、芳烷基和芳基，而X是阴离子。
从固相分离样品的步骤可以通过下列方法完成，例如过滤、重力沉降、倾析、磁力分离、离心、真空吸气、当例如使液体通过多孔膜或过滤毡片(filter mat)时过压空气或其它气体。该样品中除了核酸之外的组分在该步骤被除去。就其它组分的除去不完全而言，可以进行另外的洗涤，以帮助它们完全被去除。
裂解可裂解连接体的步骤，包括用裂解剂处理在其上结合有核酸的固相一段时间，该时间足以断裂可裂解连接体部分中的共价键但不破坏核酸。裂解剂的选择由可裂解连接体的性质决定。当可裂解连接体是水解可裂解的基团时，裂解剂是水或低级醇或它们的混合物。裂解剂优选包含当加入到水中提高pH的碱。
当可裂解连接体是还原性可裂解基团例如二硫化物或过氧化物基团时，裂解剂是选自硫醇、胺和膦的还原剂。示例性的还原剂包括乙硫醇、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、三烷基胺和三苯基膦。
光化学可裂解连接体基团要求使用光作为裂解剂，典型为紫外区或可见区的光。
如上所述的酶促可裂解连接体基团通过选自酯酶、水解酶、蛋白酶、肽酶、过氧化物酶和糖苷酶的酶裂解。
当可裂解连接体基团是可引发的二氧杂环丁烷时，裂解剂起作用，裂解引发OY基团中的O-Y键，如上所解释。裂解O-Y键使二氧杂环丁烷环基团不稳定并通过C-C和O-O键的断裂导致二氧环杂丁烷断裂成两部分。引发剂包括有机或无机碱、氟化物离子、酶、水解酯的化学剂和过氧化氢。
当可裂解连接体是用至少一个O、S或N原子取代的多电子C-C双键时，裂解剂是单态氧。该双键基团与单态氧的反应产生不稳定的1，2-二氧杂环丁烷基团，其在环境温度或以上温度下自发断裂。根据单态氧化领域中已知的方法，单态氧可以通过染料增感作用或通过热分解亚磷酸三苯酯臭氧化物或蒽内过氧化物(anthracene endoperoxide)而产生。
当可裂解连接体是如上所述的乙烯酮二硫缩醛时，裂解剂是过氧化物酶和过氧化氢。
当可裂解连接体通过与酮或醛的Wittig反应进行裂解时，优选的形成叶立德的碱是醇盐和氢化物盐，尤其是碱金属盐。优选的用于与叶立德反应的羰基化合物是脂族和芳族醛和脂族和芳族酮。丙酮是最优选的。优选的溶剂是非质子有机溶剂，其可以溶解反应物而不消耗碱，包括THF、二乙醚、对二_烷、DMF和DMSO。
特别令人惊奇的是这样的发现结合至本发明的固体支持物的核酸可以被制备，以通过与本发明的新型试剂组合物接触而释放所述核酸，所述固体支持物具有作为可裂解连接体的亚烷基，所述亚烷基的至少一个碳原子结合至三烷基或三芳基磷_基，(即，那些通过它们由与酮或醛的Wittig反应而进行裂解的固体支持物)或结合至三烷基铵基。由于通过与本领域已知的、用于洗脱结合的核酸的许多其它试剂和组合物接触，结合的核酸并未从这些固相结合材料除去，因此该结果是意料不到的，所述本领域已知的试剂和组合物例如去离子水H2O1M磷酸盐缓冲液，pH6.7
0.1％十二烷基硫酸钠0.1％十二烷基磷酸钠3M乙酸钾，pH5.5TE(tris EDTA)缓冲液50mM tris，pH8.5+1.25M NaCl0.3M NaOH+1M NaCl1M NaOH或1M NaOH+1M H2O2 在本发明的方法中，裂解后从固相释放核酸的步骤包括，用溶解和充分保护释放的核酸的溶液洗脱。该溶液是反应物组合物，其包括含水缓冲液，具有7-9的pH、0.1-3M金属卤化物或醋酸盐以及0.1-50％的亲水有机助溶剂。可选地，溶液可以包括pH为约7-9的缓冲溶液，其中缓冲组分以至少0.1M的浓度存在，并且还包括0.1-50％的亲水性有机助溶剂。更优选地，该亲水有机溶剂占约1-20％。金属卤化物盐包括碱金属盐、碱土金属盐。优选的盐是乙酸钠、NaCl、KCl和MgCl2。亲水有机助溶剂包括甲醇、乙醇、正丙醇、2-丙醇、叔丁醇、乙二醇、丙二醇、丙三醇、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、糠醇、2，2，2-三氟乙醇、丙酮、THF和对二_烷。释放捕获的核酸的步骤可以是在裂解步骤之后或者与其同时发生。在后一种情况中，裂解剂也可以作为洗脱溶液起作用。
裂解反应和释放(洗脱)步骤每一个都可以在室温下进行，但水的凝固点以上和水的沸点以下的任何温度都可以被使用。洗脱温度对于本分离核酸的方法的成功似乎并不是关键的。优选环境温度，但水的凝固点以上和水的沸点以下的任何温度都可以被使用。在一些情况下，升高的温度可以增加洗脱速率或允许使用含有较低数量的盐或亲水性有机助溶剂的组合物。释放或洗脱步骤可以进行一次，或者如果必要的话可以被重复1次或多次，以提高所释放核酸的量。
通过使用单独且不同的溶液来完成每一步骤，裂解反应和洗脱步骤可以作为连续的步骤实施。可选地，裂解和洗脱步骤可以在同一步骤中一起进行。当裂解反应条件采用了与洗脱的核酸的下游用途相容的试剂时，后者——同时发生的方法是优选的。例子是使用中度碱性的反应缓冲液以及甚至更强的氢氧化钠碱性溶液的裂解反应。前者——连续的方法在这样的情况下可以是期望的其中裂解反应的试剂或溶剂的存在与核酸是不相容或是不期望的。该情况的例子是Wittig释放化学术。当裂解反应条件基本上不释放DNA到溶液中时，使用单独的裂解和洗脱溶液是可能的。
该方法可以进—步包括这样的步骤用洗涤液洗涤具有结合到其上的、捕获的核酸的固相，以从固相中除去样品的其它组分。这些不期望的物质包括酶、其它类型的蛋白质、多糖、较低分子量的物质例如脂和酶抑制剂。通过上述的方法捕获在本发明的固相上的核酸，可以以捕获的形式用在杂交反应中，以杂交到标记或未标记的互补核酸。杂交反应在诊断测试中是有用的，用于检测捕获的核酸的存在或数量。杂交反应在固相核酸扩增过程中也是有用的。
从固相分离样品的步骤可以通过下列方法完成例如过滤、重力沉降、倾析、磁力分离、离心、真空吸气、对空气或其它气体过压处理以使液体通过多孔膜或过滤毡片。该样品中除了核酸之外的组分在该步骤被除去。如果其它组分的除去是不完全的，可以进行另外的洗涤，以帮助它们的完全去除。
洗脱组合物有利地允许在随后的下游过程中直接使用洗脱的核酸，而不需要在使用前蒸发溶剂或沉淀核酸。
当使用如上所述的本发明试剂组合物洗脱核酸时，洗脱温度对于本分离核酸的方法的成功似乎不是关键的。优选环境温度，但水的凝固点以上和水的沸点以下的任何温度都可以使用。在一些情况下，升高的温度可以增加洗脱的速率。此外，已认识到，用不同的设备洗脱不同的核酸。
下游使用 这些试剂组合物的重要优势是它们与许多下游的分子生物学过程相容。在很多情况下，洗脱入如上所述的试剂组合物的核酸可以在进一步的过程中被直接使用。扩增反应例如PCR、美国专利5,998,175中描述的多寡聚体连接(Ligation of Multiple Oligomers，LMO)、以及LCR可以采用此类核酸洗脱液。通过常规技术、尤其是从细菌培养物或从血样中分离的核酸，采用沉淀步骤。加入高体积百分比的低分子量醇，以从水溶液中沉淀核酸。然后，在使用前，沉淀的物质必须被分离、收集并重溶于合适的介质中。通过使用上述的试剂组合物，从本发明的固相结合材料洗脱核酸，这些步骤可以被免除。
样品——通过本发明的方法可以从其中分离核酸——包括含有一种或更多的核酸以及任选地含有其它物质的水溶液。代表性的例子包括核酸、扩增反应产物以及测序反应产物的水溶液。从细菌培养物、体液、血液和血液组分、组织提取物、植物材料以及环境样品得到的材料在使用前同样地被置于含水的溶液——优选缓冲的溶液中。
固相核酸捕获的方法可以被用于许多用途。如下面的具体例子所示，可以捕获和释放单链和双链核酸。可以捕获和释放DNA、RNA和PNA。第一用途是从细菌培养物中纯化质粒DNA。质粒DNA被用作克隆载体，以将含有具体基因或基因片段的重组DNA片段导入宿主，用于克隆。
第二用途是纯化扩增反应的扩增产物。这些反应可以是在交替的高温和低温之间进行热循环，例如LMO或PCR，或者它们可以在单一的温度下进行，例如核酸序列基扩增法(nucleic acid sequence-based amplication，NASBA)。所述反应可以使用各种扩增试剂和酶，包括DNA连接酶、RNA聚合酶和/或逆转录酶。可以使用本发明的方法纯化的多核苷酸扩增反应混合物包括多寡聚体连接(LMO)、自动维持序列扩增(3SR)、链置换扩增(SDA)、“支链”DNA扩增(“branched chain”DNA amplication)、连接酶链反应(LCR)、QB复制酶扩增(QB replicase amplication，QBR)、连接激活转录(ligation activated transcription，LAT)、核酸序列基扩增(NASBA)、修复链反应(repair chain reaction，RCR)、循环探针反应(CRP)和滚环扩增(RCA)。
第三用途是测序反应净化(sequencing reaction cleanup)。双脱氧终止测序反应产生多核苷酸序列梯度，所述序列梯度由用dNTPs和四种反应混合物的每一种中的一种ddNTP的混合物延伸引物而产生。标记每一种中的ddNTP，通常用不同的荧光染料标记。反应混合物包含过量的dNTPs和标记的ddNTP、聚合酶和辅因子例如ATP。序列分析之前除去在后的物质是有利的。
第四用途是从全血中分离DNA。用通常使用的技术从白细胞提取DNA。通常，处理血液，以选择性溶解红细胞，并且在沉淀或离心步骤之后，单独溶解完整的白细胞以暴露核酸内容物。消化蛋白质，并且得到的DNA用固相分离，随后用于序列多态性的测定、序列分析、RFLP分析、突变检测或其它类型的诊断试验。
第五用途是从DNA和RNA的混合物中分离DNA。涉及强碱性洗脱条件的本发明的方法，尤其是使用高温的那些方法，可以降解或破坏存在的RNA同时保持DNA的完整性。涉及强碱性裂解反应的方法将类似地起作用。
另外的用途包括从其它样品——土壤、植物、细菌和废水中提取核酸物质，以及为了存档的目的对核酸材料进行长期保存。
因此，本发明的又一方面包括使用固相结合材料分离和纯化核酸的方法。在一个实施方式中，提供了从样品分离核酸的方法包括a)提供固相，其包括包含基质的固体支持部分，所述基质选自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物和不溶的多糖，用于吸引和结合核酸的核酸结合部分；b)混合所述固相和含有核酸的样品，以将核酸结合到固相上；c)从所述固相分离所述样品；d)通过使所述固相和试剂组合物接触，将所述核酸从所述固相释放进入溶液，所述试剂组合物包括pH为7-9的含水缓冲液，其中所述缓冲液的浓度为至少0.1M，亲水性有机助溶剂为0.1-50％；和e)在下游过程中直接使用含有所述释放的核酸的溶液。
在核酸扩增反应中直接使用含有所释放的核酸的溶液是优选的实践，由此，使用聚合酶或连接酶介导的反应，核酸或它们的片段的数量得以扩增。
实施例 当存在于下面的实施例中时，结构图旨在仅仅说明固相材料的可裂解部分。所述图不代表固相材料的完整定义。
实施例1.含三丁基磷_基的聚苯乙烯聚合物的合成。
在氩填塞(argon pad)下，在200mL CH2Cl2/DMF(50/50)中，搅拌Merrifield肽树脂(Merrifield peptide resin)(Sigma，1.1meq/g，20.0g)，其为交联的氯甲基化聚苯乙烯。加入过量的三丁基膦(48.1g，10当量)，并在室温下搅拌浆液7天。过滤该浆液，并用200mL CH2Cl2洗涤所得到的固体2次。在真空下干燥树脂(21.5g)。元素分析观察到的(Found)P 2.52％，Cl 3.08％；期望的(Expected)P2.79％，Cl 3.19％P/Cl比率为0.94。
实施例2.含三辛基磷_基的聚苯乙烯聚合物的合成。
在氩填塞下，在200mL CH2Cl2/DMF(50/50)中，搅拌Merrifield肽树脂(Sigma，1.1meq/g，20.0g)。加入过量的三辛基膦(92.4g，10当量)，并在室温下搅拌浆液7天。过滤该浆液并用200mL CH2Cl2洗涤所得到的固体3次。在真空下干燥树脂(21.3g)。元素分析观察到的P 2.28％，Cl 2.77％；期望的P 2.77％，Cl 2.42％P/Cl比率为0.94。
实施例3.含三甲基磷_基的聚苯乙烯聚合物的合成。
在氩填塞下，在50mL CH2Cl2中，搅拌Merrifield肽树脂(ICNBiomedical，1.6meq/g，5.0g)。加入1.0M在THF中的三甲基膦(Aldrich，12mL)溶液，并在室温下搅拌浆液7天。加入另外的100mL CH2Cl2和1.2mL在THF中的1.0M三甲基膦溶液，并搅拌该浆液3天。过滤该浆液，并用125mL CH2Cl2洗涤所得到的固体，随后用375mL甲醇洗涤。在真空下干燥树脂(5g)。在使用前将该树脂研磨成细粉。
实施例4.含三苯基磷_基的聚苯乙烯聚合物的合成。
在氩填塞下，在40mL CH2Cl2中，搅拌Merrifield肽树脂(ICNBiomedical，1.6meq/g，5.0g)。加入三苯基膦(Aldrich，3.2g)，并在室温下搅拌浆液5天。过滤该浆液，并依次用CH2Cl2、MeOH和CH2Cl2洗涤所得到的固体。在真空下干燥树脂(5.4g)。
实施例5.含三丁基铵基团的聚苯乙烯聚合物的合成。
在氩填塞下，在150mL CH2Cl2中，搅拌Merrifield肽树脂(Aldrich，1.43meq/g，25.1g)。加入过量的三丁基胺(25.6g，4当量)，并在室温下搅拌浆液8天。过滤该浆液，并用250mL CH2Cl2洗涤所得到的固体2次。在真空下干燥树脂(28.9g)。元素分析观察到的N 1.18％，Cl 3.40％；期望的N 1.58％，Cl 4.01％N/Cl比率为0.88。
实施例6.含2-(三丁基磷_)乙酰基基团的聚苯乙烯聚合物的合成。
在氩填塞下，将氯乙酰基聚苯乙烯珠(Advanced Chemtech，3.0g，3.4meq/g)加入到50mL CH2Cl2中的三丁基膦(4.1g，2当量)的溶液中。搅拌浆液1周。过滤该浆液，并依次用CH2Cl2(4×25mL)、MeOH(2×25mL)和丙酮(4×25mL)洗涤所得到的固体。然后，风干该树脂。
实施例7.具有含聚乙烯基苯基三丁基磷_基团的聚合物层的磁性颗粒的合成。
在玻璃瓶中，将磁性Merrifield肽树脂(Chemicell，SiMag Chloromethyl，100mg)加至2mL CH2Cl2中。加入三丁基膦(80μL)，并在室温下摇动浆液3天。在该瓶下放置磁体，并用移液管除去上清液。用2mL CH2Cl2洗涤固体4次(洗涤液也通过磁体/移液管步骤除去)。风干该树脂(93mg)。
实施例8-Br.含三丁基磷_基团和溴化物阴离子的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。
用35mL SOCl2回流聚甲基丙烯酸树脂4小时，以形成酰基氯。在氩下，在冰水浴中，于100mL CH2Cl2中，搅拌聚甲基丙烯酰氯树脂(4.8g)和三乙胺(11.1g)。加入3-溴丙醇(9.0g)并除去冰水浴。在室温下过夜搅拌浆液。过滤该浆液，并用40mL CH2Cl2洗涤该树脂3次。风干该树脂(8.7g)。
在氩下，于100mL CH2Cl2中，重悬并搅拌该树脂(8.5g)。加入三丁基膦(16.2g)并搅拌该浆液7天。过滤该浆液，并用100mL CH2Cl2洗涤该树脂3次。然后，风干该树脂(5.0g)。
实施例8-Cl.含三丁基磷_基团和氯化物阴离子的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。
在氩下，在冰水浴中，于100mL CH2Cl2中，搅拌聚甲基丙烯酰氯树脂(12.2g)和三乙胺(23.2g)。加入3-氯丙醇(12.8g)并除去冰水浴。在室温下过夜搅拌浆液。过滤该浆液，并用100mL CH2Cl2洗涤该树脂3次。风干该树脂(12.8g)。
在氩下，于100mL CH2Cl2中，重悬并搅拌该树脂(12.8g)。加入三丁基膦(27.8g)并搅拌该浆液7天。过滤该浆液，并用2×100mL CH2Cl2和2×100mLMeOH洗涤该树脂。风干该树脂(9.8g)。
实施例8-S.含三丁基磷_基团和烷基硫酯(alkylthioester)键的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成 在氩下，在冰水浴中，于20mL CH2Cl2中，搅拌聚甲基丙烯酰氯树脂(3.6g)和三乙胺(8.9g)。加入稀释于20mL CH2Cl2的3-巯基-1-丙醇(5.8g)并除去冰水浴。在室温下过夜搅拌浆液。过滤该浆液，并用CH2Cl2、水和甲醇洗涤该树脂。风干该树脂(3.5g)。
在氩下，于100mL干燥的乙腈中，重悬并搅拌该树脂(4.3g)。加入四溴化碳(14.9g)和三苯基膦(11.8g)。回流该混合物5小时。过滤该浆液，并用125mL乙腈、250mL MeOH和250mL CH2Cl2洗涤该树脂。然后，风干该树脂(4.2g)。
在氩下，于40mL CH2Cl2中，重悬并搅拌该树脂(4.2g)。加入三丁基膦(6.7g)并搅拌该浆液8天。过滤该浆液，并用90mL CH2Cl2以及随后用50mLMeOH洗涤该树脂。然后，风干该树脂(4.0g)。
实施例9.含三丁基磷_基团和酯键的聚乙烯基苯基聚合物的合成。
在氩下，在冰水浴中，于50mL乙腈中，搅拌聚苯乙烯丙烯酸羟甲酯树脂(polystyrene hydroxymethyl acrylate resin)(5.0g)。在氩下搅拌三丁基膦(2.1g)和4.0M HCl(2.5mL)15分钟。在1小时内，以4等份将此溶液加入到该树脂浆液中。除去冰水浴并在室温下搅拌浆液3小时。过滤浆液，并用50mL乙腈随后用2个50mL份的CH2Cl2洗涤该树脂。然后，风干该树脂(6.24g)。
实施例10.含三丁基磷_基团和酯键的聚乙烯基苯基聚合物的合成。
在氩下，在冰水浴中，于100mL CH2Cl2中搅拌羟甲基化聚苯乙烯(Aldrich，2.0meq/g，5.0g)和三乙胺(2.3g)。加入氯乙酰氯(1.9g)并除去冰水浴。在室温下过夜搅拌浆液。过滤浆液，并用40mL CH2Cl2洗涤该树脂3次。风干该树脂(5.8g)。
在氩下于100mL CH2Cl2中，重悬并搅拌该树脂(5.8g)。加入三丁基膦(3.2g)并搅拌该浆液7天。过滤该浆液，并用100mL CH2Cl2洗涤该树脂2次。然后，风干该树脂(5.9g)。
实施例11.含三丁基磷_基团和芳基硫酯(arylthioester)键的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。
在氩下，在冰水浴中，于25mL CH2Cl2中搅拌聚甲基丙烯酰氯树脂(2.7g)和三乙胺(8.6g)。加入稀释于20mL CH2Cl2中的2-巯基苄醇(5.0g)，并除去冰水浴。在室温下搅拌浆液2天。用50mL CH2Cl2稀释浆液，并在6000rpm下离心10分钟。丢弃上清。用100mL MeOH洗涤该树脂3次(在6000rpm下离心每一洗涤液10分钟)。在最后一次洗涤后，过滤该树脂并风干(4.2g)。
在氩下于100mL干乙腈中，重悬并搅拌该树脂(3.4g)。加入四溴化碳(10.2g)和三苯基膦(8.0g)。回流该混合物4小时。过滤该浆液，并用125mL乙腈、250mL MeOH和250mL CH2Cl2洗涤该树脂。然后风干该树脂(2.8g)。
在氩下于40mL CH2Cl2中，重悬并搅拌该树脂(2.8g)。加入三丁基膦(4.0g)并搅拌浆液8天。过滤该浆液，并用50mL CH2Cl2随后用125mL MeOH洗涤该树脂。然后风干该树脂(2.7g)。
实施例12.含三甲基磷_基团和芳基硫酯键的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。
在氩下于100mL CH2Cl2中，搅拌聚甲基丙烯酰氯树脂(5.1g)和三乙胺(12.3g)。加入2-巯基苄醇(9.3g)并在室温下搅拌浆液5天。过滤该浆液，并用300mL CH2Cl2、500mL水和200mL MeOH洗涤该树脂。风干该树脂(5.8g)。
在氩下于100mL干燥的乙腈中，重悬并搅拌该树脂(4.8g)。加入四溴化碳(14.3g)和三苯基膦(11.3g)。回流该混合物4小时。过滤该浆液，并用100mL乙腈、200mL CH2Cl2、200mL MeOH和200mL CH2Cl2洗涤该树脂。然后，风干该树脂(4.8g)。
在氩下于30mL CH2Cl2中，重悬并搅拌该树脂(1.04g)。加入于THF中的1.0M三甲基膦溶液(7.3mL)，并搅拌浆液10天。过滤该浆液，并用100mLCH2Cl2、100mL THF、50mL MeOH和100mL CH2Cl2洗涤该树脂。然后风干该树脂(1.1g)。
实施例13.含三辛基磷_基团和芳基硫酯键的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。
在氩下于100mL CH2Cl2中，搅拌聚甲基丙烯酰氯树脂(5.1g)和三乙胺(12.3g)。加入2-巯基苄醇(9.3g)并在室温下搅拌浆液5天。过滤该浆液，并用300mL CH2Cl2、500mL水和200mL MeOH洗涤该树脂。风干该树脂(5.8g)。
在氩下于100mL干燥的乙腈中，重悬并搅拌该树脂(4.8g)。加入四溴化碳(14.3g)和三苯基膦(11.3g)。回流该混合物4小时。过滤该浆液，并用100mL乙腈、200mL CH2Cl2、200mL MeOH和200mL CH2Cl2洗涤该树脂。然后，风干该树脂(4.8g)。
在氩下于30mL CH2Cl2中，重悬并搅拌该树脂(1.68g)。加入三辛基膦(4.4g)并搅拌浆液10天。过滤该浆液，并用100mL CH2Cl2、100mL THF、50mLMeOH和100mL CH2Cl2洗涤该树脂。然后风干该树脂(1.67g)。
实施例14.用聚甲基丙烯酸酯连接体官能化的、并含有三丁基磷_基团和芳基硫酯键的磁性二氧化硅颗粒的合成。
将磁性的羧酸官能化的二氧化硅颗粒(Chemicell，SiMag-TCL，1.0meq/g，0.6g)置于6mL亚硫酰氯中并回流3小时。减压下除去过量的亚硫酰氯。在氩下，在冰水浴中，将树脂重悬于40mL CH2Cl2中。加入三乙胺(1.2g)。加入2-巯基苄醇(0.7g)并除去冰水浴。在室温下过夜摇动该浆液。过滤该浆液，并用35mL MeOH以5000rpm离心树脂10分钟。弃上清液。橙黄色的树脂被风干(335mg)。
在氩下于45mL干燥的乙腈中重悬该树脂(335mg)。加入四溴化碳(2.0g)和三苯基膦(1.6g)。回流混合物3小时。以5000rpm离心该树脂10分钟，并丢弃上清。用50mL乙腈以5000rpm离心该树脂10分钟，2次，并丢弃上清。然后，风干该树脂(328mg)。
在氩下于40mL CH2Cl2中重悬该树脂(328mg)。加入三丁基膦(280mg)并摇动浆液10天。通过在瓶的外部放置磁体沉降磁性树脂，并倾析上清。用30mLCH2Cl2洗涤该树脂3次，随后用25mL MeOH洗涤3次。然后，风干该树脂(328mg)。
实施例15.含有三丁基磷_基团和芳基硫酯键的磁性聚合甲基丙烯酸酯颗粒的合成。
Sera-MagTM磁性羧酸酯微粒(Seradyn)被用于形成可裂解磁性颗粒。Sera-Mag颗粒包括聚苯乙烯-丙烯酸聚合物芯，其被用专用聚合物包封的磁铁矿包覆层包围。羧酸酯基团在表面上是可及的。颗粒(0.52meq/g，0.50g)被悬浮于15mL水和25mL 0.1M MES缓冲液中(pH4.0)。在加入126mg EDC(1-[3-二甲氨基]丙基)-3-乙基碳二亚胺氢氯化物)和110mg 2-巯基苄醇之前，对该反应混合物超声处理5分钟。摇动该反应混合物7天。过滤该反应混合物。用50mL水和100mLMeOH洗涤该树脂。风干该树脂(0.53g)。
在氩下于20mL干燥的乙腈中重悬该树脂(0.53g)。加入四溴化碳(174mg)和三苯基膦(138mg)。在65℃下超声处理该混合物5小时。将反应混合物置于大磁体上并倾析上清。用乙腈洗涤该树脂4次，用磁体沉淀该树脂，并丢弃洗涤液。将该树脂重悬于MeOH中并摇动过夜。用MeOH洗涤该树脂4次，用磁体沉淀该树脂，并丢弃洗涤液。然后，风干该树脂(0.52g)。
将该树脂(0.52g)重悬于10mL乙腈中。加入三丁基膦(106mg)并摇动该反应7天。用磁体沉淀该磁性树脂并倾析上清。用乙腈洗涤该树脂4次并用MeOH洗涤4次。然后，风干该树脂(0.51g)。
实施例16.含三丁基磷_基团和芳基硫酯键的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。
在氩下，在冰水浴中，于30mL CH2Cl2中搅拌聚甲基丙烯酰氯树脂(0.6g)和三乙胺(1.5g)。加入稀释于20mL CH2Cl2中的4-巯基苄醇(1.0g)并除去冰水浴。在室温下搅拌浆液2天。过滤该浆液，并用50mL CH2Cl2、100mL水、50mL MeOH和25mL CH2Cl2洗涤该树脂。风干该树脂(0.7g)。
在氩下于20mL干燥的乙腈中重悬该树脂(0.6g)。加入四溴化碳(1.8g)和三苯基膦(1.4g)。回流该混合物3小时。过滤该浆液，并用乙腈、MeOH和CH2Cl2洗涤该树脂。然后，风干该树脂(0.6g)。
在氩下于15mL CH2Cl2中重悬并搅拌该树脂(0.6g)。加入三丁基膦(0.85g)并搅拌浆液6天。过滤该浆液，并用75mL CH2Cl2随后用150mL MeOH洗涤该树脂。然后，风干该树脂(0.6g)。
实施例17.含三丁基磷_基团和芳基硫酯键的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。
在氩下，于100mL CH2Cl2中搅拌聚甲基丙烯酰氯树脂(0.71g)和三乙胺(2.2g)。加入4-羟苯基4-溴硫代丁酸酯(2.55g)并在室温下搅拌浆液5天。过滤该浆液，并用CH2Cl2和己烷洗涤。风干该树脂(0.85g)。
在氩下于20mL CH2Cl2中重悬并搅拌该树脂(0.85g)。加入三丁基膦(2.7g)并搅拌浆液3天。过滤该浆液，并用CH2Cl2和己烷洗涤该树脂。然后，风干该树脂。
实施例18.含三丁基磷_基团和芳基硫酯键的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。
在氩下，于20mL CH2Cl2中搅拌聚甲基丙烯酰氯树脂(1.0g)和吡啶(1.9mL)。加入1，4-苯二硫醇(1.85g)并在室温下过夜搅拌浆液。过滤该浆液，并用CH2Cl2和己烷洗涤。风干该树脂(1.08g)。
在氩下于20mL CH2Cl2中搅拌该树脂(1.08g)和三乙胺(3.0mL)。加入4-溴丁酰氯(1.8mL)并搅拌反应混合物2天。过滤该浆液并用CH2Cl2洗涤。风干该树脂(1.10g)。
在氩下于30mL CH2Cl2中重悬并搅拌该树脂(1.10g)。加入三丁基膦(4.0g)并搅拌浆液5天。过滤该浆液并用CH2Cl2洗涤该树脂。然后，风干该树脂(1.0g)。
实施例19.含三丁基磷_基团的交联的聚苯乙烯聚乙二醇琥珀酸酯共聚物的合成。
在30mL亚硫酰氯中回流TentaGel S COOH珠(Advanced Chemtech，3.0g)——交联的聚苯乙烯聚乙二醇琥珀酸酯共聚物90分钟。在减压下除去残余的亚硫酰氯。该树脂重悬于30mL氯仿中并再浓缩。
在氩下，在冰水浴中，于60mL CH2Cl2中搅拌该树脂和三乙胺(0.14g)。加入2-巯基苄醇(0.11g)并除去冰水浴。在室温下搅拌浆液2天。过滤该浆液，并用CH2Cl2、水、MeOH和CH2Cl2洗涤该树脂。过滤并风干该树脂(2.9g)。
在氩下于60mL干燥的乙腈中重悬并搅拌该树脂(2.8g)。加入四溴化碳(0.36g)和三苯基膦(0.29g)。回流该混合物4小时。过滤该浆液，并用乙腈、MeOH和CH2Cl2洗涤该树脂。然后，风干该树脂(2.8g)。
在氩下于50mL CH2Cl2中重悬并搅拌该树脂(2.7g)。加入三丁基膦(0.21g)并搅拌浆液6天。过滤该浆液，并用50mLCH2C]2随后用175mL MeOH洗涤该树脂。然后，风干该树脂(2.8g)。
实施例20.含有琥珀酸酯连接的三丁基磷_基团和硫酯键的可控多孔玻璃珠的合成。
将Millipore LCAA玻璃(1.0g，38.5微摩尔/克)悬浮于10mL干燥的吡啶中。加入琥珀酸酐(40mg)并在室温下摇动反应混合物4天。用20mL MeOH稀释该反应混合物，并过滤该混合物。用20mL MeOH洗涤固体5次，并用20mLCH2Cl2洗涤5次。风干该固体(1.0g)。
将该固体(0.50g)悬浮于10mL干燥的CH2Cl2中。加入二环己基碳二亚胺(10mg)和2-巯基苄醇，并在室温下摇动反应混合物6天。用CH2Cl2稀释该反应混合物并过滤该混合物。用MeOH洗涤固体3次并用CH2Cl2洗涤3次。风干该固体(0.50g)。
在氩下于10mL干燥的乙腈中重悬该固体(400mg)。加入4-溴化碳(14mg)和三苯基膦(11mg)。回流该混合物3小时。过滤该混合物，并用50mLMeOH洗涤固体5次，以及用50mL CH2Cl2洗涤5次。风干该固体(360mg)。
在氩下于10mL CH2Cl2中重悬该固体(300mg)。加入三丁基膦(5滴)并摇动反应混合物5天。用CH2Cl2稀释该反应混合物并过滤。用50mL CH2Cl2洗涤该固体5次并风干(300mg)。
实施例21.含吖啶_酯(acridinium ester)基团的聚乙烯基苄基聚合物的合成。
在氩下，在冰水浴中，于40mL CH2Cl2中搅拌吖啶9-羧酸氯化物(Acridine 9-carboxylic acid chloride)(1.25g)和三乙胺(1.3g)。加入羟基苯硫酚树脂(Polymer Laboratories，1.67meq/g，3.0g)，并除去冰水浴。在室温下过夜搅拌浆液。过滤该浆液，并用200mL CH2Cl2洗涤该树脂3次。风干该树脂(4.4g)。
在氩下于40mL CH2Cl2中搅拌该树脂(4.3g)。加入三氟甲基磺酸甲酯(methyl triflate)(6.1g)并搅拌反应混合物2天。过滤该浆液并用200mL CH2Cl2和1L MeOH洗涤该树脂。真空干燥该树脂(4.7g)。
实施例22.含9，10-二氧化吖啶乙烯酮二硫缩醛(acridan ketene dithioacetal)基团的聚乙烯基苄基聚合物的合成。
在氩下，在-78℃下，于20mL无水THF中搅拌N-苯基9，10-二氢化吖啶(0.62g)。加入丁基锂(2.5M，在己烷中，0.93mL)并于-78℃搅拌反应混合物2小时。加入二硫化碳(0.16mL)并于-78℃搅拌反应混合物1小时。将反应混合物温热至室温。加入Merrifield’s肽树脂(1.6meq/g，1.0g)并在室温下过夜搅拌该混合物。过滤该混合物。用10mL丙酮洗涤树脂5次，用10mL水洗涤3次以及用10mL丙酮洗涤2次。风干该树脂(1.21g)。
在氩下于20mL无水DMF中搅拌该树脂(1.21g)和NaH(60％，在油中，0.003g)4小时。加入1，3-二溴丙烷(0.07mL)并搅拌混合物3天。过滤该混合物。用10mL丙酮洗涤树脂3次，用10mL水洗涤5次以及用10mL丙酮洗涤5次。风干该树脂(1.22g)。
在氩下于20mL DMF中重悬并搅拌该树脂(1.22g)。加入三丁基膦(1.18g)并搅拌浆液7天。过滤该浆液并用20mL CH2Cl2洗涤该树脂4次以及用20mL丙酮洗涤4次。然后，风干该树脂(1.07g)。
实施例23.从可水解裂解颗粒结合并洗脱DNA的一般步骤 在管中用500μL THF漂洗10mg珠样品。离心内容物并除去液体。用200μL水重复漂洗过程。将2μg线性化pUC18 DNA在200μL水中的溶液加至珠，并轻轻摇动该混合物20分钟。离心该混合物并收集上清。用2×200μL水漂洗该珠并丢弃水。通过将该珠和200μL含水NaOH于37℃温育5分钟洗脱DNA。离心该混合物并移出洗脱液，用于分析。
实施例24.荧光测定步骤 通过荧光测定，使用PicoGreenTM对DNA进行染色而分析上清液和洗脱剂中DNA含量。简要地，将10μL含有或疑似含有DNA的溶液等分试样与190μL荧光DNA“染色”液温育。荧光染色剂为在0.1M tris，pH7.5，1mM EDTA中以1∶400稀释的PicoGreen(Molecular Probes)。在温育样品至少15分钟后，在微量板荧光分析仪(microplate fiuorometer)(Fluoroskan，LabSystems)中测量荧光。滤片组为480nm和535nm。含有已知量的相同DNA的阳性对照以及阴性对照被同时进行。
实施例25.从不同的pH溶液将DNA结合至实施例11的珠上，显示出在宽范围的pH内的有效捕获。
制备pH跨度为4.5至9.0的缓冲液。具有pH4.5至6.5的缓冲液为10mM乙酸盐缓冲液。具有pH7.0至9.0的缓冲液为10mM tris乙酸盐缓冲液。在室温下，将2μg线性化pUC18 DNA在200μL每一缓冲液中的溶液加至10mg实施例11的可裂解珠30-45秒。在每一缓冲液中，平行运行阴性对照溶液，其不含DNA。在将珠样品离心后除去上清，并用UV和荧光分析。
缓冲液pH结合％(通过UV)结合％(通过荧光)4.556735.064685.558646.061716.557747.049617.544608.045558.537399.03133
单独地，发现在pH8.0下使用20mg珠结合5分钟导致100％的DNA捕获。
实施例26.从实施例11的可裂解珠洗脱的DNA在LMO扩增中的使用。
将在200μL水中的、含有0.1或1μg pUC18 DNA的溶液加至先前用400μLTHF洗涤、然后用水洗涤2次的10mg珠。在温育30分钟之后，离心样品管30秒并收集上清。用2×400μL水洗涤所述珠并丢弃洗涤液。通过在室温下用100μL 1M NaOH洗涤所述珠15分钟、离心30秒并收集洗脱液而洗脱DNA。用40μL 1M乙酸中和每一洗脱液的80μL的部分。
如美国专利5,998,175所述，使用本发明的聚合珠分离的质粒DNA通过LMO进行扩增，其直接使用洗脱液而未沉淀DNA。简要地，通过热循环方案，使用一对引物和一组跨越68个碱基区域的八聚体，扩增68 bp的区域。将一组12个八聚体-5′-磷酸盐(每条链6个)、引物和模板(1μL)溶解在Ampligase缓冲液中。用50μL矿物油覆盖反应管并加热至94℃5分钟。在约2分钟之后，将100 UAmpligase加入每一管中。样品被循环35次94℃，30秒；55℃，30秒；35℃，30秒。扩增反应物的凝胶电泳揭示了具有期望分子量的条带。
实施例27.DNA结合至实施例9的聚合物珠 在管中用1mL THF漂洗100mg珠样品。离心内容物并除去液体。用1mL水重复漂洗过程两次。将80μg pUC18 DNA在1mL水中的溶液加至珠，并轻轻摇动该混合物20分钟。离心该混合物并收集上清，用于UV分析。该上清液含有66μg DNA。因此结合容量被测定为0.14μg/mg。
实施例28.从实施例11的可裂解珠结合和释放RNA 在2个管中，使2μg荧光素酶(Luciferase)RNA结合至10mg珠。1×反转录酶缓冲液(50mM tris-HCl，pH8.5，8mM MgCl2，30mM KCl，1mM DTT(0.015％)))被用于洗脱。将一个管在94℃下加热5分钟，而另一个管在94℃下加热30分钟。在1％琼脂糖凝胶上对洗脱液和对照跑胶，并用SYBR GreenTM染色。5分钟的加热显示了～50％的RNA从所述珠洗脱，但30分钟的加热似乎使RNA变性。
实施例29.用不同的裂解/洗脱缓冲液从实施例11的可裂解珠结合和释放RNA。
在3个管中，使1μg Luciferase RNA结合至10mg珠。在一个管中，3M乙酸钾被用于在室温下洗脱RNA 30分钟。在另一个管中，1×反转录酶缓冲液(RT)被用于在94℃下洗脱1分钟。第三管具有RNA提取缓冲液并被加热至94℃1分钟。RNA提取缓冲液由pH8.8的10mM tris-HCl、0.14 MNaCl、1.5M MgCl2、0.5％NP-40、1mM DTT组成。在1％琼脂糖凝胶上对所有洗脱液和对照跑胶，并用SYBR GreenTM染色。3M乙酸钾未产生可识别的RNA。1×反转录酶缓冲液和RNA提取缓冲液都显示出条带，该条带被估计包含相应于大约50％洗脱的RNA。
实施例30.从实施例11的可裂解珠结合和释放RNA，并通过化学发光印迹试验检测。
在4个管中，使1μg Luciferase RNA结合至10mg珠。2个管使用1×反转录酶缓冲液进行洗脱，而另2个管使用RNA提取缓冲液。将每一种类的缓冲液的一个管加热至94℃1分钟。其它两个管被加热至94℃5分钟。在1％琼脂糖凝胶上对所有洗脱液和对照跑胶，并用SYBR Green染色。使用任一种缓冲液，加热1分钟的洗脱液比加热5分钟的洗脱液都含有更多的RNA。RNA提取缓冲液比1×RT缓冲液洗脱出更多的RNA。采用过夜的毛细转移，将RNA转移至尼龙膜。然后，用HF-1生物素标记的引物过夜杂交RNA。用抗生物素HRP以及作为化学发光底物的Lumigen PS-3进行检测。5分钟的暴露验证了凝胶结果。
实施例31.在不同温度下从实施例11的可裂解珠结合和释放RNA。
在6个管中，使1μg Luciferase RNA结合至10mg珠。RNA提取缓冲液被用于在若干个不同的温度下洗脱RNA 5分钟40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃。在1％琼脂糖凝胶上对所有洗脱液和对照进行跑胶，并用SYBR Green染色。所有的温度似乎都100％洗脱。
实施例32.用实施例1的三丁基磷_珠结合线性化的pUC18 DNA，并用不同的洗脱组合物释放。
在管中用500μL THF漂洗10mg珠样品。离心内容物并除去液体。用200μL水重复漂洗过程。将2μg线性化pUC18 DNA在200μL水中的溶液加至珠，并轻轻摇动该混合物20分钟。离心该混合物并收集上清。用2×200μL水漂洗该珠并丢弃水。通过将该珠和200μL下表所述的各种试剂组合物在室温下温育20分钟而洗脱DNA。离心该混合物并移出洗脱液，用于如实施例24所述的荧光分析。
缓冲液盐有机溶剂洗脱％50mM tris，pH8.5 1.25M NaCl15％糠醇 5850mM tris，pH8.5 1.25M NaCl15％聚蔗糖 1950mM tris，pH8.5 1.25M NaCl15％HOCH2CH2SH 5250mM tris，pH8.5 1.25M NaCl15％DTT5250mM tris，pH8.5 1.25M NaCl15％丙三醇 1550mM tris，pH8.5 1.25M NaCl15％2-丙醇 5050mM tris，pH8.5 1.25M NaCl15％乙醇 3750mM tris，pH8.5 1.25M NaCl15％CF3CH2OH 3850mM tris，pH8.5 1.25M NaCl15％丙酮 4250mM tris，pH8.5 1.25M NaCl15％THF4150mM tris，pH8.5 1.25M NaCl15％对二_烷 33
实施例33. 用下表描述的试剂组合物重复实施例32的结合和释放方案。检测改变DTT或2-巯基乙醇的浓度的效应。
缓冲液盐有机溶剂洗脱％50mM tris，pH8.51.25M NaCl0.1％DTT 050mM tris，pH8.51.25M NaCl1％DTT 050mM tris，pH8.51.25M NaCl3％DTT 3650mM tris，pH8.51.25M NaCl4％DTT 4150mM tris，pH8.51.25M NaCl0.1％HOCH2CH2SH 050mM tris，pH8.51.25M NaCl1％HOCH2CH2SH050mM tris，pH8.51.25M NaCl3％HOCH2CH2SH3950mM tris，pH8.51.25M NaCl4％HOCH2CH2SH38实施例34. 用下表描述的试剂组合物重复实施例32的结合和释放方案。检测改变盐NaCl和KCl的浓度的效应。
缓冲液盐有机溶剂洗脱％50mM tris，pH8.50.1M NaCl 5％DTT 150mM tris，pH8.50.25M NaCl 5％DTT 050mM tris，pH8.50.5M NaCl 5％DTT 2750mM tris，pH8.50.75M NaCl 5％DTT 2950mM tris，pH8.51.0M NaCl 5％DTT 2950mM tris，pH8.51.25M NaCl 5％DTT 2650mM tris，pH8.50.75M KCl 5％DTT 6450mM tris，pH8.51.25M KCl 5％DTT 60实施例35. 用下表描述的试剂组合物重复实施例32的结合和释放步骤。洗脱珠60分钟。
缓冲液盐有机溶剂洗脱％50mM tris，pH8.50.1M NaCl 0％2-丙醇 350mM tris，pH8.50.1M NaCl 15％2-丙醇 6850mM tris，pH8.50.25M NaCl 30％2-丙醇 6450mM tris，pH8.50.5M NaCl 50％2-丙醇 4实施例36. 用下表描述的试剂组合物重复实施例32的结合和释放步骤。评价相对效应。
缓冲液盐有机溶剂
50mM tris，pH8.5 1.0M乙酸钠 15％2-丙醇++50mM tris，pH8.5 1.5M乙酸钠 15％2-丙醇++50mM tris，pH8.5 1.25M乙酸钠 15％2-丙醇++50mM tris，pH8.5 0.75M乙酸钠 15％2-丙醇+50mM tris，pH8.5 0.5M乙酸钠 15％2-丙醇+50mM tris，pH8.5 0.1M乙酸钠 15％2-丙醇+实施例37. 用实施例1的三丁基磷_珠结合不同长度的寡核苷酸并用试剂组合物释放。
对范围为20碱基至2.7kb的不同大小的寡核苷酸进行实施例32的结合和释放方案。洗脱组合物是pH8.5的50mM tris、0.75M NaCl、5％DTT。使用ssDNA的荧光染色剂——OliGreenTM，荧光测定DNA的量。
寡核苷酸大小(nt)洗脱％2039304350366834181 33424 33753 322.7kb 20实施例38.用实施例1的三丁基磷_珠结合线性化pUC18 DNA并用不同洗脱体积释放。
将2μg线性化的pUC18 DNA在200μL水中的溶液加至在2mL离心柱(Costar)中的10mg珠。在温育20分钟后，离心该柱并收集上清。用2×200μL水洗涤所述珠并丢弃洗液。如下洗脱DNA通过用5×200μL的50mM tris，pH8.5、0.75M NaCl、5％DTT在室温下洗涤所述珠5分钟，离心并收集洗脱液，用于在每次洗脱后进行荧光和凝胶电泳分析。
以类似的方式，用5×40μL相同的缓冲液洗脱含有结合DNA的珠。
洗脱百分比200μL洗脱液40μL洗脱液洗脱163 47洗脱210 11洗脱35.5 10洗脱43.5 5洗脱52.1 4总量 84 77
实施例39.用实施例5的三丁基铵珠结合和释放核酸。
将2μg线性化pUC18 DNA在200μL水中的溶液加至10mg的珠中，并轻轻摇动该混合物30分钟。离心该混合物并收集上清。用2×200μL水漂洗该珠并丢弃水。通过将该珠和200μL的50mM tris，pH8.5、0.75M NaCl、5％DTT于室温下温育30分钟洗脱DNA。离心该混合物并移出洗脱液，用于荧光分析，如实施例26中所述。DNA结合为50％，洗脱为结合部分的69％。
实施例40.用实施例7的磁性三丁基磷_珠结合和释放核酸。
在管中用500μL THF漂洗10mg珠样品。磁法分离内容物并除去液体。用200μL水重复漂洗过程。将在200μL水中的2μg线性化pUC18 DNA的溶液加至所述珠中，并轻轻摇动该混合物20分钟。磁分离该混合物并收集上清。用2×200μL水漂洗该珠并丢弃水。通过将该珠和200μL的50mM tris，pH8.5、1.25M NaCl、15％2-丙醇于室温下温育30分钟而洗脱DNA。磁分离该混合物并移出洗脱液，用于荧光分析，如实施例26中所述。DNA结合为100％，洗脱为18％。
实施例41.用实施例1的三丁基磷_珠结合线性化的pUC18 DNA，并用不同的洗脱温度释放。
将在200μL水中的2μg线性化pUC18 DNA的溶液加至10mg的珠中，并轻轻摇动该混合物30分钟。离心该混合物并收集上清。用2×200μL水漂洗该珠并丢弃水。通过将该珠和200μL的50mM tris，pH8.5、1.25M NaCl、15％2-丙醇在不同温度下温育5分钟而洗脱DNA37℃、46℃、65℃和94℃。离心该混合物并移出洗脱液，用于荧光分析，如实施例26中所述。在所有温度下，DNA结合为100％，～65-70％的结合的DNA被洗脱。
实施例42.含有三丁基磷_基和和芳基硫酯键的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。
在氩下，在室温下，于100mL CH2Cl2中，搅拌如上所述制备的聚甲基丙烯酰氯树脂(2.96g)、5.07g 4-(甲硫基)苯硫酚和三乙胺(8.8mL)5天。过滤出该固体，并用100mL CH2Cl2和100mL水洗涤，然后在125mL甲醇中搅拌若干天。过滤并干燥所产生的3.76g硫酯产物。
将100mL CH2Cl2中的2.89g部分的固体与4.1mL三氟甲基磺酸甲酯一起搅拌7天。过滤该固体，并依次用200mL CH2Cl2、300mL甲醇和300mLCH2Cl2洗涤，然后风干。
实施例43.使用具有二甲基锍基的可裂解珠结合和释放DNA。
将在200μL 10mM pH为8的tris中的2μg线性化pUC18 DNA的溶液加至10mg实施例42的珠样品中，并轻轻摇动该混合物5分钟。离心该混合物并收集上清液。用2×200μL水漂洗所述珠并丢弃水。通过用200μL 50mM tris，pH8.5，0.75M NaCl，5％DTT于37℃温育5分钟而洗脱DNA。离心该混合物并除去洗脱液，用于荧光分析。该上清液不含有DNA。洗脱液含有37％初始结合的DNA。
实施例44.用实施例1的三丁基磷_珠结合线性化的pUC18 DNA并用不同的洗脱组合物释放 用200μL水漂洗10mg珠样品。将在200μL水中的2μg线性化pUC18DNA溶液加至10mg珠，并轻轻摇动该混合物25分钟。离心该混合物并收集上清。用2×200μL水漂洗该珠并丢弃水。通过将该珠和200μL下表所述的各种试剂组合物在室温下温育25分钟而洗脱DNA。离心该混合物并移出洗脱液，用于荧光分析和凝胶电泳分析。
缓冲液[MgCl2]有机溶剂洗脱％50mM tris，pH8.5 2.0M 5％DTT7.350mM tris，pH8.5 1.5M 5％DTT10.350mM tris，pH8.5 1.25M 5％DTT11.550mM tris，pH8.5 1.0M 5％DTT13.350mM tris，pH8.5 0.75M 5％DTT17.650mM tris，pH8.5 0.5M 5％DTT23.750mM tris，pH8.5 0.25M 5％DTT32.5实施例45.用实施例1的三丁基磷_珠结合线性化的pUC18 DNA并用含有Na、K或Mg离子的不同的洗脱组合物释放。
用200μL水漂洗10mg珠样品。将在200μL水中的2μg线性化pUC18DNA溶液加至10mg珠，并轻轻摇动该混合物25分钟。离心该混合物并收集上清。用2×200μL水漂洗该珠并丢弃水。通过将该珠和200μL下表所述的各种试剂组合物在室温下温育25分钟而洗脱DNA。离心该混合物并移出洗脱液，用于荧光和凝胶电泳分析。
缓冲液[盐]有机溶剂洗脱％50mM tris，pH8.5 1.25M NaCl 5％DTT 53.650mM tris，pH8.5 1.25M KCl 5％DTT 60.050mM tris，pH8.5 1.25M MgCl25％DTT 11.550mM tris，pH8.5 0.75M NaCl 5％DTT 67.850mM tris，pH8.5 0.75M KCl 5％DTT 64.450mM tris，pH8.5 0.75M MgCl25％DTT 17.6
50mM tris，pH8.50.1M MgCl25％DTT25.650mM tris，pH8.5无5％DTTN.D.
50mM tris，pH8.5无无N.D.
(N.D.—未检测)实施例46.用实施例1的三丁基磷_珠结合线性化的pUC18 DNA并用含有各种离子的不同的洗脱组合物释放。
用200μL水漂洗10mg珠样品。将在200μL水中的2μg线性化pUC18DNA溶液加至10mg珠，并轻轻摇动该混合物25分钟。离心该混合物并收集上清。用2×200μL水漂洗该珠并丢弃水。通过将该珠和200μL下表所述的各种试剂组合物在室温下温育30分钟而洗脱DNA。离心该混合物并移出洗脱液，用于凝胶电泳分析。
缓冲液[盐]有机溶剂洗脱％50mM tris，pH8.5 0.75M LiCl 5％DTT77.050mM tris，pH8.5 0.75M CaCl25％DTT76.350mM tris，pH8.5 0.75M CsCl 5％DTT73.950mM tris，pH8.5 0.75M ZnCl25％DTT47.250mM tris，pH8.5 0.75M NH4Cl 5％DTT49.650mM tris，pH8.5 0.1M LiCl 5％DTTN.D.
50mM tris，pH8.5 0.1M CaCl25％DTT62.350mM tris，pH8.5 0.1M CsCl 5％DTTN.D.
50mM tris，pH8.5 0.1M ZnCl25％DTTN.D.
50mM tris，pH8.5 0.1M NH4Cl 5％DTTN.D.
实施例47.用直接被用于PCR的缓冲液组合物从实施例52的可裂解磁性三丁基磷_珠释放结合的pUC18 DNA。
用400μLTHF，随后用2×100μL水漂洗10mg实施例52的磁性磷_珠样品。将在200μL裂解液中的2μg未切割的pUC18 DNA溶液加至10mg珠，并轻轻摇动该混合物5分钟。裂解缓冲液包括三种缓冲液的1∶1∶1混合物；S150mM tris，pH8.0，10mM EDTA；S2含1％SDS的0.2M NaOH溶液；S30.3MKOAc，0.2M HCl。磁法分离该混合物并收集上清。用2×200μL水漂洗该珠并丢弃水。通过将该珠和含有400mM tris，pH8.4，1M KCl和50mM MgCl2的200μL浓缓冲液在37℃下温育5分钟而洗脱DNA。荧光测定显示100％的质粒DNA结合至所述珠；41％被洗脱。
用水以各种比例1∶10和1∶20稀释含有DNA的洗脱液，并用30个循环进行PCR扩增94℃-1分钟、60℃-1分钟、72℃-1分钟。通过PCR成功扩增了1∶10和1∶20稀释液。
实施例48.采用不同的缓冲液组合物，用实施例1的聚合物珠从细菌培养物分离质粒DNA。
使大肠杆菌(E.coli)培养物过夜生长。在4℃，以6000×g离心20mL的部分15分钟，以沉淀细胞。该沉淀被重悬于4mL 50mM tris，pH8.0，10mMEDTA中，其含有100μg/mL RNase A。然后，将4mL含有1％SDS的0.2M NaOH溶液加至该混合物，其被轻轻混合并在室温下保持4分钟。接下来，加入4mL冷却至4℃的、含有0.2M HCl的0.3M KOAc，混合该溶液并使其保持10分钟，以沉淀SDS。过滤掉沉淀物并收集滤液。
将裂解物(200μL)和10mg实施例1的珠混合并温育5分钟。结合后，离心该珠并除去上清。用2×200μL水洗涤该珠样品，然后用下表中详细描述的组合物洗脱。
缓冲液有机溶剂产量(μg)1.25M tris，pH8.5 15％2-丙醇 3.51.25M tris，pH8.5 5％DTT 2.10.05M tris，pH8.5 5％DTT 1.5(+0.1M MgCl2)实施例49.含二甲基磷_基的聚苯乙烯聚合物的合成。
将Merrifield肽树脂(Sigma，1.1meq/g，2.0g)和硫代甲醇钠(sodiumthiomethylate)(2.24g，10当量)与60mL无水DMF一起加入250mL烧瓶中。将混合物置于氩下并在室温下搅拌15天。过滤浆液，并用50mL DMF、200mL水、200mL甲醇和200mL CH2Cl2洗涤得到的固体。风干该树脂(2.12g)。
将在100mL CH2Cl2中的硫甲基化的聚合物(thiomethylated polymer，0.637g)置于氩下，并与1.6mL三氟甲基磺酸甲酯(methyl triflate)反应。搅拌13天后，过滤混合物并用200mL CH2Cl2、200mL甲醇和200mL CH2Cl2洗涤固体。风干，得到2.09g白色固体。
实施例50.使用不同的缓冲液组合物释放结合到实施例49的聚合物珠上的pUC18DNA。
用300μL THF，随后用2×100μL水漂洗10mg实施例49的锍珠样品。将在200μL水中的2μg线性化的pUC18 DNA溶液加至10mg珠并轻轻摇动该混合物15分钟。离心该珠并弃上清。用2×200μL水漂洗该珠并丢弃水。通过将该珠和200μL下面的缓冲液在室温下温育15分钟而洗脱DNA。荧光测定显示100％的质粒DNA结合至所述珠；56％被洗脱。
缓冲液有机溶剂盐洗脱％50mM tris，pH8.55％DTT 0.75M NaCl 56实施例51.4′-羟苯基4-氯甲基-硫代苯甲酸酯(thiobenzoate)的合成。
将100.9g 4-氯甲基-苯甲酸和1.2L亚硫酰氯装载入3L瓶中。回流反应4小时，之后，在减压下除去亚硫酰氯。通过加入CH2Cl2和减压下蒸发，除去残留的亚硫酰氯。
向含有113.1g 4-氯甲基苯甲酸氯化物的3L瓶中装载入98.17g 4-羟基-苯硫酚和1.5L CH2Cl2。吹扫入(purged in)氩，并加入67.75mL吡啶。在搅拌过夜后，用1L CH2Cl2稀释反应混合物并用5L水萃取。水层用CH2Cl2反萃取。合并的CH2Cl2溶液经硫酸钠干燥，并浓缩至固体。用500mL CH2Cl2洗涤该固体，过滤并风干。1H NMR(丙酮-d6)δ4.809(s，2H)，6.946-6.968(d，2H)，7.323-7.346(d，2H)，7.643-7.664(d，2H)，8.004-8.025(d，2H)。
实施例52.用聚甲基丙烯酸酯连接体官能化的、并含有三丁基磷_基和可裂解芳基硫酯键的磁性二氧化硅颗粒的合成。
将磁性的羧酸官能化的二氧化硅颗粒(Chemicell，SiMag-TCL，1.0meq/g，1.5g)置于20mL亚硫酰氯中并回流4小时。减压下除去过量的亚硫酰氯。将该树脂重悬于25mL CHCl3中并通过超声分散该悬浮液。蒸发溶剂并重复超声洗涤处理。真空下干燥该颗粒，待进一步使用。
酰基氯官能化的颗粒与388mg二异丙基乙胺一起被悬于38mLCH2Cl2中。加入4′-羟苯基4-氯甲基-硫代苯甲酸酯(524mg)并将密封的反应瓶置于摇床上过夜。将颗粒转移至50mL塑料管，并用若干份CH2Cl2、CH3OH、1∶1的CH2Cl2/CH3OH，然后用CH2Cl2反复洗涤，伴随以磁分离。通过TLC监测洗涤溶液中未反应的可溶性原材料的除去。在进一步使用前风干该固体。
在氩下，将该树脂(1.233g)悬于20mL CH2Cl2中。加入三丁基膦(395mg)并摇动该浆液7天。将颗粒转移至50mL塑料管，并用40mL CH2Cl2洗涤4次，随后用40mL MeOH洗涤4次以及用40mL CH2Cl2洗涤4次。然后，风干该树脂，得到1.17g浅棕色固体。
实施例53.含三丁基磷_基团和可裂解芳基硫酯键的聚甲基丙烯酸酯聚合物颗粒的合成。
将聚(甲基丙烯酰氯)颗粒(1.0meq/g，1.5g)置于含2.45g二异丙基乙胺的75mL CH2Cl2中。加入三乙胺(1.2g)。4′-羟苯基4-氯甲基硫代苯甲酸酯(4.5g)，并将密封的反应混合物在室温下搅拌过夜。过滤该浆液，并用10mL CH2Cl2、200mL丙酮、200mL MeOH、2×100mL 1∶1的THF/CH2Cl2、250mL THF、250mLCH2Cl2、250mL己烷洗涤树脂。风干该树脂，待进一步使用。
在氩下，将该树脂(1.525g)悬于25mL CH2Cl2中。加入三丁基膦(1.7g)并搅拌该浆液4天。过滤该树脂，并用225mL CH2Cl2，随后用175mL己烷洗涤4次。然后，风干该树脂，得到1.68g固体。
以类似的方式，还制备含有三甲基磷_基的聚合物颗粒。
实施例54.用缓冲液组合物从实施例53的可裂解三丁基磷_珠释放结合的pUC18 DNA。
根据实施例49描述的方案，将质粒DNA结合至实施例56的颗粒上。通过将该颗粒在100μL含有5％DTT的1.25M tris，pH8.5缓冲液中、于37℃下温育5分钟而洗脱DNA。
荧光测定显示100％的质粒DNA结合至所述珠；55％被洗脱。
权利要求
1.从样品分离核酸的方法，所述核酸选自寡核苷酸、DNA、RNA或合成的DNA类似物，所述方法包括a)提供固相结合材料；b)混合所述固相与含有所述核酸的样品，以将所述核酸结合至所述固相结合材料；c)从所述固相结合材料分离所述样品；和d)通过用组合物洗脱，从所述固相释放所述核酸，所述组合物包含pH 7-9的含水胺缓冲溶液，其中所述胺的浓度为至少0.01M，0.1-3M的一价或二价卤化物盐或乙酸盐，和0.01-50％的亲水性有机助溶剂，所述亲水性有机助溶剂选自乙二醇、丙二醇、丙三醇、水溶性硫醇、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、糠醇、2，2，2-三氟乙醇、丙酮、THF以及对-二_烷。
2.权利要求1所述的方法，其中所述固相选自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物以及不溶的多糖。
3.权利要求1所述的方法，其中所述固相具有核酸结合部分，所述核酸结合部分包括季磷_基PR3+X-，其中R选自C1-C20烷基、芳烷基和芳基，并且其中X是阴离子。
4.权利要求1所述的方法，其中所述固相具有核酸结合部分，所述核酸结合部分包括式SR2+X-的三元锍基，其中R选自C1-C20烷基、芳烷基和芳基，并且其中X是阴离子。
5.权利要求1所述的方法，其中所述固相具有核酸结合部分，所述核酸结合部分包括季铵基NR3+X-，其中R选自C1-C20烷基、芳烷基和芳基，并且其中X是阴离子。
6.权利要求1所述的方法，其中所述固相材料进一步包括磁芯部分。
7.权利要求1所述的方法，其中所述盐选自NH4、Li、Na、K、Rb、Cs、Ca、Mg和Zn的卤化物盐和乙酸盐。
8.权利要求7所述的方法，其中所述盐以至少0.1M的浓度存在。
9.权利要求1所述的方法，其中所述亲水性有机助溶剂选自2-巯基乙醇和二硫苏糖醇。
10.权利要求1所述的方法，其中所述胺选自脂族胺、脂族氨基酸、脂族氨基醇和磺化的脂族胺。
11.权利要求1所述的方法，其中所述核酸是人基因组DNA，所述样品为体液。
12.权利要求1所述的方法，其中所述核酸是质粒DNA，所述样品是细胞培养物。
13.权利要求1所述的方法，其中所述固相进一步包括可裂解连接体部分，所述可裂解连接体部分将所述固体支持部分连接至所述核酸结合部分。
14.从样品分离核酸的方法，所述核酸选自寡核苷酸、DNA、RNA或合成的DNA类似物，所述方法包括a)提供固相结合材料；b)混合所述固相与含有所述核酸的样品，以将所述核酸结合至所述固相结合材料；c)从所述固相结合材料分离所述样品；和d)通过用组合物洗脱，从所述固相释放所述核酸，所述组合物包含pH 7-9的含水胺缓冲液，其中所述胺的浓度为至少0.1M，和0-50％的亲水性有机助溶剂，所述亲水性有机助溶剂选自C1-C4醇、乙二醇、丙二醇、丙三醇、水溶性硫醇、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、糠醇、2，2，2-三氟乙醇、丙酮、THF以及对-二_烷。
15.权利要求14所述的方法，其中所述缓冲液的浓度为至少0.4M。
16.权利要求14所述的方法，其中所述缓冲液的浓度为至少1M。
17.权利要求14所述的方法，其中所述胺选自脂族胺、脂族氨基酸、脂族氨基醇和磺化的脂族胺。
18.权利要求14所述的方法，其中所述亲水性有机助溶剂选自2-巯基乙醇和二硫苏糖醇。
19.权利要求14所述的方法，其中所述固相具有核酸结合部分，所述核酸结合部分包括四元_基，选自其中R选自C1-C20烷基、芳烷基和芳基的季磷_基团PR3+X-，其中R选自C1-C20烷基、芳烷基和芳基的式SR2+X-的三元锍基，和其中R选自C1-C20烷基、芳烷基和芳基的季铵基NR3+X-，并且其中X是阴离子。
20.权利要求14所述的方法，其中所述固相材料进一步包括磁芯部分。
21.权利要求14所述的方法，其中所述核酸是人基因组DNA，所述样品为体液。
22.权利要求14所述的方法，其中所述核酸是质粒DNA，所述样品是细胞培养物。
23.从样品分离核酸的方法，所述核酸选自寡核苷酸、DNA、RNA或合成的DNA类似物，所述方法包括a)提供固相结合材料，所述固相结合材料具有核酸结合部分，所述核酸结合部分包括或者季磷_基PR3+X-，其中R选自C1-C20烷基、芳烷基和芳基并且其中X是阴离子；或者式SR2+X-的三元锍基，其中R选自C1-C20烷基、芳烷基和芳基并且其中X是阴离子；b)混合所述固相与含有所述核酸的所述样品，以将所述核酸结合至所述固相结合材料；c)从所述固相分离所述样品；和d)通过用组合物洗脱，从所述固相释放所述核酸，所述组合物包含pH 7-9的含水胺缓冲液，其中所述胺的浓度为至少0.01M，0.1-3M的一价或二价卤化物盐或乙酸盐，和0.01-50％的亲水性有机助溶剂，所述亲水性有机助溶剂选自C1-C4醇、乙二醇、丙二醇、丙三醇、水溶性硫醇、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、糠醇、2，2，2-三氟乙醇、丙酮、THF以及对-二_烷。
24.权利要求23所述的方法，其中所述固相材料进一步包括磁芯部分。
25.权利要求23所述的方法，其中所述胺选自脂族胺、脂族氨基酸、脂族氨基醇和磺化的脂族胺。
26.权利要求23所述的方法，其中所述盐选自NH4、Li、Na、K、Rb、Cs、Ca、Mg和Zn的卤化物盐和乙酸盐。
27.权利要求23所述的方法，其中所述亲水性有机助溶剂选自2-巯基乙醇和二硫苏糖醇。
28.权利要求27所述的方法，其中所述亲水性有机助溶剂的浓度为至少1％。
29.权利要求23所述的方法，其中所述核酸是人基因组DNA，所述样品为体液。
30.权利要求23所述的方法，其中所述核酸是质粒DNA，所述样品是细胞培养物。
31.权利要求23所述的方法，其中所述固相进一步包括可裂解连接体部分，所述可裂解连接体部分将所述固体支持部分连接至所述核酸结合部分。
全文摘要
公开了分离核酸的方法，该方法包括将核酸结合至固相结合材料并通过用新型试剂组合物洗脱从所述固相释放结合的核酸。组合物特征在于高离子强度缓冲液或添加的亲水性有机助溶剂或两者。用于本发明的方法和组合物的优选的固相材料包括季核酸结合部分。
文档编号C07H21/02GK101027411SQ200580029851
公开日2007年8月29日 申请日期2005年6月30日 优先权日2004年7月15日
发明者H·阿哈万－塔夫帝, R·德西瓦, S·西利普拉普, R·汉德利 申请人:鲁米根公司