专利名称：人胰高糖素样多肽－1与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品的制作方法
技术领域：
人胰高糖素样多肽-1与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品，属于长效融合蛋白药物技术领域。
背景技术：
人胰高糖素样多肽1(Glucagon-like peptide-1，GLP-1)是由肠道内分泌L细胞合成和分泌的由30个氨基酸组成的多肽。体内外研究显示GLP-1能增强葡萄糖依赖性的胰岛素分泌，减少食物的摄取，减慢胃的排空，以及抑制胰高血糖素的分泌，导致血糖降低。此外，近年研究揭示GLP-1能刺激胰β细胞增殖，促进胰岛再生，又能抑制胰β细胞的凋亡，并能促进胰β细胞合成胰岛素。动物实验和临床试验表明II型糖尿病病人给予GLP-1后血糖水平显著降低，且无胰岛素和磺脲类降糖药的低血糖危险。GLP-1独特的降血糖作用机制与众不同，是现有抗糖尿病药物无可比拟的。
人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)是血浆中的主要蛋白成分，在血浆中的浓度为40mg/ml，它除了具有维持血浆渗透压功能外，还能结合内源性和/或外源性配体，包括激素、有毒代谢产物、药物等。通过结合这些配体，HSA可以调节激素活性、内源性和/或外源性物质的毒性和药物的利用度。细胞中刚翻译出来的人血清白蛋白具有典型的pre-pro-protein结构，包括18个氨基酸残基的信号肽和6个氨基酸残基前肽的原肽。信号肽和前肽在转运和分泌的过程中被切除，成熟的HSA由585个氨基酸残基组成，含有17对二硫键，分子量约为66.5KDa。通常情况下，HSA为非糖基化蛋白，然而有的突变体中也存在N-连接糖基化(见Uniprot中的protein ALBU HUMAN)。HSA的分子量相对较大，在正常情况下，不易被肾小球滤过，其血浆半衰期在20天左右。
虽然GLP-1具有较好的抗糖尿病效应，但是由于其体内半衰期仅2分钟(主要是DPP-IV的水解和肾脏排泄)，又属体内注射的多肽类药物，必须持续给药方能奏效，给临床应用带来很大的限制，迄今难以在临床上广泛应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种人胰高糖素样多肽-1与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品。本发明的融合蛋白在保持了人胰高糖素样多肽-1的生理特性的基础上延长其在体内的半衰期，在药学领域有良好的应用前景。
本发明的技术方案人工合成(GLP-1)2cDNA；通过PCR从人胎肝cDNA文库中扩增获得HSA cDNA；利用重叠PCR技术，连接(GLP-1)2cDNA和HSAcDNA，中间不加入任何连接肽，得到的(GLP-1)2-HSA cDNA融合基因插入到克隆载体中保存；(GLP-1)2-HSA cDNA融合基因在宿主细胞中进行表达。
(GLP-1)2cDNA的克隆，HSA cDNA的克隆，(GLP-1)2cDNA和HSA cDNA融合基因的克隆，融合蛋白(GLP-1)2-HSA的重组酵母构建和融合蛋白(GLP-1)2-HSA的表达的步骤详见实施例。
用上述方法制备的人胰高糖素样多肽-1与人血清白蛋白的融合蛋白，包括与人胰高糖素样多肽-1至少85％序列同源的第一区和与人血清白蛋白至少85％序列同源的第二区或人血清白蛋白的部分氨基酸序列第二区；所述与人胰高糖素样多肽-1同源的第一区位于融合蛋白的N末端，所述与人血清白蛋白同源的第二区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽；或所述与人血清白蛋白同源的第二区位于融合蛋白的N末端，所述与人胰高糖素样多肽-1同源的第一区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽。
优选的是所述融合蛋白包括与人胰高糖素样多肽-1至少95％序列同源的第一区和与人血清白蛋白至少95％序列同源的第二区。
所述融合蛋白的第二区可以由人血清白蛋白部分结构域组成、经结构域重排后的人血清白蛋白组成，包括所有HSA天然存在的多态型外，还包括HSA的部分片段，如EP322094中所述名为HSA(1-n)，n为369-419。
所述融合蛋白包括与人胰高糖素样多肽-1氨基酸残基序列相同的第一区和与人血清白蛋白氨基酸残基序列相同的第二区，或上述二区的功能等同物。
所述功能等同物是在不改变所述融合蛋白特性的前提下，对融合蛋白个别氨基酸残基的取代、缺失或加入得到的多肽。
宿主细胞是细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞或植物细胞等。优选的宿主细胞是酵母。优选的酵母是毕赤酵母。优选的毕赤酵母是毕赤酵母KM71。
由于(GLP-1)2基因较短，采用人工合成该段基因。HSA cDNA可以通过PCR从人胎肝cDNA文库中扩增获得。利用重叠PCR技术，连接(GLP-1)2cDNA和HSA cDNA，中间不加入任何连接肽，以避免因连接肽加入而带来的融合蛋白稳定性和免疫原性方面的问题，得到的(GLP-1)2cDNA和HSA cDNA融合基因插入到克隆载体中保存。
(GLP-1)2cDNA和HSA cDNA融合基因可以在多个宿主系统中表达，如细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞、植物细胞，及生物体(如脊椎动物、昆虫等)等。在这些表达系统中目的基因被整合到宿主的染色体中或插入到质粒中。本发明优选的是酵母表达系统，该系统除了具备原核表达系统的易操作、生长迅速、营养要求简单、易工业放大的特点外，还具有真核细胞的蛋白后修饰系统，有利于大量生产高质量的重组蛋白。更优选的是毕氏酵母表达系统，和酿酒酵母表达系统相比，毕氏酵母表达系统在蛋白分泌和糖基化方面具有明显的优势。毕氏酵母自身分泌的蛋白少，十分有利于纯化；糖基化程度低，避免了酿酒酵母超糖基化带来的免疫源性问题。
毕氏酵母表达系统分泌型表达载体主要有pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα，pYAM75P6；胞内型表达载体主要有pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZα(invitrogen)等，优选的是毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K，它是酵母整合载体，带有His缺陷型的选择性标记基因HIS4、AOX1启动子、MFα分泌信号肽和G418抗性基因(可作为筛选重组子的标记)等元件。AOX1启动子是一个强启动子，可以高效的启动目的基因的表达。在毕氏酵母里共编码两种乙醇氧化酶AOX1和AOX2，细胞中绝大多数乙醇氧化酶的活力是由AOX1提供。在甲醇为唯一碳源培养的细胞中，该酶可占细胞总蛋白的30％以上。AOX2与AOX1的同源性虽然高达97％，但酶活很低。当AOX1基因缺失，只存在AOX2时，大部分的乙醇氧化酶活力丧失，细胞利用甲醇能力降低，细胞在甲醇为唯一碳源的培养基上生长很慢。
带有融合cDNA的表达载体可以通过转化锂盐法、PEG法、原生质体法或电穿孔法转化宿主细胞。成功转化的细胞，即带有本发明构建的DNA的细胞，可以通过本领域熟知的方法加以鉴定，如收集细胞，裂解后提取DNA，然后进行Southern杂交和PCR鉴定，也可在诱导表达后用HSA抗体和/或GLP-1抗体检测培养液上清。
本发明的有益效果利用重叠PCR技术，连接(GLP-1)2cDNA和HSAcDNA，中间不加入任何连接肽，以避免因连接肽加入而带来的融合蛋白稳定性(避免针对连接肽的蛋白酶降解)和免疫原性方面的问题。
优选的酵母表达系统除了具备原核表达系统的易操作、生长迅速、营养要求简单、易工业放大的特点外，还具有真核细胞的蛋白后修饰系统，有利于大量生产高质量的重组蛋白。更优选的是毕赤酵母表达系统，和酿酒酵母表达系统相比，毕赤酵母表达系统在蛋白分泌和糖基化方面具有明显的优势。毕赤酵母自身分泌的蛋白少，十分有利于纯化；糖基化程度低，避免了酿酒酵母超糖基化带来的免疫源性问题。
可以通过培养带有本发明构建的DNA的宿主细胞，来生产本发明的融合蛋白。宿主细胞培养优选在生物反应器上进行，培养分两个阶段，第一阶段主要用于宿主细胞生长，第二阶段主要用于产物合成。可以用各种蛋白分离的方法自含有本发明DNA构建体的细胞培养物中分离、纯化融合蛋白。如盐析、沉淀、超滤、层析、制备电泳等技术及这些技术的组合。
图1.质粒pPIC-(GLP-1)2-HSA构建图2.融合蛋白基因的琼脂糖电泳分析 Lane1PCR产物；Lane2DNAMarK图3.融合蛋白的SDS-PAGE分析 Lane1空质粒转化发酵上清；Lane2发酵上清1；Lane3发酵上清2；Lane4白蛋白；Lane5蛋白质MarK图4.融合蛋白的GLP-1抗体检测(Western blot) Lane1对照；Lane2蛋白质Mark；Lane3GLP-1抗体杂交具体实施方法实施例1(GLP-1)2cDNA的克隆人工合成(GLP-1)2cDNA(由上海生工生物工程技术服务有限公司完成)。以人工合成(GLP-1)2cDNA为模板，通过PCR扩增出(GLP-1)2cDNA，所用的引物如下PG15’TGCGGATCCCACGGTGAAGGTACTTTCACTTCTGA-3’PG25’-ATAGCGGCCGCTTAACGACCCTTAACCAACCAAGC-3’PCR方法如下50μl的反应体系中加入10μmol/L的PG1和PG2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl(dNTP、10×pfu Buffer、pfu DNA聚合酶均购自上海生工生物工程技术服务有限公司，下同)，(GLP-1)2cDNA 1μg，加双蒸水补齐50μl，在MJ Research公司的PTC-100TMPCR仪上(下同)，PCR条件为95℃变性10分钟，94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸20秒，循环30次；通琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出0.2kb的目标片段，纯化好的目标片段和载体pBluescript IIKS(+)(简写为pBlue2KSP)分别经BamHI和NotI双酶切；琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收，用T4连接酶连接两双酶切后纯化好的片段；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取白色菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及BamHI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒BamHI和NotI双酶切位点间区域进行DNA测序；阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃；重组质粒命名为pBlue2KSP-(GLP-1)2，阳性重组子命名为DH5α/pBlue2KSP-(GLP-1)2。
实施例2HSA cDNA的克隆利用PCR从人胎肝cDNA文库中扩增出HSA cDNA，所用的引物为
PH15’-AGGTCGACGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3’PH25’-GCAAGCTTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3’PCR方法如下50μl的反应体系中加入10μmol/L的PH1和PH2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，人胎肝cDNA文库1μg，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为95℃变性5分钟，94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸90秒，循环30次；通琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出1.8kb的目标片段，纯化好的目标片段和载体pBlue2KSP分别经SalI和HindIII双酶切；琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收，用T4连接酶连接两双酶切后纯化好的片段；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取白色菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及SalI和HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒SalI和HindIII双酶切位点间区域进行DNA测序；阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃；重组质粒命名为pBlue2KSP-HSA，阳性重组子命名为DH5α/pBlue2KSP-HSA。
实施例3(GLP-1)2cDNA和HSA cDNA融合基因的克隆(GLP-1)2cDNA的PCR扩增，所用引物如下PG35’-GAGAGGTACCTAAAAAGACACGGTGAAGGTACTTTCACT-3’PG45’-ACCTCACTCTTGTGTGCATCCCTTCCTTTTACTAACCATG-3’PCR方法如下50μl的反应体系中加入10μmol/L的Pf1和Pf2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue2KSP-(GLP-1)21ng，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为95℃变性5分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸90秒，94℃变性1分钟，循环30次；HSA cDNA的PCR扩增，所用引物如下PH35’-CATGGTTAGTAAAAGGAAGGGATGCACACAAGAGTGAGGT-3’PH45’-TGAACCGCGGCCGCTTATAAGCCTAAGGCAGCTTG-3’PCR方法如下50μl的反应体系中加入10μmol/L的引物PG3和PH4各2.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue2KSP-HSA 1ng，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为95℃变性5分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，94℃变性1分钟，循环30次；利用重叠PCR融合(GLP-1)2cDNA和HSA cDNA将(GLP-1)2的PCR扩增产物和HSA的PCR扩增产物分别稀释40倍，再以1∶1比例混合后作为模板，于反应体系中加入2mmol/L的dNTP 5μl，10×TaqBuffer 1μl，10mol/LMg2+2.5μl，5U/μl的Taq DNA聚合酶0.5μl，混合好的模板1μl，加双蒸水补齐45μl；PCR条件为95℃变性5分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸3分钟，94℃变性1分钟，循环5次后，向反应体系中加入10μmol/L的PG3和PH4的引物各1.5μl，继续做30次上述循环；通琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出1.9kb的目标片段，用T4连接酶连接纯化好的目标片段和载体pUC18-T；连接产物转化大肠杆菌XL-1 blue感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取白色菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及SnaBI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒SnaBI和NotI酶切位点间区域进行DNA测序；阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃；重组质粒命名为pUC18T-(GLP-1)2-HSA，阳性重组子命名为XL-1/pUC18 T-(GLP-1)2-HSA。
实施例4(GLP-1)2-HSA重组酵母构建及融合蛋白的表达(GLP-1)2/HSA酵母表达系统构建取一支冻存的XL-1/pUC18T-(GLP-1)2-HSA，20ml氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基中37℃培养过夜，用常规方法提取质粒。质粒pUC18T-(GLP-1)2-HSA和酵母表达载体pPIC9K，经SnaBI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收。取双酶切后纯化好的pUC18T-(GLP-1)2-HSA片段5μl，pPIC9K 5μl，加入2μl 10×ligation buffer，0.4μlT4连接酶，加双蒸水补齐20μl，15℃反应过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板，37℃培养过夜。挑取若干个长出的菌落，接种于20ml氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基中37℃培养过夜，用常规方法提取质粒。通过PCR，及SnaBI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆。阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃。重组质粒命名为pPIC-(GLP-1)2-HSA，阳性重组子命名为DH5α/pPIC-(GLP-1)2-HSA。提取DH5α/pPIC-(GLP-1)2-HSA中的质粒，经SalI酶切后，电击转化毕赤酵母KM71。转化物涂布于含有1mol/L山梨醇的MD平板上，于30℃，培养6天。每块平板上用2ml水洗涤，收集洗涤液。取部分收集到的洗涤液，分别涂布含有1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/mlG418的YPD平板，于30℃，培养3～6天。挑取在最高浓度G418的YPD平板上的长出菌落，接种于20mlMD培养基中，30℃培养24小时，用常规方法提取重组毕赤酵母基因组DNA，通过PCR，琼脂糖凝胶电泳鉴定重组子。阳性重组子命名为KM71/pPIC-(GLP-1)2-HSA。
(GLP-1)2-HSA融合蛋白的表达将KM71/pPIC-(GLP-1)2-HSA接种至装有100mlBMGY(100mM磷酸钾，pH6.0、1.34％无氨基酸的酵母氮基、4×10-5％生物素、1％甘油)500ml三角瓶中，300rpm，29℃培养至A600nm值为2～6，离心收集菌体。将收集到的菌体接种至装有20ml BMMY(100mM磷酸钾，pH 6.0、1.34％无氨基酸的酵母氮基、4×10-5％生物素、0.5％甲醇)的100ml三角瓶中，每24小时补加一次甲醇至终浓度0.5％(V/V)，诱导3天。离心收集上清，进行SDS-PAGE电泳，融合蛋白的GLP-1的免疫源性检测(Western blot)。
权利要求
1.人胰高糖素样多肽-1与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法，其特征是人工合成(GLP-1)2cDNA；通过PCR从人胎肝cDNA文库中扩增获得HSAcDNA；利用重叠PCR技术，连接(GLP-1)2cDNA和HSA cDNA，中间不加入任何连接肽，得到的(GLP-1)2-HSA cDNA融合基因插入到克隆载体中保存；将(GLP-1)2-HSA cDNA融合基因在宿主细胞中进行表达；(1)(GLP-1)2cDNA的克隆以人工合成(GLP-1)2cDNA为模板，通过PCR扩增出(GLP-1)2cDNA，所用的引物如下PG15’-TGCGGATCCCACGGTGAAGGTACTTTCACTTCTGA-3’PG25’-ATAGCGGCCGCTTAACGACCCTTAACCAACCAAGC-3’PCR方法如下50μl的反应体系中加入10μmol/L的PG1和PG2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，人工合成的(GLP-1)2cDNA 1μg，加双蒸水补齐50μl，PCR条件为95℃变性10分钟，94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸20秒，循环30次；通琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出0.2kb的目标片段，纯化好的目标片段和载体pBlue2KSP分别经BamHI和NotI双酶切；琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收，用T4连接酶连接两双酶切后纯化好的片段；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取白色菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及BamHI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒BamHI和NotI双酶切位点间区域进行DNA测序；阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃；重组质粒命名为pBlue2KSP-(GLP-1)2，阳性重组子命名为DH5α/pBlue2KSP-(GLP-1)2；(2)HSA cDNA的克隆利用PCR从人胎肝cDNA文库中扩增出HSA cDNA，所用的引物为PH15’-AGGTCGACGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3’PH25’-GCCAAGCTTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3’PCR方法如下50μl的反应体系中加入10μmol/L的PH1和PH2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，人胎肝cDNA文库1μg，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为95℃变性5分钟，94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸90秒，循环30次；通琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出1.8kb的目标片段，纯化好的目标片段和载体pBlue2KSP分别经SalI和HindIII双酶切；琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收，用T4连接酶连接两双酶切后纯化好的片段；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取白色菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及SalI和HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒SalI和HindIII双酶切位点间区域进行DNA测序；阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃；重组质粒命名为pBlue2KSP-HSA，阳性重组子命名为DH5α/pBlue2KSP-HSA；(3)(GLP-1)2cDNA和HSA cDNA融合基因的克隆(GLP-1)2cDNA的PCR扩增，所用引物如下PG35’-GAGAGGTACCTAAAAAGACACGGTGAAGGTACTTTCACT-3’PG45’-ACCTCACTCTTGTGTGCATCCCTTCCTTTTACTAACCATG-3’PCR方法如下50μl的反应体系中加入10μmol/L的PG3和PG4的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue2KSP-(GLP-1)21ng，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为95℃变性5分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸90秒，94℃变性1分钟，循环30次；HSAcDNA的PCR扩增，所用引物如下PH35’-CATGGTTAGTAAAAGGAAGGGATGCACACAAGAGTGAGGT-3’PH45’-TGAACCGCGGCCGCTTATAAGCCTAAGGCAGCTTG-3’PCR方法如下50μl的反应体系中加入10μmol/L的引物PH3和PH4各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue2KSP-HSA 1ng，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为95℃变性5分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，94℃变性1分钟，循环30次；利用重叠PCR融合(GLP-1)2cDNA和HSA cDNA将(GLP-1)2的PCR扩增产物和HSA的PCR扩增产物分别稀释40倍，再以1∶1比例混合后作为模板，于反应体系中加入2mmol/L的dNTP 5μl，10×TaqBuffer 1μl，10mol/LMg2+2.5μl，5U/μl的Taq聚合酶0.5μl，混合好的模板1μl，加双蒸水补齐45μl；PCR条件为95℃变性5分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸3分钟，94℃变性1分钟，循环5次后，向反应体系中加入10μmol/L的PG3和PH4的引物各1.5μl，继续做30次上述循环；通琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出1.9kb的目标片段，用T4连接酶连接纯化好的目标片段和载体pUC18-T；连接产物转化大肠杆菌XL-1blue感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取白色菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及SnaBI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒SnaBI和NotI酶切位点间区域进行DNA测序；阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃；重组质粒命名为pUC18T-(GLP-1)2-HSA，阳性重组子命名为XL-1/pUC18T-(GLP-1)2-HSA；(4)融合蛋白(GLP-1)2-HSA的重组酵母构建取一支冻存的XL-1/pUC18T-(GLP-1)2-HSA，接种到20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒，提取的质粒pUC18T-(GLP-1)2-HSA和酵母表达载体pPIC9K，分别经SnaBI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收，用T4连接酶连接两双酶切后纯化好的片段；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取长出菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及SnaBI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃；重组质粒命名为pPIC-(GLP-1)2-HSA，阳性重组子命名为DHSα/pPIC-(GLP-1)2-HSA；提取DH5α/pPIC-(GLP-1)2-HSA中的质粒，经SalI酶切后，电击转化毕赤酵母KM71，提取重组毕赤酵母基因组DNA，通过PCR，琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性重组子命名为KM71/pPIC-(GLP-1)2-HSA；(5)融合蛋白(GLP-1)2-HSA的表达将KM71/pPIC-(GLP-1)2-HSA接种至装有100ml BMGY的500ml三角瓶中，300rpm，29℃培养至A600nm为2～6，离心收集菌体，将收集到的菌体接种至装有20ml BMMY的100ml三角瓶中，每24小时补加一次甲醇至终浓度0.5％(V/V)，诱导3天，离心收集上清，进行SDS-PAGE验证，Western杂交鉴定融合蛋白(GLP-1)2-HSA分子的GLP-1的免疫源性。
2.用权利要求1所述方法制备的人胰高糖素样多肽-1与人血清白蛋白的融合蛋白，其特征是包括与人胰高糖素样多肽-1至少85％序列同源的第一区和与人血清白蛋白至少85％序列同源的第二区或人血清白蛋白的部分氨基酸序列第二区；所述与人胰高糖素样多肽-1同源的第一区位于融合蛋白的N末端，所述与人血清白蛋白同源的第二区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽；或所述与人血清白蛋白同源的第二区位于融合蛋白的N末端，所述与人胰高糖素样多肽-1同源的第一区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽。
3.根据权利要求2所述的人胰高糖素样多肽-1与人血清白蛋白的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白包括与人胰高糖素样多肽-1至少95％序列同源的第一区和与人血清白蛋白至少95％序列同源的第二区。
4.根据权利要求2所述的人胰高糖素样多肽-1与人血清白蛋白的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白的第二区由人血清白蛋白部分结构域组成或经结构域重排后的人血清白蛋白组成。
5.根据权利要求2所述的人胰高糖素样多肽-1与人血清白蛋白的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白包括与人胰高糖素样多肽-1氨基酸残基序列相同的第一区和与人血清白蛋白氨基酸残基序列相同的第二区，或上述二区的功能等同物。
6.根据权利要求5所述的人胰高糖素样多肽-1与人血清白蛋白的融合蛋白，其特征在于所述功能等同物是在不改变所述融合蛋白特性的前提下，对融合蛋白个别氨基酸残基的取代、缺失或加入得到的多肽。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征是宿主细胞是细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞或植物细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征是优选的宿主细胞是酵母。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征是优选的酵母是毕赤酵母。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征是优选的毕赤酵母是毕赤酵母KM71。
全文摘要
人胰高糖素样多肽－1与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品，属于长效融合蛋白药物技术领域。本发明利用重叠PCR技术，将串联的两个GLP－1基因cDNA(简称(GLP－1)
文档编号C07K19/00GK1916173SQ20061008615
公开日2007年2月21日 申请日期2006年9月5日 优先权日2006年9月5日
发明者金坚, 窦文芳, 张莲芬, 雷楗勇, 卢大儒 申请人:江南大学