抗疟疾疫苗的制作方法

专利名称：：抗疟疾疫苗的制作方法抗自疫苗本发明涉及疟疾抗原在进行免疫抵御疟疾感染和疾病中的新用途。本发明特别涉及子孢子抗原，特别是环子孢子(cs)蛋白或其免疫原性片段或衍生物，与合适佐剂联合免疫将到疟疾流行区旅行的未接触过疟疾的个体，以抵御疟疾感染的用途。疟疾是世界范围内的主要健康问题之一。在20世纪，经济和社会发展以及抗疟疾运动已经使世界上的大部分地区都根除了賠疾，受影响的地区占地球陆地面积的比例从50%减少到27%。尽管如此，考虑到预期人口增长，估计到2010年大概一半的世界人口，接近35亿人，将生活在症疾传染区(Hay，2004)。现在的估测表明每年超过1百万人死于疟疾，单是非洲的经济费用就是惊人的(Bremen,2004)。这些数字突出了全球疟疾危机和摆在国际健康共同体面前的挑战。该危机的起因是多重的，iW现有的、负担的起和先前高效药物的普遍抗药性的出现，到医疗卫生系统的瘫痪和不完善以及资源的缺乏。除非发现控制这种疾病的途径，否则改善健康和儿童存活率，减少贫困，增强安全感和强化最脆弱社会的^J求努力将会失败。症疾还给那些在疟疾流行区旅行或者工作的人带来危险，这些人通常居住在没有柜疾的地方。对这类旅行者人群来说危险可能更大，因为他们对来自自然接触的疟疾不具有任何基础免疫。到症疾流行区的旅，#遭遇危险的另一个方面是，由于流行性感冒样症状，该疾病在其早期经常被误诊。当严重程度加重和疤疾最终被确诊时，可能就太晚了。在症状加重的几日内，就可能导致死亡，例如，源于脑型疟，或者有时是器官(例如肝或者肾)衰竭。该疾病的一个最急性形式是由原生动物寄生恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)引起的，恶性疟原虫导致大多数属于疟疾的死亡。该疾病的另一种形式是由间日疟原虫(Plasmodiumvivax)引起的。间日疟原虫(P.vivax)是所有疸疾中分布最广泛的。除了存在于热带和亚热带地区外，该寄生虫在低至615摄氏度的温度下完成蚊体内循环的能力使其可以在温带气候中传播。但由于间日疟原虫感染极少致命，控制间日疟原虫疟疾的努力(通过疫苗开发)滞后于恶性症原虫(尸./a/c^arww)。30多年前做出的观察为下列看法提供了有力支持，即最终将开发出有效的赚疫苗。M31用活的、辐射灭活親子孢子免疫，小鼠和人类可以预防疟疾。体内肝内期的维持是产生和保持保护性免疫所需的，但基本机理还没有完全明确。抗体、CD8和CD4T细胞已经暗示其作为关键效应免疫调节物(Hoffinan，1996)。疟原虫(例如恶性疟原虫或者间日疟原虫)的生活周期是复杂的，需要两个宿主，人和蚊子才能完成。人的感染是由受感染蚊子的唾液中子孢子的接种引起的。子孢子迁移到肝脏，在那里感染肝细胞(肝期)，在肝细胞中通过红细胞外胞内期(exoeiythrocyticintracellularstage)，分化进入裂殖性孢子期(merozDitestage)，裂殖性孢子感染红细胞(RBC)起始无性血液期(asexualbloodstage)中的循环复制。M大量RBC中的裂殖性孢子分化成有性期配子体，循环完成，所述配子体被蚊子摄取，在那里配子体在中肠经过一系列阶段的发育产生迁移到唾液腺的子包子。疟原虫(例如恶性疟原虫或者间日疟原虫)的子孢子期已经被鉴定为一种疫苗的潜在靶标。已知子孢子的主要表面蛋白是环子孢子蛋白(CS蛋白)。已经对不同株系例如恶性疟原虫NF54株克隆3D7进行了该蛋白的克隆、表达和测序(Caspers，1989)。来自3D7株的该蛋白的特征是具有中心免疫显性重复区，包括重复40次的四肽^11-^3-^11-Pro,但其中散布4个较少重复的四肽Asn-Val-Asp-Pro。在其他株系中，主要的和较少的重复的数目以及它们的相对位置是不同的。该中心部分位于N和C末端部分中间，所述N和C末端部分由非重复氨基酸序列组成，其被命名为CS蛋白的无重复部分。基于CS蛋白的葛兰素史密斯克莱恩生物有限公司的(GlaxoSmiih-KlmeBiologicals')RTS,S自疫苗从1987年开始研发，是当前研究中最有效的，疫苗(Ballou，2004)。该疫苗特异的以恶性疟原虫的红细胞前期(pre-eiytkocytic)作为靶标。RTS,S/AS02A(RTS,S加佐剂AS02A，佐剂AS02A包括免翻U激剂QS21，3D-MPL和水包油乳剂)被用于在冈比亚进行的连续I期研究，所述研究包括成人(Doherty,1999)，年龄在6-11禾口1_5岁的儿童(Bojang,2005)，证实该疫苗是安全、良好耐受和产生免疫性的。随后选择儿科疫苗齐懂，在包括l-4岁莫桑比克儿童的I期研究中发现它是安全、良好耐受和产生免疫性的(Macete)。RTS,S/AS02A疫苗在美国和西非地区的临床试验中也显示明显功效。RTS,S/AS02A诱导针对恶性疟原虫环子孢子蛋白显著的IgG抗体应答和实质T细胞免疫(Lalvani，1999;Sun，2003)。在美国未接触过症疾的志愿者中进行抗恶性疟原虫实验攻击的效果，据估算大约平均是30—50%(Stoute，1997;Stoute，1998;Kester，2001)。这些研究(Stoute,1997)中的第一项在小规模试验中86%有效，其中用RTS,S/AS02A免疫的7位个体中有6位得到保护。此外，在冈比亚进行的不完全免疫现场研究(在冈比亚成人中进行的安全性研究(Doherty，1999))显示在15周的传染季节期间内，总有效率达34%，在随后的前9周内71%的有效率，此后0。/。的有效率(Bojang，2001)。这些研究(Stoute，1997;Stoute，1998;Bojang，2001;Kester，2001)显示了抗感染的效果。最近报道了在年幼非洲l儿童中利用RTS,S/AS02A进行试验的结果。人们发现基于CS蛋白的RTS,S疫苗不仅可以预防自然接触下的感染，而且可以预防恶性疟原虫引起的一系列临床疾病。接种RTS,S疫苗的儿童比对照组的儿童经历更少的严重有害事件、住院和严重的启疾并发症，包括死亡(Alonso，2004)。此外，RTS,S疫苗抗新感染或者临床发作的效果似乎并不减弱或者作用缓慢。在试验后6个月，疫苗仍然是有效的，因为在感染患病率方面存在显著差异。这与先前在未接触过疙疾的志愿者或者冈比亚成人中的试验相反，先前试验表明RTS,S的疫苗效果是短暂的(Stoute，1998;Bojang，2001)。此外，在继续12个月后，观察到疫苗抗临床疟疾发作的效果没有显著减弱(Alonso，2005)。尽管如上所述的疫苗制剂显示临床效果，仍然需要进一步改进，以便增加接受预防个体的数目以及预防的持久性。新的佐剂制剂，例如包含QS21和3D-MPL的脂质体制剂(本文称为佐剂B)，在不同临床前和临床调查中证实对增强T细胞免疫应答更强的潜能。特别的，对于一个不是来自流行区但将到疟疾流行区做有限时间旅行的人来说，需要的是对感染更好的预防。只有当存在肝脏的增殖性感染时才会出现疸疾的临床表现，肝脏的增殖性感染导致裂殖性孢子的形成和它们从肝脏期的释放。这些裂殖性孢子然后感染RBC，起始寄生虫的致病血液期，弓跑临床症状。如果接触后没有增殖性感染(即肝脏未受感染和/或没有肝裂殖性孢子的释放)，则这称为无菌免疫。在蛟叮咬后将显著斷氐如上定义的增殖性肝感染风险的疫苗，对没有预先免疫的旅行者群体来说是非常需要的，因为通过阻止增殖性肝感染，疫苗将预防任何继发的临现。这可能与以流行区的儿童或者成人作为目标的疫苗开发的目的相反，这种开发的主要目的是降低疾病的严重程度和/或降低发病数量，但不需要完全预防它们。理论上，在流行区的人口中长期地维持无菌保护是不可能的，因此他们需要通过接触培疾感染建立他们自己的免疫性。此外，对居住在流行区的人口给予长期但有限时段的无菌保护也不是可取的。本文中我们描述了在未接触过疱疾的群体中由RTS,S/AS02A相对包含不同的佐剂(佐剂B)的RTS,S头对头(headtohead)比较组成的攻击临床试验，所述佐剂是包含QS21和3D-MPL的含有胆固醇的脂质体制剂(参见实施例)。对T-和B-细胞介导的免疫均进行了研究。结果显示在未接触过疱疾的成年群体中，在疟疾攻击后预防增殖性肝感染方面，RT5,S抗原与佐剂B组合比RTS,S/AS02A的有效率高50%。因此，RT5,S抗原与佐剂B组合对无菌保护是更有效的，到自流行区旅行的未接触过疟疾的个体需要无菌保护。这种增强的效果源于佐剂B增强抗原特异性免疫应答(抗体和CD4-ThlT细胞)。因此本发明提供一种疟原虫抗原或者其免疫原性片段或其衍生物和佐剂在制备药物中的用途，所述药物用于免疫到流行区的旅行者以抵御增殖性症疾感染，所述佐剂是包括脂质A(lipidA)衍生物和皂苷的脂质体制剂。通常，到流行区的旅行者都是未接触过症疾的。因此，本发明适用于未接触过疟疾的个体。本发明尤其涉及降低到流行区的旅行者中增殖性顿感染的发病率，旅行者可以是任何年龄的，但尤其是成人。本发明的第二个方面提供一种包括疟原虫抗原或者其免疫原性片段或其衍生物和佐剂的制剂，所述佐剂是包括脂质A衍生物和皂苷柳旨质体制剂，用于免疫到流行区的旅行者以抵御增殖性赚感染。本发明的第三个方面提供一种在流行区的旅行者中预防增殖性疟疾感染的方法，包括施用适量制剂，所述制剂包括疟原虫抗原或者其免疫原性片段或其衍生物和佐剂，所述佐剂是包括脂质A衍生物和皂苷的脂质体制剂。在本发明的一个实施例中，疟原虫抗原是恶性疟原虫抗原。在本发明的另一个实施例中，疟原虫抗原是间日疟原虫抗原。合适地，抗原是红细胞前期抗原。抗原可以例如选自在寄生虫的子孢子期或者其他红细胞前期例如肝脏期表达的任意抗原。例如抗原可以选自环子孢子(CS)蛋白，肝期抗原(liverstageantigen)-l(LSA-l)(参见例如WO2004/044167),肝期抗原-3(LSA-3)(例如描述于EP0570489和EP0833917)，Pfs16kD(描述于W091/18922和EP597843),输出抗原(Exportedantigen)-l(Exp-l)(例如描述于MeraM等人2002,ParasiteImmunolvol24(3):141)，子孢子-苏氨酸-天门冬,安-富集蛋白(STARP)，子孢子和肝期抗原(SALSA),血小板反应素相关蛋白(thrombospondinrelatedanonymousprotein,TRAP)(描述于WO90/01496,W091/11516和W092/11868)和尖端裂殖性孢子抗原(apicalmerezoiteantigen-l,AMA-l)(描述于EP0372019)，它们最近显示存在于肝期(除红细胞内期之外)。所有这些抗原都是本领域公知的。抗原可以是完整的蛋白或其免疫原性片段或者上述任一种的衍生物。启疾抗原的免疫原性片段是公知的，例如AMA-1的胞外域(例如描述于WO02/077195)。衍生物包括例如与其他蛋白融合，其他蛋白可以是疙疾蛋白或者非柜疾蛋白例如HBsAg。本发明的衍生物能够激发抵御天然抗原的免疫应答。疟原虫抗原可以与乙型肝炎的表面抗原(HBsAg)融合。本发明使用的一种具体抗原来源于环子孢子(CS)蛋白，可以采用与HBsAg杂合蛋白的形式。抗原可以是完整的CS蛋白或者其一部分，包括CS蛋白的一个片段或者一些片段，其中这些片段可以融合。基于CS蛋白的抗原可以采用杂合蛋白的形式，包括基本上全部的疟原虫CS蛋白C末端部分，4个或者更多CS蛋白免疫显性区的串联重复，和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。杂合蛋白可以包括一个包含至少160个氨基酸并且基本上与CS蛋白的C末端部分同源的序列。特别的，"基本上全部"CS蛋白的C末端部，括缺少gl7K性锚定序列的C末端。此外，就恶性疱原虫的抗原而言，它包括4个或者更多，例如10个或者更多，Asn-Ala-Asn-四肽重复模体。CS蛋白可以缺失C末端最后12个氨基酸。本发明使用的杂合蛋白可以是包括恶性疟原虫CS蛋白一部分的蛋白，CS蛋白的这个部分基本上对应于恶性疟原虫3D7克隆的207-395位氨基酸，来自ffiii线性接头与HBsAg的N端符合读框地(inframe)融合的NF54株(Caspers，1989)。接头可以包括来自HBsAg的preS2的一部分。本发明使用的CS构建Wf述于WO93/10152。一种特异的构建体是称为RTS的杂合蛋白，在W093/10152(其中它被标注为RTS*)和WO98/05355中有描述，这两篇在此整体引入作为参考。本发明使用的特异杂合蛋白是称为RTS的杂合蛋白，RTS由下歹,质组成得自酿酒酵母(Sacchromyescerevisiae)TDH3基因序列的1059到1061位核苷酸编码的甲硫氨酸残基。(Musti,1983)。得自用于构建杂交基因的克隆过程产生的核苷序列(1062到1070)的3个氨基酸，MetAlaPro。核苷酸1071到1637位编码的189个氨基酸的一段序列代表恶性疟原虫3D7株的环子孢子蛋白(CSP)的207至lj395位氨基酸(Caspers，1989)。用于构建杂交基因的克隆过程编码的核苷酸1638到1640位的氨基酸(Gly)。1641到1652位核苷酸编码的4个氨基酸，ProValThrAsn，代表乙型肝炎病毒adw血清型)pres2蛋白的4个羧基末端残基(Valenzuela，1979)。核苷酸1653到2330位编码的226个氨基酸的一辦列，指定是乙型肝炎病毒(adw血清型)的S蛋白。RTS可以是RTS,S混合颗粒的形式。RTS,S颗粒包括两个多肽RTS和S，RTS和S可以同时合成并自发形成组合微粒结构(RTS,S)，例如在纯化期间。RTS蛋白可以在酵母，例如酿酒酵母(Sce"v/由e)中表达。在这类宿主中，RTS将表达为脂蛋白颗粒。受体酵母菌株可以在其基因组中携带乙型肝炎S表达盒的几个整合拷贝。所获菌株因此合成两个多肽S和RTS，这两个多肽自发地共组装成混合(RTS，S)脂蛋白颗粒。这些颗粒可以在它们的表面呈现杂交分子的CSP序列。这些混合颗粒中的RTS和S可以特定比例存在，例如1:4。在本发明中其他症疾抗原或者其片段或其衍生物的用途也包括在本发明范围内。其他的红细胞前期抗原例如AMA-1，LSA-1，LSA-3(例如描述于EP0570489和EP0833917)和Pfs16kD，可以与RTS,S联用。此外，RTS,S与血液期抗原例如裂殖性孢子表面蛋白-1(MSP-1)(例如描述于US4,837,016)、红细胞结合抗原-175(EBA-175)或者MSP—3(例如描述于EP0666916)联用。本文所述的任意抗原的免疫原性片段将包括至少一个抗原表位，并显示疱疾抗原性，当存在于合适构建体，例如融合到其他疫疾抗原或者其他非抗原或者存在于载体时，能够激发免疫应答，该免疫应答针对天然抗原。通常免疫原性片段包括来自疟疾抗原的至少20，或者至少50，或者至少100个连续氨基酸。本文所述的抗原或其片段的衍生物类似地将包括至少一个抗原表位，并显示疟疾抗原性，能够激发免疫应答，该免疫应答针对天然抗原。衍生物包括例如疟疾抗原与另一种蛋白的融合，该蛋白可能是也可能不是另一种疟疾蛋白，可以是例如HBsAg。根据本发明，纯化的杂合蛋白水溶液可以直接使用，并与本发明的合适佐剂组合。或者，该蛋白可以在与佐剂混合前冻干。佐剂可以是一种液体，因此可用于将抗原重组成液体疫苗形式。因此本发明还提供如本文所述的疟原虫抗原或者其免疫原性片段或其衍生物和佐剂在制备用于免疫到流行区的旅行者以抵御疟疾感染的试剂盒中的用途，所述佐剂是包括脂质A衍生物和皂苷的脂质体制剂，其中提供的抗原是冻干形式，抗原和佐剂在施用前混合。根据本发明的疫苗剂量可以在每剂量1-100微克RTS，S之间，例如25到75微克RTS,S，例如一次剂量50微克RTS,S，其可以存在于500微升中(最终液体制剂)。这是供成人使用的合适剂量。供儿童使用的合适剂量是成人剂量的一半，即25微克RTS,S，其可以存在于250微升中(最终液体制剂)。相似的剂量可以用于其他抗原。本发明的抗原与佐剂组合，所述佐剂是包括脂质A衍生物和皂苷的脂质体制剂。本发明的合适佐剂是来自任意来源的脱毒脂质A和脂质A的无毒衍生物，它是Thl细胞应答的优i^lj激剂(本文也称为Thl型应答)。免疫应答可以大致分为两个大类，体液或者细胞介导的免疫应答(通常分别表征为保护的抗体机制和细胞效应机理)。这些类型的应答被称为Thl型应答(细胞介导的应答)和Th2型免疫应答(#答)。极端Thl型免疫应答可以表征为抗原特异的、单倍型限制的细胞毒T淋巴细胞和天然杀伤细胞应答的产生。在小鼠中，Thl型应答通常表征为IgG2a亚型抗体的产生，而在人中这些对应于IgGl型抗体。Th2型免疫应答表征为一系列免疫球蛋白同种型的产生，包括小鼠中的IgGl。人们认为这两种类型免ffi答发展背后的推动力是细胞因子。高水平的Thl型细胞因子倾向于诱导针对给定抗原的细胞介导的免疫应答，而高水平的Th2型细胞因子贝,向于诱导针对抗原的体液免^答。Thl和Th2型免疫应答的区另杯是乡树的，可以采取这两种极端间的连续形式。实际上，个懒每支持被描述为主要的Thl或者主要的Th2的免疫应答。但是，常常方便的依据Mosmann和Coffinan在小鼠CD4+veT细胞克隆中的描述来考虑细胞因子家族(Mosmann，1989)。通常，Thl型应答与T淋巴细胞产生的INF-Y细胞因子有关。通常与Thl型免疫应答的诱导直接相关的其他细胞因子不是由T细胞产生的，例如EL-12。相反，Th2型应答与IL4,IL-5,EL-6,IL"IO和肿瘤坏死因子-P(TNF-beta)的分泌相关。众所周知某些疫苗佐剂特别适合于刺激Thl或者Th2型细胞因子应答。通常，疫苗接种或者感染后免疫应答Thl:Th2平衡的指示包括，体外抗原再刺激后T淋巴细胞产生Thl或者Th2细胞因子的直接测量，禾Q/或抗原特异抗体应答的lgGl:IgG2a比例的检测(至少在小鼠中)。因此，Thl型佐剂是一种刺激独立T细胞ffiE接受体外抗原再刺激后产生高水平的Thl型细胞因子的佐剂，该佐剂还诱导与Thl型同种型相关的抗原特异免疫球蛋白应答。能够优先的刺激Thl细胞应答的佐剂描述于WO94/00153和WO95/17209。很早就已经知道肠道菌脂多糖(LPS)是免疫系统的有效刺激剂，虽然因为毒性其作为佐剂的用途已经减少。通过从还原端葡糖胺去除核心糖类基团和磷酸酯产生的LPS的无毒衍生物，单磷酸脂A(MPL)，已经有相對艮道(Ribi，1986)，并具有下列结构:<formula>seeoriginaldocumentpage14</formula>MPL的其他脱毒形式源自从二糖骨架的3-位置去除酰基链，被称为3-0-脱酰基单磷酸脂A(3D-MPL)。可以根据GB2122204B教导的方法纯化和制备3-0-脱酰单磷翻旨A，该参考文献还公开了二磷翻旨A和其3-0-脱酰变体的制备。本发明使用的3D-MPL的特殊形式是乳剂形式，其微粒直径小于0.2微米，W094/21292公开了其制备方法。WO98/43670已经描述了包括单磷酸脂A和表面活性剂的水剂。本发明使用的细菌脂多糖来源的佐剂可以从细菌来源纯化和制备，或者它们也可以是合成的。例如，Ribi等人(Ribi，1986)描述了纯化的单磷酸脂A，GB2220211和US4912094描述了来源于沙门氏菌(Salmonellasp)的3-0-脱酰单磷酸或者二磷翻旨A。其他纯化和合成的脂多糖也已经有描述(Hilgers，1986;Hilgers，1987;EP0549074B1)。本发明使用的一个特异细菌脂多糖是3D-MPL。因此，可用于本发明的LPS衍生物是那些与LPS或者MPL或者3D-MPL结构相似的免自微剂。在另一种选择中，LPS衍生物可以是酰化单糖，这是MPLi上述结构的亚基。皂苷也是Thl免疫激剂。皂苷是公知的佐剂(Lacaille-Dubois，1996)。本发明使用的合适皂苷包括免疫活性皂苷，例如，QuilA(来源于南美QuillajaSaponanaMobna树的树皮)，及其免疫活性部分，描述于US5,057,540和"Sapo扁asvaccineadjuvants"(Kensil，1996)和EP036227犯1。溶血皂苷QS21和QS17(QmlA的HPLC纯化部分)已经被描述为有效的全身性佐剂，美国专利号5,057,540和EP0362279B1公开了它们的生产方法。这些参考文,描述了QS7(Quil-A的非溶血部分)的用途，QS7是全身性疫苗的有效佐剂。Kensil等人(Kensil，1991)也描述了QS21的用途。QS21和聚山梨酯80或者环糊精的组合也是已知的(WO99/10008)。W096/33739和W096/11711描述了包括QuilA部分例如QS21和QS7的微粒佐剂系统。用于本发明的上述脂多糖和阜苷免M微剂与脂质体载体一起配制。例如，如W096/33739所述，载体可以由含有胆固醇的脂质体组成。单磷酸脂A和皂苷衍生物的组合描述于WO94/00153;WO95/17210;W096/33739;W098/56414;W099/12565;W099/11241,QS21禾口3D誦MPL的组合公开于WO94/00153。因此，本发明〗顿的合适佐剂系统包括，例如，单磷酸脂A，例如3D-MPL，与皂苷衍生物的组合，尤其是WO94/00153公开的QS21和3D-MPL的组合。佐剂系统包括脂质体载体，例如含有胆固醇的脂质体，例如W096/33739公开的在组合物中，QS21在含有胆固醇的脂质体(DQ)中被淬灭。因此如W096/33739所述，皂苷例如QS21可能存在于脂质体膜上或者与脂质体膜结合。3D-MPL或者其他脂质A衍生物可以固定于脂质体膜，或者出现在脂质体外，或者两种情况都存在。本发明使用的一种特殊佐剂包括两种免疫刺激剂QS21和3D-MPL，在含有胆固醇的脂质体制剂中，其中3D-MPL位于脂质体内，而QS21与脂质体结合。选择各个疫苗剂量中存在的本发明蛋白的量为诱导免疫保护应答而没有典型疫苗中显著不良副作用的量。这种量将根据所使用的具体免疫原和具体佐剂而不同。通常，可以预期每次剂量将含有1-1000tt克蛋白，例如1-200微克，例如10-100微克。特殊疫苗最适量可以通过标准研究确定，包括观察受试者的抗体滴度和其他应答来确定。本发明使用的合适免疫方案是到疟疾流行区旅行前的初始免疫，这可以在到达该区域前例如至少2-4周完成。这个初始免疫可能包括1到3次齐l遣，例如2次或者3次剂量，在施用各次剂量之间间隔至少7天，或者1到4周之间或者例如1个月。只要感染风险仍然存在，在初始免疫后，可以每隔6个月重复力口强。在反复到流行区旅行前进行周期性加强免疫是合适的。每次剂量中RT5,S蛋白的合适量如本文上面所述。本发明的疫苗可以M任意各种途径施用，例如口服的、局部的、皮下的、粘膜的(通常阴道内的)、静脉的、肌肉的、鼻内的、舌下的、真皮内的和通过栓剂。本发明还可用于，初始-加强(prime-boost)疗法。替代或者除了包含RTS,S或者其他多肽的组合物的重复剂量之外，不同形式的疫苗可以采用异源"初始-加强"免疫方式施用。初始组合物和加强组合物应具有至少一个共同抗原，尽管它不需要是相同形式的抗原；它可能是相同抗原的不同形式。本发明的初始-加强免疫可以利用蛋白和多核苷酸的组合进行，尤其是基于DNA的制剂。这样一个策略被认为可有效诱导广谱免疫应答。佐剂化蛋白疫苗主要诱导抗体和T辅助免疫应答，而作为质粒或者活载体输送的DNA诱导强的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。因此，蛋白和DNA免疫的组合可适用于广谱的免疫应答。因此本发明还提供如本文所述的疟原虫抗原或者其免疫原性片段或其衍生物和佐剂，以及编码疟原虫抗原或者其免疫原性片段或其衍生物的多核苷酸，在制备用于免疫到流行区的旅行者以抵御增殖性赚感染的试剂盒中的用途，所述佐剂是包括脂质A衍生物和皂苷的脂质体制剂。本发明还提供一种试剂盒，包括以冻干形式提供的疟原虫抗原或者其免疫原性片段或其衍生物，包括脂质A衍生物和阜苷的脂质体剂型的佐剂，和说明书，该说明书详细说明在施用到流行区的旅行者前将抗原、佐剂和可选的载体混合，从而保护所述旅行者免于增殖性疟疾感染。因此当RTS,S或者另一种基于CS蛋白的多肽被用作初始-加强疗法的多肽组分时，多核苷酸组分将编码CS蛋白或者其免疫原性片段或其衍生物。DNA可以作为裸DNA例如质粒DNA输送，或者采用重组活载体的形式。本发明使用的活载体可以是复制缺陷型的。可使用活载体的实例是痘病毒载体，包括修饰的痘病毒载体，例如修饰的病毒安卡拉(ModifiedVirusAnkara,MVA)，甲病毒载体例如VenezuelianEquineEncephalitis病毒载体，或者腺病毒载体例如非人类腺病毒载体例如黑猩猩腺病毒载体，或者任意其他合适的活载体。在本发明初始-加强疫苗中作为活载体使用的合适腺病毒是一种低血清阳性率的人腺病毒，例如Ad5或者Ad35，或者非人，源腺病毒例如非人类灵长类动物腺病毒例如猿腺病毒。载体可以是复制缺陷型的。通常这些病毒含有E1缺陷，可以在转化了E1基因的细胞系中生长。合适的猿腺病毒是从黑猩猩分离的病毒。尤其是，C68(也称为Pan9)(参见美国专利号6083716)和Pan5,6和Pan7(WO03/046124)也可在本发明中使用。因此可以对这些载体进行操作以插A^发明的异源多核苷酸，以便能够表达本发明的多肽。这类重组腺病毒载体的使用、制剂和制备详细描述于W003/046142。可以在注射蛋白抗原一次或者数次后，施用一次或者多次DNA，或者首先施用一次或者多次DNA，然后进行一次或者多次蛋白免疫。首先施用DNA，然后施用蛋白可能是有益的。因此本发明初始-加强免疫的一W寺定实施例涉及用单一齐糧的多核苷酸初始免疫，该多核苷用例如上述任意的重组活载体形式，然后使用一次或者多次齐懂的，例如2次或者3次剂量的，佐齐U化蛋白例如RTS,S与本文描述的佐齐叻膙免疫。该多核苷酸编码相同的蛋白(例如CS蛋白)或者其免疫原性片段或其衍生物。因此本发明还提供一种药物试剂盒，包括a)疟原虫抗原或者其免疫原性片段或其衍生物和佐剂，所述佐剂是包括脂质A衍生物和皂苷棚旨质体制剂，禾口b)编码疟原虫抗原或者其免疫原性片段或其衍生物的多核苷酸；其中a)和b)可以按任意次序顺序使用，但特别的，其中b)被用作初始而a)被用作加强。本发明还提供所述试剂盒的说明书，说明关于a)，在给到流行区的旅fi^"施用前，混合抗原、佐剂和可选的载体。组合物a)可以是在本文所述合适佐剂中的任意本文所述多肽组合物。例如a)可以是包括RTS，S和佐剂的组合物，所述佐剂是包括QS21和3D-MPL的脂质体制剂，和b)可以是本文描述的活载体例如腺病毒载体，例如黑猩猩腺病毒载体，编码CS蛋白或者其免疫原性片段或其衍生物。初始组合物和加强组合物可以施用不止一次剂量。此外，初始引发和加强剂量后可以采用更高的剂量，这可以交替以产生例如DNA初始/蛋白加衝更高的DNA剂獻更高的蛋白剂量。本发明使用的合适的药学上可接受的稀释剂或者赋形剂是本领域公知的，包括例如7jC或者缓冲液。疫苗制备方法被广泛报道(Powell,1995;Voller，1978)。例如Fullerton，美国专利4,235,877描述了月旨质体内的包裹。例如Likhite，美国专利4,372,945和Armor等人，美国专利4,474,757公开了蛋白与高分子的结合。在另一方面，本发明提供一种在给个体施用疟疾抗原组合物，尤其是红细胞前期疟疾抗原组合物后，检测个体是否预防疱疾的方法，该方纟跑括检测个体中激发的賠疾抗原特异的CD4T细胞水平。本发明还提供一种在给个体施用疟疾抗原组合物，尤其是红细胞前期症疾抗原组合物后，检测个体是否预防疟疾的方法，该方法包括检测个体中激发的疟疾抗原特异的抗体浓度。在另一方面，本发明提供一种评价纟，疫苗，尤其是红细胞前期候选疫苗，预防賠疾的效果的方法，该方法包括检观U个体中激发的抗候选疫苗的CD4细胞水平。在另一方面，本发明提供一种评价候选疫苗，尤其是红细胞前期特异抗体候选疫苗，预防疟疾的效果的方法，该方法包括检测个体中激发的抗候选疫苗的特异抗体浓度。在更具体的实施例中，这类疫苗包括疟原虫抗原或者其免疫原性片段或其衍生物和佐剂，所述佐齐提包括脂质A衍生物和皂苷的脂质体制剂。实施例实施例1:使用RTS，S和佐剂B的免疫和实验性驗攻击。疫苗RTS,S:RTS是含424个氨基酸(a.a.)的51kDa杂合多肽,连，由来源于寄生恶性疟原虫NF54株(CSP抗原，氨基酸207到395)的子孢子表面抗原(CS蛋白中心串驢复和羧基末端区域，总共189个^^酸)融合到乙型肝炎病毒S蛋白的氨基末端组成。S是对应于乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的24kDa的多肽(长226氨基酸)，用作GSKBiologicalsEngerix-B⑧疫苗中的抗原。这两个蛋白在酵母(酿酒酵母(S.cwev&ae))胞内产生，自发组装成混合聚合微粒结构，该微粒结构估计包含大约100个多肽。WO93/10152描述了RTS,S的制备。RTS,S/AS02A(GlaxoSmithKlineBiologjcals,RixensaitBelgium)的完整剂量，包含构建于500微升AS02A佐剂-水包油乳剂中的50微克冻干RTS,S抗原，AS02A佐剂-7j^包油乳剂包含免翻ij激剂3D-MPL(GlaxoSmithKlineBiologicals,Montana,USA)和QS21各50微克。RTS,S/佐剂B(GlaxoSmithKlineBiologicals,Rixens賊Bdgium)的完整剂量，包含构建于500微升佐剂B中的50微克冻干RTS，S抗原，佐剂B是包含免疫刺激剂3D-MPL(GlaxoSmithKlineBiologicals,Montana^USA)和QS21(各50微克)的含有胆固醇柳旨质体制剂。可以从有机翻'冲的脱油磷脂醐旦碱(DOPC)、胆固醇和3D-MPL的混合物制备脂质体，其中混合物被脱水。然后添加ZK溶液以悬浮脂质。悬浮液被微流体化(microfluidised)，直至鹏质体大小縮小到可以无菌土过0.2,滤器。通常胆固醇磷脂Stl旦碱比例是l:4(w/w)，添加水溶液到最终胆固醇浓度为5到50毫弥毫升。添加QS21到包含胆固醇的脂质体中。方法该临床试验评价一种痏疾疫苗的安全性，致反应力，免疫原性和初步效果，所述痏疾疫苗包含抗原RTS,S并添加AS02A或者佐剂B。103位受试者被分为两组，根据0、1、2个月免疫方案随机接种3次齐糧的任一疫苗。因为涉及大量受试者，所招募的各组依次接受抗原攻击。各个组中，第3次剂量后，志愿者被要求接受标准化初始疟疾攻击(CMay，1986)2到4周。初始攻击包括让5只感染恶性疟原虫子孢子的斑须按蚊C4wqp/^fe^舰ve腦mosquitos)对攻击志愿者叮咬5辦中。每组中，12个未免疫的对照志愿者也被攻击。在初始攻击大概6个月后，在初始攻击中受到保护的志愿者被要求接受重复攻击。在攻击之间没有施用额外剂量的疫苗。重复攻击按照初始攻击的方式进行。每组中，6个未免疫对照志愿者也被攻击。在每次攻击后的至少30天内，每天检测受试者是否被感染。检测感染的主要方法是鉴定Giesma染色外周血涂片，M31光学显微镜检测无性期寄生虫。^示受试者已经遭受增殖性感染，寄生虫已经Ay干脏释放并iSA红细胞内期。因此没有实现抵御攻击的无菌保护。一旦出现感染症状时，受试者被宣布为疟疾阳性的，接受治疗量的氯喹。主要疗效体现为无菌保护，即受试者从不发生无性期寄生虫血症(parasitaemia)。此外，记录在攻击和那些未被完全保护的受试者中出现寄生虫血症之间的时间。此外，在免疫前、n次免疫后2周和m次免疫后14-28天(攻击日期DOC)，收集外周血单核细胞(PBMC)样品。通过细胞因子流式细胞仪，检测PBMCs样品中的CD4和CD8T细胞应答。流式细胞技术可以对给定抗原特异的T细胞定量。细胞表型进行常规免疫荧光标记以及产生胞内细胞因子后，通过流式细胞仪计数抗原特异的CD4和CD8T细胞。简单来说，当与其相应抗原孵育时，夕卜周血中抗原特异的CD4和CD8T细胞可以在体外被再次刺激，产生IL-2、CD40L、TNF-a或者IFN-Y。肽的HBs(乙型肝炎表面抗原)和CSP库都可用作再刺激抗原特异T细胞的抗原。结果可以表示为CD4或者CD8T细胞亚群中表达CD40L、IL-2、TNF-a或者IFN-Y中至少两个不同细胞因子的CD4或者CD8T细胞的表达频率。利用重组蛋白R32LR作为捕获抗原的标准ELISA方法检测对恶性疟原虫CS重复区的抗体(IgG)应答，确定抗体水平。简单的说，在96孔板上包被R32LR蛋白[对应于恶性疟原虫环子孢子蛋白(CSP)的重复区(NANP)]。在板被t包和后，直接向板上添加血清样品的连纟释液。血清样品中的R32LR抗懒每结合预包被的R32LR。洗板。添加过氧化物酶标记的山羊抗人IgG(Y)，它将结合抗CSIgG抗体。在另一个洗涤步骤后，过氧化物酶特异生色底物的添加提供一种检测与预包被抗原结合的抗CSIgG的方法。过氧化物Hf崔化显色反应。形成的颜色强度与血清中含有的抗CSIgG抗体的滴度成正比。相对每块板上的已知的血清标准确定抗重复抗体水平，表示为微弥毫升。结果组1<table><row><column>佐剂</column><column>接受免疫的志愿者数目</column><column>接受攻击的志愿者数目(受保护的数目)</column><column>接受再攻击的志愿者数目(受保护的数目)</column></row><row><column>佐剂B</column><column>26</column><column>17(10)</column><column>5(3)</column></row><row><column>AS02A</column><column>25</column><column>24(9)</column><column>5(1)</column></row><row><column>TOTAL:</column><column>51</column><column>41</column><column>10</column></row><table>组2:<table><row><column>佐剂</column><column>接受免疫的志愿者数目</column><column>接受攻击的志愿者数目(受保护的数目)</column><column>接受再攻击的志愿者数目(受保护的数目)</column></row><row><column>佐剂B</column><column>数字未提供</column><column>19(8)</column><column>未进行</column></row><row><column>AS02A</column><column>数字未提供</column><column>20(5)</column><column>未进行</column></row><row><column>总数</column><column>52</column><column>39</column><column></column></row><table>对于初始攻击的组1&2组合:<table><row><column>佐剂</column><column>接受免疫和攻击的志愿者数目(初始攻击)</column><column>受保护的志愿者数目</column><column>受感染的志愿者数目</column><column>疫苗有效率</column></row><row><column>佐剂B</column><column>36</column><column>18</column><column>18</column><column>50%</column></row><row><column>AS02A</column><column>44</column><column>14</column><column>30</column><column>32%</column></row><table>因此在这项逸验中，佐剂B離多更有效的保护未接触过疱疾的个術氐御症疾感染。佐剂B组50。/。的受攻击个体得到保护，AS02A组32%的受攻击个体得到保护。这4樣两种佐齐胸保护的提高超过50%。此外，在组l中，发现佐剂B比AS02A能够更高效的诱导针对RTS，S中抗原的CD4T细胞应答(图l，p=0.01663)。组1和2的组合数据是不显著的(图2，p=0.07)。在免疫前，没有可检测的针对HBs或者CSP的CD4/CD8T细胞应答。与此相反，在n次免疫后2周以及m次免疫后2周(doc:攻击日期)，在大多数接种两种制剂的个体中发现HBs和CSP特异的CD4T细胞。在相同时间点，没有观察到可检测的CD8T细胞应答。这些观察证明用于T细胞免g控的方法是特异和敏感的，而这是在接受不同疫苗制齐啲组间进行正式比较的前提条件。图1显示在n次免疫后和m次免疫后2周(DOC)，组1中接种RTS,S/佐剂B的个体相对那些接种RTS,S/AS02A的个体具有更高频率的CSP特异的CD4T细胞。对HBs特异的CD4T细胞可以得出相似的结论，该细胞在n次免疫后2周产生,-Y和另一种来自IL-2、CD40L、TNF-a其中之一的细胞因子(数据未显示)。图2显示和图1相同的研究，只是其包含两组的数据。在图1和2中，结果可以表示为106个CD4T细胞中表达CD40L、IL-2、TNF-a或者IFN-y中至少两个不同细胞因子的CD4T细胞的表达频率。在抗CSP特异抗体应答中可以看到相似的图象。从图5可知RTS,S/佐剂B激发的抗体浓度显著大于RTS,S/AS02A激发的浓度(特别参见DOC—m次免疫后2周(P=0.00793)，但II次免疫后2周的效果显著)。结果表示为几何平均浓度(GMC)。前(Pre)是指施用任意剂量前的起始时间点。Ml是指第一次剂量后2周的时间点。M2是指第二次剂量后2周的时间点。DOC是指"攻击的日期"，是第三次剂量后2周。抵御疟疾攻击的保护与显著更高的CD4T细胞应答和对CSP的特异抗体应答有关。RTS,S/佐剂B相对RTS,S/AS02A免疫原性的增强并不一定表祐将转化成生物相关的效果。但是，本试验中接种RTS,S/佐剂B的个体(36位个体中的18位50X)相对那些接种RTS,S/AS02A的个体(44位个体中的14位32%)，显示抵御疟疾攻击保护水平的提高。因此发现了CD4T细胞应答变幅和对疟疾的防护之间的可能联系。如果战假设成立，受保护的个体比接种RTS,S/AS02A或者甚至比RTS,S/佐剂B的个体具有更高的CD4T细胞应答。分别针对第1组和合并组(和两个佐剂组库)的图3和4，明确的证实了上述假设，并支持以下观点，即CSP特异的CD4T细胞在保护作用中起重要作用。与此一致，对II次免疫后2周以及m次免疫后2周收集样品的统计分析证明受保护和未受保护的个体间频率的差异是统计上有显著意义的。在图3和4中，结果可以表示为106个CD4T细胞中表达CD40L、IL~2、TNF-a或者IFN-Y中至少两个不同细胞因子的CD4T细胞的表达频率。免疫原性分析还显示，与CSP特异的CD4T细胞相反，HBs特异的CD4T细胞与n次免疫后2周以及m次免疫后2周的抵御疤疾的保护作用无关(分别为p=0.14和p=053)。鄉一步证实了战结果的可靠性，强烈表明保护作用是与能够识别CSP而不是HBs肽的CD4T细胞的存在特异相关的。最后，因为没有可检测的CD8T细胞应答，还可以得出结论，即最有可能的是，用佐剂B或者AS02A佐剂化的RTS,S弓拨的疤疾红细胞前期保护不像是因为免疫后CSP特异的CD8T细胞的诱导造成的。在监控抗CSP抗体应答中可以观察到相似的图象。图6显示受保护和未受保护个体中的抗体浓度(结果涉及使用两种佐剂组库的两个组)。很明显那些受保护的个体比那些未受保护的个体显示明显更高的抗体浓度(P<O.0001)。讨论上述结果一方面清楚表明CSP特异的CD4T细胞和抗体应答之间的关联，另一方面表明存在抵御攻击的保护状态。CSP特异的CD4T细胞或者抗体产生抵御寄生效果的机制还是未知的。但是，分析还是清楚地鉴定出少数未受保护的个体具有高CD4T细胞或者高抗体应答。这表明仅由对CSP的强CD4T细胞应答或者高抗体应答不能预示抵御攻击的保护作用。己经开发出不同的监控T细胞应答的技术，例如淋巴细胞增殖(lymphoproloferation)、细胞因子分泌、四聚体染色(tetramerstaining)、Elipsot或者细胞因子流式细胞术。基于良好的重复掛重现性数据以及相关标记物检测(CD4,CD8,CD40L,IL-2,TNF,IFNg)，最近后者被选为先导技术。此外还鉴定了一种特异的分析方法学，这解决了细胞因子流式细胞术方法中常见的高背景问题。本文证明了在人临床试验中禾,细胞因子流式细胞术稳定监控T细IM答的可行性。此外，它还证明了有可能鉴定不是与体液免M:接相关的保护标记尽管已经证明佐剂B比AS02A制齐脂,明显更有效的诱导CSP特异的CD4T细胞和抗体，但CD4T细胞频率和抗体浓度的差异是相对适中的，可以得出结论，即它们不是生物相关的。该临床试验中获得的数据允许利用抵御疟疾的数据作为生物相关标记物正式鉴定这类差异的生物关联性。分析清楚地显示，佐剂之间关于T细胞频率和抗体浓度的适中但显著的差异转化为显著地更高程度的抵御疟疾攻击的保护作用。参考文献·Al·DnsoP等人(2004)E．1~cacyoftheRTS,．S/AS02AvaccineagainstPlasmodiumfalciparuminfectionanddiseaseinyoungAfricanchildrenrandomisedcontrolledtrial．LancetOct；364141l-1420．·AI—ONSO等人(2005)DurationofprotectionwithRTS,S/AS02AmalariavaccineinpreventionofPlasmodiumfalciparumdiseaseinMozambicanchildrenjsingle·bRndextendedfollow-upofarandomisedcontrolledtrial．Lancet．Dec10366(9502)2012—8．·BallouWR，Arevalo·Hene~M，CarucciD，RichieTL，CorradinG，DiggsC，等人(2004)Updateontheclinicaldevelopmentofcandidatemalariavaccines．Am3TropMedHyg；71Qjuppl)239·247．·BojangKA，MilliganPJM，PinderM，VigneronL，AllouecheA，KesterKE，等人(2001)EfficacyofRTS,S／AS02malariavaccineagainstPlasmodiumfalciparuminfectioninsemi·immuneadultmeninTheGambiaarandomisedtrial．TheLancet；358(9297)l927-l934．·BojangKA，，OlodudeF，PinderM，Ofori—Anyinam0，VigneronL，FitzpatrickS，NjieF，KassangaA，LeachA，MilmanJ，RabinovichR，MeAdamKPWJ，KesterKE，HeppnerDG，CohenJD，TomieporthN，andMilliganPJM．(2005)SafetyandimmunogenicityoyRTS,s，As02Acandidatemawr~vaccineinGambianchildren．Vaccine23(32)4148—57．．·BremanJG，AlilioMS，MillsA．(2004)Theintolerableburdenofmalaria:what'snew,what'sneeded．AmJTropMedHyg；71(2suppl)0-i-．·Caspers等人(1989)ThecircumsporozoiteproteingenefromⅣJ町taPlasmodiumfalciparumisolateusedinmalariavaccinetrials．M01．Biochem．Parasitol35，185—190．·Chulayetal，(1986)Malariatransmittedtohumans砂mosquitoesinfectedfromculturedPlasmodiumfalciparum．AmJTropMedHyg．Jan35(1)66—8·DohertyJ，PinderM，TomieporthN，CanonC，VigneronL，MilliganP，等人(1999)AphaseIsafetyandimmunogenicitytrialwiththecandidatemalariavaccineRTS,S／SBAS2insemi—immuneadultsinTheGambia．AmJTropMedHyg；61(6)865—868．HaySI,GuerraCA,TatemAJ，NoorAM,SnowRW.(2004)Theglobaldistributionandpopulationatriskofmalaria:past,present,andfuture.TheLancetInfectiousDiseases;4(6):327-336.Hilgers等人(1986),Synergisticeffectsofsyntheticadjuvantsonthehumoralimmuneresponse.Int.Arch.Allergy.Immunol.,79(4):392-6HHgers等人(1987).Syntheticsulpholipopolysachrides:noveladjuvantsforhumoralimmunerespondes.Immunology,60(1):141-6.HoffmanSL(1996)"MalariaVaccineDevelopment:amulti-immuneresponseapproach"AmSocMicrobiolPressEdHoffhianSL，Chapter3"Attackingtheinfectedh印atocyte,,KensilCR,PatelU,LennickM，MarcianiD.(1991)SeparationandcharacterizationofsaponinswithadjuvantactivityfromQuillajasaponariaMolinacortex.J.Immunologyvol146，431-437KensilCR,(1996)Saponinsasvaccineadjuvants,CritRevTherDrugCarrierSystl2(l-2):l-55KesterKE,McKinneyDA，TomieporthN,等人(2001)EfficacyofRecombinantcircumsporozoiteproteinvacineregimensagainstexperimentalPlasmmodiumfalciparummalaria.J,ln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，尤其是红细胞前期疟疾抗原组合物后是否预防了疤疾的方法，该方法包括检测个体中激发的抗原特异的CD4T细胞水平。46.—种检测个体施用了疟疾抗原组合物，尤其是红细胞前期疟疾抗原组合物后是否预防了疟疾的方法，该方法包括检测个体中激发的疟疾抗原特异的抗微度。全文摘要本发明提供一种在疟疾流行区的旅行者中预防增殖性疟疾感染的方法，包括施用适量的制剂，所述制剂包括疟原虫(Plasmodium)抗原或者其免疫原性片段或其衍生物和佐剂，所述佐剂是包括脂质A(lipidA)衍生物和皂苷的脂质体制剂。文档编号C07K14/445GK101208100SQ200680023139公开日2008年6月25日申请日期2006年6月29日优先权日2005年6月30日发明者J·D·科亨申请人:葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司