专利名称：人α2干扰素与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品的制作方法
技术领域：
人α2干扰素与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品，属于长效融合蛋白药物技术领域。
背景技术：
人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)是血浆中的主要蛋白成分，在血浆中的浓度为40mg/ml(Phillip P.Minghettis et al.，THE JOURNAL OFBIOLOGICAL CHEMISTRY，1986 2616747-6757)，它除了具有维持血浆渗透压功能外，还能结合内源性和/或外源性配体，包括激素、有毒代谢产物、药物等。通过结合这些配体，HSA可以调节激素活性、内源性和外源性物质的毒性和药物的利用度(Ji-Sook Ha et al.，Biochimica et Biophysica Acta，20031640119-128)。David S.Park等构建的Half HSA(截取HSA的前297氨基酸残基)具有野生型HSA相应区类似的二级结构，同时保留了野生型HSA结合甲状腺素和甲状腺素类似物的能力(David S.Park et al.，IUBMB Life，1999 48169-174)。细胞中刚翻译出来的人血清白蛋白具有典型的pre-pro-protein结构，它包括18个氨基酸残基的信号肽和6个氨基酸残基前肽的原肽。信号肽和前肽在转运和分泌的过程中被切除，成熟的HSA由585个氨基酸残基组成，含有17对二硫键，分子量约为66.5KDa。通常情况下，HSA为非糖基化蛋白，然而有的突变体中也存在N-连接糖基化(见Uniprot中的protein ALBU_HUMAN)。Peters的观点认为进化出大分子蛋白的优点是减小其在内循环时经肾排泄(Peters T.Jr.，Adv.Protein Chem.，198537161-245)。HSA的分子量相对较大，在正常情况下，不易被肾小球滤过，其血浆半衰期在20天左右。
人干扰素(Interferon，IFN)分为I型和II型两类，I型干扰素主要包括IFNα、IFN β，两者共用同一个受体，且对热和pH的耐受能力较强。II干扰素包括IFN γ。IFN α是有由白细胞产生，包括至少25种以上的亚型，这些亚型具有相似的结构特点分子量均在16～27.6kDa之间，等电点约5～7，氨基酸残基数165和166，有两对二硫键(C1-C98，C29-C138或C1-C99，C29-C139)，二硫键对IFN α蛋白的正确折叠和生物学活性十分重要，只有少数几个IFN α亚型有糖基化。本发明所涉及的IFN α2，为IFN α家族中的成员，它存在三形式，即IFN α2a、IFN α2b和IFN α2c，因为它们具有优越的抗病毒、抗肿瘤和调节机体免疫功能而被广泛地应用于治疗病毒性疾病和肿瘤。临床上常用的IFNα2a和IFN α2b，由于分子量较小，易被肾小球滤过，从而导致它的血浆清除率高、体内半衰期短(皮下给药或肌肉注射的半衰期一般在8小时左右)，生物利用度低。为了达到治疗效果，一般需要频繁大剂量用药，如隔日一次，每次8×106IU，而慢性病毒性肝炎周期较长(一般在六个月以上)，频繁大剂量用药不仅增加了病人的痛苦和治疗费用，而且容易产生毒副作用。为了克服上述缺点，可以对干扰素加以修饰，以延长其半衰期。主要方法有剂型改造、利用化学手段修饰(如用PEG，葡聚糖修饰)、利用基因工程手段，将其与其它大分子蛋白融合。Tse Wen Chang等利用干扰素与人免疫球蛋白IgG的Fc融合以达到延长半衰期的目的(Tse Wen Chang et al.，美国专利US5908626，1999-01-01)。由于人IgG存在同种异型，在用药者体内可能产生相应的抗体而降低该融合蛋白的疗效，本发明拟将α2干扰素与人血清白蛋白融合。
发明内容
本发明的目的是提供一种人α2干扰素与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品。本发明的融合蛋白在保持了人α2干扰素的生理特性的基础上延长其在体内的半衰期，在药学领域有良好的应用前景。
本发明的技术方案人α2干扰素与人血清白蛋白的融合蛋白的制备是IFNα2 cDNA通过RT-PCR从经新城鸡瘟病毒诱导的人淋巴细胞RNA中直接扩增得到；HSA cDNA通过PCR从人胎肝cDNA文库中扩增获得；获得的IFN α2cDNA和HSAcDNA分别插入到克隆载体中，测序。利用重叠PCR技术，连接IFN α2cDNA和HSA cDNA，中间不加入任何连接肽，得到的HSA-IFN α2cDNA融合基因插入到克隆载体中保存；利用毕赤酵母分泌型表达载体将HSA-IFN α2cDNA融合基因整合到宿主的染色体中进行表达。
IFNα2 cDNA的克隆，HSA cDNA的克隆，IFNα2 cDNA和HSA cDNA的连接，融合蛋白HSA-IFN α2的酵母表达系统构建和融合蛋白HSA-IFN α2的表达的步骤详见实施例。
用上述方法制备的人α2干扰素与人血清白蛋白的融合蛋白，包括与人α2干扰素至少85％序列同源的第一区和与人血清白蛋白至少85％序列同源的第二区或人血清白蛋白的部分氨基酸序列第二区；所述与人α2干扰素同源的第一区位于融合蛋白的N末端，所述与人血清白蛋白同源的第二区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽；或所述与人血清白蛋白同源的第二区位于融合蛋白的N末端，所述与人α2干扰素同源的第一区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽。
优选的是所述融合蛋白包括与人α2干扰素至少95％序列同源的第一区和与人血清白蛋白至少95％序列同源的第二区。
所述融合蛋白的第二区可以由人血清白蛋白部分结构域组成、经结构域重排后的人血清白蛋白组成，包括其所有HSA天然存在的多态型外，还包括HSA的部分片段，如EP322094中所述名为HSA(1-n)，n为369-419。
所述融合蛋白包括与人α2干扰素氨基酸残基序列相同的第一区和与人血清白蛋白氨基酸残基序列相同的第二区，或上述二区的功能等同物。
所述功能等同物是在不改变所述融合蛋白特性的前提下，对融合蛋白个别氨基酸残基的取代、缺失或加入得到的多肽。
宿主表达系统是细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞、植物细胞表达系统。优选的宿主表达系统是酵母。优选的酵母是毕赤酵母。优选的毕赤酵母是毕赤酵母KM71。
IFN α2 cDNA可以通过RT-PCR从经新城鸡瘟病毒诱导的人淋巴细胞RNA中直接扩增得到。HSA cDNA可以通过PCR从人胎肝cDNA文库中扩增获得。IFN α2cDNA和HSA cDNA也可以通过人工合成的方法获得。该法可以人为地选择宿主偏好的密码子，以使目的基因高效表达。获得的IFN α2 cDNA和HSA cDNA分别插入到克隆载体中，测序。利用重叠PCR技术，连接IFN α2cDNA和HSA cDNA，中间不加入任何连接肽，得到的IFN α2cDNA和HSA cDNA融合基因插入到克隆载体中保存。
IFN α2cDNA和HSA cDNA融合基因可以在多个系统中表达，如细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞、植物细胞，及生物体(如脊椎动物、昆虫等)等。在这些表达系统中目的基因被整合到宿主的染色体中或插入到质粒中。本发明优选的是酵母表达系统，该系统除了具备原核表达系统的易操作、生长迅速、营养要求简单、易工业放大的特点外，还具有真核细胞的蛋白后修饰系统，有利于大量生产高质量的重组蛋白。更优选的是毕氏酵母表达系统，和酿酒酵母表达系统相比，毕氏酵母表达系统在蛋白分泌和糖基化方面具有明显的优势。毕氏酵母自身分泌地蛋白少，十分有利于纯化；糖基化程度低，避免了酿酒酵母超糖基化带来的免疫源性问题。
毕氏酵母表达系统分泌型表达载体主要有pPIc9，pPIc9k，pHIL-S1，pPIcZa，pYAM75P6；胞内型表达载体主要有pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa等，优选的是毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K，它是酵母整合载体，带有His缺陷型的选择性标记基因HIS4、AOX1启动子、MFα分泌信号肽和G418抗性基因(可作为筛选重组子的标记)等元件。AOX1启动子是一个强启动子，可以高效的启动目的基因的表达。在毕氏酵母里共编码两种乙醇氧化酶，AOX1和AOX2，细胞中绝大多数乙醇氧化酶的活力是由AOX1提供。在甲醇为唯一碳源培养的细胞中，该酶可占细胞总蛋白的30％以上。AOX2与AOX1的同源性虽然高达97％，但酶活很低。当AOX1基因缺失，只存在AOX2时，大部分的乙醇氧化酶活力丧失，细胞利用甲醇能力降低，细胞在甲醇为唯一碳源的培养基上生长很慢。
带有IFN α2 cDNA和HSA cDNA融合基因的表达载体可以通过转化锂盐法、PEG法、原生质体法或电穿孔法转化宿主细胞。成功转化的细胞，即带有本发明构建的DNA的细胞，可以通过本领域熟知的方法加以鉴定，如收集细胞，裂解后提取DNA，然后进行Southern杂交和PCR鉴定，也可在诱导表达后用HSA抗体和/或IFN α2a、IFN α2b、IFN α2c抗体检测培养液上清。
本发明的有益效果利用重叠PCR技术，连接IFN α2 cDNA和HSA cDNA，中间不加入任何连接肽，以避免因连接肽加入而带来的融合蛋白稳定性(避免针对连接肽的蛋白酶降解)和免疫原性方面的问题。
优选的酵母表达系统除了具备原核表达系统的易操作、生长迅速、营养要求简单、易工业放大的特点外，还具有真核细胞的蛋白后修饰系统，有利于大量生产高质量的重组蛋白。更优选的是毕酵母表达系统，和酿酒酵母表达系统相比，毕赤酵母表达系统在蛋白分泌和糖基化方面具有明显的优势。毕赤酵母自身分泌地蛋白少，十分有利于纯化；糖基化程度低，避免了酿酒酵母超糖基化带来的免疫源性问题。
可以通过培养带有本发明构建的DNA的宿主细胞，来生产本发明的融合蛋白。宿主细胞培养优选在生物反应器上进行，培养分两个阶段，第一阶段主要用于宿主细胞生长，第二阶段主要用于产物合成。可以用各种蛋白分离的方法自含有本发明DNA构建体的细胞培养物中分离、纯化融合蛋白。如盐析、沉淀、超滤、层析、制备电泳等技术及这些技术的组合。
1.pPIC9K-HSA-IFN α2构建2.融合蛋白HSA-IFN α2b的SDS-PAGE分析3.融合蛋白HSA-IFN α2b的HSA抗体检测(Western blot)4.融合蛋白HSA-IFN α2b的抗病毒活性5.HSA-IFN α2b在小鼠体内代谢的药时曲线具体实施方法实施例1IFN α2 cDNA的克隆取正常人外周血加淋巴细胞分离液，分离出人血白细胞，用含有5％胎牛血清的DMEM培养基稀释至细胞浓度为5×107个/ml，加入新城鸡瘟病毒到100血凝单位/ml，37℃，5％CO2，培养1小时，使病毒吸附在细胞上，1000×g离心弃上清，加入新鲜的有5％胎牛血清的DMEM培养基，37℃，5％CO2，培养18小时。用RNA提取试剂盒分离总RNA，后用一步法RT-PCR试剂盒(购自大连宝生物公司)，反转录为cDNA并从中扩增出IFN α2，所用的引物如下Pa2b15’-AGAGTCGACATGTGTGATCTGCCTCAA-3’Pa2b25’-GCCAAGCTTTCATTCCTTACTTCTTAAACT-3’一步法RT-PCR反应体系配制如下
在MJ Research公司的PTC-100TMPCR仪上，条件为50℃30min，94℃充分变性2分钟，94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸90秒，循环30次。
通琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现预期大小(约0.5kb)的条带。用PCR片段胶回收试剂盒(购自北京博大泰克生物基因技术有限公司，下同)纯化出0.5kb的目标片段。纯化好的目标片段和载体pBlueScript II KS(+)，经SalI和HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收。取双酶切后纯化好的IFN α2cDNA 9μl，pBlueScript II KS(+)1μl，加入2μl 10×ligation buffer，0.4μl T4连接酶，加双蒸水补齐20μl，15℃反应过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板，37℃培养过夜。挑取白色菌落，接种于20ml氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基中37℃培养过夜，用常规方法提取质粒。通过PCR，及SalI和HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对SalI-HindIII区进行DNA测序。阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃。重组质粒命名为pBlue-IFN α2，阳性重组子命名为DH5α/pBlue-IFN α2。
实施例2HSA cDNA的克隆利用PCR从人胎肝cDNA文库中扩增出HSA cDNA。所用的引物为HSA15’-AGAGTCGACGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3’HSA25’-GCCAAGCTTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3’PCR方法如下50μl的反应体系中加入10μmol/L的HSA1和HSA2的引物各3μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl(dNTP、10×pfu Buffer和pfu DNA聚合酶均购自上海生物工程技术服务公司，下同)，人胎肝cDNA文库1μg，加双蒸水补齐50μl。在MJResearch公司的PTC-100TMPCR仪上，PCR条件为95℃充分变性5分钟，94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸90秒，循环30次。
通琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现预期大小(约1.8kb)的条带。用PCR片段胶回收试剂盒纯化出1.8kb的目标片段。纯化好的目标片段和载体pBlueScript II KS(+)，经SalI和HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收。取双酶切后纯化好的HSA cDNA 9μl，pBlueScript II KS(+)1μl，加入2μl 10×ligation buffer，0.4μl T4连接酶，加双蒸水补齐20μl，15℃反应过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板，37℃培养过夜。挑取白色菌落，接种于20ml氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基中37℃培养过夜，用常规方法提取质粒。通过PCR，及SalI和HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对SalI-HindIII区进行DNA测序。阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃。重组质粒命名为pBlue-HSA，阳性重组子命名为DH5α/pBlue-HSA。
实施例3HSA cDNA和IFN α2 cDNA融合片段的克隆HSA cDNA的PCR扩增所用引物如下Pf15’-CCCTCCGAATTCAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCT-3’Pf25’-TGGGTTTGAGGCAGATCACATAAGCCTAAGGCAGCTTGAC-3’PCR方法如下50μl的反应体系中加入10μmol/L的Pf3和Pf4的引物各2.5μl，2mmol/L的dNTP 5μ1，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue-HSA 1ng，加双蒸水补齐50μl。在MJ Research公司的PTC-100TMPCR仪上，PCR条件为95℃充分变性5分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，94℃变性1分钟，循环30次。
IFN α2 cDNA的PCR扩增所用引物如下Pf35’-GTCAAGCTGCCTTAGGCTTATGTGATCTGCCTCAAACCCA-3’Pf45’-CATAAGGCGGCCGCTCATTCCTTACTTCTTAAACTTTC-3’PCR方法如下50μl的反应体系中加入10μmol/L的Pf1和Pf2的引物各2.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue-IFN α2 1ng，加双蒸水补齐50μl。在MJ Research公司的PTC-100TMPCR仪上，PCR条件为95℃充分变性5分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸90秒，94℃变性1分钟，循环30次。
利用重叠PCR融合HSA和IFN α2 cDNA，具体方法如下将IFN α2的PCR反应产物和HSA的PCR反应产物分别稀释40倍，再以1∶1比例混合后作为模板。于50μl的反应体系中加入2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，混合好的模板1μl，加双蒸水补齐45μl。在MJ Research公司的PTC-100TMPCR仪上，PCR条件为95℃充分变性5分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，94℃变性1分钟。循环10次后，向反应体系中加入10μmol/L的Pf1和Pf4的引物各2.5μl，继续做30个循环。
通琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现预期大小(约2.2kb)的条带。用PCR片段胶回收试剂盒纯化出2.2kb的目标片段。纯化好的目标片段HSA-IFN α2和载体pBlueScript II KS(+)，经EcoRI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收。取双酶切后纯化好的HSA-IFN α2片段9μl，pBlueScript IIKS(+)1μl，加入2μl 10×ligationbuffer，0.4μl T4连接酶，加双蒸水补齐20μl，15℃反应过夜。连接产物转化大肠杆菌XL-1 blue感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板，37℃培养过夜。挑取白色菌落，接种于20ml氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基中37℃培养过夜，用常规方法提取质粒。通过PCR，及EcoRI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对EcoRI-NotI区进行DNA测序。阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃。重组质粒命名为pBlue-HSA-IFNα2，阳性重组子命名为XL-1/pBlue-HSA-IFN α2。
实施例4HSA-IFN α2酵母表达系统构建取一支冻存的XL-1/pBlue-HSA-IFN α2，20ml氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基中37℃培养过夜，用常规方法提取质粒。质粒pBlue-HSA-IFN α2和酵母表达载体pPIC9K，经EcoRI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收。取双酶切后纯化好的pBlue-HSA-IFN α2片段5μl，pPIC9K 5μl，加入2μl 10×ligation buffer，0.4μl T4连接酶，加双蒸水补齐20μl，15℃反应过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板，37℃培养过夜。挑取若干个菌落，接种于20ml氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基中37℃培养过夜，用常规方法提取质粒。通过PCR，及EcoRI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆。阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃。重组质粒命名为pPIC-HSA-IFN α2，阳性重组子命名为DH5α/pPIC-HSA-IFN α2。提取DH5α/pPIC-HSA-IFN α2中的质粒，经SalI酶切后，电击转化毕赤酵母KM71。转化物涂布于含有1mol/L山梨醇的MD平板上，于30℃，培养6天。每块平板上用2ml水洗涤，收集洗涤液。取部分收集到的洗涤液，分别涂布含有1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/mlG418的YPD平板，于30℃，培养3～6天。挑取在最高浓度G418的YPD平板上的长出菌落，接种于20mlMD培养基中，30℃培养24小时，用常规方法提取酵母基因组DNA，通过PCR，琼脂糖凝胶电泳鉴定重组子。阳性重组子命名为KM71/pPIC-HSA-IFN α2。
实施例5HSA-IFN α2融合蛋白的表达以HSA-IFN α2b融合蛋白为例，其表达、鉴定及药效学分析将KM71/pPIC-HSA-IFN α2b接种至装有100mlBMGY(100mM磷酸钾，pH 6.0、1.34％无氨基酸的酵母氮基、4×10-5％生物素、1％甘油)500ml三角瓶中，300rpm，29℃培养至OD600为2～6，离心收集菌体。将收集到的菌体接种至装有20mlBMMY(100mM磷酸钾，pH 6.0、1.34％无氨基酸的酵母氮基、4×10-5％生物素、0.5％甲醇)的100ml三角瓶中，每24小时不加一次甲醇至终浓度0.5％，诱导7天。离心收集上清，过滤除菌，用细胞病变抑制法测定上清中的HSA-IFN α2活性。WISH细胞在培养基中呈单层，贴壁生长。每周2-3次，1∶2～1∶4消化传代，于完全培养液中生长。WISH细胞用完全培养液于37℃、5％CO2条件下培养，弃去培养瓶中的培养液，用PBS洗2次后消化和收集细胞，用完全培养液配制成2.5×105～3.5×105个/ml的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl。37℃、5％CO2条件下培养4～6小时。将配制完成的标准品溶液和供试品溶液移入接种WISH细胞的培养板，每孔加入100μl。37℃，5％CO2条件下培养18～24小时。取制备的96孔细胞培养板，弃去上清。将保存的水泡性口炎病毒(VSV，-70℃保存)用攻毒培养液稀释至工作浓度，每孔100μl。37℃，5％CO2培养24小时，弃上清，每孔加入50μl染色液(50mg结晶紫溶于20ml无水乙醇)，室温放置30分钟后，用流水小心冲去染色液，并吸干残留水分，每孔加入100μl脱色液，混匀后在酶标仪上测定波长570nm的吸光度值。活性分析结果证明产物具有干扰素的抗病毒活性，如图4。Western杂交表明产物具有HSA的免疫源性。
HSA-IFN α2b融合蛋白药代动力学分析溶液配制方法取125I-HSA-IFN α2b适量(约含74MBq)，用药代动力学试验用样品针剂和50mmol/L pH7.2PBS含0.2％BSA缓冲液配制成200μg/ml(3.6681MBq/ml)，注射剂量为1.0ml/kg。大鼠48只，称重，随机分为8组，每组6只，雌雄各半，按200μg/kg 125I-HSA-IFN α2b皮下注射，各组分别于给药后30分钟、2、6、24、48，90、180和300小时放血处死血清取100μl，直接测定血清及各整脏器的放射性。并计折算出每克组织药物的分布量(ng/g)。绘制药时曲线，从图5曲线中可以看出HSA-IFN α2在大鼠体内代谢半衰期约为48小时。
HSA-IFN α2a融合蛋白和HSA-IFN α2c融合蛋白的表达、药效及药代动力学分析，操作步骤同上述。
权利要求
1.人α2干扰素与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法，其特征是IFNα2cDNA通过RT-PCR从经新城鸡瘟病毒诱导的人淋巴细胞RNA中直接扩增得到；HSAcDNA通过PCR从人胎肝cDNA文库中扩增获得；获得的IFNα2 cDNA和HSA cDNA分别插入到克隆载体中，测序；利用重叠PCR技术，连接IFNα2 cDNA和HSA cDNA，中间不加入任何连接肽，得到的HSA-IFNα2 cDNA融合基因插入到克隆载体中保存；利用毕赤酵母分泌型表达载体将HSA-IFNα2 cDNA融合基因整合到宿主的染色体中进行表达；(1)IFNα2 cDNA的克隆取正常人外周血加淋巴细胞分离液，分离出人血白细胞，用含有5％胎牛血清的DMEM培养基稀释至细胞浓度为5×107个/ml，加入新城鸡瘟病毒到100血凝单位/ml，37℃，5％CO2，培养1小时，使病毒吸附在细胞上，1000×g离心弃上清，加入新鲜的有5％胎牛血清的DMEM培养基，37℃，5％CO2，培养18小时；用RNA提取试剂盒分离总RNA，用一步法RT-PCR试剂盒反转录为cDNA并从中扩增出IFNα2，所用的引物如下Pa2b15’-AGAGTCGACATGTGTGATCTGCCTCAA-3’Pa2b25’-GCCAAGCTTTCATTCCTTACTTCTTAAACT-3’一步法RT-PCR反应体系配制如下10×one step RNA PCR Buffer5μl25mM MgCl210μl10mM dNTP 5μlRNase inhibitor(40U/μl) 1μlAMV-optimized Taq 1μlAMV RTase XL(5U/μl) 1μl10μM Pa2b12μl10μM Pa2b22μl提取的总RNA1μlRNase Free H2O 22μl总体积 50μl反应条件为50℃30分钟，94℃变性2分钟，94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸90秒，循环30次；通琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带；用PCR片段胶回收试剂盒纯化出0.5kb的目标片段；纯化好的目标片段和载体pBlueScriptII KS(+)，经SalI和HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收；用T4连接酶连接两双酶切后纯化好的片段；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取白色菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及SalI和HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒SalI和HindIII酶切位点间区域进行DNA测序；阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃；重组质粒命名为pBlue-IFNα2，阳性重组子命名为DH5α/pBlue-IFNα2；(2)HSA cDNA的克隆利用PCR从人胎肝cDNA文库中扩增出HSA cDNA，所用的引物为HSA15’-AGAGTCGACGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3’HSA25’-GCCAAGCTTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3’PCR方法如下50μl的反应体系中加入10μmol/L的HSA1和HSA2的引物各3μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，人胎肝cDNA文库1μg，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为95℃变性5分钟，94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸90秒，循环30次；通琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出1.8kb的目标条带，纯化好的目标片段和载体pBlueScriptIIKS(+)分别经SalI和HindIII双酶切；琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收，用T4连接酶连接两双酶切后纯化好的片段；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取白色菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及SalI和HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒SalI和HindIII酶切位点间区域进行DNA测序；阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃；重组质粒命名为pBlue-HSA，阳性重组子命名为DH5α/pBlue-HSA；(3)HSA cDNA和IFNα2 cDNA融合基因的克隆HSA cDNA的PCR扩增，所用引物如下Pf15’-CCCTCCGAATTCAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCT-3’Pf25’-TGGGTTTGAGGCAGATCACATAAGCCTAAGGCAGCTTGAC-3’PCR方法如下50μl的反应体系中加入10μmol/L的Pf1和Pf2的引物各2.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue-HSA 1ng，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为95℃变性5分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，94℃变性1分钟，循环30次；IFNα2 cDNA的PCR扩增，所用引物如下Pf35’-GTCAAGCTGCCTTAGGCTTATGTGATCTGCCTCAAACCCA-3’Pf45’-CATAAGGCGGCCGCTCATTCCTTACTTCTTAAACTTTC-3’PCR方法如下50μl的反应体系中加入10μmol/L的Pf3和Pf4的引物各2.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue-IFN α21ng，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为95℃变性5分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸90秒，94℃变性1分钟，循环30次；利用重叠PCR融合HSA和IFNα2 cDNA将IFNα2的PCR扩增产物和HSA的PCR扩增产物分别稀释40倍，再以1∶1比例混合后作为模板，于50μl的反应体系中加入2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，混合好的模板1μl，加双蒸水补齐45μl；PCR条件为95℃变性5分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，94℃变性1分钟，循环10次后，向反应体系中加入10μmol/L的Pf1和Pf4的引物各2.5μl，继续做30次循环；通琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带；用PCR片段胶回收试剂盒纯化出2.2kb的目标片段；纯化好的目标片段HSA-IFNα2和载体pBlueScript II KS(+)，经EcoRI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收；用T4连接酶连接两双酶切后纯化好的片段；连接产物转化大肠杆菌XL-1 blue感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取白色菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及EcoRI和NotIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒EcoRI和NotIII酶切位点间区域进行DNA测序；阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃；重组质粒命名为pBlue-HSA-IFNα2，阳性重组子命名为XL-1/pBlue-HSA-IFNα2；(4)HSA-IFNα2酵母表达系统构建取一支冻存的XL-l/pBlue-HSA-IFNα2，20ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；质粒pBlue-HSA-IFNα2和酵母表达载体pPIC9K，经EcoRI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收；用T4连接酶连接两双酶切后纯化好的片段；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取若干个菌落，分别接种于20ml 100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及EcoRI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒EcoRI和NotI酶切位点间区域进行DNA测序；阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃；重组质粒命名为pPIC-HSA-IFNα2，阳性重组子命名为DH5α/pPIC-HSA-IFNα2；提取DH5α/pPIC-HSA-IFNα2中的质粒，经SalI酶切后，电击转化毕赤酵母KM71；提取酵母基因组DNA，通过PCR，琼脂糖凝胶电泳鉴定重组子；阳性重组子命名为KM71/pPIC-HSA-IFNα2；(5)HSA-IFNα2融合蛋白的表达将KM71/pPIC-HSA-IFNα2接种至装有100ml BMGY的500ml三角瓶中，300rpm，29℃培养至A600nm为2～6，离心收集菌体；将收集到的菌体接种至装有20mlBMMY的100ml三角瓶中，每24小时补加一次甲醇至终浓度0.5％，诱导7天；离心收集上清，过滤除菌，用细胞病变抑制法测定上清中的HSA-IFNα2活性；Western杂交检测产物HSA的免疫源性。
2.用权利要求1所述方法制备的人α2干扰素与人血清白蛋白的融合蛋白，其特征是包括与人α2干扰素至少85％序列同源的第一区和与人血清白蛋白至少85％序列同源的第二区或人血清白蛋白的部分氨基酸序列第二区；所述与人α2干扰素同源的第一区位于融合蛋白的N末端，所述与人血清白蛋白同源的第二区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽；或所述与人血清白蛋白同源的第二区位于融合蛋白的N末端，所述与人α2干扰素同源的第一区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽。
3.根据权利要求2所述的人α2干扰素与人血清白蛋白的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白包括与人α2干扰素至少95％序列同源的第一区和与人血清白蛋白至少95％序列同源的第二区。
4.根据权利要求2所述的人α2干扰素与人血清白蛋白的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白的第二区由人血清白蛋白部分结构域组成或经结构域重排后的人血清白蛋白组成。
5.根据权利要求2所述的人α2干扰素与人血清白蛋白的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白包括与人α2干扰素氨基酸残基序列相同的第一区和与人血清白蛋白氨基酸残基序列相同的第二区，或上述二区的功能等同物。
6.根据权利要求5所述的人α2干扰素与人血清白蛋白的融合蛋白，其特征在于所述功能等同物是在不改变所述融合蛋白特性的前提下，对融合蛋白个别氨基酸残基的取代、缺失或加入得到的多肽。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征是宿主表达系统是细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞、植物细胞表达系统。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征是优选的宿主表达系统是酵母。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征是优选的酵母是毕赤酵母。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征是优选的毕赤酵母是毕赤酵母KM71。
全文摘要
人α2干扰素与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品，属于长效融合蛋白药物技术领域。本发明利用重叠PCR技术，连接IFNα2 cDNA和HSA cDNA，中间不加入任何连接肽，得到的HSA－IFNα2 cDNA融合基因被整合到宿主的染色体中进行表达；本发明的融合蛋白包括与人α2干扰素至少85％序列同源的第一区和与人血清白蛋白至少85％序列同源的第二区，两区直接连接，中间不加入任何连接肽，该融合蛋白可以在不改变融合蛋白特性的前提下，进行个别氨基酸残基的取代、缺失或加入；宿主表达系统可以是细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞、植物细胞等。本发明的融合蛋白在保持了人α2干扰素的生理特性的基础上延长其在体内的半衰期，在药学领域有良好的应用前景。
文档编号C07K14/765GK1831124SQ20061003879
公开日2006年9月13日 申请日期2006年3月10日 优先权日2006年3月10日
发明者金坚, 雷楗勇, 杨健良, 张莲芬, 窦文芳, 徐钰, 李洁 申请人:江南大学