高亲和力hivt细胞受体的制作方法

专利名称：：高亲和力hivt细胞受体的制作方法髙亲和力HIVT细胞受体本发明涉及对HIVGag多肽衍生的SLYNTVATL-HLA-A*0201具有结合特性的T细胞受体(TCR)。该TCR包含至少一个TCRa链可变区和/或至少一个TCR|3链可变区，其对于所述SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物的Kd小于或等于lpM禾Q/或对SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物的解离速率(k。ff)为1x10—3S"或更慢。发明背景人免疫缺陷病毒(HIV)是获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的致病因子。该病毒是属于慢病毒群(gro叩)中的一种被膜逆转录病毒。SLYNTVATL(SEQIDNO:16)肽衍生自Gag基因的gl7基因产物，Gag基因是构成人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的九个基因中的一个。该肽由HLA-A*0201负载，并呈递到HIV感染细胞的表面。因此，SLYNTVATL-HLA-A2*0201复合物提供了一种TCR可靶向的HIV标记，例如为将细胞毒剂或免疫刺激剂递送到感染细胞的目的。然而，对于该目的，如果TCR对肽-HLA复合物具有高亲和力和/或慢的解离速率将是有利的。发明概述本发明首次提供了对SLYNTVATL-HLA-A1110201复合物的亲和力(Ko)小于或等于lpM禾n/或解离速率(k。ff)为lxl(T3S—'或更慢的TCR，前提是当所述TCR由细胞递呈且包含SEQIDNO:1禾B2时，所述细胞不是天然T细胞。此类TCR不论单用或是与治疗剂一起使用对于靶向递呈该复合物的HIV感染细胞都是很有利的。发明详述本发明提供了一种T细胞受体(TCR)，其对SLYNTVATL-HLA-A*0201具有结合特性，并包含至少一个TCRa链可变区和/或至少一个TCR|3链可变区，它的特征在于所述TCR对于所述SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物的Kd小于或等于lpM和/或对于SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物的解离速率(k。ff)为lxl(T3S"或更慢，前提是当所述TCR由细胞递呈且包含SEQIDNO:1和2时，该细胞不是天然T细胞。可采用任何已知的方法测定KD和/或(k。ff)。一种优选的方法是实施例4中的表面等离子共振(SurfacePlasmonResonance,Biacore)方法。为了比较，通过实施例4的基于Biacore方法测定亲本HIVgagTCR(TCRa链见SEQIDNO:9，TCR]3链见SEQIDNO:IO)的二硫键连接的可溶性变体与SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物相互作用的KD约为85nM，解离速率(koff)为2.21X10—2S-l，半衰期为0.17分钟。SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物的特异性亲本HIVGagTCR具有以下的V。链和Ve链基因用途a链-TRAV12.2P链-TRBV5.6可将亲本HIVGagTCR用作模板来产生本发明的其它TCR，所述其它TCR对于所述TCR与SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物之间的相互作用的高亲和力高和/或解离速率慢。因此，相对于亲本HIVGagTCRa链可变区(参见图la和SEQIDNo:1)和/或p链可变区(参见图lb和SEQIDNO:2)，本发明的TCR在其至少一个互补决定区(CDR)和/或可变区框架区发生突变。本发明也考虑了本发明TCR可变区中的其它超变区(例如超变4(HV4)区)可在高亲和力突变TCR中发生突变。噬菌体展示为产生TCR变体文库提供了一种手段。(Li筝，(2005)7Vfl&"23(3):349-354)和WO2004/04404详述了适于噬菌体展示和随后的TCR变体文库筛选的方法，所述TCR变体各含有非天然链间二硫键。天然TCR以异二聚化的ap或^形式存在。然而，现已显示由单条TCRTCRa或TCRp链组成的重组TCR可结合肽MHC分子。在一个实施方式中，本发明的TCR包括a链可变区和TCR(3链的可变区。TCRa链序列和/或TCRp链序列中的突变可为一个或多个取代、缺失或插入，这对于本领域技术人员而言是显而易见的。可用任何合适的方法来实现这些突变，这些方法包括但不限于基于聚合链式反应(PCR)方法、基于限制性内切酶的克隆方法、或不依赖于连接反应的克隆(LIC)方法。这些方法在许多标准分子生物学教材中有所详述。关于聚合酶链式反应(PCR)诱变法和基于限制性内切酶的克隆法更为详尽的描述可参见(Sambrook&Russell，(2001)MolecularCloning-ALaboratoryManual(3rdEd.)《分子克隆实验室指南》第三版，CSHLPress)。关于LIC法的进一步描述可见于(Rashtchian，(1995)CwatOp/"肠tecA"o/6(1):30-6)。应注意到包含相似Va和VP基因应用并由此氨基酸序列与HIVGag相似的任何a卩TCR可用来制作便利的模板TCR。然后可能将产生本发明突变的高亲和力TCR所需的改变引入编码模板apTCR的一个或两个可变区的DNA中。本领域技术人员显然知道可通过许多方法，例如定点诱变引入所需的突变。与图la和SEQIDNo:1的亲本HIVGagTCRa链可变区序列中这些位置的氨基酸相比，本发明TCR包含那些在对应于以下所列的一个或多个TCRa链可变区的氨基酸发生突变的TCR。除非另有相反陈述，本文的TCR氨基酸序列一般含有N-末端甲硫氨酸(Met或M)残基。本领域技术人员可知该残基在重组蛋白产生过程中可以除去。本领域技术人员也显然知道，可将其C-末端和/或N-末端的序列截短1、2、3、4、5个或更多个残基，而基本不影响该TCR的pMHC结合性能，本发明包括所有这些不重要的变体。本文所用的术语"可变区"应理解为包括给定TCR的不包含在由TCRa链的TRAC基因或TCR(3链的TRBCl或TRBC2基因所编码的恒定区内的所有氨基酸(序列)。(《T细胞受体手册》(TcellreceptorFactsbook)，(2001)，LeFranc和LeFranc，科学出版社，ISBN0-12-441352-8)。本文所用的术语"可变域"应理解为包括给定TCR的由TCRa链的TRAC基因或TCR(3链的TRBV基因所编码的所有氨基酸(序列)。(《T细胞受体手册》(TcellreceptorFactsbook)，(2001)，LeFranc禾口LeFranc,科学出版社，ISBN0-12-441352-8)。本领域技术人员可知，在本文定义的可变区和恒定区之间交界处由密码子所编码的氨基酸中发生变异可导致TCR库(r印ertoire)的部分多样性。例如，存在于亲本HIVGagTCR序列中该交界处的密码子(突变)导致本文可变区序列的C-末端存在组氨酸(H)残基。该组氨酸取代了图8a所示，TRAC基因编码的N-末端天冬酰胺(N)残基。本发明的实施方式中包括含有对应于以下一个或多个a链可变区氨基酸发生突变的突变性TCR:95T、96N、97S、98G和100A，例如以下氨基酸95S或G96A97H98D100S以上的编号与图la和SEQIDNo:l中所示的编号一致。本发明的实施方案也包括对应于以下所列的一个或多个TCRP链可变区氨基酸相对于图lb和SEQIDNo:2的天然HIVGagTCRP链可变区中这些位置的氨基酸发生突变的TCR。所指示的可能发生突变的氨基酸是51Y、52E、53E和54E，例如51V或A52R或L53G54V以上的编号与图lb和SEQIDNo:2中所示的编号一致。本发明的其它优选实施方式是含有图6所示突变的a链可变区氨基酸序列之一的TCR。(SEQIDNo:11到13)。这种TCR的表型沉默变体也构成本发明的一部分。本发明的其它优选实施方式是含有图7所示突变的3链可变区氨基酸序列之一的TCR。(SEQIDNo:14和15)。这种TCR的表型沉默变体也构成本发明的一部分。天然TCR存在异源二聚体a(3或yS形式。然而，目前已显示由aa或即同源二聚体构成的重组TCR能与肽MHC分子结合。因此，本发明的一个实施方式是TCRaoc或TCR卩(5同源二聚体。本发明的其它优选实施方式是含有下列a链可变区氨基酸序列和(3链可变区氨基酸序列组合的本发明的TCR，这类TCR的表型沉默变体也构成本发明的一部分<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>在另一优选实施方案中，含有以上详述的可变区组合的本发明TCR还含有图8a所示a链恒定区氨基酸序列(SEQIDNO:19)以及图8b和8c所示J3链氨基酸恒定区序列之一(SEQIDNO:20和21)或其表型沉默变体。本文所用的术语"表型沉默变体"应理解为指对所述SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物的Kd小于或等于1jiM禾口/或具有1X10—3S"或更慢的解离速率(k。ff)的那些TCR。例如，本领域技术人员已知可能产生与以上详述的那些TCR相比，在其恒定和/或可变区中掺入了较小变化但不改变与SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物相互作用的亲和力和/或解离速率的TCR。本发明范围包括这类不重要的变体。其中含有一个或多个保守取代的那些TCR也构成本发明的一部分。就广义而言，本发明TCR可以如WO04/033685和WO03/020763所述为单链TCR(scTCR)或二聚体TCR(dTCR)形式。合适的scTCR形式包括由对应于TCRcc链可变区的氨基酸序列构成的第一区段，由对应于TCRp链可变区序列并与对应于TCRp链恒定区胞外序列的氨基酸序列的N末端相融合的氨基酸序列构成的第二区段，和连接该第一区段C末端与该第二区段N末端的接头序列。或者，所述第一区段可由对应于TCR(3链可变区氨基酸序列构成，所述第二区段可由对应于TCRa链可变区序列并与对应于TCRa链恒定区胞外序列的氨基酸序列的N末端相融合的氨基酸序列构成。以上scTCR在第一和第二链之间还含有二硫键，所述二硫键在天然apT细胞受体中没有等价物，其中该接头序列的长度和该二硫键的位置应使第一和第二区段的可变区序列的相互取向基本上如天然a卩T细胞受体中的那样。更具体地说，所述第一区段可由对应于TCRa链可变区序列并与对应于TCRa链恒定区胞外序列的氨基酸序列的N末端相融合的氨基酸序列构成，第二区段可由对应于TCR卩链可变区序列并与对应于TCR卩链恒定区胞外序列的氨基酸序列的N末端相融合的氨基酸序列构成，和在第一和第二链之间可以存在天然apT细胞受体中没有等价物的二硫键。在以上scTCR形式中，接头序列可连接第一区段C末端和第二区段N末端，其可如式-PGGG-(SGGGGVP-所示，其中n是5或6，P是脯氨酸，G是甘氨酸，S是丝氨酸。-PGGG-SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG-P(SEQIDNO:17)-PGGG-SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG陽P(SEQIDNO:18)本发明TCR的合适dTCR形式包括第一多肽，其中对应于TCRa链可变区的序列的一条序列与对应于TCRa链恒定区胞外序列的序列的N末端相融合；第二多肽，其中对应于TCRP链可变区序列的一条序列与对应于TCRp链恒定区胞外序列的序列的N末端相融合；该第一和第二多肽通过在天然a卩T细胞受体中没有等价物的二硫键相连。所述第一多肽可含有与对应于TCRa链恒定区胞外序列的序列的的N末端相融合的TCRa链可变区序列，而第二多肽中对应于TCR(3链可变区序列的一条序列与对应于TCR(3链恒定区胞外序列的序列的N末端相融合，该第一和第二多肽通过取代TRAC*01外显子1的Thr48和取代TRBC1*01或TRBC2*01或其非人等价物的外显子1的Ser57的半胱氨酸残基之间的二硫键相连。("TRAC"等在本文根据《T细胞受体手册》(TcellreceptorFactsbook)，(2001)，LeFranc和LeFranc，科学出版社，ISBN0-12-441352-8命名)。本发明TCR的dTCR或scTCR形式可具有对应于人apTCR胞外恒定区和可变区序列的氨基酸序列，在天然TCR中没有等价物的二硫键可连接所述恒定区序列的氨基酸残基。所述二硫键存在于与在天然TCR中其卩碳原子距离小于0.6nm的氨基酸残基相对应的半胱氨酸残基之间，例如在取代TRA(^01外显子1的Thr48和取代TRBC1*01或TRBC2*01或其非人等价物的外显子1的Ser57的半胱氨酸残基之间。就TCRa链而言，可引入半胱氨酸形成二硫键的其它位点是TRACMl外显子l中的以下残基，就TCRP链而言，是TRBCPOl或TRBC2M1外显子1中的以下残基<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>除了以上提及的非天然二硫键以外，本发明TCR的dTCR或scTCR形式可在对应于天然TCR中通过二硫键连接的残基的残基之间含有二硫键。本发明TCR的dTCR或scTCR形式优选不含有对应于天然TCR的跨膜或胞质序列的序列。本发明的TCR与SLYNTVATL-HLA-A2*0201牢固结合。当用HLA-A*0201负载时，这些TCR还可与HIVGag衍生的SLYNTVATL天然变体相结合，其结合程度虽然发生改变但仍然有用。已从AIDS患者中分离的SLYNTVATL变体包括下述变体(Sewell筝，(1997)￡wJ27:2323-2329):SL[NTVATLSL￡NTVAYLslyntvatlS处NTVATLSLLNTVATLSLYNTIATLSL￡NTIATLSL￡NTIAYLSL￡N￡VATL突变的氨基酸用下划线表示。尸五g化游rci単沐在一个具体的实施方式中，本发明的TCR与至少一条聚亚垸基二醇链结合。本领域技术人员已知有许多方法可产生这种结合。在一优选的实施方式中，一条或多条聚亚烷基二醇链与TCR共价相连。在另一实施方式中，本发明该方面的聚乙二醇链含有至少两个聚乙烯重复单位。多份rc7复会激本发明一方面提供含有至少两个本发明TCR的多价TCR复合物。在该方面的一个实施方式中，至少两个TCR分子经接头部分相连形成多价复合物。这些复合物优选为水溶性的，所以应照此(标准)选择接头部分。此外，接头部分优选能与TCR分子上确定的位置相连，从而尽可能降低所形成复合物的结构多样性。该方面的一个实施方式所提供的本发明TCR复合物中聚合物链或肽接头序列延伸于各TCR中不位于该TCR可变区序列中的氨基酸残基之间。由于本发明复合物可用作药物，接头部分应该适当考虑它们的药学适用性，例如它们的免疫原性来选择。本领域己知符合以上所需标准的接头部分的例子，例如连接抗体片段的技术。两类接头优选用于产生本发明的多价TCR分子。其中的TCR通过聚亚烷基二醇链相连的本发明TCR复合物提供了该方面的一个实施方式。第一类是亲水性聚合物，例如聚亚垸基二醇。此类中最常用的是聚乙二醇或PEG，其结构如下式所示。HOCH2CH20(CH2CH20)n-CH2CH2OH其中n大于2。然而其它聚合物可以基于其它合适的、任选取代的聚亚烷基二醇，包括聚丙二醇，和乙二醇与丙二醇的共聚物。这种聚合物可用于处理或偶联治疗剂，特别是多肽或蛋白质治疗剂来有益地改变该疗剂的PK分布，例如降低肾廓清率、提高血浆半衰期、降低免疫原性和提高溶解性。据信，一个或多个PEG分子在治疗剂周围形成的"外壳"能在立体上阻碍治疗剂与免疫系统反应并降低其蛋白酶降解，从而改善PEG-治疗剂偶联物的PK分布。(Casey等，(2000)，TumorTargetting，4235-244)。所用亲水性聚合物的分子大小可根据TCR复合物预定的治疗应用来具体选择。已有许多综述文章和书籍详细描述了PEG和类似分子在药物制剂中的应用。例如，参见Harris,(1992)，《聚乙二醇化学-生物技术和生物医药应用》(PolyethyleneGlycolChemistry-BiotechnicalandBiomedicalApplications),Plenum,纽约，纽约州或Harris和Zalipsky，(1997)，《聚乙二醇化学和生物学应用ACS手册》(ChemistryandBiologicalApplicationsofPolyethyleneGlycolACSBooks),华盛顿，哥伦比亚特区。所用的聚合物可具有线形或分支构型。可通过加入分支部分，包括甘油和甘油寡聚物、季戊四醇、山梨醇和赖氨酸来诱生分支PEG分子或其衍生物。该聚合物一般在其结构中，例如在其一端或两端，和/或骨架的支链处具有化学反应活性基团而使该聚合物能与PCR中的靶位点相连。如下所示，这种化学反应活性基团可与亲水性聚合物直接相连，或者在亲水性聚合物或反应活性化学(基团)之间可以具有间隔基团/部分反应活性化学(基团)-亲水性聚合物-反应活性化学(基团)反应活性化学(基团)-间隔基团-亲水性聚合物-间隔基团-反应活性化学(基团)用于形成以上概述的该类型构建物的间隔基团可以是无反应活性、化学稳定的、链状的任何有机部分。这种间隔基团包括但不限于以下基团-(CH2)n-，其中n=2至U5-(CH2)3NHCO(CH2)2其中二价亚烷基间隔基团位于聚亚垸基二醇链和其与该复合物的TCR连接点之间的本发明TCR复合物是该方面的另一种实施方式。其中聚亚烷基二醇链含有至少两个聚乙二醇重复单位的本发明TCR复合物是该方面的另一实施方式。本发明可用的直接或经间隔基团与反应活性化学物质相连的亲水性聚合物有许多商业供应商。这些供应商包括NektarTherapeutics(加利福尼亚州，美国)、NOFCorporation(日本)、Sunbio(韩国)和EnzonPharmaceuticals(新泽西州，美国)。本发明可用的直接或经间隔基团与反应活性化学物质相连的亲水性聚合物包括但不限于以下聚合物<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>髙级别TCR多聚体15K，3臂，Mal3(用于三聚体)NektarOJOON0320K,4臂，MaU(用于四聚体)NektarOJOOP0440K，8臂，Mals(用于八聚体)NsktarOJOOT08可利用各种偶联化学(物质)将聚合物分子偶联于蛋白质和肽治疗剂。选择最合适的偶联化学(物质)在很大程度上取决于所需的偶联部位。例如，以下偶联化学(物质)已用于连接PEG分子(来源Nektar分子工程目录2003(NektarMolecularEngineeringCatalogue2003))的一个或多个末端N-马来酰亚胺乙烯基砜苯并三唑碳酸酯琥珀酰亚胺丙酸酯(Succinimidylpropionate)琥珀酰亚胺丁酸酯(Succinimidylbutanoate)硫代酯乙醛丙烯酸酯生物素伯胺如上所述，非PEG基聚合物也可为本发明TCR的多聚化提供合适的接头。例如，可以利用含有通过脂肪链相连的马来酰亚胺末端的部分，例如BMH和BMOE(Pierce，产品号22330和22323)。肽接头是另一类TCR接头。这些接头由氨基酸链组成，其作用为在可连接的TCR分子上产生简单接头或多聚化结构域。曾采用生物素/链霉亲和素系统来产生体外结合研究用的TCR四聚体(参见WO/99/60119)。然而，链霉亲和素是微生物来源的多肽，因此用于治疗剂中并不理想。其中的TCR通过源自人多聚化结构域的肽接头连接的本发明TCR复合物提供了该方面的另一种实施方式。有许多含多聚化结构域的人蛋白质可用于产生多价TCR复合物。例如，p53四聚化结构域，其已用于产生scFv抗体片段四聚体，该四聚体与单体scFV片段相比，显示血清持久性增加和解离速率明显降低。(Willuda等，(2001)J.Biol.Chem.276(17)14385-14392)。血红蛋白的四聚化结构域也可能用于该类应用。含有至少两个TCR的本发明多价TCR复合物提供了该方面的最后一种实施方式，该复合物中所述TCR的至少一个与治疗剂结合。在一方面，本发明TCR(或其多价复合物)或者还可或额外还可在其cc或(3链的C-末端或N-末端包含反应活性半胱氨酸。珍銜浙治/f应^一方面，本发明TCR可以与治疗剂或可检测部分结合。例如，所述治疗剂或可检测部分可与TCR共价相连。在本发明的一个实施方式中，所述治疗剂或可检测部分与一条或两条TCR链的C-末端共价相连。一方面，可利用可检测部分，例如适用于诊断目的的标记物来标记本发明TCR的scTCR或一条或两条dTCR链。这种标记的TCR可用于检测SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物的方法，该方法包括使TCR配体与该TCR配体的特异性TCR(或多聚高亲和力TCR复合物)接触；和检测与该TCR配体的结合情况。在例如利用生物素化的异源二聚体形成的四聚体TCR复合物中，可利用荧光链霉亲和素来提供可检测标记。这种荧光标记的TCR四聚体适用于FACS分析，例如检测携带这些高亲和力TCR的特异性SLYNTVATL-HLA-A*020l复合物的抗原呈递细胞。可检测本发明可溶性TCR的另一种方法是利用TCR特异性抗体，特别是单克隆抗体。有许多商业可购得的抗-TCR抗体，例如ocFl和PF1可分别识别a和(3链的恒定区。在其它方面，本发明TCR(或其多价复合物)或者还可或额外还可与治疗剂结合(例如，以共价或其它方式相连)，所述治疗剂可以是，例如用于杀伤细胞的毒性部分，或免疫效应分子，如白介素或细胞因子。与非多聚野生型或本发明的T细胞受体异源二聚体相比，本发明的多价TCR复合物对TCR配体的结合能力提高。因此，本发明的多价TCR复合物特别可用于在体外或体内追踪或靶向呈递SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物的细胞，也可用作中间体来产生具有这种用途的其它多价TCR复合物。因此，这些TCR或多价TCR复合物可以在体内应用的药学上可接受的制剂中提供。本发明也提供将治疗剂递送至靶细胞的方法，该方法包括在允许潜在的靶细胞与本发明TCR或多价TCR复合物结合的条件下使二者接触，所述TCR或多价TCR复合物对SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物具有特异性并结合有治疗剂。具体地说，本发明的可溶性TCR或多价TCR复合物可用于将治疗剂递送至呈递具体抗原的细胞。这可用于许多情况，特别是针对HIV感染的细胞。治疗剂的递送应可在局部起作用而非只对与其结合的细胞起作用。因此，一种具体方案设想可采用与SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物特异性的本发明TCR或多价TCR复合物相连的细胞毒性或免疫刺激分子。为此应用，可利用许多治疗剂，例如放射性化合物，酶(例如，穿孔素)或化疗药物(例如，顺铂)。为保证在所需部位发挥毒性作用，可将毒素包裹在与链霉亲和素相连的脂质体内从而使该化合物缓慢释放。这防止了毒素在体内转运期间遭受破坏并且保证了TCR与相关的抗原呈递细胞结合后毒素具有最大作用。其它合适的治疗剂包括小分子细胞毒性药物，即分子量小于700道尔顿，能杀伤哺乳动物细胞的化合物。这种化合物也可包含具有细胞毒性作用的毒性金属。此外，应该理解这些小分子细胞毒性药物也包括药物前体，即能在生理条件下分解或转变从而释放细胞毒性药物的化合物。这种药物的例子包括顺铂、美登素衍生物、拉奇霉素(rachelmycin)、刺胞霉素、多西他赛、鬼臼亚乙苷、吉西他滨、异环磷酰胺、依利替康、苯丙氨酸氮芥、米托蒽醌、sorfimer卟啉钠II(sorfimersodiumphotofrin11)、替莫唑胺、拓扑替康、葡萄糖醛酸曲美沙特(trimetreateglucuronate)、奥利斯他汀E(auristatinE)、长春新碱和阿霉素；肽细胞毒素，即能杀伤哺乳动物细胞的蛋白质或其片段。包括但不限于蓖麻毒素、白喉毒素、假单胞菌细菌外毒素A、DNA酶和RNA酶；放射性核素，即一些元素的不稳定同位素，其在衰减同时发射一种或多种oc或p粒子，或Y射线。包括但不限于碘131、铼186、铟111、铱90、铋210和213、锕225和砹213;也可利用螯合剂来促进这些放射性核素与高亲和力TCR或其多聚体结合；前药，包括但不限于抗体定向的酶前药；免疫刺激剂，即能激活免疫应答的部分。包括但不限于细胞因子，例如IL-2和IFN;超抗原和其变体；TCR-HLA融合物和趋化因子，例如IL-8、血小板因子4、黑色素瘤生长刺激蛋白等抗体或其片段；补体激活剂；异种蛋白结构域；同种蛋白结构域；病毒/细菌蛋白结构域；病毒/细菌肽和抗T细胞决定簇抗体(例如，抗-CD3或抗-CD28)或抗体类似物，例如Nanobodies和AffybodiesTM。本发明的可溶性TCR或多价TCR复合物可与能将前药转化为药物的酶相连接。这就使前药仅在需要药物的位点得以转化为药物(即通过sTCR靶向)期望本文所揭示的高亲和力SLYNTVATL(SEQIDNO:16)-HLA-A*0201特异性TCR可用于诊断和治疗AIDS的方法中。出于治疗目的，使治疗剂定位在HIV感染的(CD4+)细胞邻近处将增强毒剂或免疫刺激剂的效果。出于疫苗递送的目的，疫苗抗原可定位于抗原递呈细胞的附近，从而增强抗原的效力。该方法还可用于成像目的。一个实施方式是包含本发明TCR的膜制剂。可用细胞制备所述膜制剂，或者所述膜制剂可包含合成的膜。另一实施方式是具有包含本发明TCR编码核酸的表达载体的细胞。例如，所述细胞可为T细胞。本发明的其它实施方式是包含以下成分的药物组合物本发明的TCR或多价TCR复合物(任选地与治疗剂结合)，或包含本发明TCR的膜制剂，或多个具有包含本发明TCR编码核酸的表达载体的细胞，同时还含有药学上可接受的载体。AIDS的方法，所述方法包括给予罹患AIDS的对象有效量的本发明的TCR或多价TCR复合物，或包含本发明TCR的膜制剂，或多个具有包含本发明TCR编码核酸的表达载体的细胞。在相关的实施方式中，本发明提供了本发明TCR或多价TCR复合物、包含本发明TCR的膜制剂、或多个具有包含本发明TCR编码核酸的表达载体的细胞在制备治疗AIDS的组合物中的用途。本发明的这些用途和方法的其它具体实施方式是将本发明的TCR或多价TCR复合物、或包含本发明TCR的膜制剂以与治疗剂结合的方式给药。在其它优选的实施方式中，所述具有包含本发明TCR编码核酸的表达载体的细胞是CD8+T细胞.本发明的治疗性或成像TCR将通常作为一般包含药学上可接受的载体的无菌药物组合物的一部分应用。该药物组合物可为任何适合的形式(取决于将其给予患者所需的方法)。可以单位剂型提供，(所述单位剂型)通常装在密封容器中提供，并可作为试剂盒的一部分提供。这种试剂盒通常(虽然并不是必须)装有使用说明书。其可装有多种所述的单位剂型。不希望受限于理论，期望本发明的TCR可提供能递送治疗剂(例如免疫刺激剂和/或针对HIV感染的(CD4+)细胞的细胞毒剂)的有效靶向剂。具体而言，期望将本发明TCR与免疫刺激剂和/或细胞毒剂一起给药，并联用常规的抗逆转录病毒药物疗法和/或IL-2治疗将能靶向HIV感染细胞。以下是在美国获准使用的抗逆转录病毒药物的列表Agenerase(安泼那韦)-蛋白酶抑制剂可比韦-叠氮胸苷(300mg)与拉米夫定(150mg)并用Crixivan(印地那韦(indinavir))-蛋白酶抑制剂拉米夫定(3-硫胞苷/lamivudine)—腺苷类似物，逆转录酶抑制剂Epzicom(联用两种核苷逆转录酶抑制剂(在同一药丸中的NRTI;600mgZiagen(阿巴卡韦)和300mg拉米夫定(3TC))Emtriva[恩曲他滨(FTC)]沙奎那韦软凝胶剂(沙奎那韦)-蛋白酶抑制剂Fuzeon(恩夫韦地(enfuvirtide))-融合抑制剂唑西他宾(ddc/扎西他宾)-核苷类似物逆转录酶抑制剂Invirase(沙奎那韦)-蛋白酶抑制剂Kaletra(洛匹那韦)-蛋白酶抑制剂Lexiva(福沙那韦)-蛋白酶抑制剂，批准于10/20/03诺韦(利托那韦)-蛋白酶抑制剂Rescriptor(地拉夫定)-非核苷类似物逆转录酶抑制剂叠氮胸苷，AZT(齐多夫定)-核苷类似物逆转录酶抑制剂Reyataz(阿扎奈韦(atazanavir);BMS-232632)-蛋白酶抑制剂Sustiva(依法韦仑)-非核苷类似物逆转录酶抑制剂Trizivir(于同一片剂中的3种非核苷；阿巴卡韦+叠氮胸苷+叠氮胸苷Truvada(恩曲他滨+替诺福韦DF)惠妥滋(ddl/地达诺新)核苷类似物逆转录酶抑制剂惠妥滋EC;(ddl/地达诺新)核苷类似物逆转录酶抑制剂；奈非那韦(那非那韦)-蛋白酶抑制剂Viramune(奈韦拉平)-非核苷类似物逆转录酶抑制剂Viread(奈韦拉平；延胡索酸替诺福韦酯(tenofovirdisoproxilfomarate))核苷酸逆转录酶抑制剂(阿糖腺苷类)泽瑞特(d4t/司他夫定)-核苷类似物逆转录酶抑制剂Ziagen(司他夫定)-核苷类似物逆转录酶抑制剂所述药物组合物可适于用任何合适的途径给药，例如胃肠道外、透皮或通过吸入给药，优选经胃肠道外途径(包括皮下、肌内或最优选静脉内给药)。该组合物可用药剂领域中己知的任何方法制备，例如在无菌条件下混合活性成分与载体或赋形剂。本发明物质的剂量可根据待治疗的疾病或病症、待治疗个体的年龄和状况等而有较大不同，医师最终可确定所使用的合适剂量。其它方面本发明的scTCR或dTCR(优选由对应于人序列的恒定区或可变区序列构成)可以以基本纯的形式、或作为纯化或分离的制剂提供。例如，可以基本上不含其它蛋白质的形式提供。也可改变本发明TCR的一种或多种编码核酸的序列，从而使得在宿主细胞中获得的表达水平最优化。宿主细胞可为任何适宜的原核细胞或真核细胞。例如，所述宿主细胞可为大肠杆菌(五.co/()细胞或人T细胞。对这些遗传序列所作出的改变是沉默的，即它们不会改变所编码的氨基酸序列。有很多提供此类表达最优化服务的公司，包括德国的GeneArt。本发明也提供与SLYNTVATL-HLA-A*0201具有结合特性的高亲和力TCR的制备方法。所述TCR的特征在于(i)含有至少一个TCRcx链可变区和/或至少一个TCRp链可变区，和(ii)对所述SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物的Kd小于或等于1pM和/或对SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物的解离速率(k。ff)为1XlO—3S—1或更慢，该方法包括(a)制备含有亲本HIVGagTCR的ot禾P卩链可变区的TCR，其中a和(3链可变区的一个或两个在权利要求7和8所鉴定的一个或多个氨基酸中含有突变；(b)在适合于TCR和SLYNTVATL-HLA-A*0201结合的条件下使所述突变的TCR与SLYNTVATL-HLA-A*0201接触；和测定该相互作用的Kd和/或k。ff。本发明各方面的优选特征与已作了必要修正的其它各方面的一样。本文提及的现有技术文件按照法律所允许的最大程度纳入。实施例以下实施例进一步描述了本发明，但不以任何方式限制本发明的范围。下文参考了附图，其中图la和lb分别详细描述了亲本HIVGagTCR的a链可变区氨基酸序列和卩链可变区氨基酸序列。图2a和2b分别显示了可溶形式亲本HIVGagTCRa链和|3链的DNA序列。图3a和3b分别显示了从图2a和2b的DNA序列产生的HIVGagTCRoc和卩链胞外氨基酸序列。图4a和4b分别显示了可溶形式HIVGagTCRa和(3链的DNA序列经突变而能编码额外的半胱氨酸残基从而形成非天然的二硫键。阴影表示突变的密码子。下划线表示限制性内切酶识别位点。图5a和5b分别显示了从图4a和4b的DNA序列产生的HIVGagTCRa和p链胞外氨基酸序列。阴影表示各链中引入的半胱氨酸。图6详细描述了高亲和力HIVGagTCR变体的cc链可变区氨基酸序列。图7详细描述了高亲和力HIVGagTCR变体的|3链可变区氨基酸序列。图8a详细描述了TRA可溶部分的氨基酸序列。图8b详细描述了TRBC1可溶部分的氨基酸序列。图8c详细描述了TRBC2可溶部分的氨基酸序列。图9详细描述了pEX954质粒的DNA序列。图IO详细描述了pEX821质粒的DNA序列。图11详细描述了通过肽接头连接于野生型人IL-2的亲本可溶性HIVGagTCR变体的P链氨基酸序列。接头的氨基酸和IL-2用斜体表示。图12提供了可溶性二硫键连接的亲本HIVGagTCR与SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物相互作用的Biacore响应曲线。图13提供了pEX954质粒的质粒作图。图14提供了pEX821质粒的质粒作图。图15a提供了为在人T细胞中表达而优化的亲本HIVGagTCRa链的全长DNA序列。图15b提供了为在人T细胞中表达而优化的亲本HIVGagTCR0链的全长DNA序列。图16a提供了亲本HIVGagTCRa链的全长氨基酸序列。图16b提供了为在人T细胞中表达而优化的亲本HIVGagTCRP链的全长氨基酸序列。图17a提供了未转导的对照CD8+T细胞的FACS分析数据。图17b提供了说明亲本HIVGagTCR表达在转导CD8+T细胞表面上的FACS分析数据。图18a和18b分别提供了可溶性二硫键连接的高亲和力cllc6HIVGagTCR的a和P链的氨基酸序列。图19显示了在受HIV感染的To细胞存在下，通过IFN-y和TNF-a的产量测定的可溶性二硫键连接的高亲和力clIc6HIVGagTCR对SLYNTVATL-HLA-A*0201反应性0X84单克隆T细胞株活化的抑制能力。图20显示了在SLYNTVATL肽脉冲的未受HIV感染的To细胞存在下，通过IFN-Y和TNF-a的产量测定的可溶性二硫键连接的高亲和力clIc6HIVGagTCR对SLYNTVATL-HLA-A*0201反应性0X84单克隆T细胞株活化的抑制能力。图21显示了可溶性二硫键连接的高亲和力clIc6HIVGagTCR染色SLYNTVATL肽脉冲的T2细胞的能力。实iiW;-包诊袭本/z/KGagrc;^资,游^麥性二疏經遂麥游rc/游产主图4a和4b提供了对SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物具有特异性的亲本TCR的可溶性二硫键连接ap链的DNA序列。可由多个承包研究公司(contractresearchcompany)从头合成这些DNA序列，例如GeneArt(德国)。可在这些DNA序列中加入限制性内切酶识别位点，从而使得这些DNA序列易于连接入基于pGMT7的表达质粒，该质粒含有用于在大肠杆菌BL21-DE3(pLysS)中高水平表达的T7启动子(Pan等，肠^c/zm々廳(2000)29(6):1234-8)。该TCRa链序列包含导入的C/a/和&///限制性内切酶识别位点，并且该序列被连接入用C/a/和Z/zo/切割的pEX954(参见图9和13)。该TCR|3链序列包含导入的Ae/和^ge/限制性内切酶识别位点，并且该序列被连接入用A^e/^ge/切割的pEX821(参见图10和14)。导乂编^rcw舒游"A^游銜劍丝/^级發街激泣^C/a/-ATCGAT5*淑-GTCGAC-ATTAAT々e/-ACCGGT遂麥采用快速DNA连接试剂盒(rapidDNAligationkit，Roche)，根据厂商说明书连接切割的TCRouJ3链DNA和切割的载体。将连接的质粒转化入感受态的大肠杆菌菌株XLl-蓝细胞，并将其接种于含有100mg/ml氨苄西林的LB/琼脂平板上。于37'C孵育过夜后，挑选单菌落，使其在10ml含有100mg/ml氨苄西林的LB中于37'C摇动生长过夜。采用Miniprep试剂盒(Qiagen)纯化克隆的质粒，并采用自动化DNA测序仪(LarkTechnologies)对插入片段进行测序。图5a和5b分,處激2-^",丝二藏經遂麥游///「(^^re//^旁浙力变,游产主可将如实施例1所述产生的可溶性二硫键连接的天然HIVGagTCR用作模板，由该模板可产生对SLYNTVATL(SEQIDNO:16)-HLA-A*0201复合物的亲和力提高的本发明TCR。噬菌体展示是可为鉴别高亲和力变体而制备HIVGagTCR变体库的一种方法。例如，可对Li等(2005)A^ft^e23(3):349-354)描述的TCR噬菌体展示和筛选方法进行调整并将其用于HIVGagTCR。图6和7分别列出了与适当的TCR链结合时对SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物显示出高亲和力的突变TCRa和!3链氨基序列(分别为SEQIDNo:11-13和14-15)。本领域技术人员己知可通过定点突变将产生这些突变链所需的必需密码子变化导入编码这些链的DNA中(QuickChangeTM，Stratagene的定点突变试剂盒)。简而言之，通过使用掺入所需的一个或多个密码子变化的引物以及作为诱变模板的含相关TCR链DNA的质粒来实现采用以下条件进行诱变50ng质粒模板、lpl的10mMdNTP、由厂商提供的5pi的10XPfuDNA聚合酶缓冲液、25pmo1的正向引物、25pmol的反向引物、1^1的pfuDNA聚合酶，总体积为50nl。在95。C进行2分钟的初始变性之后，进行25个循环的如下反应变性(95。C，10秒)、退火(55'C,10秒)和延伸(72。C，8分钟)。用DpnI限制性内切酶消化所得产物以去除模板质粒，并转化入大肠杆菌菌株XU-蓝。通过测序验证诱变。实嚴伊"-^#WTCA游表这、置叛#//7錄众将实施例l或2中制备的分别含有突变a链和p链的表达质粒分别转化入大肠杆菌菌株BL21pLysS，并于37"C下在TYP培养基(含100吗/ml氨苄西林)中培养具有氨苄西林抗性的单菌落直至OD6。o为0.4，然后用0.5mMIPTG诱导蛋白质表达。诱导后3小时用BeckmanJ-6B以4000rpm离心30分钟收集细胞。将细胞沉淀物重悬在含有50mMTris-HCI、25%(w/v)蔗糖、lmMNaEDTA、0.1%(w/v)叠氮钠、10mMDTTpH8.0的缓冲液中。在过夜的冻融步骤之后，在MilsonixXL2020超声波仪中用标准的12mm直径探头对重悬的细胞进行1分钟的超声破碎，总共超声约IO分钟。用BeckmanJ2-21离心机以13000rpm离心30分钟回收包涵体沉淀物。然后用去污剂洗涤三次以去除细胞碎片和膜组分。每次将包涵体沉淀物在Triton缓冲液中均浆(50mMTris-HCl、0.5%Triton-X100、200mMNaCl、10mMNaEDTA、0.1%(w/v)叠氮钠、2mMDTT，pH8.0)，然后用BeckmanJ2-21离心机以13000rpm离心15分钟使其沉淀。然后在如下缓冲液中进行类似洗涤去除去污剂和盐50mMTris-HCl、lmMNaEDTA、0.1%(w/v)叠氮钠、2mMDTT，pH8.0。最后，将包涵体分成30mg的等分，并于-70。C冷冻。用6M盐酸胍溶解并通过Bradford染料结合测试(PerBio)定量测定包涵体蛋白产率。融化冷冻储备物中溶有约30mg的TCR|3链和60mg的TCRa链的包涵体，然后混合样品，用15ml胍溶液(6M盐酸胍、10mM醋酸钠、10mMEDTA)稀释该混合物以确保链完全变性。然后将含有完全还原并变性的TCR链的胍溶液注入到1升如下的重折叠缓冲液中100mMTrispH8.5、400mML-精氨酸、2mMEDTA、5mM还原性谷胱甘肽、0.5mM氧化的谷胱甘肽、5M尿素、0.2mMPMSF。加入氧化还原对(2-巯乙胺和六甲烯胺(其终浓度分别为6.6mM禾tl3.7mM)，约5分钟后加入变性的TCR链。将溶液静置5小时±15分钟。5T士3r，在Spectr叩or1膜(Spectrum;产品编号132670)中用10L10mMTrispH8.1透析重折叠的TCR18-20个小时。然后将透析缓冲液换为新鲜的10mMTrispH8.1(10L)，继续在5°。±3匸下再透析20-22小时。从降解产物中分离sTCR，将透析的重折叠蛋白加载到POROS50HQ阴离子交换柱上，然后采用Akta纯化仪(Pharmacia)以50倍以上柱体积的0-500mMNaCl梯度溶液洗脱结合的蛋白质来纯化。将峰部分储存于4t:，采用考马斯染色的SDS-PAGE进行分析，然后合并和浓縮。最后，采用在HBS-EP缓冲液(IOmMHEPESpH7.4、150mMNaCl、3.5mMEDTA、0.05%乙基苯基聚乙二醇p40(nonidetp40))预平衡的Superdex200HR凝胶过滤柱纯化和表征sTCR。收集并浓縮在相对分子量约为50kDa洗脱的峰，然后用BIAcore表面等离子共振分析法表征。-表厥筝蓐f关嚴表C兹^f錄,丝pMi/C游JC/采用表面等离子共振生物传感器(Biacore3000")来分析sTCR与其肽-MHC配体的结合。产生以半定向形式固定于抗生物素蛋白链菌素包被的结合表面的一种pMHC复合物(如下所述)有助于该分析并可同时有效测试可溶性T-细胞受体与多达4种不同pMHC(固定于不同流动小室)的结合。手工注射HLA复合物易于操控固定的I类分子的精确水平。体外重新折叠含有组成性亚单位蛋白和合成肽的细菌表达的内涵体的生物素化I类HLA-A*0201分子，然后纯化并在体外进行酶生物素化(O'Callaghan#"(1999)ja/.B/ocAe/w.266:9-15)。所表达的HLA-A+0201-重链具有C末端生物素化标签，其在适合的构建物中替代了该蛋白质的跨膜区和胞质结构域。获得的内涵体表达水平约75mg/升细菌培养物。还从适合的构建体在大肠杆菌中表达了MHC轻链或(52-微球蛋白，其水平约为500mg/升细菌培养物。裂解大肠杆菌细胞，将内涵体纯化到约80%的纯度。在6M盐酸胍、50mMTrispH8.1、100mMNaCl、10mMDTT、10mMEDTA中使内涵体的蛋白质变性，通过在低于5'C将变性蛋白一次脉冲加入重折叠缓冲液，以30mg/升重链、30mg/升(32m的浓度在0.4ML-精氨酸-HCl、100mMTrispH8.1、3.7mM六甲烯胺、6.6mM(3-巯乙胺，负载于HLA-A*0201分子所需的4mg/mlSLYNTVATL肽中重折叠。重折叠在4'C时进行至少1小时方能完成。用IO倍体积的10mMTrispH8.1进行透析来更换缓冲液。需更换缓冲液2次以充分降低溶液的离子强度。然后用1.5pm的醋酸纤维素滤膜过滤蛋白质溶液，并加载到POROS50HQ阴离子交换柱上(8ml的床体积)。用线性0-500mMNaCl梯度洗脱蛋白质。以约250mMNaCl洗脱HLA-A"201-肽复合物，收集峰组分，加入蛋白酶抑制剂混合物(Calbiochem)，然后在冰上冷藏该部分。采用以10mMTrispH8.1、5mMNaCl平衡的Pharmacia快速脱盐柱，将生物素化标记的pMHC分子的缓冲液更换为10mMTrispH8.1、5mMNaCl。洗脱后立即将含蛋白质的组分置于冰上冷藏，加入蛋白酶抑制剂混合物(Calbiochem)。然后加入生物素试剂lmM生物素、5mMATP(缓冲至pH8)、7.5mMMgCb禾口5吗/mlBirA酶(根据O，Callaghan#"(1999)勘a/.266:9-15进行纯化)。然后将该混合物在室温下孵育过夜。采用凝胶过滤层析来纯化生物素化的pHLA-AW201分子。用经过滤的PBS预平衡PharmaciaSuperdex75HR10/30柱，然后加载1ml生物素化反应混合物，用PBS以0.5ml/分钟洗脱柱。生物素化的pHLA-A*0201分子在约15ml时以单峰洗脱。合并含蛋白质的组分，在冰上冷藏，然后加入蛋白酶抑制剂混合物。采用考马斯结合分析法(PerBio)测定蛋白质浓度，将生物素化pHLA-A*0201分子的等份试样冷冻于-20°C。采用标准胺偶联法固定抗生物素蛋白链菌素。该固定化的复合物与T-细胞受体和共同受体CD8otoc均能结合，这些受体都可注入可溶相。即便是在低浓度下(至少40Mg/ml)也获得了TCR的特异性结合，这就暗示了TCR相对稳定。如果采用溶解的或固定相的sTCR，所观察到的sTCR的pMHC结合特性在质量和数量上类似。这是可溶性物质的部分活性的一种重要控制方法，也提示生物素化的pMHC复合物与非生物素化复合物具有相同的生物学活性。在Biacore3000tm表面等离子共振(SPR)生物传感器上分析含新的链间键的HIVGagsTCR与其配体/MHC复合物或无关HLA-肽组合物之间的相互作用(其产生如上所述)。在一流动小室中，SPR检测到传感器表面附近以响应单元(RU)表示的折光率发生变化，该原理可用于检测受体配体相互作用和分析它们的亲和力以及动力学参数。所述探针流动小室如下制备通过交联到p2m上的生物素与已化学交联到流动小室的活性表面上的抗生物素蛋白链菌素之间的结合，将各HLA-肽复合物固定在不同的流动小室中。然后使sTCR以恒定的流速通过不同流动小室的表面，并测定该情况下的SPR响应以进行测试。情錄^煮',層定制备了亲本或突变HIVGagsTCR的连续稀释液，以5pl/分钟的恒定流速注入两个不同的流动小室；一个流动小室用约1000RU的特异性SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物包被，另一个用约1000RU的非特异性HLA-A2-肽复合物包被。采用对照小室的测定值对各浓度的响应进行标准化。以标准化数据响应对TCR样品的浓度作图，拟合成双曲线(hyperbola)以计算平衡结合常数，KD。(Price&Dwek，PrinciplesandProblemsinPhysicalChemistryforBiochemists(2ndEdition)，《生物化学的物理化学中的原理和问题》第二版，1979，ClarendonPress,牛津)。动力学参教層定通过试验测定解离速率常数Kd和结合速率常数Ka来确定高亲和力TCR的KD。平衡常数KD计算为kd/ka。将TCR注射流过两个不同小室，一个用约300RU的特异性HLA-A2-nyeso肽复合物包被，另一个用约300RU的非特异性HLA-A2-肽复合物包被。流速设置为50pl/分钟。通常以约3pM的浓度注入250pi的TCR。然后使缓冲液流过直到响应回复到基线。采用Biaevaluation软件计算动力学参数。也将解离相拟合为单指数衰变方程式以计算半衰期。兹菜釆用上述方法分析可溶性二硫键连接的天然HIVGagTCR(由SEQIDNO:9禾B10分别详述的a和(3TCR链组成)和SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物之间的相互作用，显示I(D为85nM，解离速率(k。ff)为2.21Xl(T2S"。(Biacore响应曲线可参见图12)下表所述TCR具有的KD小于或等于1MM禾P/或k。ff为1X10—3S—1或更慢。<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>貧^W5-/^霧丝葛凌浙力///FGagrCT-勞fMX^^歪/^游产主可利用大致上如实施例1-3中所述方法产生可溶性高亲和力HIVGagTCR-野生型(WT)人IL-2融合蛋白。简言之，将编码所需接头和WT人IL-2的DNA加到可溶性二硫键连接的亲本HIVGagTCR(3链3'端，即直接在TAA("终止")密码子的前部。图11提供了融合蛋白的氨基酸序列，该融合蛋白包含通过接头序列融合到WT人IL-2的二硫键连接的亲本HIVGagTCR卩链(SEQIDNO:24)。该融合蛋白的接头和IL-2部分用斜体表示。然后可将编码该构建物的DNA连接入pEX821。然后可采用基本上如实施例3所述的方法，使该(3链融合蛋白与图5a详述的可溶性二硫键连接的亲本HIVGaga链TCR链相结合，从而表达可溶性亲本HIVGagTCR-IL-2融合蛋白。实督/6-#本鮮G"gra,T—鍾表,J:游重资表这合成了编码亲本HIVGagTCR链的信号序列、胞外区、跨膜区和胞内区的DNA构建物(GeneArt，德国)。这些TCRa链和TCR卩链DNA序列(分别示于图15a和15b)与亲本HIVGagTCRDNA序列不同，从而增强了所编码的TCR链在人T细胞中的表达水平，并同时保留了天然氨基酸序列。图16a和16b提供了分别由图15a和15b所示DNA序列编码的全长氨基酸序列。然后将TCRa链和TCR(3链DNA序列一起插入慢病毒(Lentiviral)表达载体。该载体包含作为单个开放读框的编码亲本HIVGagTCRa链和卩链和隔开TCR链的框内口蹄疫病毒(FMDV)2A分裂因子(cleaviagefactor)氨基酸序列(LLNFDLLKLAGDVESNPG(SEQIDNO:31))的DNA序列。(deFelipe等，Ge"e,Facc/"^77zw(2004)2(1):13)。在mRNA翻译时，产生了在C末端具有2A肽序列的TCRa链，而TCRp链则作为单独的多肽产生。用上述慢病毒载体转导T细胞。简言之，用抗CD3/抗CD28珠刺激原始(primary)T细胞24小时。然后将表达TCR基因的慢病毒浓縮上清液与经刺激的T细胞一起孵育以进行病毒转导。然后去除抗CD3/抗CD28珠，培养转导的T细胞直到它们达到200-300fL的"静体积"(restingvolumn)。利用HLA-A*0201-SLYNTVALTPE三聚体和抗CD8单克隆抗体FITC共染色，通过FACS分析证实亲本HIVGagTCR递呈到转导细胞表面上。錄菜图17b提供了FACS分析数据，该数据显示亲本HIVGagTCR成功地表达在转导的CD8+T细胞表面。图17a提供了利用对照的未转导T细胞产生的FACS分析数据。7-^银丝腐;黄^7力///rGagTOC7X/g众游渐劍进行了以下测试以证实可溶性高亲和力cllc6HIVGagTCR能抑制SLYNTVATL-HLA-A*0201反应性单克隆T细胞株的活化。///f感染潘應存在7oxs4^sxKv:n^^反应丝^^"虔r潘應^/g歸渐劍鋪本试验中采用的可溶性cllc6高亲和力HIVGagTCR包含分别如图6c(SEQIDNO:13)和图7b(SEQIDNO:15)所示的TCRa链可变区和TCR(5链可变区。该可溶性TCR的TCRa和卩链全长序列分别示于图18a(SEQIDNO:29)和图18b(SEQIDNO:30)中。将IFN-y和TNF-a的产生用作CTL活化的显示。微RIO分析培养基10%FCS(经热灭活，Gibco，目录号10108-165)、88%RPMI1640(Gibco，目录号42401-018)、1%谷胺酰胺(Gibco，目录号25030-024)和"/。青霉素/链霉素(Gibco，目录号15070-063)。肽(获自各种来源)最初溶于DMSO(Sigma，目录号D2650),浓度为4mg/ml，冻存。BDTM细胞计数珠芯片试剂盒(BDTMCytometricBeadArrayKit)，人Thl/Th2细胞因子试剂盒II(HumanThl/Th2cytokineKitII，BDBiosciences,圣迭戈，美国)包含了该测试所需的所有试剂。r邻應^众/，试洗漆慢性HIV感染的To靶细胞(HXB2和HIV3BHIV试验株)，并重悬于RIO培养基中。作为对照，加入未感染的To靶细胞和lnM的SLYNTVATL肽，于37匸、5%。02中(培育)30分钟。96孔U型底培养板中每孔含有RIO培养基配制的25,000个HIV感染的To耙细胞。每孔中含有RIO培养基配制的2X10—7M高亲和力cllc6HIVGagTCR或亲本HIVGagTCR。每孔中含有RIO培养基配制的50000X84单克隆效应T细胞株。上述替代的无关可溶性TCR(HLA-A*0201-Tax特异性和HLA-A*0201-NY-ESO特异性TCR)或高亲和力HIVGagTCR。然后将板在37。C、5%(302中孵育4小时。去除培养上清液，采用如下方法测定IFN-y和TNF-a存在的水平。/FjV7浙7WF-cc,/试根据厂商说明书制备(a)IFNY捕获抗体和(b)抗TNFa捕获抗体包被的bdtm细胞计数珠。然后制备含有以下添加物的多个分析管50p旧D测试稀释液配制的混合抗IFNy和抗TNFabdtm细胞计数珠50plPE检测试剂方法如下从T细胞活化测试孔中取出50pl培养上清液(试样)或通过连续稀释储备标准液制备各浓度范围的50pl混合IFNY和TNFa标准液(定标标准物)然后避光孵育试管3小时，再用lmlBD洗涤缓冲液洗涤，离心。最后，将这些珠重悬于300pl洗涤缓冲液中，通过流式细胞术根据厂商的说明书测定IFNy和TNFa存在的水平。以s丄]wnM7xi(fi^^游未^"籴ro潘應存,7^s丄iwr^4r丄-特弄丝多jT虔r潘應系游,虔y采用上述CTL活化测试所用的相同试剂和方法，除了在各T细胞活化测试中使用20000X84多克隆效应T细胞。用1(T1G-l(T8MSLYNTVATL肽脉冲的未感染To类淋巴母细胞用作靶T细胞。錄菜通过IFN-y禾卩TNF-a产量测得，在HIV感染的To细胞存在下，可溶性高亲和力cllc6HIVGagTCR强烈抑制了SLYNTVATL-HLA-A*0201反应性0X84多克隆T细胞株活化(参见图19)。通过IFN-y和TNF-a产量测得，在SLYNTVATL脉冲的未感染To细胞存在下，可溶性高亲和力cllc6HIVGagTCR强烈抑制了SLYNTVATL-HLA-A*0201反应性0X84多克隆T细胞株的活化(参见图20)。实^Ws-邀过贵i^微籍^募袭^7力"/c(5///kc^gre/定着粼定if嚴;^游77纷應J:游潘應表鹰SLlW7T^r丄HJ"厕贫嚴通过单分子荧光显微镜用可溶性高亲和力cllc6HIVGagTCR测定肽脉冲的T2类淋巴母细胞上SLYNTVATL-HLA-A*0201抗原的数量(基于假设一个荧光信号与一个标记TCR结合其位于靶细胞表面的同源pMHC配体有关)。采用生物素化TCR靶向表达抗原的癌细胞，然后用抗生物素蛋白链菌素R-藻红蛋白(PE)偶联物来标记与细胞结合的TCR有助于该项测定。然后用三维荧光显微镜使单个PE分子成像。37。C用一定浓度范围(10—5-1CT"M)的HIVGag-衍生的SLYNTVATL肽或无关肽(SLLMWITQC)脉冲T2类淋巴母细胞90分钟。脉冲后，用50(^1PBS洗涤细胞2次。室温下，将细胞孵育于200pl的TCR溶液中(100nM高亲和力cllc6HIVGagTCR，用含0.5%BSA白蛋白的PBS配制)30分钟。去除TCR溶液，用500plPBS洗涤细胞3次。室温下，在200pl抗生物素蛋白链菌素-PE溶液中(5吗ml"含0.5%BSA的PBS配制的抗生物素蛋白链菌素-PE中)避光孵育细胞20分钟。去除抗生物素蛋白链菌素-PE溶液，用500plPBS洗涤细胞3次。去除洗涤介质，将细胞保存在400plRlO中，在用荧光显微镜成像前不加入酚红。资光^微法采用Axiovert200M(Zeiss)显微镜以63X油镜(Zeiss)进行荧光显微法。用将装有300W氤弧灯(Sutter)的XLS光源照明，通过在光路中放入0.3和0.6中密度滤片将光强减低到优化水平。采用TRITC/Dil滤波器组(Chroma)来分离激发和发射光谱。通过z-叠层(z-stack)采集(21个平面，1pm间隔)使细胞三维成像。采用如(Irvine等，淑匿419:p845-9禾口Purbhoo等，NatureImmunology5:p524-30)所述的Metamorph软件(UniversalImaging)进行图像采集和分析。兹菜如图21所示，上述方法成功地使与肽脉冲的T2细胞表面上的SLYNTVATL-HLA-A*0201抗原结合的高亲和力cllc6HIVGagTCR成像。这些结果显示采用高亲和力c6cllHIVGagTCR对SLYNTVATL肽脉冲的细胞上表位进行计数的阈值约为10力M肽。权利要求1.一种T细胞受体(TCR)，其对于SLYNTVATL-HLA-A*0201具有结合特性，且包含至少一个TCRα链可变区和/或至少一个TCRβ链可变区，其特征在于，所述TCR对所述SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物的KD小于或等于1μM和/或对SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物的解离速率(koff)为1×10-3S-1或更慢，前提是当所述TCR由细胞递呈并包含SEQIDNO1和2时，该细胞不是天然T细胞。2.如权利要求1所述的TCR，其包含a链可变区和TCR(3链可变区。3.如权利要求1所述的TCR，其为aa或即同二聚体。4.如前述任一权利要求所述的T细胞受体(TCR)，其特征在于，所述KD和/或k。ff用表面等离子共振法测定。5.如前述任一权利要求所述的TCR，其相对于亲本HIVGagTCRa链可变区(SEQIDNo:1)和/或卩链可变区(SEQIDNO:2)在至少一个互补决定区中存在突变。6.如前述任一权利要求所述的TCR，其相对于亲本HIVGagTCRoc链可变区(SEQIDNo:1)和/或(3链可变区(SEQIDN0:2)在其至少一个可变区框架区中存在突变。7.如前述任一权利要求所述的TCR，其特征在于，采用SEQIDNO:l所示编号，a链可变区氨基酸95T5、96N、97S、98G和IOOA中的一个或多个发生突变。8.如前述任一权利要求所述的TCR，其特征在于，采用SEQIDNO:2所示编号，(3链可变区氨基酸51Y、52E、53E和54E中的一个或多个发生突变。9.如权利要求1-6中任一项所述的TCR，采用SEQIDNO:l所示编号，其包含a链可变区氨基酸95S、95G、96A、97H、98D或100S中的一个或多个。10.如权利要求l-6或9中任一项所述的TCR，采用SEQIDNO:2所示编号，其包含(3链可变区氨基酸51V、51A、52R、52L、53G或54V中的一个或多个。11.如权利要求1-6中任一项所述的TCR，其包含SEQIDNO:ll-13所示a链可变区氨基酸序列之一，任选包含一个或多个表型沉默取代。12.如权利要求1-6或11中任一项所述的TCR，其包含SEQIDNO:14-15所示P链可变区氨基酸序列之一，任选包含一个或多个表型沉默取代。13.如权利要求2所述的TCR，其包含下表所示的a和P链可变区对，任选地包含一个或多个表型沉默取代<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>14.如前述任一权利要求所述的TCR，其还包括SEQIDNO:19所示的a链恒定区氨基酸序列和/或SEQIDNO:20和21所示的e链氨基酸恒定区序列之一，任选地包含一个或多个表型沉默取代。15.如前述任一权利要求所述的TCR，其为二聚T细胞受体(dTCR)或单链T细胞受体(scTCR)。16.如权利要求4-15中任一项所述的TCR，其为包含如下区段的scTCR:第一区段，其由对应于TCRa链可变区的氨基酸序列构成；第二区段，其由对应于TCR(5链可变区序列并融合于对应于TCR(3链恒定区胞外序列的氨基酸序列N末端的氨基酸序列构成；和接头序列，该序列连接第一区段的C末端和第二区段的N末端。17.如权利要求4-15中任一项所述的TCR，其为包含如下区段的scTCR:第一区段，其由对应于TCRe链可变区的氨基酸序列构成；第二区段，其由对应于TCRoc链可变区序列并融合于对应于TCRa链恒定区胞外序列的氨基酸序列N末端的氨基酸序列构成；和接头序列，该序列连接第一区段的C末端和第二区段的N末端。18.如权利要求16或17所述的TCR，其还包含位于第一和第二链之间的二硫键，所述二硫键在天然a(3T细胞受体中没有等价物，且其中所述接头序列的长度和所述二硫键的位置使得第一和第二区段的可变区序列相互取向基本上与天然a(3T细胞受体相同。19.如权利要求16-18中任一项所述的scTCR，其特征在于，在结合部分中，所示接头序列连接第一区段的C末端和第二区段的N末端。20.如权利要求16-19中任一项所述的scTCR，其特征在于，在结合部分中，所述接头序列具有结构式-000-(80000)5--(SEQIDNO:17)或-PGGG-(SGGGG)6-P-(SEQIDNO:18)，其中P为脯氨酸，G为甘氨酸，S为丝氨酸。21.如权利要求l、2或4-15中任一项所述的TCR，其是包含如下区段的dTCR:第一多肽，其中对应于TCRoc链可变区序列的序列融合于对应于TCRa链恒定区胞外序列的序列的N末端；和第二多肽，其中对应于TCRP链可变区序列的序列融合于对应于TCR(3链恒定区胞外序列的序列的N末端，所述第一和第二多肽通过二硫键连接，该二硫键在天然aPT细胞受体中没有等价物。22.如权利要求21所述的TCR，其特征在于，所述二硫键连接所述恒定区序列的氨基酸残基，该二硫键在天然TCR中没有等价物。23.如权利要求22所述的TCR，其特征在于，所述二硫键位于半胱氨酸残基之间，所述半胱氨酸对应于天然TCR中P碳原子距离小于0.6nm的氨基酸残基。24.如权利要求22所述的TCR，其特征在于，所述二硫键位于半胱氨酸残基之间，所述半胱氨酸残基取代TRAC*01外显子1的Thr48和TRBC1*01或TRBC2*01或其非人等价物的外显子1的Ser57。25.如权利要求15-24中任一项所述的TCR，其特征在于，所述dTCR或scTCR结合部分包括二硫键，所述二硫键位于对应于在天然TCR中由二硫键连接的那些残基的残基之间。26.如权利要求14-23中任一项所述的TCR，其特征在于，所述dTCR或scTCR结合部分不含对应于天然TCR跨膜或胞质序列的序列。27.如前述任一权利要求所述的TCR，其特征在于，所述TCR与至少一条聚亚垸基二醇链相连。28.如权利要求27所述的TCR，其特征在于，所述一条或多条聚亚烷基二醇链与TCR共价连接。29.如权利要求27或28所述的TCR，其特征在于，所述一条或多条聚亚垸基二醇链包含至少两个聚乙二醇重复单元。30.如前述任一权利要求所述的TCR，其还包括位于其a或(3链C末端或N末端的反应活性半胱氨酸。31.如前述任一权利要求所述的TCR，其与治疗剂或可检测部分连接。32.如权利要求31所述的TCR，其特征在于，所述TCR与所述治疗剂或可检测部分共价连接。33.如权利要求31所述的TCR，其特征在于，所述治疗剂或可检测部分与一条或两条TCR链的C末端共价连接。34.如权利要求31-33中任一项所述的TCR，其与治疗剂连接，所述治疗剂为免疫效应分子。35.如权利要求34所述的TCR，其特征在于，所述免疫效应分子是细胞因子。36.如权利要求34所述的TCR，其特征在于，所述免疫效应分子是IL-2或其功能性变体或片段。37.如权利要求31-33中任一项所述的TCR，其特征在于，所述治疗剂是细胞毒剂。38.如权利要求31-33中任一项所述的TCR，其特征在于，所述治疗剂是放射性核素。39.—种多价TCR复合物，其包含前述任一权利要求中所述的至少两个TCR。40.—种多价TCR复合物，其包含通过非肽聚合物链或肽接头序列连接的前述任一权利要求中所述的至少两个TCR。41.如权利要求40所述的TCR复合物，其特征在于，所述聚合物链或肽接头序列在各TCR的氨基酸残基之间延伸，所述氨基酸残基不位于TCR可变区序列中。42.如权利要求40或41所述的TCR复合物，其特征在于，所述TCR通过聚亚垸基二醇链或衍生自人多聚化结构域的肽接头连接。43.如权利要求42所述的TCR复合物，其特征在于，二价亚垸基间隔基团位于所述聚亚烷基二醇链和其与所述复合物的TCR的连接点之间。44.如权利要求40或41所述的TCR复合物，其特征在于，所述聚亚垸基二醇链包括至少两个聚乙二醇重复单元。45.—种多价TCR复合物，其包含如权利要求1-30中任一项所述的TCR中的至少两个TCR，其中(i)所述TCR中的至少一个与权利要求31-38中任一项所述的治疗剂连接。46.—种膜制剂，其包含权利要求1-26中任一项所述的TCR。47.—种包含表达载体的细胞，该表达载体包含权利要求1-26中任一项所述的TCR的编码核酸。48.—种药物组合物，其包含权利要求1-45中任一项所述的TCR或多价TCR复合物、或权利要求46所述的膜制剂、或多个权利要求47中所述的细胞，以及药学上可接受的载体。49.一种治疗AIDS的方法，所述方法包括给予罹患AIDS的对象有效量的权利要求1-45中任一项所述的TCR或多价TCR复合物、或权利要求46所述的膜制剂、或多个递呈权利要求1-30中任一项所述的TCR中的多个TCR的T细胞。50.如权利要求49所述的方法，其特征在于，以与治疗剂结合的形式给予TCR或多价TCR复合物、或包含TCR的膜制剂。51.如权利要求49所述的方法，其特征在于，给予多个递呈多个TCR的T细胞，且所述T细胞是CD8+T细胞。52.权利要求1-45中任一项所述的TCR或多价TCR复合物、或权利要求46所述的膜制剂、或多个权利要求47中所述的细胞在制备治疗AIDS的组合物中的用途。53.如权利要求52所述的用途，其特征在于，以与治疗剂结合的方式给予TCR或多价TCR复合物、或含有TCR的膜制剂。54.如权利要求52所述的用途，其特征在于，给予多个递呈多个TCR的T细胞，且所述T细胞是CD8+T细胞。55.—种产生对SLYNTVATL-HLA-A*0201具有结合特性的高亲和力TCR的方法，其特征在于，所述TCR(i)包含至少一个TCRa链可变区和/或至少一个TCR卩链可变区，和(ii)其对所述SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物的KD小于l|iM和/或对所述SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物的解离速率(k。ff)小于1X10—3，所述方法包括(a)产生包含HIVGagTCR的a禾B|3链可变区的TCR，其中a禾Q卩链可变区中的一条或两条在权利要求7和8中所限定的一个或多个氨基酸中含有突变；(b)在适于使所述突变的TCR与SLYNTVATL-HLA-A*0201结合的条件下，使所述TCR与SLYNTVATL-HLA-A*0201接触；禾口测定该相互作用的Kd和/或k。ff。全文摘要本发明提供了对SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物的亲和力(K_D)小于或等于1μM和/或解离速率(k_off)为1×10^-3S^-1或更慢的TCR，前提是当所述TCR由细胞递呈并包含SEQIDNO1和2时，所述细胞不是天然T细胞。此类TCR可单独使用或与治疗剂联用，以靶向于递呈该复合物的HIV感染细胞。文档编号C07K14/725GK101155829SQ200680011470公开日2008年4月2日申请日期2006年3月29日优先权日2005年4月1日发明者B·K·雅各布森,P·E·莫洛伊,S·M·邓恩,懿李申请人:阿维德克斯有限公司