专利名称：重组蛋白amacr及其在制备前列腺癌诊断标记物上的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药生物研究领域，具体涉及分子和细胞生物学研究领域、免疫学研究领域以及疾病的诊断研究领域，更具体地涉及体外重组蛋白AMACR及其制备、抗AMACR抗体及其制备以及重组蛋白AMACR在制备前列腺癌诊断标记物上的应用。
背景技术：
前列腺癌是男性生殖系常见的恶性肿瘤。前列腺癌的发病率在国内外有很大差别欧美各国发病率极高，在高龄男性中仅次于肺癌(Reiter Robert E，(2002).Campbell′s Urology，Walsh PC，ed.Elsevier，pp.3003-30024.)；东方发病率比较低，但是近几年我国前列腺癌的发病率有上升的趋势。据估计，男性在青壮年时期，约有35％-40％患有不同程度的前列腺炎。前列腺疾病容易诱发前列腺癌。
通常诊断前列腺癌是采用筛选(screening)方法，包括血清前列腺特异性抗原测试法(serum prostate specific antigen testing，PSA)和直肠指检(digital rectalexamination，DRE)。目前这两种方法的组合是用于诊断早期前列腺癌的最佳方法。作为诊断标志物，全血清PSA浓度高于10ng/ml时疑似为前列腺癌；PSA浓度低于10ng/ml时，则较难判断(Stamey et al.，(2002).J.Urol.167，103-111.)。各项研究显示PSA筛选能够诊断70％-80％的前列腺癌，其中包括40％的无感觉肿瘤(Schroder，(2003)，Urol.Clin.North Am.30，239-51，viii.)。从中看出尽管PSA/DRE组合和前列腺活检使前列腺癌的诊断正确率达到80％，然而仍会遗漏大量肿瘤，尤其是无感觉肿瘤。
其次，应用PSA筛选来诊断前列腺癌尚存在以下几方面的不足。当全血清PSA在4ng/ml-10ng/ml(正常为0-2.5ng/ml)范围时1.在此范围内的男性需要做前列腺活检(Catalona et al.，(1994b)，J.Urol.151，1283-1290.)，然而在这种情况下最终被诊断为癌症的患者仅占22％-27％(Catalona et al.，(1993)，JAMA 270，948-954.；Djavanet al.，(2000)，J.Urol.163，1144-1148.)，原因可能是与前列腺癌无关的PSA的增高或者活检取样存在问题；2.活检诊断的假阴性比率达到25％(Cookson，(2000)，Mol.Urol.4，93-97.)，原因可能是取样时检体方向的随机性，因而有四分之三的处于这一浓度范围内的男性并不受益于这个过程(阴性并不排除癌症的存在)而且还会经历焦虑、不适、流血和感染这些副作用(Aus et al.，(1996)，Br.J.Urol.77，851-855.；Rietbergen et al.，(1997)，Urology 49，875-880.)；3.通常第一次活检显示为阴性的男性会被建议重复一次，但在复查过程中能检测出癌的比率仅为10％(Djavan et al.，(2003)，Urol.Clin.North Am.30，253-62，viii.)。当PSA浓度在2.5ng/ml-4ng/ml范围时有15％-40％的癌症被遗漏(Catalona et al.，(1997)，JAMA 277，1452-1455.；Schroder et al.，(2000)，J.Urol.163，806-812.)。当PSA浓度在2.5-3ng/ml范围时在此范围内的男性也被鼓励做活检(Catalona et al.，(1994a)，J.Urol.152，2037-2042.；Schroder et al.，(2000)，J.Urol.163，806-812.；Babaian et al.，(2000)，Urology 56，1000-1006.)。在上述这三个PSA浓度范围内，良性前列腺肿大的情况更为普遍，而且已发现PSA诊断在检测早期器官癌症上有很大的局限性(Canto et al.，(2003)，Urol.Clin.North Am.30，263-277.)。
另外，在过去50年里经男性尸体解剖发现40％的病例是死于前列腺癌(StollerML，Current Medical Diagnosis & Treatment 2002，M.S.P.M.Tierney LM，ed.LangeMedical Books/McGraw-Hill，pp.985-990.)，研究显示30％的50岁以上男性以及60％-70％的80岁以上男性是逐步在前列腺体中产生小肿瘤(Stoller ML，CurrentMedical Diagnosis & Treatment 2002，M.S.P.M.Tierney LM，ed.Lange MedicalBooks/McGraw-Hill，pp.985-990.)。据估计在这些患者中间，只有16％的病人是通过screening方法诊断出前列腺癌，并经放射线治疗而获益(McGregor et al.，(1998)，CMAJ.159，1368-1372.)。
因此，非常需要发展一种更为敏感和特异的方法来检测前列腺癌。
前列腺癌诊断的一个革命性方法是直观地估计肿瘤的存在和程度。理想的造影技术是能对患者伤害最小而且能够高精确度和特异性地检测出肿瘤的大小和位置。然而目前各种造影技术均无法达到这样的效果，包括TRUS、CT、核磁共振、MRS和放射线标记ProstaScint抗体成像技术(Moul et al.，(2001)，Urol.Clin.North Am.28，459-472.；Purohit et al.，(2003)，Urol.Clin.North Am.30，279-293.)。上述文献显示大量中间阶段的前列腺癌病人，即使是用各种综合的临床方法仍无法显示足够精确的肿瘤阶段和时期。因而需要一个新的方法来提高诊断的精确度和治疗的效果。
此时，肿瘤标志物的应用便应运而生了。肿瘤标志物是肿瘤细胞本身存在或分泌的特异性物质，对肿瘤的早期诊断、观察评价治疗的效果及判断愈后有极大的意义。一种合适的、用于前列腺癌的肿瘤标志物应该是一种基因产物——能够大量且持久地在前列腺癌以及大部分癌细胞中表达。AMACR就是符合这些条件的一个分子(Xu et al.，(2000)，Cancer Res.60，1677-1682.)。
AMACR，α-甲酰基-辅酶A消旋酶(α-methylacyl-CoA racemase，即P504S)，是一个在前列腺癌中持久且大量表达的蛋白质(Jiang et al.，(2001)，Am.J.Surg.Pathol.25，1397-1404.；Luo et al.，(2002)，Cancer Res.62，2220-2226.；Rubin et al.，(2002)，JAMA 287，1662-1670.)。AMACR是在支链脂肪酸以及它们的衍生物的β-氧化过程中起基本作用的一种酶(Swinnen et al.，(2002)，Int.J.Cancer 98，19-22.)，它能催化几种(2R)-甲基-支链脂酰辅酶A酯与(S)脂异构体之间的转化(Schmitz et al.，(1994)，Eur.J.Biochem.222，313-323.；Wanders et al.，(2001)，Biochem.Soc.Trans.29，250-267.)。
P504S/AMACR在前列腺癌的mRNA和蛋白质水平上均有大量表达(Xu et al.，(2000)，Cancer Res.60，1677-1682.)，其大量表达存在于癌的各个阶段和时期(Luo etal.，(2002)，Cancer Res.62，2220-2226.；Rubin et al.，(2002)，JAMA 287，1662-1670.)；同时研究表明，在95％甚至于100％的前列腺癌病例中，大部分腺体的AMACR经免疫染色后结果均呈阳性；而只有3％-12％的正常前列腺上皮细胞染色为微弱阳性(Jiang et al.，2001；Luo et al.，2002；Rubin et al.，2002)；PIN(前列腺内上皮肿瘤，一种前列腺癌的前体缺乏症)染色为阳性结果也很普遍(Beach et al.，(2002)，Eur.J.Nucl.Med.Mol.Imaging 29，933-938.；Luo et al.，(2002)，Cancer Res.62，2220-2226.；Rubin et al.，(2002)，JAMA 287，1662-1670.)，因此用AMACR来鉴定以及对初级前列腺肿瘤的定位有着无可比拟的优势(Yang et al.，2003)。同时，这种方法还能应用于穿刺活检中以辅助确定穿刺的方向、能估计肿瘤的程度以及帮助搜索癌的系统转移(Jiang et al.，(2002)，Am.J.Surg.Pathol.26，1169-1174.；Magi-Galluzzi et al.，(2003)，Am.J.Surg.Pathol.27，1128-1133.)。可见AMACR在临床上是一个应用意义极大的分子。
因此，制备AMACR抗体并将其应用于病理组织切片染色，会大大提高诊断前列腺癌的准确度。美国已有这方面的报道及应用，报道显示免疫动物所用的抗原是合成多肽。可是，由于多肽分子量小，属于半抗原，自身不能诱导抗体产生，必须通过物理吸附或化学合成法与载体结合后才能刺激机体产生抗体。合成免疫原性高的多肽抗原操作繁锁。
考虑到制备抗原的简易性以及获得更高效价的抗体，本发明者使用体外重组蛋白质作为抗原。本发明者应用分子克隆技术从人体前列腺癌细胞中克隆得到AMACR编码全基因，并在大肠杆菌中大量表达重组质粒pRSET-B-AMACR，获得重组蛋白AMACR。将所得重组蛋白作为抗原免疫家兔，制备得到抗AMACR抗体。将所得抗AMACR抗体应用于体外检测前列腺癌，从而完成了本发明。
因此，本发明的第一个目的是提供重组蛋白AMACR。
本发明的第二个目的是提供重组蛋白AMACR的制备方法。
本发明的第三个目的是提供抗AMACR抗体。
本发明的第四个目的是提供抗AMACR抗体的制备方法。
本发明的第五个目的是提供重组蛋白AMACR在制备前列腺癌诊断标记物上的应用。
本发明的第六个目的是提供前列腺癌的体外检测方法。
发明概述本发明第一方面提供的重组蛋白AMACR的氨基酸序列包含序列表中SEQ IDNO.1所示氨基酸序列。
本发明第二方面提供的重组蛋白AMACR的制备方法包括以下步骤1)提取雄性激素依赖型人癌细胞株LNCaP中所含总RNA，以其作为模板进行RT-PCR扩增，获得序列表中SEQ ID NO.2所示的AMACR编码全基因序列；2)构建增幅用重组质粒pDrive-AMACR；3)构建表达用重组质粒pRSET-B-AMACR；4)转化重组质粒pRSET-B-AMACR至宿主细胞中，并在宿主细胞中表达，得到表达产物重组蛋白AMACR；5)Ni-NTA树脂纯化表达产物重组蛋白AMACR。
本发明第三方面提供的抗AMACR抗体是以重组蛋白AMACR为抗原，经免疫动物后所得的抗体。
本发明第四方面提供的抗AMACR抗体的制备方法包括以下步骤1)以重组蛋白AMACR为抗原，多次免疫动物；
2)采集免疫后全血，分离得血清。获得抗AMACR抗体。
3)重组蛋白A琼脂糖凝胶快速分离树脂(rProtein A Sepharose Fast Flow)纯化所得抗体。
本发明的第五方面提供重组蛋白AMACR在制备前列腺癌诊断标记物上的应用。
本发明的第六方面提供的前列腺癌体外检测的方法包括以下步骤1)前列腺样品的固定、包埋及切片；2)脱蜡和水化；3)用抗AMACR抗体进行免疫组织化学染色；4)脱水、透明、封片及镜检。
发明详述本发明者首先对AMACR基因进行扩增，所得扩增产物与质粒载体pDrive构建成增幅用重组质粒pDrive-AMACR，转化、抽提质粒后，进行DNA测序鉴定；之后将质粒pDrive-AMACR与质粒载体pRSET-B通过酶切、回收及连接构建成在原核生物中表达的重组质粒pRSET-B-AMACR，转化、抽提质粒，DNA测序鉴定后将所得质粒转化于宿主细胞中大量表达，所得重组蛋白用Ni-NTA亲和层析树脂纯化；将纯化所得蛋白作为抗原，多次免疫家兔后，收集家兔血清，所得血清经纯化后得到抗AMACR抗体；将所得抗体应用于免疫组织化学染色。
1.AMACR基因的克隆从雄性激素依赖型人癌细胞株LNCaP中抽提出总RNA。以序列表中SEQ IDNO.3所示的DNA序列为5’端引物、SEQ ID NO.4所示的DNA序列为3’端引物，经RT-PCR技术扩增得编码AMACR的全基因序列。
将所得AMACR基因PCR片段与质粒载体pDrive酶切连接，构建成增幅用重组质粒pDrive-AMACR。将此重组质粒转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，培养后涂布于含有氨苄青霉素(Amp)的LB平板上。挑取单克隆进行培养，抽提菌体中所含质粒，进行DNA测序鉴定。
2.构建可在宿主细胞中表达的重组质粒pRSET-B-AMACR挑选上述经DNA测序鉴定正确的质粒与表达载体pRSET-B酶切连接，构建成表达重组质粒pRSET-B-AMACR。将此重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞中，培养后涂布于含有Amp和氯霉素的LB平板上，只有带有pRSET-B-AMACR的克隆才能在此平板中生长。挑取单克隆进行培养，抽提菌体中所含质粒，进行DNA测序鉴定，确认在克隆过程中AMACR基因没有发生变异及蛋白读取框正确。
3.重组质粒pRSET-B-AMACR在大肠杆菌中的表达与重组蛋白的制备挑选上述经DNA测序鉴定正确的质粒，于含有Amp和氯霉素的LB培养液中培养过夜，隔天转种至新鲜的上述培养液中培养菌液至对数生长期，加入诱导剂继续培养，最后收集菌体沉淀。用变性剂溶解所得菌体沉淀，离心后保留上清液。由于重组质粒含有6×His，因此选用Ni-NTA亲和层析树脂纯化所得上清液。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定诱导表达及纯化结果。
4.重组蛋白AMACR接种家兔诱导免疫反应及所得抗体的纯化以所得重组蛋白为抗原，对家兔进行颈部皮下多点注射免疫，整个免疫过程分四次进行。第一次将抗原与完全福氏佐剂混和后注射，第二、三、四次将抗原与不完全福氏佐剂混和后注射，每次免疫注射间隔时间为28-30天。待第一次免疫后100天采集家兔全血，分离血清获得抗体。用rProtein A Sepharose Fast Flow纯化所得抗体，透析纯化产物。
5.抗AMACR抗体应用于免疫组织化学染色及标记物的检测待测前列腺样品经福尔马林固定、包埋、切片、脱蜡水化及微波炉抗原修复后进行免疫组织化学染色，再经脱水、透明及封片后进行镜检。上述免疫组织化学染色步骤均为常规方法。
本发明有如下优点本发明者选用Invitrogen的pRSETA，B，C Kit构建重组蛋白。这是一个专门用于在大肠杆菌中高水平表达重组蛋白质的工具包。其中pRSET是从pUC-衍生出的专门用于在大肠杆菌中高水平表达和纯化重组蛋白质的载体。
本发明者在构建重组质粒pRSET-B-AMACR时，将(小)牛小肠碱性磷酸(酯)酶(calf intestinal alkaline phosphatase，CIAP)作用于双酶切后的pRSET-B质粒。其中，CIAP破坏开环后碱基末端的磷酸基，阻止载体的自我环化，大大提高了连接的效率。
本发明者将重组蛋白与佐剂混合后进行免疫。这种组合方式使抗原充分发挥其免疫原性，从而所得抗体具特异性高，亲和力大的特点。
本发明者通过标记物检测，所得结果显示通过染色能很好的区分正常的前列腺切片和癌症患者的前列腺切片，并且其染色有效率达到90％以上，也就是说在免疫组化染色过程中，每100例正常的前列腺切片的假阳性率低于10％。因此病理医生能利用被染色的患者组织切片来辅助进行前列腺癌的诊断。
图1是AMACR全基因序列的扩增结果。
图2是重组蛋白AMACR的诱导结果。
图3是重组蛋白AMACR的纯化结果。
图4是前列腺样品的镜检结果。
具体实施方案下面用实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明有任何限制。本领域技术人员在本说明书的启示下对本发明实施中所作的任何变动都将落在权利要求书的范围内。
实施例1 AMACR基因的克隆1).材料细胞株LNCaP是一种雄性激素依赖型人细胞株，是为数不多的几个前列腺癌研究的常用癌细胞株的一种。
培养液DMEM是GIBCO的产品，利用前需要添加10％的FBS。
2).步骤a.抽提总RNA用Rneasy Micro Kit(Qiagen公司)从LNCaP细胞中提取总RNA。
b.RT-PCR扩增AMACR基因用One Step RT-PCR Kit(Qiagen公司)对步骤a所得RNA进行AMACR基因的扩增。
引物的设计Primer A5’GAGCTCGGCA CTGCAGGGCA TCTCGPrimer B5’GGTACCAAAT TCACTTGAGC CGTGGGCC引物Primer A(序列表中SEQ ID NO.3所示)为增幅AMACR基因的5’端引物，其中引入了Sac I酶切位点GAGCTC；
引物Primer B(序列表中SEQ ID NO.4所示)为增幅AMACR基因的3’端引物，其中引入KpnI酶切位点GGTACC。
反应体系(总体积50μl)
反应条件
其中变性、退火和伸长反应为35个循环。
AMACR基因序列的扩增结果见图1。其中，泳道1为PCR参照分子量；泳道2为AMACR基因的PCR扩增条带。结果显示，泳道2所示条带大小约为1149bp，与预计结果相符。
实施例2 AMACR基因PCR产物的测序验证1)pDrive-AMACR增幅质粒的构建用PCR Cloning Kit(Qiagen公司)将实施例1所得AMACR基因与pDrive载体进行连接。
连接体系(总体积10μl)
反应条件将上述连接体系于16℃中反应30min。
2)重组质粒pDrive-AMACR转化入大肠杆菌DH5α中进行筛选
缓慢解冻PCR Cloning Kit中所提供的大肠杆菌DH5α感受态细胞后，加入1μl步骤1)所得连接液。冰浴30分钟；42℃热休克40秒；冰浴2分钟之后，加入LB培养基，于37℃孵化1小时，随后涂布于含有100μg/ml的Amp的LB平板上，培养皿倒置于37℃中培养12小时以上，直到长出明显的菌落为止。
挑选5个菌落，于5ml含有Amp的LB液体培养基中培养过夜，用QIAprep SpinMiniprep kit(Qiagen公司)抽提菌体中所含重组质粒。DNA测序鉴定所得质粒的DNA序列。
测序鉴定结果显示，与预计结果一致，含有完整的未变异的AMACR基因。
实施例3 在原核生物中表达的重组质粒pRSET-B-AMACR的构建1)材料试剂盒pRSETA，B，C Kit(Invitrogen公司)，这是一个专门在大肠菌中高水平表达重组蛋白质的工具包。
表达载体pRSET，这是一个从pUC-衍生出来的专门用于大肠杆菌中高水平表达和纯化重组蛋白质的载体。
2)步骤(具体步骤见操作手册)a.酶切用Sac I和Kpn I酶于37℃中分别消化pDrive-AMACR和pRSET-B，反应2小时以上，直到被完全切断为止。
b.AMACR基因的回收纯化用MinElute Gel Extraction Kit(Qiagen公司)抽提双酶切后所得的目标片段。
c.pRSET-B载体的回收纯化双酶切后的pRSET-B质粒经纯化去除这两种酶的活性后，加入CIAP并于37℃中反应1小时，破坏开环后碱基末端的磷酸基，阻止载体的自我环化，再纯化，去除CIAP酶活性。
d.连接反应体系(总体积20μl)
反应条件将上述连接体系于16℃中反应30min。
实施例4 pRSET-B-AMACR表达载体的鉴定根据实施例2中步骤2)的方法，将实施例3所得连接产物转化入大肠杆菌BL21(DE3)pLys S菌株中，并且抽提菌体所含的重组表达质粒。用DNA测序方法来鉴定所得质粒。
测序鉴定结果显示，与预计结果一致，并未发生变异，且蛋白读取框正确。
实施例5 AMACR重组表达质粒在大肠杆菌中的诱导表达由于只有带有pRSET-B-AMACR的克隆才能在含有Amp和氯霉素的培养基中存活，因此可挑取平皿上的单菌落，于3ml含有50μg/ml Amp和35μg/ml氯霉素的LB培养基中，37℃震荡培养过夜。随后转种至25ml的培养基(不含抗菌素)中，使所得菌液的OD600约为0.1。继续培养至OD600＝0.4时，取出1ml菌液作为对照，其余菌液加入终浓度为1mM的异丙基β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-Dthiogalactoside，IPTG)诱导T7RNA聚合酶(T7RNA polymerase)的表达。对照菌液和诱导菌液继续培养，培养温度为25℃，诱导时间为20小时，使所得菌液的OD600为1。收集菌体。
重组蛋白AMACR的诱导电泳图谱见图2。其中，泳道1为未诱导表达的重组质粒pRSET-B-AMACR；泳道2为标准分子量蛋白；泳道3及泳道4均为诱导表达的重组质粒pRSET-B-AMACR。结果显示，在分子量为46KDa处，诱导后的菌体较诱导前的菌体呈现出明显表达条带，此处即为重组蛋白AMACR，分子量大小与理论值相符。
实施例5 AMACR重组蛋白的纯化1)使用试剂纯化试剂盒为The QIAexpressionist Kit(Qiagen公司)。包含缓冲液A-E、2×SDS-PAGE样品缓冲液、Ni-NTA树脂以及空层析柱。
2)步骤a.破碎将实施例4所得菌体沉淀按照每克湿菌体加入5ml缓冲液的比例加入一定量的缓冲液B，充分混匀后于12,000rpm离心20分钟，收集上清液。
b.纯化取5倍柱体积的缓冲液B平衡树脂。取4ml步骤a所得上清液与1ml 50％的Ni-NTA树脂结合，室温轻柔混合15分钟以上。收集流穿液。用5ml的缓冲液C洗涤两次，直至OD280低于0.01。用0.5ml的缓冲液D洗脱4次后，再用0.5ml的缓冲液E洗脱4次。收集所有洗脱液。
c.SDS-PAGE鉴定表达与纯化预制胶——Bis-Tris-HCl(pH 6.4)聚丙烯酰胺凝胶制备(Invitrogen公司提供)。
电泳条件200V。染色考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)R-250染色。
重组蛋白AMACR的纯化结果见图3。其中，泳道1为标准分子量蛋白；泳道2为纯化蛋白(浓度为1×)；泳道3为纯化蛋白(浓度为1/2×)；泳道4为纯化蛋白(浓度为1/4×)；泳道5为纯化蛋白(浓度为1/8×)。结果显示，经洗脱得到的纯化蛋白，其分子量约为46KDa，与理论值相符。经DC Protein Assay Kit(BioRad公司)测定，所得纯化蛋白(浓度为1×)的浓度为300μg/ml。
实施例6 AMACR重组蛋白接种家兔诱导免疫反应1)家兔数量两只。
2)抗原注射量每只家兔需要50-200μg实施例5所得抗原。
3)免疫步骤a.第一次免疫免疫原根据2)所示抗原注射量，取等倍体积的完全福氏佐剂(Sigma公司)与之混合，于6000转/分搅拌机上搅拌5分钟，使两者充分混匀，待注射家兔；免疫注射方式家兔颈部皮下多点注射；b.第二次免疫免疫时间第一次免疫之后的28-30天后；免疫原根据2)所示抗原注射量，取等倍体积的不完全福氏佐剂(Sigma公司)与之混合，于6000转/分搅拌机上搅拌5分钟，待两者充分混匀，待注射家兔；免疫注射方式家兔颈部皮下多点注射；c.第三次免疫免疫时间第一次免疫之后的58-60天后；免疫原同步骤b.所示免疫原；免疫注射方式同步骤b.所示方式；d.第四次免疫
免疫时间第一次免疫之后的88-90天后；免疫原同步骤b.所示免疫原；免疫注射方式同步骤b.所示方式；e.采家兔血获得抗体采血时间第一次免疫之后的第100天；抗体的获得离心所得家兔全血，收集血清，所得抗体待纯化。
实施例7 AMACR重组蛋白免疫家兔后所得抗体的纯化1)试剂和材料a.rProtein A Sepharose Fast Flow(Amersham Biosciences#17-1279-01)；b.0.1M Tris-HCl，pH 8.0；c.0.05M甘氨酸-盐酸，pH 2.8；d.1M Tris-HCl，pH 8.02)纯化步骤a.树脂平衡用10倍柱体积的0.1M Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液平衡树脂；b.上样根据实施例6所得血清量，加入等倍体积的0.1M Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液，混匀后上样；c.洗涤用0.1M Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液洗涤，至流穿液的OD280＜0.05；d.洗脱用0.05M甘氨酸-盐酸(pH 2.8)缓冲液分管洗脱，收集洗脱液；e.透析将步骤d.所得洗脱液按1∶10的比例加至含有1M Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液的试管内，测定OD280；合并OD280＞0.1的洗脱所得液，随后于1×PBS中透析过夜。
通过测定透析所得抗体OD280，换算得到抗体的浓度，即抗体浓度(mg/ml)＝OD280×0.8。结果显示，抗体OD280＝1，则抗体浓度(mg/ml)＝0.8mg/ml实施例7 免疫组织化学染色1)前列腺样品的固定通常利用福尔马林来固定样品。
2)切片通常制作6μm厚的切片。
3)染色a.脱蜡和水化脱蜡前，将组织切片在60℃恒温箱中烘烤30～60分钟；组织切片置于二甲苯中浸泡5分钟，更换二甲苯后再浸泡5分钟；无水乙醇中浸泡3分钟，更换无水乙醇再浸泡3分钟；95％乙醇中浸泡3分钟；80％乙醇中浸泡3分钟；70％乙醇中浸泡3分钟；纯水中浸泡3分钟；PBS缓冲液中浸泡3分钟；3％H2O2(80％甲醇)滴加在组织样品上，室温静置10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性；PBS洗涤2次各5分钟。
b.微波炉抗原修复将步骤a所得组织切片放入0.01M枸橼酸钠缓冲液(pH6.0)，于微波炉中加热至沸腾，保持沸腾5～6分钟；在缓冲液中冷却30分钟；PBS洗涤2次各5分钟。
c.免疫组织化学染色在步骤b所得组织切片中滴加正常山羊血清封闭液(不可有气泡)，室温反应45分钟；滴加I抗，(即抗AMACR抗体，1∶100稀释)50μl，4℃反应过夜；用PBS缓冲液洗涤2次各10分钟；滴加II抗(山羊抗家兔，1∶200稀释)40～50μl，室温静置1小时；PBS缓冲液洗涤2次各10分钟；DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度；自来水冲洗10分钟；苏木精复染2分钟后，放在PBS缓冲液中直到变蓝，随后用自来水冲洗。
d.脱水、透明、封片、镜检将步骤c所得组织切片依次于70％乙醇中浸泡3分钟；80％乙醇中浸泡3分钟；95％乙醇中浸泡3分钟；无水乙醇中浸泡3分钟，更换无水乙醇再浸泡3分钟；置于二甲苯中浸泡5分钟，更换二甲苯后再浸泡5分钟；最后封片。
实施例8 标记物的检测根据正常组织不被染色、癌组织被染成棕色的显色反应，结合实施例7所得结果，即可确定待测前列腺样品是否癌变。
前列腺样品镜检结果见图5。其中，A为细胞角蛋白；B为癌细胞；C为癌细胞(High Grade)；D为正常细胞；E为正常细胞。根据结果显示，未着色细胞为正常细胞，深色为癌细胞。
SEQUENCE LISTING<110>上海普洛康裕药物研究院有限公司张，辉罗，宏伟<120>重组蛋白AMACR及其在制备前列腺癌诊断标记物上的应用<130>CN051013<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>382<212>PRT<213>人工合成<400>1Met Ala Leu Gln Gly Ile Ser Val Met Glu Leu Ser Gly Leu Ala Pro1 5 10 15Gly Pro Phe Cys Ala Met Val Leu Ala Asp Phe Gly Ala Arg Val Val20 25 30Arg Val Asp Arg Pro Gly Ser Arg Tyr Asp Val Ser Arg Leu Gly Arg35 40 45Gly Lys Arg Ser Leu Val Leu Asp Leu Lys Gln Pro Arg Gly Ala Ala50 55 60Val Leu Arg Arg Leu Cys Lys Arg Ser Asp Val Leu Leu Glu Pro Phe65 70 75 80Arg Arg Gly Val Met Glu Lys Leu Gln Leu Gly Pro Glu Ile Leu Gln85 90 95Arg Glu Asn Pro Arg Leu Ile Tyr Ala Arg Leu Ser Gly Phe Gly Gln100 105 110Ser Gly Ser Phe Cys Arg Leu Ala Gly His Asp Ile Asn Tyr Leu Ala115 120 125Leu Ser Gly Val Leu Ser Lys Ile Gly Arg Ser Gly Glu Asn Pro Tyr130 135 140Ala Pro Leu Asn Leu Leu Ala Asp Phe Ala Gly Gly Gly Leu Met Cys145 150 155 160Ala Leu Gly Ile Ile Met Ala Leu Phe Asp Arg Thr Arg Thr Asp Lys165 170 175Gly Gln Val Ile Asp Ala Asn Met Val Glu Gly Thr Ala Tyr Leu Ser180 185 190Ser Phe Leu Trp Lys Thr Gln Lys Ser Ser Leu Trp Glu Ala Pro Arg195 200 205Gly Gln Asn Met Leu Asp Gly Gly Ala Pro Phe Tyr Thr Thr Tyr Arg210 215 220
Thr Ala Asp Gly Glu Phe Met Ala Val Gly Ala Ile Glu Pro Gln Phe225 230 235 240Tyr Glu Leu Leu Ile Lys Gly Leu Gly Leu Lys Ser Asp Glu Leu Pro245 250 255Asn Gln Met Ser Met Asp Asp Trp Pro Glu Met Lys Lys Lys Phe Ala260 265 270Asp Val Phe Ala Lys Lys Thr Lys Ala Glu Trp Cys Gln Ile Phe Asp275 280 285Gly Thr Asp Ala Cys Val Thr Pro Val Leu Thr Phe Glu Glu Val Val290 295 300His His Asp His Asn Lys Glu Arg Gly Ser Phe Ile Thr Ser Glu Glu305 310 315 320Gln Asp Val Ser Pro Arg Pro Ala Pro Leu Leu Leu Asn Thr Pro Ala325 330 335Ile Pro Ser Phe Lys Arg Asp Pro Phe Ile Gly Glu His Thr Glu Glu340 345 350Ile Leu Glu Glu Phe Gly Phe Ser Arg Glu Glu Ile Cys Gln Leu Asn355 360 365Ser Asp Lys Ile Ile Glu Ser Asn Lys Val Lys Ala Ser Leu370 375 380<210>2<211>1149<212>DNA<213>人工合成<400>2atggcactgc agggcatctc ggtcatggag ctgtccggcc tggccccggg cccgttctgt60gctatggtcc tggctgactt cggggcgcgt gtggtacgcg tggaccggcc cggctcccgc120tacgacgtga gccgcttggg ccggggcaag cgctcgctag tgctggacct gaagcagccg180cggggagccg ccgtgctgcg gcgtctgtgc aagcggtcgg atgtgctgct ggagcccttc240cgccgcggtg tcatggagaa actccagctg ggcccagaga ttctgcagcg ggaaaatcca300aggcttattt atgccaggct gagtggattt ggccagtcag gaagcttctg ccggttagct360ggccacgata tcaactattt ggctttgtca ggtgttctct caaaaattgg cagaagtggt420gagaatccgt atgccccgct gaatctcctg gctgactttg ctggtggtgg ccttatgtgt480gcactgggca ttataatggc tctttttgac cgcacacgca ctgacaaggg tcaggtcatt540gatgcaaata tggtggaagg aacagcatat ttaagttctt ttctgtggaa aactcagaaa600tcgagtctgt gggaagcacc tcgaggacag aacatgttgg atggtggagc acctttctat660acgacttaca ggacagcaga tggggaattc atggctgttg gagcaataga accccagttc720tacgagctgc tgatcaaagg acttggacta aagtctgatg aacttcccaa tcagatgagc780atggatgatt ggccagaaat gaagaagaag tttgcagatg tatttgcaaa gaagacgaag840
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权利要求
1.重组蛋白AMACR，其特征在于包含序列表中SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。
2.重组蛋白AMACR的制备方法，其特征在于包括以下步骤1)提取雄性激素依赖型人细胞株LNCaP中所含总RNA，以其作为模板进行RT-PCR扩增，获得序列表中SEQ ID NO.2所示的AMACR全基因序列；2)构建增幅用重组质粒pDrive-AMACR；3)构建表达用重组质粒pRSET-B-AMACR；4)转化重组质粒pRSET-B-AMACR至宿主细胞中，并在宿主细胞中表达，获得重组蛋白AMACR。
3.如权利要求2所述的制备方法，其中还包括纯化步骤。
4.如权利要求3所述的制备方法，其中所述的纯化步骤采用Ni-NTA树脂。
5.抗AMACR抗体，其特征在于以重组蛋白AMACR为抗原，经免疫动物后所得的抗体。
6.抗AMACR抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤1)以重组蛋白AMACR为抗原，多次免疫动物；2)采集免疫后全血，分离得血清，获得抗AMACR抗体。
7.如权利要求6所述的制备方法，其中所述抗原还包括免疫佐剂。
8.如权利要求6所述的制备方法，其中还包括采用rProtein A Sepharose Fast Flow树脂进行纯化的步骤。
9.权利要求1所述重组蛋白AMACR在制备前列腺癌诊断标记物上的应用。
10.前列腺癌的体外检测方法，其特征在于包括以下步骤1)前列腺样品的固定、包埋及切片；2)脱蜡和水化；3)用抗AMACR抗体进行免疫组织化学染色；4)脱水、透明、封片及镜检。
全文摘要
本发明提供AMACR的基因序列及其获得方法、可在宿主细胞表达的重组质粒pRSET－B－AMACR及其获得方法、在宿主细胞中表达的重组蛋白AMACR及其制备方法。本发明还提供以重组蛋白AMACR与佐剂的混合物为抗原免疫动物的过程，以及免疫所得抗体及其制备方法。本发明还提供重组蛋白AMACR在制备前列腺癌诊断标记物上的应用。
文档编号C07K16/18GK101077886SQ20061002684
公开日2007年11月28日 申请日期2006年5月25日 优先权日2006年5月25日
发明者张辉, 罗宏伟 申请人:上海普洛康裕药物研究院有限公司, 张辉, 罗宏伟