从胸、腹水中提取游离mRNA的方法

专利名称：从胸、腹水中提取游离mRNA的方法
技术领域：
本发明涉及一种生物技术提取方法，特别涉及一种从胸、腹水中提取游离mRNA的方法。
背景技术：
在本发明之前，因为胸水、腹水常常是恶性肿瘤转移或首发临床表现，所以抽取一定容量的胸、腹水进行恶性肿瘤的检测是医疗实践中经常要做的。然而，由于肿瘤细胞病理检出率相对较低，且需要一定数量的胸水、腹水标本，临床上经常需要对于有胸腔、腹腔积液的患者反复进行送检，因而难于及时明确诊断或者因没有足够数量的标本，无法准确诊断从而耽误最佳治疗时机；同时，在胸腹水中肿瘤相关抗原的检测方面，传统的方式所检测的对象仅限于胸水、腹水中相关蛋白、细胞，灵敏度较低，不利于疾病的早期诊断和疗效判断。

发明内容
本发明的目的就在于克服上述缺陷，研制一种从胸、腹水中提取游离mRNA的方法，从而有利于恶性胸水/腹水的诊断及病情监控。
本发明的技术方案是从胸、腹水中提取游离mRNA的方法，其主要技术步骤在于(1)将胸水或腹水注入有枸橼酸钠溶液的无RNA酶抗凝管中；(2)上离心机离心，吸取上清至新管，再离心，吸取三分之二上清至新管；(3)取上清加入到Trizol LS溶液中，室温震荡；(4)向其中加入氯仿，剧烈震荡后室温下放置；(5)上离心机离心，吸取水相层至新管；(6)加入异丙醇，沉淀RNA；(7)上离心机离心，75％乙醇洗涤后晾干；(8)加入无RNA酶水，溶解RNA，以其为模板，常规技术反转录为cDNA保存。
本发明的优点和效果在于成功地从小量胸水/腹水中提取游离RNA，经实时定量荧光PCR扩增证实相关目的基因的表达。对于转移性恶性胸腔/腹腔积液而言，能从少量标本中监测某种肿瘤相关基因的表达丰度，实现对疾病的动态监测及疗效判断。
具体而言1.突破了传统方法，成功地从胸腹水游离上清中提取RNA并扩增目的基因；2.可从小量(3-5ml)胸水/腹水标本中扩增肿瘤相关基因，有利于恶性胸水/腹水的早期分子水平诊断；3.从小量(3-5ml)恶性胸水/腹水标本中扩增相关基因如相关肿瘤标记物，有利于对疾病的实时监控、动态观察与疗效判断。与目前检测胸腹水中蛋白表达的方法相比，灵敏度高；与从胸腹水中的细胞RNA检测相关基因表达的方法相比，操作简便，无需细胞的收集、富集等步骤。
4.本方法的建立也适用于从少量胸水/腹水中检测其它疾病相关基因，从而有利于早期诊断；5.操作方便，灵敏度高，可重复性强。


图1——部分标本胸水/腹水游离上清中Tublin III mRNA的扩增图；图2——部分标本胸水/腹水游离上清中ERCC1 mRNA的扩增图；图3——部分标本胸水/腹水游离上清中TS mRNA的扩增图；图4——部分标本胸水/腹水游离上清中β-actin mRNA的扩增图；具体实施方式
1.将所有实验用物品均经去RNA酶处理相关试剂用灭活的0.1％DEPC水配置；实验用玻璃器皿需经160℃烘烤6小时；2.将胸水或/腹水5ml注入事先加入了0.5ml 3.8％枸橼酸钠的无RNA酶管中；3.上4000g离心机，在4℃下，离心10分钟，将上清移至新管；4.再上4000g离心机，在4℃下，再次离心10分钟，吸取上2/3的上清，仍移至新管；5.取1ml上清，加入到3ml Trizol LS(invitrogen产品)，室温震荡15分钟，至使蛋白颗粒充分裂解；
6.加入氯仿，剧烈震荡后室温放置15分钟；7.上12000g离心机，在4℃下，离心15分钟，吸取水相层至另一新管；8.在水相层新管中加入异丙醇沉淀RNA；9.上离开心机12000g，在4℃下，离心15分钟，用75％乙醇洗涤两遍后晾干；10.加入无RNA酶水，溶解RNA；11.以溶解RNA为模板，按TaKaRa反转录试剂盒说明操作反转录为cDNA，-20℃保存。
采用Taqman-MGB探针技术实时荧光定量PCR检测胸水/腹水游离ERCCl、TS、Tublin III和BRCAlmRNA的表达(以β-actin为内参)；所用探针及引物均为ABI产品(引物跨内含子设计，在扩增中避免了DNA污染的可能性)，相关基因的扩增证实了胸水/腹水游离mRNA的成功提取，如图1、图2、图3、图4所示。
说明附图横坐标为PCR循环数，纵坐标为荧光强度。所有样本均可检测到目的基因的阳性扩增；同时以相对应提取RNA为阴性对照未见扩增，排除了样本DNA污染的可能性。
本发明请求保护的范围并不仅仅局限于本具体实施方式
的描述。
权利要求
1.从胸、腹水中提取游离mRNA的方法，其步骤在于(1)将胸水或腹水注入有枸橼酸钠溶液的无RNA酶抗凝管中；(2)上离心机离心，吸取上清至新管，再离心，吸取三分之二上清至新管；(3)取上清加入到Trizol LS溶液中，室温震荡；(4)向其中加入氯仿，剧烈震荡后室温下放置；(5)上离心机离心，吸取水相层至新管；(6)加入异丙醇，沉淀RNA；(7)上离心机离心，75％乙醇洗涤后晾干；(8)加入无RNA酶水，溶解RNA，以其为模板，常规技术反转录为cDNA保存。
2.根据权利要求1所述的从胸、腹水中提取游离mRNA的方法，其特征在于步骤(2)中离心机为4000g，离心机，在4℃下，分别离心10分钟。
3.根据权利要求1所述的从胸、腹水中提取游离mRNA的方法，其特征在于步骤(3)中震荡以使蛋白颗粒充分裂解。
全文摘要
本发明涉及一种从胸、腹水中提取游离mRNA的方法。本发明将胸或腹水注入有枸橼酸钠溶液的无RNA酶抗凝管中，离心，吸取上清，再离心，再吸取上清，上清加入到Trizol LS溶液中，室温震荡，加入氯仿，剧烈震荡后室温下放置，离心，吸取水相层至新管，加入异丙醇，沉淀RNA，离心，75％乙醇洗涤后晾干，加入无RNA酶水，溶解RNA，以其为模板，常规技术反转录为cDNA保存。解决了过去无法从胸、腹水中抽提RNA的缺陷，可以对肿瘤及其他疾病进行早期诊治。操作方便，重复性强。
文档编号C07H21/00GK1952176SQ20061009645
公开日2007年4月25日 申请日期2006年9月27日 优先权日2006年9月27日
发明者刘宝瑞, 王立峰, 钱晓萍 申请人:南京大学医学院附属鼓楼医院