用于核酸提取和鉴定的方法

专利名称：：用于核酸提取和鉴定的方法用于核酸提取和鉴定的方法本申请要求于2005年1月21日提交的系列号为60/645,905的美国临时申请的优先权，将其说明书的全部内容以引用方式结合于此以供参考。
背景技术：
：公共卫生部门越来越需要高灵敏度的病毒、细菌、真菌、寄生虫或细胞基因测定法。用于篩查(例如血液供给、蚊子体内的虫媒病毒)、监控(例如鸟群中的西尼罗病毒)、水分析、感染的移、断、基于基因的诊断(例如血友病、乳癌易感性、癌细胞)等的高通量样品处理，将会非常有益。血液供给污染致病病毒如人类免疫缺陷病毒(HIV)、曱肝、乙肝或丙肝病毒、细小病毒、巨细胞病毒和EB病毒(非洲淋巴细胞瘤病毒)以及细菌感染如莱姆病，已经成为一个越来越严重的问题。美国食品与药物管理局以及其它部门的普遍意见是除了血清学试验外，所有血液均应利用聚合酶链式反应(PCR)分析进行筛查，或者最终用PCR代替血清学试验。现在认为，筛查血液的传染性病毒，每年将能防止至少一百个输血相关的乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)和HIV病例的发生。直到最近，血清学试-验仍然是筛查血液所选纟奪的方法。这些试一睑才佥测血液中抗体的存在情况，其中抗体针对病毒试剂、病毒抗原、细菌试剂、细菌4元原等而升高。血清学筛查试-验的击夹陷在于如果机体还没有发动抗体反应，则不能一全测感染。例如，血清学^式一睑常常无法才全测在感染的早期阶,殳才全测-波感染个体。另外，表现为低免疫反应的个体一般携带少量病毒。通常，小量病毒不能刺激抗体产生。这种病毒的一个实例是HIV。由于血清学试马佥的这些以及其它实用局限性，因此现在需要无i仑个体处于哪个感染阶4殳均可一企测感染的方法。分离血浆中存在的核酸随后进4亍PCR扩增，能够在缺乏抗体的情况下检测致病体。致病体的检测对于确保血液供给无可传染病原体非常关^t建。医疗单位中筛查血液以及相关生物材料，通常是大规才莫进行的。血液中心每一天通常检测多达1000或更多单位的血液。利用目前可用的技术每天从1000份样品中制备分离出来的核酸，需要相当量的时间、劳力和试剂。因此，由于技术局限性，通常不进行大规模的个体样品核酸检测。现在，如果在筛查和监测应用中采用核酸试验，也是用于样品混合物中。遗憾的是，混合样品降低了试验的灵敏度，如果混合样品检测为阳性，则延误了最终的诊断。提取DNA或RNA用于检测通常涉及到采用两种不同的提取方法。一种方法仅适用于DNA提取；另一种方法则仅适用于RNA提取。采用DNA提取方法得到很少量RNA,反之亦然。因此，直到最近，血'液筛查仍需要一种方法分离DNA,而需要另一种方法分离脂A。因此，需要一种可以高灵敏度提取及纯化DNA和RNA的简单、有步文而可信的方法，这才羊一种方法对于筛查血液供乡合特别有用。该方法对于多种其它应用也非常有益，例如基于基因的诊断、传染病的监测(例如鸟群中的西尼罗病毒、蚊群中的疟疾)、水分析等。
发明内容本发明提供了一种用于从样品中提取核酸的方法，满足了上述需要。所述方法包括获得包含细胞、病毒、或者既包含细胞又包含病毒的样品；将含去垢剂的裂解液加入该样品中，从而裂解细胞或病毒并形成裂解物；向该裂解物中加入一定量足以聚集或沉淀一亥酸的醇；以及通过^皮璃纤维滤器过滤混合物而从裂解物-醇混合物中纯化核酸。在另一个具体实施方式中，本发明提供了一种用于鉴定样品中病原体的方法。所述方法包括获得包含细胞、病毒、或者既包含细胞又包含病毒的样品；将含去垢剂的裂解液加入该样品中，从而裂解细胞或病毒并形成裂解物；向该裂解物中加入一定量足以聚集或沉淀核酸的醇；通过^皮璃纤维滤器过滤混合物而/人裂解物-醇混合物中纯〗匕核酸；以及分片斤该冲亥酸，以鉴定病原体。在另外一个具体实施方式中，本发明4是供了一种用于鉴定水样中的生物污染物的方法。所述方法包括获得包含细胞、病毒、或者既包含细胞又包含病毒的水样；将含去垢剂的裂解液加入该样品中，/人而裂解细月包或病毒并形成裂解物；向该裂解物中加入一定量足以聚集或沉淀核酸的醇；通过玻璃纤维滤器过滤混合物而乂人裂解物-醇'混合物中纯4匕核酸；以及分片斤该核酸，以鉴定污染物。在进一步的实施例中，本发明提供了一种用于鉴定哺乳动物中遗传疾病的方法。所述方法包括获得包含细胞的生物样品；将含去垢剂的裂解液加入该4f品中，/人而裂解细力包或病毒并形成裂解物；向该裂解物中加入一定量足以聚集或沉淀核酸的醇；通过^皮璃纤维滤器过滤混合物而乂人裂解物-醇混合物中纯^f匕核酸；以及分一斤该核fr复，以筌定遗4专疾病。在另一个具体实施方式中，本发明^是供了一种用于从样品中冲是耳又核酸的试剂盒，所述试剂盒包括含去垢剂的裂解液以及玻璃纤维滤器。图1:PEG对病毒^r测的影响。以104.5个WNV基因组当量(GE)/ml刺激正常人血浆，并加入不同浓度的PEG8000。将2.0mlPEG-血浆混合并离心。沉淀和上清液各200ml用于提取和定量RT-PCR。图2:PEG对病毒检测的影响。提取未浓缩和经PEG浓缩的血浆各200jul，并进行PCR。与0o/oPEG相比，在3%PEG时可才企测到大约IO倍以上的RNA。图3.血浆中WNV在4。C的稳定性。对从WNV样品提取的RNA进行终点RT-PCR,其中WNV样品4。C保存0、7或14天。结果以4个重复样品的平均相对荧光单位(RTU)+/-标准偏差来表示。具体实施方式本发明基于本申请发明人的一个惊人发现，即一种快速高效的从既包含DNA又包含RNA的样品中同时(即利用一种方法)提取DNA和RNA的方法。本申请的发明人意外地发现通过用去垢剂裂解样品、通过加入醇聚集或沉淀存在的任何核酸，以及通过玻璃纤维滤器过滤混合物而从裂解物中分离核酸，DNA和RNA均能从才羊品中分离，即纯4匕。所述纟是耳又和纯化过程适于自动化。一是取的核酸适用于核酸扩增技术，如PCR(聚合酶链式反应)或者RT-PCR(逆转录-聚合酶《连式反应)。在一个具体实施方式中，本发明提供了一种用于从样品中提取核酸的方法。所迷核酸包括脱氧核糖核酸(DNA)或核^唐核酸(RNA)。用于从样品中提取核酸的方法的第一步是获得包含细胞或病毒的样品。任何包含细胞或病毒的样品均可根据本发明的方法而采用。包含细胞或病毒的样品的实例包括但不限于生物样品和含水(aqueous)非生物样品。任何包含细胞或病毒的生物样品均适用于本发明的方法。在本文中4吏用的生物样品包括例如体液、组织和细月包。生物才羊品的一些具体实例包4^f旦不P艮于血液、血浆、尿、唾液、阴道分泌物、月S脊液、血清、上皮细胞、免疫细胞、口腔刮取物、宫颈组织刮取物等。所述生物样品可利用本领域中技术人员已知的任何方法而获得。恰当的方法包括例如静脉的静脉穿刺以获得血液样品以及颊细胞刮取以获得口腔样品。所述样品可以包含细胞。该细月包可以是本领域中4支术人员已知的任何细胞。在本文中使用的术语"细胞"包括单独的细胞或者作为组织一部分的细月包。细月包可以存在于体液中。除了其它细月包，单独的细胞还包括上文提及的细胞(例如，上皮细胞、免疫细胞等)。术语"细胞"还包括4效生物整体或部分。该微生物通常是致病性的(即引起疾病)，但也可以是非致病性的。〗敛生物的实例包括细菌、寄生虫、真菌、藻类等等。所述细菌可以是本领域技术人员已知的任何细菌。细菌的一些实例包括疏螺旋体种、钩螺旋体种、分枝杆菌种等。寄生虫是一种生物，在另一种生物体表或体内生长、进食并定居(sheltered),同时常常对其宿主的存活具有有害作用。来自本领域技术人员已知的任何寄生虫的核酸均可以按照本发明的方法提取。寄生虫的一些实例包括血吸虫种、利什曼原虫种、毛滴虫种、合胞体种(例如症疾)、弓形虫种、隐孢子虫种以及内阿米巴种等。真菌是缺乏叶绿素和脉管组织的真核生物，存在形式通常从单细胞到整个枝状菌丝体不等。本领域」技术人员已知的任何真菌均可根据本发明的方法而采用。真菌的一些实例包括霉菌和酵母(例如念珠菌种、酵母菌种等)。藻类通常是水生真核光合生物。藻类可以为本领域技术人员已知的任何藻类。藻类的实例包括但不限于蓝细菌。此外，所述样品还可包含病毒。来自本领域4支术人员已知的任何病毒的核酸均可按照本发明的方法提取。这样的病毒包括DNA病毒和RNA病毒。DNA病毒的实例包4舌痘病毒、疱渗病毒、A泉病毒、乳多空病毒、肝DNA病毒属(例如乙肝病毒)和细小病毒(例如B19细小病毒)。RNA病毒的实例包括樣i小RNA病毒(例如甲肝病毒)、卡利希病毒、批膜病毒、黄病毒属(例如丙肝病毒和西尼罗病毒)、冠^)犬病毒、P乎肠病毒、才干^)犬病毒、纤丝病毒、副津占病毒、正沣'占病毒、布尼亚病毒、沙粒病毒和逆转录病毒(例如人类免疫缺陷病毒)。所述才羊品可以来自4壬何生物，或者如果该生物为合适的寿交小尺寸则才羊品可以是整个生物。合适的生物的实例包括「;微生物以及纟且织体液，后者来自于哺乳动物、鸟类、水生动物(例如鱼)或节肢动物(例如脾、蚊等)，以及真菌。樣t生物包括上面描述的那些。所述哺乳动物可以是本领域4支术人员已知的任-f可哺乳动物。哺乳动物包括例如人、狒狒以及其它灵长类、还包括宠物动物如狗和猫、实-验动物例4口大鼠和小鼠、以及农场动物力o马、羊和牛。在一个具体实施方式中，所述样品是怀#是污染了细胞和/或病毒的含水非生物样品。该样品可以获得自例如饮用水以及水体(例如湖、溪、河、海等)。从水样中的细胞或病毒提取核酸对于检测例i"大用7jC的污染物非常有用，如下文论及的。本领域的技术人员将理解从不同类型的样品中提取核酸可能需要不同类型的样品制备方法，以制备可用于本发明方法中的样品。合适的制备技术的一些实例包括加入不同类型的緩沖系统、溶液等。另一种恰当的制备技术包括从样品中去除细胞。例如，为了制备血清样品，通常但非必须将细胞从样品中去除，例如从全血样品中去除。可以利用本领域技术人员已知的任何方法将细胞从样品中去除。例如，离心或过滤可用来制备无细胞样品。例如，通常通过离心去除细胞组分而从凝固的血液中获得血清。除了在血液中加入抗凝剂之外，通常以与血清类似的方式获得血桨。在另一个具体实施方式中，可选的，该方法进一步包括浓缩样品中细胞或病毒的步骤。本领域技术人员已知的任何浓缩方法均可采用。恰当的浓缩方法包括^旦不限于应用聚乙二醇。通常，用于本方法中的恰当浓缩部分依赖于样品的性质。浓缩方法可能例如依赖于样品中是否包含细胞、病毒还是二者都包含；依赖于细胞类型；等。在第一个具体实施方式中，用聚乙二醇浓缩样品，包4舌含病毒样品。聚乙二醇的任何聚合物均可用于本发明的方法中。例如，聚乙二醇具有的最小分子量可以为约120,优选约5,000,较优选7,000。聚乙二醇的最大分子量可以为约IO，OOO，优选约9,500，较优选约9,000。可以结合上述任何最小值和最大值，为聚乙二醇提供一个恰当的范围。优选的，聚乙二醇具有约8,000的分子量。在第二个具体实施方式中，硫酸铵用来浓缩细胞或病毒。本发明的方法中所用的石危酸铵的'除当浓度可以为，例如，在约5%和约50。/。v/v之间。在第三个具体实施方式中，离心和/或超速离心用来浓缩才羊品中的细月包或病毒。恰当的离心条件(例如时间、速度、温度等)可以由本领域的技术人员确定。典型的，离心用于浓缩细胞，而超速离心通常用于;农缩病毒。本方法的第二步中，通过将含去垢剂的裂解液加入样品中而形成裂解物。该裂解液以足以裂解细月包或病毒的量加入。如在本文中使用的，"裂解"通常指细胞或病毒结构组分(例如病毒^L膜和衣壳、细胞膜、凝固的蛋白等)的物理-化学性石皮坏。在本发明方法中可用的裂解液包含能够溶解脂质的去垢剂。去垢剂包括但不限于十二烷基硫酸钠(即月桂基碌uJ臾钠)、磷酸三正丁酉旨(tri画N画butylphosphate)、Brij-35、辛基P-葡萄糖普、辛基(3画葡斗唐石克吡喃苷等。利用本领域才支术人员已知的任何方法，使裂解液与样品接触。典型的，该裂解'液与才羊品一起孵育足够的时间和温度以石皮坏细月包和/或病毒。通常，将裂解液(通过移液管)移入样品中。本领域的4支术人员可以很容易确定恰当的孵育条件(例如时间、温度等)。通常在4。C和90。C之间的温度下，将样品与裂解液一起孵育至少l分钟或多分钟，需要或无需振荡。振荡的实例包括但不限于摇动、搅拌、震动、涡旋或任何其它类型的^M戒混合。裂解液中去垢剂的浓度将依赖于多种因素，如去垢剂的强度、孵育条件等。例如去垢剂的浓度通常从约0.1%至约10。/。v/v不等。在一个具体实施方式中，该裂解液进一步包括蛋白酶。典型的，蛋白酶用于消化蛋白。对于含细胞或病毒(其中核酸与蛋白相结合)的样品，蛋白酶在本发明方法中特别有用。这种病毒的一个实例是乙肝病毒。任何本领域技术人员已知的蛋白酶均可釆用。恰当的蛋白酶的实例包括蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶等。裂解液中蛋白酶的最小量通常约0.1mg/ml，优选约0.4mg/ml，较优选约0.7mg/ml。裂解液中蛋白酶的最大量通常约10mg/ml，优选约7mg/m，專交优选约5mg/ml。可以结合4壬4可上述最小量和最大量，为蛋白酶提供一个范围。通常，裂解液包含约lmg/ml蛋白酶。裂解物形成后，用于^是取核酸的方法中下一步是将醇特别是水溶性醇加入裂解物中。本领域技术人员已知的任何醇均可按照本发明的方法而4吏用。醇的实例包括j旦不限于乙醇、异丙醇等。另一个有用醇的实例是甲醇。将醇加入裂解物中，通常引起核酸从溶液中聚集或沉淀。加入裂解物中的醇的浓度和量，可以为足以聚集或沉淀核酸的任何浓度或量。这些浓度和量可以4艮容易由本领域的4支术人员确定。醇的实际量将才艮据本领域中熟知的多个因素而变动，例如所利用的特定醇、待加入醇的浓度、裂解物溶液的体积以及4寺裂解样品的类型和制备方法。力口入裂解物中的醇可以为100%醇，或者醇与水的溶液，如50%、70%或95%的醇溶液。例如，对于100%醇，所加入醇的量为裂解物溶液体积的约1/10至约2#，最适为裂解物溶液体积的约一半。用于提取核酸的方法中最后一步包括从裂解物-醇混合物中纯化核酸。通过3皮璃纤维滤器过滤混合物而将核酸/人该裂解物-醇混合物的非核酸部分分离而纯化核酸。这些滤器是用硼石圭3皮璃制造的微:型纤维滤器。该玻璃纤维滤器提供高流速和高结合能力。恰当的玻璃纤维滤器包括例如可从Whatman,Clifton,NJ购得的GF/F型。玻璃纤维滤器的最小孔径大小为约0.4jxm,优选约0.6pm。最大孔径大小为约1.2(im,优选约l.Ojam,4交优选约0.8(^m。可以结合上述任何最小值和最大值，为滤器孔径大小提供一个恰当的范围。优选的，孑L径大小为约0.7pm。容许该裂解物-醇混合物通过滤器。通过应用压力可促进裂解物-醇混合物的流动。例如，在滤器下方提供负压的设备或者在滤器上方3是供正压的设备，可以用来提供必要的压力辅助醇溶液通过滤器。该过滤步骤可以例如利用安装于多头抽真空装置中的多孔过滤才反。该过滤^1利用本发明方法中的JE皮璃纤维滤器作为其过滤构件。适于应用的过滤板可以购得。例如，GF/F型96孔玻璃纤维过滤板可从Whatman,Clifton,NJ购得。包含多于或少于96孔的板也合适，而且可以依据使用者的需要而制备并使用。经设计用来容纳多孔过滤板的多头抽真空装置可以购得，且常规用来处理多个样品。例如，可以采用Millipore提供的多头抽真空装置。放置该多孔过滤板使其"坐"于多头装置的板支架上，其边缘围以密封垫圈。采用多孔板例如96或386孔板，可同时处理多个样品。当这种才反固定于多头4由真空装置时，才羊品可同时流过所有的3L，/人而可同时处理多个样品。因此，本发明的方法适合于利用实验室机器人技术(robotics)的自动化操作。例如，可以利用自动液体处理系统结合真空单元吸引样品同时通过每个孔而处理样品。当例如需要迅速处理多个样品的筛查时，如血液筛查或遗传筛查，则核酸提取自动化的能力是一个有〗介值的优势。可用来辅助裂解物-醇混合物流过或通过玻璃纤维滤器的其它压力包括采用来自过滤纟反顶部的正压、离心或重力。多孔^反可以与特别i殳计的离心系统一起4吏用(利用板转子)以同时处理多个样品。通过玻璃纤维滤器过滤混合物而将核酸从该裂解物-醇混合物纯化后，可选的，将结合于玻璃纤维滤器的核酸用洗涤緩沖液进行洗涤。可采用加压^L备辅助该洗涤緩沖液流过或通过玻璃纤维滤器。可4,4义的，真空、离心或重力可用来辅助该洗涤纟爰沖'液流过或通过滤器。洗涤緩沖液可以是本领域技术人员已知的任何核酸洗涤缓冲液。优选的洗涤緩冲液是包含约10%至约100%乙醇的溶液，最适约50%至约70%乙醇。该洗涤纟爰冲液进一步包^舌约10mM至约1000mMNaCl、lOmMTris-HCL和2mMEDTA，最适为100mMEDTA。本领域技术人员已知的其它盐类、緩沖液、鳌合剂以及醇也是合适的。洗涤纟爰沖液通常通过结合的核酸至少一次，通常为两次或多次。结合核酸的洗涂次lt依赖于多个因素例如裂解物-醇混合物的组成和体积。可选的，可将含有该结合核酸的玻璃纤维滤器干燥。可通过本领域l支术人员已知的任何方法干燥玻璃纤维滤器。例如可通过在某温度(通常低于90。C)下加热而干燥滤器，通常需1分钟或多分钟。选"f奪的干燥条件应不至于破坏核酸或使其变性。其它用于干燥滤器的方法包括但不限于空气干燥、采用干燥器等。脱下来。该洗脱液优选具有较低的离子强度。因此，洗脱液中盐和其它离子化合物的浓度4呆持在最小值。这种洗脱液的一个实例是无核酸酶的水，可选的包含约0.01%至2.00%的Tween20,最适为约0.02%至约0.1%的Tween20。核酸可以洗脱入多孔收集板中，而收集板置于多孔过滤板(上文已阐述)下方并固定于真空或加压多头装置，在这样一个位置，以1更可收集通过滤器的流体样品。多孔收集板可以购得，例如由BectonDickinsonandCompany(FranklinLakes,N.J.)出售的名一尔为Microtest.RTM的96孔4反。可替代的，可采用组织培养才反。所述收集才反具有的孔通常与多孔过滤才反的孔相匹配，且其安装在在过滤板的下方，处于可以收集通过玻璃纤维滤器的核酸的位置。这些板，过滤板和收集板，均以联锁叠力。(interlockingsuperposition)的方式安装在在多头抽真空装置内。收集板很容易购得。然而，正如上述论及的96孔过滤板，收集板也可依据使用者的需要适合具有较多或较少孔或者较大或较小体积。提取的核酸可以在例如下面描述的方法中使用。本申请的发明人意外的发现上述提取方法能高效分离DNA和RNA。其它标准测定法通常需要一种方法高效分离DNA，另一种独立的方法高步文分离RNA。鉴定样品中的病原体在一个具体实施方式中，本发明4是供了一种用于鉴定样品中病原体的方法。该方法中第一步是从样品中的细胞或病毒提取核酸。该核酸可以按照上述纟是取方法提取。一旦核酸乂人样品中|是取出来，该鉴定病原体的方法中下一步就是分析该核酸。核酸可以通过本领域熟练-技术人员已知的任何方法进行分析。核酸通常用于核酸扩增和/或其它标准分碎斤:技术。利用例如PCR或RT-PCR方法的核酸扩增系统为本领域的熟练技术人员已知。核酸扩增技术的综述以及将这些技术应用于病原体诊断的阐述，参见侈寸口<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>利用PCR方法的核酸扩增系统已经自动化。如上文论及的，声明的发明中用于核酸提取的方法也可以自动化。核酸提取和纯化的自动化结合核酸扩增:技术的自动化，使得这些方法可以用来在短时间内筛查大量^f羊品如血液的病原体(例如病毒、细菌、真菌或寄生虫等)，这些病原体可能存在于样品中，即使是以极低的水平。核酸扩增产物(扩增子)以及因此核酸从其起源的病原体的身〈分可以例如通过杂交技术而确定。通常，杂交技术采用寡核苷酸探针，其互补于已知核酸序列且与其独特杂交。该寡核苷酸纟笨针可以是RNA或DNA分子。可以采用任何用于分析寡核苦酸探针与核酸杂交的方法。例^t口，Southern杂交4支术(Southernblotting)是这种#支术的——个4寺另寸熟知的实例。该Southernblot技术涉及到用限制性核酸内切酶切割核酸扩增子、通过凝胶电泳分离切割的片段、用特异的寡核苷酸探针探测以及检测杂交的存在情况。其它相关方法为本领域中的技术人员已杀口，参见Samteooketal.，Afo/ecwhrGtom'wg;^丄a;&(ra勿o/Afa咖fl/,2ded,,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor(1989).寡核苷酸探针的长度并不关键，只要其能够杂交于靶分子即可。该寡核苦酸应该包含至少6个核苷酸。不存在寡核苷酸〗笨针长度的上限，然而，4交长纟笨针制备比较困难，而且需要较长的杂交时间。因此，探针不应长于必要的长度。一般，寡核苷酸探针应包含不多于50个的核苷酸，优选不多于40个核苷酸，4交优选不多于30个核苦酸。这种探针可以按照本领域已知的方法可检测性的进行标记，例如》欠射标记、酶、生色基团、荧光基团等。才企测到标记物则表明寡核苦酸探针与核酸杂交。因此，检测到标记物则表明样品含有该寡核苷酸特异的特殊病原体，从而鉴定样品中的病原体。可替代的，不能检测到特异于特殊病原体的特定寡核苷酸表明该才羊品中不包含可纟佥测量的寡核苷酸特异的特殊病原体核酸。分析核酸的另一个途径是采用常身见或通用的分子信标。这种方法例如由Tyagi和Kramer(NatureBiotechnolojy14，303-308,1996)描述过，Andrus和Nichols也在美国专利申请公开No.20040053284中4苗述过，其,皮净争让纟会纽约血液中心(NewYorkBloodCenter,NewYork,N.Y)。简要的说，分子信标是单链的寡核苷酸杂交探针，形成茎和环结构。所述环具有互补于革巴序列的揮:针序列。所述茎则通过探4十序列两侧每一侧上互补的臂序列退火形成。典型的，荧光基团共价连接于一个臂的末端，而淬灭剂共价连接于另一个臂的末端。当游离存在于溶液中时，由于茎-环结构以及荧光基团的淬灭，分子信标不发出荧光。然而，当分子信标杂交于包含靶序列的核酸时，发生构象改变使其发出荧光。分子信标一笨针可用4壬<可适于核酸(例如PCR扩增产物)4企测的方式进行变更。变更的探针包括例如在第6,037,130号美国专利中描述的"波长移位"分子信标探针。特别的，这些变更的探针具有基础的分子信标探针结构，即一个环；两个茎；位于一个末端上的淬灭剂以及一个位于另一个末端上与淬灭剂相对的才艮告基团，通常是荧光基团。该报告基团称为"采集报告基团"。探针的变更即该探针包括经过该"采集报告基团，，的几个核苷酸延伸。该延伸终止于另一个连接于"发射报告基团"的核苷酸，通常是另一个荧光基团。在存在靶核酸分子时，淬灭剂从报告基团上分离。在这种开放构象下，"采集报告基团"吸收来自刺激源的能量，但将显著部分的能量(在某些结构下为绝大部分能量)转移至"发射报告基团"，其接收转移来的能量并发出其较长的特征性波长。分子信标通常对探针与靶序列之间的小量核苷酸错配敏感(Tyagietal,，1998,所otec/ww/"16:49-53).可以变更分子信标#支术，使其可用于^r测例如甚至高度变异的病毒种。例如，Andrus和Nichols的序列号10/399,843的美国专利申^青(美国专利申讀^开案No.20040053284，其被转让给纽约血液中心(NewYorkBloodCenter,NewYork,N.Y)描述了正向和反向引物的应用，所述引物在耙序列上"面对面"排列(即两个引物的杂交位点之间不存在插入性空隙)。分子信标探针设计为跨越两个引物的结合处而不对称的杂交。存在核苷酸错配的情况下，PCR引物能够杂交于靶序列并启动扩增。由于引物的"面对面"构象，扩增的PCR产物与分子信标探针有一定的核苷酸序列同一性。因此，例如可以开发通用信标RT-PCR测定法检测高度变异林，包括例如hiv-1的全部重要基因型如O群以及HCV的全部亚型。用于冲企测高度变异病毒的'除当通用信标RT-PCR测定法实例在序列号10/399,843的美国专利申请(美国专利申请7>开No.20040053284)中有所4苗述。在一个优选的具体实施方式中，采用多重PCR。在该测定法中，PCR混合物包含针对多种病原体核酸的引物和纟笨4十。通常在该分析中使用单一荧光基团。因此，检测到阳性信号表明存在病原体中的任何一个。通过例如对待检测病原体中每一个进行单独的PCR反应或者通过标记扩增子并4吏扩增子杂交于不同的包埋把点，可以确定所抬r测到的特定病原体的身份。所述耙点可以包埋于例如硝化纤维膜、DNA芯片、微珠等。还可以采用其它基于PCR的方法分析核酸来鉴定样品中的病原体。这些方法的实例包括凝胶分析、Taqman⑧等。鉴定含水(7jC溶性)非生物样品中的污染物在另一个具体实施方式中，本发明提供了一种用于鉴定怀疑包含或已知包含细胞、病毒、或既包含细胞有包含病毒的含水(水溶性)非生物(即水)样品中的污染物。从而可检测水(例如饮用水、湖等)中的生物污染物以确4呆々欠用或々吴乐(例如游泳)用水的安全性。所述生物污染物可以包4舌细月包或病毒。水中生物污染物的实例包括细菌(例如大肠埃希杆菌、粪〗更大肠菌等)、藻类(例如蓝-绿藻、蓝细菌等)、真菌(瓶霉菌属sp、外瓶霉属sp以及支顶孢属sp.)、寄生虫(例如隐孢子虫属、利什曼原虫、肠兰伯鞭毛虫、阿米巴、葡更毛虫等)以及病毒。该方法中的第一步是从样品中的细胞或病毒提取核酸。核酸按照上述提取方法进4于4是取。为了鉴定污染物，可以利用例如本领域熟练技术人员已知的基于PCR的方法来分析核酸。恰当的分析方法包括上文描述的那些方法。鉴定il传疾病在另一个具体实施方式中，本发明提供一种用于鉴定哺乳动物中遗传疾病的方法。该方法中的第一步是/人样品中的细月包l是取核酸。核酸按照上述提取方法进行提取。优选的，细胞来自于哺乳动物，通常是人。为了鉴定遗传疾病，可以利用例如本领域熟练」技术人员已知的基于PCR的方法来分析核酸。恰当的分析方法包括上文描述的方法。可以4要照本发明的方法鉴定4壬何遗传疾病。遗传疾病的实例包才tf旦不限于血友病、链状细胞性贫血、唐氏综合4正、癌症、癌症易感性(例如测定BRCA1基因)、家族黑蒙性痴呆(tay-sachs)、嚢性纤维病、脑性麻痹、马凡综合症等。试剂盒在另一个具体实施方式中，本发明提供了一种用于从样品中揭_取核酸的试剂盒。该试剂盒包括裂解液以及玻璃纤维滤器。所述裂解液包含去垢剂。可选的，该试剂盒含有下列物质中的一种或多种醇、蛋白酶、洗涤緩冲液、洗脱緩沖液以及容器(例如试管、多孔板等)。所述裂解液、去垢剂、玻璃纤维滤器、醇、蛋白酶、洗涤緩沖液、洗脱緩沖液以及容器上文已经加以阐述。实施例实施例1:材料乂人纟丑约国家卫生部(theNewYorkStateDepartmentofHealth)获得西尼罗病毒，并在Vero细胞中培养。通过常规噬菌斑测定法来确定传染性病毒颗粒的数量(Beatyetal，Arboviruses,p.797-856.JSI.J,Schmidt,andR."W,Em加ons(ed,),Diagnosticproceduresforvirai,rickettsialandchalmydialinfections.AmericanPublicHealthAssodation，Washington.D,C.1989)。通过定量RT-PCR确定病毒基因组当量的数值，利用WNV函A定量4义QWN702(BBIDiagnostics,WestBridgewater,MA)4乍为定量才示准。纽约血液中心提供HBV感染的血浆以及来自慢性HCV感染献血者的血浆。HIV储存物(原种，原液)是来自HIV感染的人周围血淋巴细胞培养物的无细胞上清液。正常人血浆，预先测定其血源性病原体，用于阳性或加标(spiked)样品的系列稀释。实施例2:血浆中多种病毒基因组的提取将等分HBV、HCV、HIV和WNV样品以不同体积移入96孑L的2.2ml储存板(ABgene,Surrey,KT,UK〕中。用于直接提取的血浆体积从150至450Ml不等。加入优化量的蛋白酶K(Qiagen,Chatsworth，CA)以及AL裂解乡爰沖'液(Qiagen,Chatsworth,CA)并筒单混合。除了其它成分之外，AL裂解緩沖液还包含去垢剂以及胍盐。将储存板在振荡水浴中58。C孵育25分钟后，将预定量的无水乙醇(表1)与裂解物轻柔混合。将上述制备物转移入0.7|am玻璃纤维滤器板(GF/F,Whatm叫CUfton,NJ)中，并在-450mmHg真空中过滤。依据该裂解制备物的总体积，转移在1至3个移液步骤中完成。随后，将负载的过滤寺反在同一真空装置中用AW2洗涤i爰冲'液(Qiagen,Chatsworth，CA)进行洗涤。洗涤液体积以及洗涤重复(次数)依赖于初始样品体积(表1)。洗涤后，给予过滤板-350mmHg真空达10分钟，去除残留的洗涤液。随后，无真空时，将板在室温放置IO分钟，以实现最后的空气干燥。通过65-100Ml含0.05。/。吐温20的无核酸酶水的-350mmHg真空过滤，将纯化的核酸洗脱入U形底的96孔板或PCR才反中。表1:用GF/F法提取不同体积血浆的条件<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>混合，58。C孵育25分钟<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>混合，转移入GF/F过滤板在450mmHg真空过滤洗涤体积<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>在450mmHg真空过滤洗涤步骤将过滤板在350mmHg真空干燥10分钟无真空装置时将过滤板空气干燥10分钟洗脱<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>在350mmHg过滤1分钟之前，接触1分钟的时间移液和过滤可以人工操作或者利用GenesisRSP150以及GenesisWorkstation200(Tecan*Mae皿edorf,Switzerland)自动化操作。核酸扩增和检测可以遵循Lee等人所描述的in-housePCR反应和循环条件而实现(StabilizedviralnucleicacidsinplasmaasanalternativeshippingmethodforNAT.rra^fw<'o42，409-413,2(JU2).采用分子信标技术(TyagiandKramer,Molecularbeacons:probesthatfluoresceuponhybridization.NatureBiotechnology14，303-308,1996)斗企测PCR扩增子并加以定量。引物和分子信标经i殳计适用于4企测所有HCV、HIV和WNV的常见4朱。引物的革巴点位于HCV和西尼罗病毒(WNV)的5，-UTR非翻i奪区、HIV的gag-和/oZ-基因以及编码HBV表面抗原的基因上。每个热循环过程中，均在退火步骤监测光发射。序列检测v1.6.3软件程序(PE-Biosystems，FosterCity,CA)通过分析由于PCR过程中模板扩增引起的循环至循环之间荧光信号的变化，并通过比较未知曲线与从系列稀释的已知合成RNA或者质粒DNA标准样品生成的曲线，确定靶模板的拷贝数。将所有的标准用EUROHEP仪(CUB,Netherlands)才交〉隹，用于确定拷贝数。利用AL裂解緩冲液结合蛋白酶K,可以实现病毒RNA和DNA从保护性衣壳和被膜释放。评估AL裂解緩冲液中的RNA稳定性并发现可以与石克氰酸胍相比專交(彰:l居未示出)。通过真空滤过JE皮璃纤维膜可实现核酸捕获、洗涤和洗脱。结果在表2中示出。表2利用GF/F流程和Qiagen试剂盒所确定的血浆病毒负荷的<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>1人正常血浆中阳性样品的稀释度。每种病毒均选择10倍系列稀释，以覆盖103和1()S拷贝/ml的范围。22利用蛋白酶K/AL緩冲液裂解并通过Whatman96孔玻璃纤维过滤4反过滤，提取150m1血浆(n=8)。3利用QiaAmpRNA试剂盒^是取140m1HCV和HIV血浆。200ju1HBV血浆用于QiaAmpRNA试剂盒(n=8)。4基因组数量通过定量实时PCR确定，并以1og,o拷贝数/ml表示。5GF/F结果除以用Qiagen提取试剂盒得到的结果，以确定玻璃纤维法相比参照方法的相对提耳又效率。实施例3:核酸提取的再现性对这些定量4企测结果的可重复性，包括分析内和分析间变化，进行评估。以HCV为例，表3示出了对GF/F和Qiagenl是取后得到的PCR结果计算的变化系数。两种方法的分析内变化类似，然而，Qiagen法的分析间PCR结果则不一致得多。人工以及自动化提取后回收的核酸，i正明是一致而可4言的。表3:GF/F提取和Qiagen提取后得到的HCVPCR结果确定的分析内和分析间变化。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>(1)每个变化系数均对每一组共8个值进行计算。试验由4个不同技术员利用等分的相同HCV感染血浆(在正常人血浆中1/100稀释)在不同时间完成。实施例4:PEG对核酸回收的作用将等分的WNV样品移入96孑L的2.2ml储存板(ABge加，Smrev，KT,UK)中，并与不同量的37%PEG80004诸存'液混合。每次提取的血浆-PEG制备物总体积均为2.0ml。混合PEG与样品后，留出10-30分钟的室温接触时间，然后1500g旋转(离心)3分钟，弃去1.8ml上清而保留可见沉淀(包括一些残余液体)，从而将体积减至200ju1(10X体积减少)。力口入40jul蛋白酶K(Qiagen,Chatsworth，CA)p乂及270iu1AL裂解緩冲液(Qiagen，Chatsworth,CA)，并混合。随后将板在水浴中孵育，58。C热消化25分钟。其后将270jul无水乙醇与该裂解物轻柔混合。将总体积780ju1的提取制备物转入0.7ym玻璃纤维过滤板(glass-fiber-filterplate)中(GF/F,Whatman，Clifton，NJ)，在-450mmHg过滤。该负载的过滤板用600ju1AW2洗涤緩冲液(Qiagen,Chatsworth，CA)在同一真空装置中洗涤一次。洗涤后，给予过滤板-350mmHg真空达IO分钟，去除残留的洗涤液。随后，无真空时将板在室温保存10分钟，以实现最后的空气干燥。通过-350mmHg真空过滤100ju1含0.05%Tween20的无核酸酶水，将纯化的核酸洗脱入U形底的96孔4反中。可3#4戈的，通过75jul含Tween画？K直4妄滤入MicroAmp光学96孑L反应4反(PEAppliedBiosystems,FosterCity,CA)中而完成洗脱。移液和过滤可以人工才喿作或者利用GenesisRSP150以及GenesisWorkstation200(Tecan,ResearchTrianglePark,NC)自动化操作而完成。为了达到最大灵每文度，分别利用100jul洗脱物中的50jul或者75Jul洗脱物的全部体积，进行"高体积"PCR反应。为了合成cDNA,我们加入30ml逆转录(RT)混合物(表4)。反应在42。C运行45分钟，随后是95°C2分钟。其后，加入40PCRmaster-mix(表3)。Taq聚合酶在95。C激活10分钟，靶cDNA在45个循环中扩增，每个循环包括三个升温(热)步骤(95°C,58。c和72°c),每步各30秒。RT混合物以及PCRmaster-mix特别针对120ju1的总反应体积而伊"匕。表4:大体积扩增的RT混合物以及PCR〉'昆合物每个反应30ja1RT混合物试剂供应商浓度样品M-MLVRT緩冲液lnvitrogen5x化.ODTTGibco100mM4.0PCR4亥香酸混合物Amersham10mM2.0Biosciences反向引物100jaM1,0Rnase水卩制剂Promegs4U/jnl0.4M-MLV逆4t录酶lnvitrogen200U/pil0.4无核酸酶的水Promega1X6.2每个反应40ja1PCR混合物试剂供应商浓度靠"pP二MgCI2PEApplied25mM3.0Biosystems正向引物■0.1分子信标GenelJnk200ng/pJ1.0TaqGoldPEApplied5U/pi0.5无核酸酶的水BiosystemsPromsgs1X35.4采用分子信标技术(TiyagiandKramer,Molecularbeacons:probesthatfluoresceuponhybridization^NatureBiotechnology1996,14,303-308)来展示PCR扩增子。引物的革巴点位于5'UTR区。反向引物(5，-getcttgecgggccctectg-3，)、正向引物(5'_gcacgaagatotcgatgtctaagaaac-3，)和分子信标(5'-FAMcgeacgatetogatgtota汪gaaaccc鹏cgDABCYL-3，)经设计适用于检测WNV的所有常见株。AMPrism7700以及7900序歹'J才企测系统4义器(TEAppliedJBiosystems,FosterCity,CA)用于才广i曾,口冲企观'J。才广i曽产4勿可通过实时定量PCR或者通过PCR后定量分4斤而确定。对于实时PCR,序列检测vl.6.3软件程序(PE-Biosystems，FosterCity,CA)通过分析由于PCR过程中模板扩增引起的循环至循环之间荧光信号的变化可确定耙模板的拷贝数。PCR后分析测定扩增前后发射的相对光单元。PCR后定量分析的截断值从阴性对照的平均信号加3个标准偏差计算得来。将不同量的PEG8000加入血浆中以浓缩病毒或者病毒组分。对于PEG-血浆沉淀的沉积，我们选纟奪的条件产生形状疏^K大小恒定的沉淀，其可以在裂解緩沖液中重悬。沉淀成团后，我们将体积减至200jul并处理样品。AL裂解緩沖液/蛋白酶K、乙醇沉淀、过滤、洗涤和洗脱均针对从PEG-血浆沉淀物中提取核酸而改造并优化。分别用100ju1或75y1Tween-水进4亍洗脱，以^吏纯化的RNA产量最大化。将50iul提取的核酸用于PCR反应中。发现PEG8000是一种有效的浓缩方法，可促进人血浆样品中WNV的才企测。图l表明，用3。/。PEG8000浓缩的样品中确定最高量的病毒RNA。利用优化的条件，当浓缩样品并将样品体积减至初始PEG-血浆体积的1/10时，确定可检测的RNA分子呈10倍增力口(图2)。当应用于HBV卩日性样品时，PEG对HBVDNA产生相似的浓缩效果。实施例5:检测限值为了评估检测的低限，进行血浆样品的终点滴定，该血浆样品已用培养的WNV力。以刺激。之前已分别通过相对于BBI仪用定量PCR以及谨菌斑测定法确定了WNV制备物中RNA分子和传染性病毒颗粒的量。发现我们的4诸存病毒制备物的病毒基因组lt量高于p藍菌斑形成的病毒颗粒数量的740-1500倍。为了确定WNV分析的灵4丈度，对BBI〗诸存物(Uganda,7.33x1()4拷贝/ml,Loi^l0n02C)加以稀释并检测。该BBI储存物在阴性血浆中以！2.5，6.3,3.2,L6和0.8拷贝/ml稀释。对每个稀释度的80个复制品进行4企测，并用概率分析来分析，以确定95%和50%的检测限值(LOD)。典型结果示于下面的表5、6、7和8中。表5:FAM(WNV)<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>孔1A-H:内对照(IC)阴性。WNV临界值孔2A-2D(阴性血浆)的平均值+5SD=1197。孔E2:WNV阳性对照，在~300拷贝/ml(估计值)。孔F2:WNV阳性对照，^~60拷贝/ml(估计值)。阳性WNV结果以沣且体示出。表6:利用5个WNV稀释度的灵敏度数据总结(WNV拷贝/迈L)#阳性/射企测<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>承稀释4勿来自于BBI'原液(Uganda,7.33xio4拷贝/ml,Lot#101702C)表7:单个概率分析(SPSS11.5)以及这些试验的变化系数示于下面<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>伞WNV拷贝数/mlLOD-检测限值表8:从不同天在5个板上检测的每个稀释度的80个复制品计算的总体概率分析(SPSS11.5)。<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>实施例6:西尼罗病毒的特定描述屑于『ivr^金承i/的遞^/^^尹wr-尸CT.引物和探针针对跨越WNV基因组中5，-非翻译区和核衣壳起始位点且长47个核苷酸的区域。用于引物设计和核苷酸编号的参照序列是Lanciottietal报道的纽约1999-马分离抹(Science28(5:2333-2337,1999;GteiibankAPI96835》。该47个核苦酸的耙区域在所有种系1分离株(存在其Genebank序列信息)内为〉97%保守，且与WNVUgandal937(GenbankM12294)有94%的同一性。引物和探针序列如下.正向引物5，-GCACGAAGATCTCGATGTCTAAGAAAC-3，(27mer，位置83-109;44%G/C;Tm77°C),反向引物5,一GCTCTrGCcGGGCCCTCCTG-3，(20mer，位置110-129;75%G/C;Tm84°C)，分子信标#笨针5，6-FAM-cgcacgATCTCGATGTCTAAGAAACCcgtgcg-DABCYL-3'(WNV探针区域为大写字母，茎核苷酸为小写字母)。型^^革趟4毒力乂,裙iA^的^rCi.经设计，引物扩增一个67bp区域(1型登革热RNA(参照序列Genba11kAF513110)3，非编码区的10632-10698位核苷酸)。VIC标记的Taqman一笨针用于对照RNAPCR产物的冲企测，以高效区分ABIPRISM7900HT中的IC和WNV焚光信号。引物和4笨针序列如下正向引物5，-GCATATTGACGCTGGGAGAGA-3>(20mer，位置10632-10652;%G/C;Tm73。C)和反向引物5,-GCGTTCTGTGCCT-3，(13mer，位置10686-10698;52%G/C;Tm51°C)。Taqman#冢针5，-VIC-AGATCCTGCTGTCTCTACA-MGB-3'(19證，位置10657-10675;47%G/C;Tm59。C)。yf品求源.对冷冻的血浆样品力D以才企测。该样品为来自于献血者且收集于CPDA-l抗凝剂中的全血。将其离心，然后在96孔深孔板中储存于-8(TC。使用前，将储存的血浆样品4。C解冻40-48小时。研究人员发现该步骤能保留全部WNVRNA。袢品浙务.在两种液体处理系统(Tec叫GenesisRSP150和GenedsWorkstation200)上进行样品提取。将400"i血浆样品从存档板自动转移一个新的96孔深孔孔板中。将4个WNV阴性对照、1个WNV阳性对照和3个内对照(IC)阴性样品自动置于该深孔板中。使用前，将内对照靶RNA与裂解緩冲液混合。提取过程中，4吏其以与WNV样品相同的方式经过整个处理过程。将蛋白酶K和AL裂解緩沖液与血浆样品在GenesisRSP150上混合。将混合物在振荡水浴中于58°C孵育。孵育后，在GenesisWorkstation200上将ETOH加入裂解物中。随后将混合物转移入96孔^皮璃纤维过纟反中，并真空过滤4吏核酸结合。将滤器通过过滤连续洗涤两次，然后真空干燥以及空气干燥该滤器。WNVRNA通过用无核酸酶的水过滤进行洗脱。洗脱液直接收集入含有逆转录(RT)混合物的PCR板的相应孔中。,增,逆餘z秀(^7V和尸C7.将上面得到的含有RTMas敏^和洗脱样品的PGR板在AppliedBiosystem^Model2700热循环^f义上孵育，用于逆4争录。在RT步结束时，^)夺逆转录酶力口热灭活并向每个3L中加入PCR混合物。首先加热PCR反应混合物以激活^pMTaqgold,然后进4亍454仑PCR循环。yi^身；在45个PCR循环结束时，荧光光谱热循环^义(ABIPRISM7900HT，PE-Biosystei2S，FesterCity，CA)用于进行终点才企测。WNV信号用FAM标记的4笨针进4亍才企测，在522nm读数，而VIC标记的IC信号在554nm读数。如果阳性和阴性对照值落在预定的范围内，则认为运行有效。如果阳性和阴性样品在可接受范围内，则运行有效。如果内对照(VIC)RFU值超过了IC截断值，则认为单个样品的结果有效。IC截断值从IC阴性对照的平均相对荧光单位(RFU)力。3SD(n=3)计算得来。WNV反应截断值从WNV阴性对照的平均RFU加5SD(n=4)计算得来。样品具有的RFlH氐于IC截断值，则将^人为IC失败除非WNVPCR阳性。阳性样品是RFU大于或等于WNV截断值的样品，无论ICRFU为何值。/^,/47力裙试W.WNV阳性对照WNV组织培养上清通过60°C加热1小时而灭活，在阴性人血浆中稀释(1000倍)并通过RT-PCR利用一组含有已知量WNVRNA的样品进4于定量。将阳性样品调为含60个RNA拷贝/ml、迅速冷冻并将单次使用的等份保存于-80。C或更低温度。到使用那天，通过在37匸水浴中振动解冻。力力:桥试^/.登革热(夏威夷一朱)培养上清通过60。C加热1小时而灭活、在PBS、10%阴性人血浆中稀释为^7p^^并分装成80Ml的量，其足以用作单板或多板的内对照。将等份迅速冷冻并保存于-8(TC或更低温度。到使用那天，通过在37。C水浴中振动解冻。才法,惑/#.通过用AL裂解緩冲液/蛋白酶K裂解液裂解病毒颗粒，对400jul血浆进行该分析。登革热病毒用作PCR内对照。裂解物随后在真空下吸收入玻璃纤维板上，在洗脱核酸用于逆转录和PCR之前，将该板洗涤并干燥。所有的移液步骤均在TecanGenesisRFP150和200workstations上进行。PCR反应在ABIModel2700热循环仪上进行。扩增的核酸在ABI7900焚光读数仪上进行检测。除了内对照，检测对照还包括阴性对照以及含已知拷贝数RNA的WNVRNA阳性对照。利用终点计算确定WNVRNA的阳性，其中将冲全测样品中的萸光与阴性对照的荧光进行比较。^^品求源和袭iA条来自于-80。C冷冻的CPDA-1抗凝血的血浆是用于本特定研究的源材料。使用前，将样品在4。C解冻40-48小时并储存于4"C。厉'/4以及力乂力辨.对于筛查性分析，采用l个阳性对照孔，其含有相当于300WNVRNA/ml的热灭活WNV病毒。4个孔含有WNV阴性对照血浆，3个另外的孔设为IC阴性对照血浆，其将用缺乏登革热内对照靶RNA的裂解緩沖液处理。WNV的阳性截断值计算为4个WNV阴性对照的平均值+5SD。登革热内对照的阳性截断值计算为缺乏登革热病毒的3个IC阴性对照的平均值+3SD。病毒教「在的袭游.包含于血浆样品中的病毒颗粒通过加入蛋白酶K和AL裂解ll沖液而裂解，在58。C水浴中孵育25分钟的过程中，释放的核酸受到裂解緩冲液的保护。在即将使用前，将登革热病毒内对照加入裂解》爰沖液中，作为该方法所有步驶《的内对照。『7VrAiV」将无水乙醇加入裂解物中，并一寻才羊品自动转入^皮璃纤维过滤^反中，在真空下过滤。然后用洗;条液洗涤该滤器，除去蛋白以及可能的PCR抑制剂，干燥并用无核酸酶的水直接洗脱入96孔PCR反应氺反中。逆脊录.将全部核酸洗脱液用于逆转录和PCR扩增。逆转录混合物包含5X第一条链緩沖液、DTT、dNTPs、RNase抑制剂、WNV反向引物(WNVR)引物、登革热反向(DR)引物以及M-MLV逆转录酶，该混合物与提取洗脱液混合，在42。C孵育45分钟，随后是95。C2分钟。尸CT扩增.PCR混合物包含WNV正向(WNVF)引物、登革热反向(DF)引物和VIC标记的登革热内对照探针(DP)、Mgd2、PCR緩沖液以及Taq聚合酶(AmpUTaqgold)，将该混合物加入RT孔中。在ABI2700热循环仪上，首先在95匸加热PCR反应混合物10分钟以激活^PKT叫gQld，然后在95°C、58。C和72。C进行45个PCR循环。尸C7,參的一企鄉.由于对靶序列进行了简化，PCR产物结合FAM标记的WNV信标探针的环结构，从而在FAM(报告基团)与DABCYL(淬灭基团)远离之前防止其茎3皮杂交。该FAM在490nm脱离，在522nm读数。正如登革热内对照，VIC标记的探4十在其中一个引物的下游退火，当引物延伸时VIC分子一皮TaqDNA聚合酶的5'核酸酶活性切割。靶序列扩增过程中，VIC信号随着探(廳，50,250,125,62.5GE/ml、于4。C储存0、7和14天。样品体积为每种4是取物350ju1,每个才羊品有5〗分重复才羊品。7于每个才羊品的四份重复样品进行重复检测。利用玻璃纤维过滤板在TecanRobotics上进行RNA提取；对WNVRNA进行终点RT-PCR。RT-PCR的结果示于图3中，对数据的统计分析则展示于表6中。在4。CM诸存7到14天的样品表现出的WNV焚光信号的水平与4。C储存0天的对照样品的WNV焚光信号的水平相当(表9)。因此，储存于4。C时，WNVRNA在正常人血浆中可稳定至少14天。表9图3中所展示数据的统计分析<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>*来自所有稀释物的数据回归计算为1000GE/mL(参见图3)**通过斯氏T检验针对O天对照分析数据。针释放出切割的VIC报告基团而增加。VIC在490nm脱离，在522函读数。实施例7:储存于4°C时血浆中WNV的稳定性品羊释前东遽迅权利要求1.一种用于从样品中提取核酸的方法，包括a)获得包含细胞、病毒、或者既包含细胞又包含病毒的样品；b)将含去垢剂的裂解液加入所述样品中，从而裂解所述细胞或病毒并形成裂解物；c)向所述裂解物中加入一定量足以聚集或沉淀核酸的醇；以及d)通过玻璃纤维滤器过滤混合物而从裂解物-醇混合物中纯化所述核酸。2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括浓缩所述样品中的细胞或病毒。3.才艮据^又利要求2所述的方法，其中用聚乙二醇浓缩所述细月包或病毒。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是生物样品。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是含水样品。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品包含病毒。7.才艮据权利要求1所述的方法，其中所述细胞是樣i生物。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述裂解液进一步包括蛋白酶。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述蛋白酶是蛋白酶K。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述去垢剂是十二烷基硫酸钠。11.根据权利要求1所述的方法，酯。12.4艮据^^又利要求1所述的方法，13.才艮据权利要求12所述的方法,14.4艮据;f又利要求1所述的方法，15.根据权利要求1所述的方法，其中所述去垢剂是磷酸三正丁其中所述样品来自哺乳动物。其中所述哺乳动物是人。其中所述样品来自鸟类。其中所述才羊品来自节月支动物。16.—种用于鉴定样品中病原体的方法，所述方法包^舌a)获得包含细胞、病毒、或者既包含细胞又包含病毒的样品；b)将含去垢剂的裂解液加入所述样品中，从而裂解所述细月包或病毒并形成裂解物；c)向所述裂解物中加入一定量足以聚集或沉淀核酸的醇；d)通过玻璃纤维滤器过滤混合物而从裂解物-醇混合物中纯4匕所述核&臾；以及e)分析所述核酸，以鉴定所述病原体。17.—种用于鉴定7jC才羊中生物污染物的方法，所述方法包4舌a)获得包含细胞、病毒、或者既包含细胞又包含病毒的水样；b)将含去垢剂的裂解液加入所述样品中，从而裂解所述细胞或病毒并形成裂解物；c)向所述裂解物中加入一定量足以聚集或沉淀核酸的醇；d)通过玻璃纤维滤器过滤混合物而从裂解物-醇混合物中纯4匕所述一亥&臾；以及e)分析所述核酸，以鉴定所述污染物。18.—种用于鉴定哺乳动物中遗传疾病的方法，所述方法包4舌a)获得包含细胞的生物样品；b)将含去垢剂的裂解液加入所述样品中，乂人而裂解所述细胞或病毒并形成裂解物；c)向所述裂解物中加入一定量足以聚集或沉淀核酸的醇；d)通过玻璃纤维滤器过滤混合物而乂人裂解物-醇混合物中纯化所述核酸；以及e)分4斤所述核酸，以鉴定遗传疾病。19.一种用于从样品中提取核酸的试剂盒，所述试剂盒包括a)含去垢剂的裂解液以及b)玻璃纤维滤器。全文摘要本发明提供了一种用于从样品中提取核酸的方法。所述样品包含细胞、病毒、或者既包含细胞又包含病毒。该方法包括将含去垢剂的裂解液加入样品中以裂解细胞或病毒形成裂解物、将醇加入所述裂解物中以聚集或沉淀核酸、以及通过玻璃纤维滤器过滤混合物而从裂解物-醇混合物中纯化核酸。文档编号C07H21/04GK101268198SQ200680002953公开日2008年9月17日申请日期2006年1月20日优先权日2005年1月21日发明者李敦勋,沃尔弗拉姆·H.E.·普尔法,琳达·安德勒斯,艾尔弗雷德·M·普林斯申请人:纽约血液中心有限公司