专利名称：：排斥性引导分子(rgm)蛋白质家族的蛋白质的结合结构域及其功能性片段和它们的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及排斥性引导分子(repulsiveguidancemolecular,RGM)蛋白质家族成员的受体结合结构域(receptorbindingdomain)的鉴定和用途，并且涉及从其衍生的多肽片段。根据本发明的结构域和肽片段适宜作为主动或被动免疫个体的药剂，并且适宜作为用于疾病或病理状况(其中在所述疾病或病理状况的t艮或进程当中牵涉RGM家族成员和该分子的细胞受体)的诊断剂和治疗剂。本发明还涉及抗本发明结合结构域和抗从其衍生的多肽的单克隆和多克隆抗体，并且涉及用于制备本发明的结构域、多肽和抗体的方法。
背景技术：
：RGM蛋白质家族成员的功能由Monnier，P.P.等，Nature,419，pp.392-395,2002第一次描述。该家族包括目前>^开的三个成员，它们分别称作RGMA、RGMB(也称作DRAGON)和RGMC(也称作血幼素(hemojuvelin扉iederkoflerV.等，J.Neurosci.24，808-18，2004)。它们是通过脂质锚(糖基磷脂酰肌醇锚-GPI锚)结合至质膜的糖蛋白。该蛋白质家族的成员与其他蛋白质没有任何广泛的序列同源性，并且已经鉴定的结构特征基本上是如下区域N-末端信号肽；RGD序列；M酸序列GDPH附近的蛋白水解切割位点；vonWillebrand因子结构域(vWFD)的结构同系物；邻近C末端的疏水序列以及C-末端GPI锚共有序列(还可参见图2)。在人中，RGMA的编码序列位于15号染色体，RGMB的编码序列位于5号染色体，并且RGMC的编码序列位于1号染色体。观察到特征性表达方式。RGMA和B尤其表达于成人脑和脊髓，RGMC尤其表达于骨骼肌、肝脏和心肌。RGMB还表达于软骨组织。RGM蛋白质最初作为在神经元拓朴投射形成中起重要作用的候选蛋白质而被鉴定出来(StahlB.等，Neuron5:p735-43，1990;MudlerB.K.等，Curr.Biol.6,pp.1497-1502，1996;MuellerB.K，《MolecularBasisofAxonGrowthandNervePatternFormation》，H.Fujisawa编，JapanScientificSocietiesPress,215-229，1997)。它们以排斥或抑制方式对生长的神经纤维产生作用的能力是一项决定性的功能特征，该特征在其分离、克隆和表征当中起着重要的作用。可以在样品细胞分析试验系统中容易地检测该活性。RGM蛋白质在两种不同的细胞分析试验中具有抑制或排斥效应。在塌陷试验(collapseassay)中，RGM蛋白质加入到生长的神经纤维中。RGM与RGM受体的结合诱导一个由神经元生长锥的所有膜元件参与的强力反应。由此，最初延伸的手样生长锥转变成细线。在RGM存在下，神经纤维持继受到抑制、极大回缩并且不再能够继续生长。RGM蛋白质通过结合至RGM受体再生蛋白(Neogenin)发挥其部分作用(RajagopalanS.等，NatCellBiol.6,pp.756-62，2004)。再生蛋白与DCC(在结直肠癌中缺失(这eletedin￡olorectalgancer))受体密切相关。两个受体均M疫球蛋白超家族的成员并且具有细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。两个受体均被描述为另一配体导蛋白-1的受体，但是只有再生蛋白，而不是DCC结合RGM蛋白质。这些受体的细胞外结构域由四个免疫球蛋白样结构域组成，其后是6个纤连蛋白重复结构域。RGMA在神经系统中的功能了解最深，并且特别值得注意的是其在非常低的浓度时具有抑制神经纤维生长的作用。在成年人类和在成年大鼠中，中枢神经系统的损伤导致RGM蛋白质在损害部位积累(SchwabJ.M.等，Arch.Neurol.待版，2005;SchwabJ.M.等，Eur.J.Neurosci.21:p.387-98,2005)。由此，损伤的神经纤维的重新向外生长(outgrowth)被阻止，并且发生持久的或多或少严重的功能缺陷(这取决于损害的部位的位置)。RGM的这种对神经纤维生长的抑制活性通过结合至再生蛋白受体而介导(RajagopalanS.等，见上引文)。然而，同一受体通过结合导蛋白-1也介导刺激神经纤维生长的相反效应。最新的结果表明，RGM蛋白质还在中枢和周围神经系统中、在调节铁代谢方面、在肿瘤病中、在炎性过程中以及在骨和软骨组织的形成中起着重要的作用。基于RGMA、B和C以高亲和力结合再生蛋白受体的观察，本发明的一个目的是详细表征这些分子、特别是RGMA的功能性结合结构域。这将使得可以产生抗该结构域的抗体和抗从该结构域衍生的活性RGM肽的抗体，其中所述的抗体高度可能中和RGM的抑制活性，并且由此可能刺激神经纤维的再生或重新向外生长。此外，结合结构域或从其衍生的活性RGM肽本身可以作为治疗有效剂而提供。发明简述通过分离和表征人RGM蛋白质、特别是RGMA的结合结构域及其活性多肽片段，令人惊讶地实现了上述目的。附图简述图1显示人RGMA(GenBank#NP—064596.1)RGMB(GenBank#NP—001012779)和RGMC(GenBank#NP—998818.1)的序列比对。图2以图表形式显示RGM分子的结构。在N-末端信号肽和C-末端GPI锚之间显示了RGD序列、vonWillebrand因子结构域(vWFD)和锚区域之前的C末端区域内的疏7jC序列。根据本发明的目的结合结构域区推测位于vWFD和疏水区之间。表下显示人RGMA中的相应氨基酸位置，蛋白水解切割位点位于M酸168和169之间。图3A通过焚光显微照片显示不同RGMA肽片段对大鼠神经元细胞的神经纤维生长的影响。虽然肽l在10ng/ml的浓度时具有抑制活性，但是相同浓度的肽4是无活性的。显示了相应的与緩冲液或PBS的对照混合物，用于比较。图3B显示所测量的轴突生长指数(轴突所覆盖的面积相对于细胞聚集物大小的度量；显示了平均值和标准差)的柱形图，以说明本发明的RGMA肽1的轴突生长抑制活性的浓度依赖性。对于RGMA肽4的相应的柱形图示于图3C。图4A显示人神经元NTera细胞的荧光显微照片，以说明RGMA肽1和肽4(每一个的浓度为30照/ml)对这些细胞的神经纤维生长的影响。与所示的对照图像(与PBS而不是肽孵育)相比，说明只有肽1对神经纤维生长具有抑制性作用。图4B显示对于用肽1、肽4和对照(PBS)进行的实验系列相应测量到的轴突生长指数(上图各单独的测量值和平均值，下图带有平均值和标准差的柱形图)。图5A显示在NTera神经纤维生长分析试验中对RGMA片段的分析结果。RGMA片段2(218-284)和6(168-422)均以90nM的浓度加入到Ntera神经元中。两个片段均强烈地抑制Ntera神经元的神经纤维生长。***=相对于PBS对照具有p<0.001的显著性。图5B显示在Ntera神经纤维生长分析试验中对RGMA片段的分析结果的焚光显微照片。吸取所示浓度的RGMA片段2(218-284)、3(266-335)、4(316-386)和6(168-422)加入到Ntera神经元中。对轴突生长具有活性的、有意义的抑制作用的片段是2，3和6，但是片段4无活性。图5C显示在Ntera神经纤维生长分析试验中对RGMA片段的其它分析结果。RGMA片段3(286-335)和6(168-422)以6pg/ml的浓度加入到Ntera神经元中。该两个片段强烈地抑制Ntera神经元的神经纤维生长。**=相对于緩冲液对照具有p<0.01的显著性，***=相对于緩冲液对照具有p<0.001的显著性。图6A显示在Ntera神经纤维生长分析试验中对RGMA肽1及与其部分重叠的两个肽(Down-l和Up-1)的分析结果。肽以10照/ml或30將/ml的浓度加入到Ntera聚集物中。24-36小时后，将培养物固定、染色并分析。全部3种RGMA肽在30照/ml的浓度时具有活性，并且非常显著地抑制神经纤维生长。图6B显示在Ntera神经纤维生长分析试验中对三种另外的RGMA肽的分析结果。RGMA肽以10將/ml或30jug/ml的浓度加入到Ntera聚集物中。24-36小时后，将培养物固定、染色并分析。全部3种RGMA肽(5-Ak，6-Ak，7-Ak)在10fig/ml的浓度时无活性；只有肽7-Ak和6-Ak在较高的浓度时在抑制神经纤维生长方面显出明显倾向。图7A显示RGMA-再生蛋白结合分析试验的结果。在该分析试验中，抗肽Dowii-l的多克隆抗体是非常有效的，并且甚至在最低的浓度(Down18641和Down18640)也阻断了RGMA配体与其受体再生蛋白的相互作用。对照抗体(兔对照)无作用，而从R&DSystems商业得到的多克隆抗体(PAB抗RGM抗体)同样阻断了RGMA-再生蛋白的相互作用，但是具有实质性较差的效果。图7B显示在Ntera神经纤维生长分析试验中，Down-1特异性多克隆抗体如何中和有效的RGMA片段2的抑制性活性。在此向外生长分析试验中，用PBS、或片段2(2將/ml)或同时用片段2(2ing/ml)及多克隆抗体Down-l(0.6jug/ml)处理Ntera培养物。发明详述I一般术语的解释"受体"在本发明上下文中特别是指与细胞膜结合的表面分子，该表面分子能够与例如可溶性配体相互作用，并且作为该相互作用的结果可以诱导定向于例如细胞内部的信号或者信号级联反应(也称作发信号)。"配体，，指"受体"的天然(即体内形成)或人工产生的低或高分子量的结合配偶体。配体优选地能够在细胞外环境中自由移动。"免疫原"指适于诱导形成抗该免疫原的抗体的、糖基化或非糖基化形式的本发明肽片段。适当时，免疫原(作为半抗原)与大分子载体的结合可能是有利的。"表位"或抗原决定簇指决定抗原例如蛋白质的抗体特异性的区域。如果该表位是例如通过外部影响如蛋白质与配体的相互作用而新近在蛋白质区段中形成的或者在可接近的分子表面呈现的，则所用的术语是"新表位(neoepitope)，，。蛋白质或抗体的"结构域，，指通过a-螺旋和/或p-片层元件形成的并且在蛋白质内被划分出来的复杂结构。除非另外指出，术语"本发明的RGM蛋白质"包括RGM分子家族成员，特别是RGMA、B和C的再生蛋白结合结构域及从其衍生的多肽。还尤其包括"具有抑制性活性"的功能性多肽。"抑制性，，多肽或"具有抑制性活性，，的多肽是在本文所述的神经细胞生长分析试验中降低或者完全抑制神经细胞生长的那些多肽。除非另外指出，"RGM"代表RGMA、B和C，特别是RGMA。"再生蛋白"或"再生蛋白受体，，是同义的术语。II.本发明的具体方面本发明的第一方面涉及优选来源于哺乳动物如人、大鼠或小鼠或家禽如鸡的、糖1^化或者尤其是非糖基化形式的、排斥性引导分子(RGM)的受体结合结构域、特别是再生蛋白受体结合结构域。一个优选的实施方案涉及衍生自如SEQIDNO:2所示人RGMA、如SEQIDNO:4所示人RGMB或者如SEQIDNO:6所示人RGMC的再生蛋白受体结合结构域。关于这一点，结合结构域尤其包含RGM的M酸序列区域，特别是RGM如RGMA的相对于RGD切割位点的C端和相对于GPI锚区域的N端的区域，的至多150，例如至多125、至多100、至多80、至多30或至多20、例如10-20、例如ll、12、13、14、15、16、17、18或19个连续氨基酸残基长度的M酸序列。本发明特别涉及通过下列如SEQIDNO:7所示的部分序列所表征的那些再生蛋白受体结合结构域GXAVEX^AXsYIGTTXAXgRQ其中X,至Xs是任何氨基酸残基。其中，特别地Xi是Gln、His或Asn;X2是His或Tyr;X3是Ile或Met;X4是Gln或His;X5是Lys、Arg或Ala;X6是Ile或Val;X7是Val、Phe或Ile;以及Xs是Val或Ile。可以提到的具体实例是GQHVEIQAKYIGTTIWRQ(SEQIDNO:8)GHYVEMHARYIGTTVFVRQ(SEQIDNO:9)GNHVEIQAAYIGTTIIIRQ(SEQIDNO:10)再生蛋白受体结合结构域的实例包括衍生自如SEQIDNO:2所示氨基酸位置200-350的#^酸序列、衍生自如SEQIDNO:4所示M酸位置200-330的氨基酸序列或者衍生自如SEQIDNO:6所示氨基酸位置180-350的M^列，或者它们的功能性再生蛋白受体结合片段。此类结构域或片段特别包括如SEQIDNO:2所示的^J^酸位置200-325、200-300、200-285、250-285或260-285或260-280或者片段215-340、260-340、250-300、260-291、210-260或290-350;或者可以自SEQIDNO:2与SEQIDNO:4和6的序列比对(参见附图1)得到的、对应于上面所详述的SEQIDNO:2位置的、SEQIDNO:4和6的序列片段；和如SEQIDNO:4所示的^J^酸位置200-300、280-340、240-300、260-300或240-280，或如SEQIDNO:6所示的^J^酸位置200-350、200-320、220-310、250-290或260-280。适合本发明的结合结构域的其它具体实例是衍生自RGMA的KITEKVSGQHVEIQAKYIGTTIWRQVGRYLT(SEQIDNO:23);衍生自RGMB的RIVERESGHYVEMHARYIGTTVFVRQVGRYLT(SEQIDNO:24);衍生自RGMC的SIQTANPGNHVEIQAAYIGTTIIIRQTAGQLS(SEQIDNO:25);衍生自RGMA的KITEKVSGQHVEIQAK(SEQIDNO:26);衍生自RGMA的YIGTTIWRQVGRYLT(SEQIDNO:27);衍生自RGMA的WNAVEDWDSQGLYLC(SEQIDNO:28);衍生自RGMA的TIIFKNFQECVDQKVYQA(SEQIDNO:29);衍生自RGMB的RIVERESGHYVEMHAR(SEQIDNO:31);衍生自RGMB的YIGTTVFVRQVGRYLT(SEQIDNO:32);衍生自RGMC的SIQTANPGNHVEIQAA(SEQIDNO:33);和衍生自RGMC的YIGTTIIIRQTAGQLS(SEQIDNO:34)。再生蛋白受体结合结构域或其结合片段的其它实例包括衍生自上述肽之一的、或者衍生自如SEQIDNO:2所示位置260-291或267-285的序列区域、衍生自如SEQIDNO:4所示位置260-325的序列区域或者衍生自如SEQIDNO:6所示位置250-300的序列区域的、至少10、例如10-30、10-25、10-20或10-15、例如尤其是IO、11、12、13、14或15个连续氨基酸残基。本发明的另一方面涉及如上所定义的再生蛋白受体结合结构域的抗原多肽片段。本发明尤其涉及可以用于产生免疫球蛋白分子并且调节、尤其是部分地或完全地拮抗RGM与再生蛋白受体结合的那些抗原多肽片段。可以提及例如包括如SEQIDNO:7、8、9、10、23-29或31-34所示肽的至少10、例如10-30、10-25、10-20或10-15、例如尤其是10、11、12、13、14或15个连续M酸残基的那些抗原多肽片段。本发明的再一方面涉及如上面所定义的再生蛋白受体结合结构域或者如上面所定义的多肽片段用于产生抗RGM的多克隆抗血清或者单克隆抗体的用途，其中抗血清或者抗体调节、优选部分地或完全地拮抗特别是RGM与再生蛋白受体的结合。本发明还涉及用于诊断或治疗的如上所定义的抗RGM的多克隆抗血清或单克隆抗体。本发明还涉及本发明的多克隆抗血清或单克隆抗体的用途，所述用途为产生用于诊断或治疗由再生蛋白受体与RGM或RGM片段相互作用介导的疾病或疾病状态的药物组合物。这些疾病或疾病状态尤其选自a)头骨、脑和脊髓的机械损伤，b)慢性病如神经变性病、炎性疾病和自身免疫病，c)神经元再生、轴突芽生、轴突延伸和神经元可塑性的损害，d)肿瘤病和肿瘤转移。本发明还涉及如上面所定义的再生蛋白受体结合结构域或者如上面所定义的多肽片段用于产生组合物的用途，所述组合物用于诊断或治疗由受损的RGM或RGM片段与相关受体(例如再生蛋白受体)的相互作用介导的疾病或疾病状态。这些疾病或疾病状态特别选自a)由过度神经元芽生和/或病理性突触发生所导致的、精神病和慢性疼痛相关的、改变的轴突发生过程，b)与受损的铁代谢、特别是年轻型血色素沉着症(juvenilehemochromatosis)相关的病症，c)与受损的骨生长相关的病症，d)与退行性软骨改变相关的病症，e)与推间盘和推骨损伤相关的病症，f)与失调的、不受控制的细胞迁移过程相关的病症。本发明的再一方面涉及如上面所定义的再生蛋白受体结合结构域或者如上面所定义的多肽片段作为靶标在检测或鉴定RGM结合性配体中的用途。本发明的另一方面涉及如上所定义的再生蛋白受体结合结构域或者如上所定义的多肽片段作为免疫原在主动或净皮动免疫中的用途。本发明还涉及可以通过用抗原量的如上所定义的再生蛋白受体结合结构域或者如上所定义的多肽片段免疫哺乳动物而得到的多克隆抗血清；和抗如上所定义的再生蛋白受体结合结构域或者抗如上所定义的多肽片段的单克隆抗体，或者其抗原结合片段，适当时可以为人源化的形式。本发明还涉及药物组合物，其包含在可药用载体中的至少一种选自下列的活性成分a)如上所定义的再生蛋白受体结合结构域或者如上所定义的多肽片段，b)如上所定义的单克隆或多克隆抗体。该类型的药物組合物特别可用于鞘内、静脉内、皮下、口服或肠胃夕卜、经鼻和吸入施用。本发明还涉M达载体，其包含与至少一个调节核酸序列有效连接的(operativelylinked)至少一个编码如上所定义的再生蛋白受体结合结构域或者如上所定义的多肽片段的编码核酸序列。本发明还涉及-包含至少一个如上所定义的载体的重组微生物。-产生如上所定义的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。-产生如上所定义的再生蛋白受体结合结构域或者如上所定义的多肽片段的方法，其中培养如上所定义的重组微生物，并且从培养物中分离所产生的蛋白质产物。在本发明中，培养如上所定义的杂交瘤细胞系，并且从培养物中分离所产生的蛋白质产物。III.用于实施本发明的其它信息1.多肽本发明特别涉及RGM家族的蛋白质的结合结构域以及衍生自这些结构域的肽片段。虽然本发明具体研究了RGMA及其结合结构域以及从其衍生的片段，但本发明还涉及同源蛋白质，例如特别是RGM家族的同源成员，例如特别是RGMB和RGMC的相应结构域和片段。所具体/>开的RGM结构域或多肽的"功能等效物"或类似物在本发明中指这样的多肽，所述多肽与本发明的多肽不同，例如与如SEQIDNO:2、4或6所示蛋白质的再生蛋白结合结构域的同源性程度小于100%但仍具有期望的生物学活性。特别地，它们应该能够结合再生蛋白受体和/或在本文所述的神经纤维生长分析试验中显示出抑制作用，并且还统计学显著性地&<=0.05)部分地或完全地抑制神经纤维生长。根据本发明，"功能等效物"尤其指这样的突变体，其在上述具体序列的至少一个序列位置上具有与该具体提到的序列不同的氨基酸，然而却具有本文所提到的生物学活性之一。因此，"功能等效物，，包括可以通过一个或多个氨基酸添加、替换、缺失和/或倒位得到的突变体，其中可以在任何序列位置出现所迷改变，只要它们导致产生具有本发明性质谱的突变体即可。尤其是，当突变体和未改变的多肽在反应方式上性质一致，即例如观在功能等效性。氨基酸残基的适宜替换实例如下原始残基替换实例AlaSerArgLysAsnGin;HisAspGluCysSerGinAsnGluAspGlyProHisAsn;GinlieLeu;ValLeulie;ValLysArg;Gin;MetLeu;liePheMet;Leu;SerThrThrSerTrpTyrTyrTrp;PheValHe;Leu在上述含义中，"功能等效物"还可以是所述多肽的前体、和多肽的功能衍生物和盐。术语"盐"意思是指本发明蛋白质分子的氛基的盐和氨基的酸加成盐两者。氛基盐可以以本身已知的方式制备，并且包括无机盐，例如钠盐、钙盐、铵盐、铁盐和锌盐，以及与有机碱如胺如三乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、哌咬等形成的盐。酸加成盐，如与无机酸如盐酸或硫酸形成的盐和与有机酸如乙酸和草酸形成的盐，同样也是本发明的一个方面。本发明多肽的"功能衍生物"还可以借助于已知技术在氨基酸侧链官能基团上或者在多肽的N-末端或者C-末端上制备。这些类型的衍生物包括例如羧酸基团的脂族酯、羧酸基团的酰胺(可以通过与氨或伯胺或仲胺反应得到)；通过与酰基基团反应制备的游离M基团的N-酰基衍生物；或者通过与酰基基团反应制备的游离羟基基团的O-酰基衍生物。当然，"功能等效物，，也包括可以从其它生物得到的多肽和天然存在的变体。例如，可以通过序列比较发现同源序列区域的范围，并且可以基于本发明的具体需求建立等效的酶。此外，"功能等效物，，可以是融合蛋白，所述融合蛋白具有功能性N-或C-末端连接(即融合蛋白的各部分相互间的功能损害可忽略)的上述多肽序列或从其衍生的功能等效物之一以及与其功能不同的至少一个另外的异源序列。此类异源序列的非限定性实例为例如酶和免疫球蛋白。本发明包括的"功能等效物"还可以是具体公开的蛋白质和肽的同系物(homolog)。这些同系物与具体公开的序列之一具有至少40%、或至少50%、或至少60%、例如至少75%、或特别是至少85%、例如卯％、95%或99%的同源性，其中同源性是通过例如Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad，Sci.(USA)85(8)，1988，2444-2448的算法计算的。本发明同源多肽的同源性百分数尤其是指基于本文具体描述的M酸序列之一的全长的氨基酸残基的同一性百分数。根据本发明，除非另外指出，否则"衍生的"氨基酸序列指与初始序列具有至少80%或至少90%、特别是91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%和99%同一性的序列。两个序列之间的"同一性"是指在每一情况下跨越序列全长的氨基酸残基的同一性，例如通过借助于来自Informax(USA)的VectorNTISuite7.1软件，使用Clustal方法(HigginsDG，SharpPM.Fastandsensitivemultiplesequencealignmentsonamicrocomputer.ComputAppl.Biosci.1989Apr;5(2):151-1)和下列参数设置，通过比较计算的同一性多序列比对参数空位开放罚分10空位拓展罚分10空位分离罚分范围8空位分离罚分(gapseparationpenalty)关比对延迟的同一性(identityforalignmentdelay)%40残基特异性空位关亲水残基空位关转变力口权(transitionweighing)0成对序列比对^it:FAST算法开K-tuple大小1空位罚分3窗口大小5最佳对角线数5为了进一步说明本发明包括的同系物，参考下表，在下表中显示了RGMB和C与RGMA在全长蛋白质上以及在本发明特别感兴趣的某些部分序列区域上的一致性百分数。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>1)氨基酸残基，指示基于RGMA序列(SEQIDNO:2)的位置2)全长蛋白质和肽片段的M酸同一性百分数3)方法BLAST2SEQUENCESVERSIONBLASTP2.2.5[Nov-16-2002]矩阵Blosum62(空位开放11空位拓展1)在蛋白质可能存在糖基化的情况下，本发明的等效物包括去糖基化或糖基化形式的和可以通过改变糖基化模式而得到的修饰形式的上迷类型的蛋白质。本发明肽的同系物可以通过筛选突变体，如截短突变体的组合文库来鉴定。例如，可以通过在核酸水平组合诱变，例如通过将合成的寡核苷酸的混合物进行齊&连接，产生肽变体的多样性文库。存在可以从简并寡核苷^列产生潜在同系物文库的大量方法。简并基因序列的化学合成可以在自动DNA合成仪上开展，然后合成的基因可以连接进入适宜的表达栽体。一组简并基因的使用使得在一个混合物中提供编码一组目的潜在蛋白质序列的所有序列成为可能。合成简并寡核苷酸的方法是本领域技术人员已知的(例如Narang，S.A.(1983)Tetrahedron39:3;Itakura等，(1984)Annu.Rev.Biochem.53:323;Itakura等，(1984)Science198:1056;Ike等，(1983)NucleicAcidsRes.11:477)。2.核酸本发明还涉及上述RGM结合结构域和多肽的编码核酸序列，尤其是如SEQIDNO:1、3和5所示的序列，以及从其衍生的核酸序列或部分序列。本发明的所有核酸序列(单链和双链DNA和RNA序列，例如cDNA和mRNA)可以以本身已知的方式通过化学合成从核苷酸单元制备，例如通过各个重叠的、互补的双螺旋核酸单位的片段缩合来制备。寡核苷酸的化学合成可以例如以已知的方式通过亚磷酰胺方法进行(Voet，Voet，第2版，WileyPressNewYork,第896~897页)。合成的寡核普酸的加入以及使用DNA聚合酶Klenow片段进行的缺口补平和连接反应，以及一般克隆方法描述于Sambrook等，(1989)，MolecularCloning:Alaboratorymanual.ColdSpringHarborLaboratoryPress,根据本发明，除非另外指出，否则"衍生的"核酸序列意思是指与初始序列具有至少80%或至少90%、特别是91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%和99%同一性的序列。两个核酸之间的"同一性"在每一情况下均指跨越全长核酸的核苷酸同一性，特别是借助于来自Informax(USA)的VectorNTISuite7.1软件使用Clustal方法(见上)通过比较得到的同一性。本发明还涉及编码上迷肽之一的核酸序列以及可以通过例如使用人工核苷酸类似物得到的其功能等效物。本发明涉及编码本发明肽或其生物活性片段的分离的核酸分子，以及可以例如用作杂交探针或者引物用于鉴定或者扩增本发明的编码核酸的核酸片段。本发明的核酸分子还可以在基因编码区的3，和/或5'末端包含非翻译序列。"分离的"核酸分子是与存在于该核酸的天然来源中的其它核酸分子相分离的核酸分子，并且其还可以基本上不含其它细胞材料或培养基(如果通过重组技术制备的话)或不含化学前体或其它化学品(如果是化学合成的话)。本发明的核酸分子可以通过分子生物学的标准技术和本发明提供的序列信息来分离。例如cDNA可以通过使用具体公开的完全序列之一或者其片段作为杂交探针并使用标准杂交技术(如描述于Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.MolecularCloning:ALaboratoryManual.第2版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989)从适宜的cDNA文库中分离。此外，可以通过聚合^式反应使用基于本发明序列之一构建的寡核苷酸引物分离包含该序列或其片段的核酸分子。以该方式扩增的核酸可以克隆入适宜的载体中并且通过DNA序列分析表征。本发明的寡核苷酸还可以通过标准合成方法，例如使用自动DNA合成仪制备。本发明还包括与具体确描述的核苷酸序列互补的核酸分子或其片段。从本发明的核苷酸序列可以产生用于鉴定和/或克隆其它细胞类型和生物中的同源序列的探针和引物。此类探针和引物通常包含在严格杂交条件下与本发明核酸序列的有义链或相应的反义链的至少约12、优选至少约25、例如约40、50或75个连续核苷酸杂交的核苦酸序列区。本发明的其它核酸序列可以衍生自本发明的RGM结构域和肽的编码序列，并且与其不同之处在于一个或多个核苷酸的添加、替换、插入或缺失，但仍编码具有期望特性镨的肽。本发明还包括这样的核酸序列，其包含所谓的沉默突变，或者与具体提到的序列以及天然存在的变体如其剪接变体或等位基因变体相比，按照具体来源生物或者宿主生物的密码子选择进行了修饰。可以通过保守核普酸替换(即相关氨基酸被具有同样电荷、大小、极性和/或可溶性的氨基酸替换)得到的序列同样也是一个方面。本发明还涉及通过序列多态性衍生自具体公开的核酸的分子。这些遗传多态性可以因群体中个体之间的天然变异而存在。这些天然变异通常导致基因的核苷,列中产生1-5%的差异。本发明还包括与上述编码序列杂交或者与其互补的核酸序列。这些多核苷酸可以通过篩选基因组文库或者cDNA文库找到，并且适宜的话可以通过使用适宜引物及PCR从其扩增，并且随后使用例如适宜的探针分离。另一种可能性是用本发明的多核苷酸或载体转化适宜微生物，以繁殖微生物并由此扩增多核苷酸，然后分离多核苷酸。再一种可能性是还可以通过化学途径合成本发明的多核苷酸。能够"杂交"至多核苷酸上的特性是指多核苷酸或寡核苷酸在严格IHt下结合至几乎互补序列的能力，而在这些条件下不存在非互补配偶体之间的非特异性结合。为此目的，序列应该具有70-100%、特别是90-100%、例如95%、96%、97%、98%或99%的互补性。互补序列能够彼此特异性结合的特性能够用于例如Northern印迹或Southern印迹4支术或者PCR或RT-PCR的引物结合当中。为此目的，通常采用长度为30个g对或者更长的寡核苷酸。严格条件，例如在Northern印迹技术中，是指使用洗涤溶液如含0.1。/。SDS的0.1xSSC緩冲液(20xSSC:3MNaCl，0,3M柠檬酸钠，pH7.0)于50-70。C、优选60-65°C洗脱非特异性杂交的cDNA探针或寡核普酸。在该情况下，如上面所提到，只有高度互补的核酸仍然彼此结合。严格条件的建立是本领域技术人员已知的，并且描述于例如Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。本发明的再一方面涉及反义核酸。这包含与编码有义核酸互补的核苷酸序列。反义核酸可以与全部编码链互补或者仅与其部分互补。在另一实施方案中，反义核酸分子与核苷酸序列编码链的非编码区是反义的。术语"非编码区"涉及称作5，-和3，-非翻译区的序列部分。反义寡核苷酸的长度可以是例如大约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸。本发明的反义核酸可以使用本领域已知的方法通过化学合成和^连接反应构建。反义核酸可以使用天然存在的核苷酸或者不同地修饰的核香酸化学合成，其中所述修饰的核苷酸的构型使得其可以提高分子的生物学稳定性或者提高反义和有义核酸之间所形成的双链体的物理稳定性。可以使用的实例是硫代磷酸酯衍生物和吖咬取代的核苷酸。可以用于产生反义核酸的修饰核苷酸的实例尤其是5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-珙尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫脲苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、p-D-半乳糖基辫苷、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、l-甲基肌苷、2,2-二曱基鸟嘌呤、2-甲基腺噤呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫脲嘧啶、p-D-甘露糖基辫苷、5，-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嗜咬-5-氧基乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧咬、辫苷、2-巯基胞嘧啶、5-曱基-2-疏脲嘧啶、2-硫脲嘧啶、4-硫脲嘧啶、5-甲基尿嘧啶、甲基尿嘧咬-5-氧基乙酸酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸~)、5-甲基-2-硫脲嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧咬，(acp3)w和2，6-二氨基噤呤。反义核酸还可以通过使用表达栽体以生物学方法产生，在该表达载体中核酸已经以反义方向进行亚克隆。3.表达构建体和载体本发明还涉M达构建体，所i^达构建体包含处于调节性核酸序列遗传控制下的编码本发明RGM蛋白质或功能等效物或者免疫球蛋白的核酸序列，并且还涉及包含至少一个这样的表达构建体的载体。本发明的此类构建体优选包含位于具体编码序列5，-上游的启动子和位于3，-下游的终止序列，以及适当的话其它常见调节元件(特别地，它们的每一个都与编码序列有效连接)。"有效连接，，意思是指以这样一种方式连续排列启动子、编码序列、终止子以及适当的话其它调节元件，以致于每一调节元件对于编码序列的表达都能够实现其预期功能。可以有效连接的序列的实例是靶向序列和增强子、多腺苷酸化信号等。其它调节元件包括选择标记、扩增信号、复制起点等。适宜的调节序列描述于例如Goeddel,GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicP訓，SanDiego，CA(1990)。除了人工的调节序列外，还可以在实际结构基因前面仍保留天然调节序列。这种天然调节可以根据需要通过遗传修饰来关闭，并且基因的表达可以裙:提高或者降低。然而，基因构建体也可以具有更简单的结构，也就是iJL在结构基因前面没有插入额外的调节信号，并且天然启动子及其调节作用没有缺失。作为替代，可以将天然调节序列突变以致于不再发生调节作用，并且基因表达被增强或者降低。核^列可以以一个或多个拷贝存在于基因构建体中。可以〗吏用的启动子的实例是cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、laelq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、入-PR或入-PL启动子，它们有利地用于革兰氏阴性细菌；以及革兰氏阳性细菌启动子amy和SP02,酵母启动子ADC1、MFot、AC、P-60、CYC1、GAPDH或植物启动子CaMV/35S、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、not或泛素或菜豆蛋白启动子。诱导型启动子的使用是特别优选的，例如光诱导启动子以及特别是温度诱导启动子如Pr&启动子。原则上，可以使用所有天然启动子及它们的调节序列。此外，还可以有利地使用合成性启动子。所述的调节序列旨在使核酸序列特异性表达以及蛋白质表达成为可能。这可以意味着，例如取决于宿主生物，基因仅在诱导后表达或过表达或者基因立刻表达和/或过表达。此外，调节序列或因子可以优选正向影响，并因此增加或降低表达。因此，调节元件的增强作用可以通过使用强转录信号如启动子和/或增强子在转录水平有利地发生。然而，还可以通过例如提高mRNA的稳定性增强翻译。通过将适宜的启动子与适宜的编码序列和终止信号或多腺苷酸化信号融合产生表达盒。为此目的可以使用重组和克隆的常规技术，例如描述于T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，MolecularCloning:ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor,NY(1989)以及T.J.Silhavy，M丄.Berman和L.W.Enquist，ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1984)以及Ausubel，F.M.等，CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssoc.andWileyInterscience(1987)中的常规技术。对于在适宜宿主生物中的表达，重组核酸构建体或者基因构建体可以有利地插入到宿主特异的载体中，这使得基因可以在宿主中最佳地表达。载体是本领域技术人员众所周知的，并且可以在例如"CloningVectors，，(PouwelsP，H.等编，Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985)中找到。载体不仅仅指质粒，还指技术人员已知的所有其它载体，例如噬菌体、病毒，如SV40、CMV、杆状病毒和腺病毒、转座子、IS元件、噬菌粒、粘粒以及线性或环状DNA。这些载体可在宿主生物中自主复制或随染色体复制而复制。可以提到的适宜表达载体的实例是常规融合表达栽体，如pGEX(PharmaciaBiotechInc;Smith,D.B.和Johnson,K.S.(1988)Gene67:31-40)，pMAL(NewEnglandBiolabs，Beverly,MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ),其可以分别用于将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E-结合蛋白和蛋白A与重组靶蛋白融合。非融合蛋白质表达载体，如pTrc(Amann等，(1988)Gene69:301-315)和pETlld(Studier等，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego，California(1990)60-89)。用于在酿酒酵母(S.cerevisiae)中表达的酵母表达载体，如pY印Secl(Baldari等，(1987)EmboJ.6:229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz(1982)Cell30:933-943)、pJRY88(Schultz等，(1987)Gene54:113-123)和pYES2(InvitrogenCorporation,SanDiego,CA)。适用于其它真菌如丝状真菌的载体和用于构建载体的方法包括详细描述于vandenHondel，C.A.M.J.J.&Punt，P.J.(1991)"Genetransfersystemsandvectordevelopmentforfilamentousfungi,in:AppliedMolecularGeneticsofFungi,J.F.Peberdy等编，第1-28页,CambridgeUniversityPress:Cambridge中的那些。可得到的用于在培养的昆虫细胞(例如Sf9细胞)中表达蛋白质的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等，(1983)Mol.CellBiol.3:2156-2165)和pVL系列(LucklowandSummers(1989)Virology170:31-39)。植物表达载体如详细描述于Becker,D.，Kemper,E.，Schell，J.和Masterson，R.(1992)"Newplantbinaryvectorswithselectablemarkerslocatedproximaltotheleftborder",PlantMol.Biol.20:1195-1197;以及Bevan，M.W.(1984)"BinaryAgrobacteriumvectorsforplanttransformation",Nucl.AcidsRes.12:8711-8721中的那些。哺乳动物表达栽体如pCDM8(Seed，B.(1987)Nature329:840)和pMT2PC(Kaufman等，(1987)EMBOJ.6:187-195)。用于原核细胞和真核细胞的其它适宜表达系统描述于Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecularcloning:ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989中的第16和17章。4.重组宿主生物:本发明的载体可以用于产生重组生物，所述的重组生物用例如至少一种本发明的载体转化并且可以用来产生本发明的结构域或多肽。可以将上述的本发明重组构建体有利地导入适宜的宿主系统并在其中表达。技术人员熟悉的克隆和转染方法，例如共沉淀、原生质体融合、电穿孔、逆转录病毒转染等优选用于使所述核酸在特定表达系统中表达。适宜的系统描述于例如CurrentProtocolsinMolecularBiology,F.Ausubel等编，WileyInterscience,NewYork1997，或Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989。适宜的宿主生物原则上是能够表达本发明核酸、它们的等位基因变体、它们的功能等效物或者衍生物的所有生物。宿主生物指例如细菌、真菌、酵母、植物或动物细胞。优选的生物是细菌，如埃希氏菌属(Escherichia)如大肠杆菌(Escherichiacoli)、链霉菌属(Streptomyces)、芽孢杆菌属(Bacillus)或假单胞菌属(Pseudomonas)的那些细菌，真核微生物如酿酒酵母、曲霉菌属(AspergiHus)、来源于动物或植物的高等真核细胞，如Sf9、CHO或HEK293细胞。成功转化的生物可以通过同样存在于载体或表达盒中的标记基因来选择。此类标记基因的实例是赋予抗生素抗性的基因和赋予酶活性的基因，该酶催化形成颜色的反应，从而导致所转化的细胞被染色。然后，这些细胞可以通过自动化细胞分选被选择出来。已经成功地用载体转化并且含有适当抗生素(例如G418或者潮霉素)抗性基因的^t生物可以通过适当的包含抗生素的培养基或营养培养基来选择。存在于细胞表面的标记蛋白质可以通过亲和层析的方法用于选择。如果希望的话，基因产物还可以在转基因生物中表达，如转基因动物如特别是小鼠、绵羊或转基因植物。本发明还涉及用于重组产生本发明RGM结构域或多肽或其功能性生物活性片段的方法，其中培养产生肽的重组宿主生物，根据需要诱导多肽的表达并且从培养物中分离多肽。如果希望的话，肽也可以以该方式以工业规^莫生产。重组宿主可以通过已知方法培养和发酵。细菌可以生长于例如TB或LB培养基中和20-40°C的温度以及6-9的pH下。适宜培养条件的细节描述于例如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1989)。如果多肽不分泌i^培养基中，则将细胞破碎并且通过已知的蛋白质分离方法从裂解物中得到产物。备选地，细胞可以通过下列方法破碎通过高频超声、通过高压如在弗氏细胞压碎器中、通过渗透裂解、通过去污剂作用、通过溶菌酶或有机溶剂、通过匀浆器或者通过多种所提到的方法的组合。肽可以通过已知层析方法如分子筛层析(凝胶过滤)，如Q-Sepharose层析、离子交换层析和疏水层析以及通过其它常用方法如超滤、结晶、盐析、透析和非变性凝胶电泳纯化。适宜的方法描述于例如Cooper,T.G.，BiochemischeArbeitsmethoden,VerlagWalterdeGruyter，Berlin,NewYork或Scopes,R.，ProteinPurification,SpringerVerlag，NewYork,Heidelberg,Berlin中。对于重组肽的分离而言，有利的是使用载体系统或者寡核苷酸通过特定核苷酸序列延长cDNA并且由此编码可以用于例如使纯化更简单的修饰多肽或融合蛋白。适宜的该类型修饰是例如充当锚的所谓的标签，例如称作六组氨酸锚的修饰，或者可以被抗体作为抗原识别的表位(描述于例如Harlow,E.和Lane,D.，1988，Antibodies:ALaboratoryManual.ColdSpringHarbor(N.Y.)Press)。这些锚可用于使肽附着于固相支持物，例如聚合物基质(其可以例如填装在层析柱中或者可以用在微量滴定板或者另一支持物上)。这些锚还可以同时用于肽的识别。对于肽的识别，也可以使用常规标记例如焚光染料、与底物反应后形成可检测反应产物的酶标记、或者放射性标记，所述标记可以单独或者与锚联合用于肽的衍生化。5.免疫球蛋白5.1定义本发明涉及特异性结合本发明RGM蛋白质或其衍生物/等效物的单克隆或多克隆抗体，即对本发明RGM蛋白质或其衍生物/等效物具有特异性的抗体。本发明还涉及这些抗体的部分，特别是其抗原结合部分，即可以结合本发明RGM蛋白质或其衍生物/等效物的抗体片段。优选选择对于特异性结合本发明的RGM蛋白质或其衍生物/等效物而言具有特定的结合动力学(例如高亲和性、几乎不解离、低解离速率(koff)、强中和活性)的本发明抗体。因此，可以提供对于本发明RGM蛋白质或其衍生物/等效物的亲和力为KD=l(r6-l(r12M的抗体。根据另一个方面，可以如此选择本发明的抗体，以致于它们以0.1s"或更小的koff速率常数结合RGM蛋白质或其衍生物/等效物。抗体优选是分离的抗体。根据另一个方面，抗体是中和抗体。本发明的抗体尤其包括单克隆抗体和重組抗体。本发明的抗体可以包含完全从单一物种得到的M酸序列，并且因此可以是人抗体或小鼠抗体。根据其它的实施方案，抗体可以是嵌合抗体或者CDR嫁接抗体或者另一个类型的人源化抗体。术语"抗体"旨在指由4个多肽链，即两个重链(H)和两个轻链(L)形成的免疫球蛋白分子。这些链通常通过二硫键连接在一起。每一个重链由重链可变区(在本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由CH1、CH2和CH3三个结构域组成。每一个轻链由轻链可变区(在本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由CL结构域组成。VH和VL区可以进一步划分出称作互补决定区(CDR)的高变区，高变区之间散置称作构架区(FR)的更为保守的区域。每一个VH和VL区由三个CDR和四个FR形成，它们从N端至C端以下列顺序排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。术语抗体的"抗原结合部分"(或简称做"抗体部分")指对本发明的RGM蛋白质或其衍生物/等效物具有特异性的抗体的一个或多个片段，其中所述片段仍然具有特异性结合RGM蛋白质或其衍生物/等效物的能力。已经证实，抗体的抗原结合功能可以由完整抗体的片段实现。在术语抗体的"抗原结合部分"的含义之中的结合片段的实例包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab，)2片段，即由在铰链区通过二硫键连接在一起的两个Fab片段组成的双价片段；(iii)Fd片段，其由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，其由抗体单臂的VL和VH结构域组成；(v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature341:544-546)，其由VH结构域、或VH、CH1、CH2、DH3、或VH、CH2、CH3组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。虽然Fv片段的两个结构域，即VL和VH由分开的不同基因编码，但是它们可以通过重组方法由一个合成的接头连接在一起，由此它们可以作为一个单一蛋白质链产生，其中VL和VH区一起存在以便形成单价分子(称作单链Fv(ScFv)，见例如Bird等，(1988)Science^:423画426;和Huston等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA^:5879-5883)。此类单链抗体也旨在包括在术语抗体的"抗原结合部分"之内。其它类型的单链抗体如双抗体(diabody)同样也属于该术语范围之内。双抗体是双价、双特异性抗体，其中VH和VL结构域表达在单一多肽链上，但是该抗体使用的接头对于共存于同一条链上的两个结构域而言太短以致于迫使这些结构域与另一条链上的互补结构域配对并形成两个抗原结合位点(见例如Holliger，P.等,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA2^:6444-6448;Poljak，R.J.等，(1994)Structure1:1121-1123)。对于抗体或者其抗原结合部分的另一种可能性是作为较大的免疫粘附分子的一部分，所迷分子通过抗体或抗体部分与一个或多个另外的蛋白质或肽的共价或非共价结合形成。此类免疫粘附分子可以涉及使用链霉亲和素核心区，以便产生四聚体scFv分子(Kipriyanov，S.M.等，(1995)HumanAntibodiesandHybridomas6:93-101)，以及涉及使用半胱氨酸残基、标记肽和C-末端多组氨酸标签，以便产生二价和生物素化的scFv分子(Kipriyanov，S.M.等，(1994)Mol.Immunol.^1:1047-1058)。抗体部分，如Fab和F(ab，)2片段可以通过常规技术，如用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化从完整抗体中产生。还可以通过使用标准重组DNA技术得到抗体、抗体部分和免疫粘附分子。"对本发明的RGM蛋白质或其衍生物/等效物具有特异性的分离的抗体"描述这样的抗体，其对本发明的RGM蛋白质或其衍生物/等效物具有特异性并且基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体。术语"中和抗体"描述这样的抗体，其与特定抗原的结合导致该抗原生物学活性的抑制。抗原生物学活性的这种抑制可以通过使用适宜的体外或体内分析法测量抗原生物学活性的一个或多个指标来评定。术语"单克隆抗体"描述源自杂交瘤的抗体(例如，由通过杂交瘤技术如K6hler和Milstein的标准杂交瘤方法所产生的杂交瘤分泌的抗体)。来源于杂交瘤并对本发明RGM蛋白质或其衍生物/等效物具有特异性的抗体因此被称作单克隆抗体。术语"重组抗体"描述通过重组方法生产、表达、产生或分离的抗体，如通过使用转染进入宿主细胞的重组表达威体而表达的抗体；从重组组合抗体文库分离的抗体；从具有人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小鼠)分离的抗体(见例如Taylor,L.D.等，(1992)Nucl.AcidsRes.20:6287-6295);或者通过涉及特定免疫球蛋白基因序列(例如人免疫球蛋白基因序列)与其它DNA序列相组合的任何其它方式生产、表达、产生或分离的抗体。重組抗体包括例如嵌合抗体、CDR嫁接抗体和人源化抗体。术语"人抗体"描述这样的抗体，其可变区和恒定区对应于人种系的免疫球蛋白序列，如Kabat等，(见Kabat等，(1991)SequencesofProteinofImmunologicalInterest,第5版，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242)所描述的序列，或者是从该序列衍生的。然而，本发明的人抗体可以包含不是由人种系免疫球蛋白序列所编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异诱变或者通过体内的体细胞突变引入的突变)，例如在CDR中并且尤其在CDR3中。本发明的重组(见Kabat，E.A.等，(1991)SequencesofProteinofImmunologicalInterest,第5版，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242)。然而根据特定的实施方案，可以对此类重组人抗体进行体外诱变(或者，如果使用含有人Ig序列的转基因动物的话，进行体内体细胞诱变)，以致于重组抗体VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，即虽然它们与人种系的VH和VL序列相关或者从其衍生而来，但是它们不天然存在于体内的人抗体种系语中。根据特定的实施方案，此类重组抗体是选##变或者回复突变或者两者的结果。术语"回复突变"指这样的方法，其中人抗体中的一些或全部体细胞突变的M酸被同源种系抗体序列的相应种系残基代替。本发明人抗体的重链和轻链序列分别与VBASE数据库中的种系序列比较，以便鉴定出具有最大同源性的序列。本发明人抗体中的偏离通过在编码此异常氨基酸的确定核苷酸位置进行的突变而恢复至种系序列。研究以该方式鉴定为回复突变的候选者的每一氨基酸对于抗原结合的直接或间接的重要性，并且在最终的人抗体中不包含突变后损害人抗体的期望特性的氨基酸。为了使回复突变的^J^酸数量最小化，可以不改变如下lt^酸位置，所述位置虽然偏离了最接近的种系序列，但是与第二种系序列的相应M^列是相同的，条件是第二种系序列与本发明的人抗体序列在所述氨基酸两侧有至少10个并且优选12个M酸相同并线性对应。回复突变可以在抗体优化的任何阶段进行。术语"嵌合抗体"包含其中分子的不同部分衍生自不同物种的抗体。因此，嵌合抗体是(但不限于)例如包含来自一个物种的重链和轻链可变区序列，但是其中VH和/或VL的一个或多个CDR区序列被另一物种的CDR序列替换的抗体。在此类抗体中可变区可以具有小鼠重链和轻链，其中一个或多个小鼠CDR(例如CDR3)净ilACDR序列替换。术语"人源化抗体"描述这样的抗体，其包含来自非人物种(例如小鼠、大鼠、兔、鸡、骆驼、山羊)的重链和轻链可变区序列，但是其中VH和/或VL序列的至少一部分已经被修饰以便"更像人"，即像人种系的可变区序列。一种类型的人源化抗体是CDR嫁接抗体，其中人CDR序列被插入到非人VH和VL序列中以便于替换相应的非人CDR序列。用于测定抗体结合动力学的一种方法基于所谓的表面等离振子共振。术语"表面等离振子共振，，指一种光学现象，利用这种现象可以通过使用生物传感器基质，例如4吏用BIAcore系统(PharmaciaBiosensorAB,Uppsala,SwedenandPiscataway，NJ)检测蛋白质浓度的改变来分析生物特异性相互作用。对于进一步的描述见J6nsson，U.等，(1993)Ann.Biol.Clin,a:19画26;JRinsson，U.等，(1991)Biotechniques11:620-627;Johnsson，B.等，(1995)J.Mol.Recognit.&125-131;和Johnnson，B.等，(1991)Anal.Biochem,198:268-277。术语"K。ff"描述抗体从抗体/抗原复合物上解离下来的解离速率常数。术语"Kd，，描述特定抗体-抗原相互作用的解离常数。本发明抗体的结合亲和力可以通过使用标准体外免疫分析法，如ELISA或BIAcore分才斤评定。5.2免疫球蛋白的产生5.2.1多克隆抗体的产生本发明涉及抗本发明RGM结构域和多肽的多克隆抗体以及其生产。为此目的，宿主用至少一种本发明的RGM蛋白质或其衍生物/等效物免疫；并且得到因免疫应答而形成的宿主的含抗体血清。如果所使用的RGM多肽仅具有弱的免疫原性或者没有免疫原性，则它们的免疫原性可以通过将其偶联至载体，优选载体蛋白质如如匙孔血蓝蛋白(KLH)、美洲鲎(Limuluspolyphenus)血蓝蛋白(LPH)、牛血清白蛋白(BSA)或卵白蛋白(OVA)而增加。多种偶联可能方案对技术人员而言是可以得到的，并且是通常已知的。一种方便的可能方案是例如与戊二醛反应，例如通过将RGM蛋白质与水或者水溶剂中的适宜肽或肽混合物孵育。该反应可以在环境温度，通常指室温下方便地开展。然而，冷却或温和加热也可能是有利的。反应通常在数小时内产生期望结果，并且反应时间例如2小时处于正常的范围。戊二醛浓度通常在ppm至％范围内，有利的是从10ppm至1。/0，优选地从100ppm至0.5。/。。反应参数的优化在技术人员的能力范围内。组合物除了包含抗原外，通常还包含赋形剂，特别是正常用于免疫的佐剂，例如弗氏佐剂。尤其是，完全弗氏佐剂用于第一次免疫，而所有的进一步的免疫用不完全弗氏佐剂开展。免疫鸡尾酒式混合物通过向赋形剂中加入抗原(免疫原)，优选地以上述组分混合物的形式，产生。在该情况下，抗原通常被乳化。适宜的宿主特别是啮齿类或兔。这些宿主或其它适宜宿主用免疫鸡尾酒式混合物优选以皮下方式注射。抗体效价可以使用免疫分析法确定，例如使用抗宿主IgG的绵羊抗血清和标记的RGM蛋白质的竟争性免疫分析法。由此可以在免疫结束时决定特定的宿主是否适用于得到抗体。如果开展4次免疫，可以在第3次免疫后确定抗体效价，然后可以从显示具有足够抗体效价的动物得到抗体。优选地在几周或数月内从宿主采^Ufii液，以便得到所形成的抗体。最终可以对宿主进行放血。包含目的抗体的血清可以以本身已知的方式从以该方式得到的血液中得到。以该方式得到的全血清可以根据需要以技术人员已知的方式进一步纯化，以便浓缩其中存在的抗体级分，特别是识别RGM蛋白质的抗体。在该方法的一个特定实施方案中，选择血清中的至少一种特异性识别作为免疫原使用的RGM蛋白质或其衍生物/等效物的抗体。关于这一点，特异性是指抗体对免疫原的结合亲和力高于对其它蛋白质、特别是免疫原性相关蛋白质的结合亲和力。5.2.2单克隆抗体的产生根据本发明有用的免疫球蛋白可以使用本身已知的方法得到。因此，可以利用杂交瘤技术产生针对目的抗原的单特异性抗体。此外，已经M了重组抗体技术，如体外抗体文库篩选，并且这些技术同样可以用于产生此类特异性抗体。因此，例如动物可以用目的抗原免疫。该体内方法可以进一步包括从动物的淋巴细胞或脾细胞建立一系列杂交瘤并且选择分泌特异性结合抗原的抗体的杂交瘤。待免疫的动物可以是例如小鼠、大鼠、兔、鸡、骆驼或绵羊或者上述动物之一的转基因动物，例如带有人免疫球蛋白基因的转基因小鼠，该小鼠在用抗原刺激后会产生人抗体。可以免疫的其它类型动物包括已经用人外周血单核细胞(嵌合hu-PBMC-SCID小鼠)或用淋巴细胞或其前体重构的重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠，以及已经接受过致死性全身辐射处理、随后用来自重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠的骨髓细胞进行防辐射损害的保护处理并且随后移植了功能性人淋巴细胞的小鼠(所谓的trimera系统)。可免疫的另一种类型的动物是在其基因组中编码目的抗原的内源基因已经被关闭("敲除")，如通过同源重组关闭的动物(例如小鼠)，该动物在用该抗原免疫后识别作为外来物的该抗原。技术人员知道，通过这些方法产生的多克隆抗体或单克隆抗体可通过已知的筛选方法来表征及选择，所述方法包括ELISA技术，但不限于此。才艮据另一实施方案，使用抗原筛选重组抗体文库。重组抗体文库可以在例如噬菌体表面或者酵母细胞表面或者细菌细胞表面上表达。重组抗体文库可以是例如scFv文库或Fab文库。在另一实施方案中，抗体文库可以作为RNA-蛋白质融合物表达。产生本发明抗体的另一种方法包括体内和体外方法的组合。例如，通过用抗原体内免疫动物使抗原作用于抗体镨(antibodyrepertoire)，随后使用抗原体外筛选由动物淋巴样细胞产生的重组抗体文库或单结构域抗体文库(例如带有重链和/或轻链)。根据另一种方法，通过用抗原体内免疫动物使抗原作用于抗体谱，然后将从动物淋巴样细胞产生的重组抗体文库或单结构域文库进行亲和力成熟。根据另一种方法，通过用抗原体内免疫动物使抗原作用于抗体i普，然后选择分泌目的抗体的抗体生产单细胞，并且从所选择的这些细胞中得到重链和轻链可变区的cDNA(例如通过PCR)并且在哺乳动物宿主细胞中体外表达该重链和轻链可变区(这称作淋巴细胞-抗体选捧方法或者SLAM，即选择性淋巴细胞抗体方法)，这允许对所选择的抗体基因序列进行进一步的选择和操作。单克隆抗体还可以利用表达克隆来选择，所述的表达克隆为在哺乳动物细胞中表达重链和轻链的抗体基因，并且选择分泌具有目的结合亲和力的抗体的哺乳动物细胞。本发明〗吏得可以得到RGM结合结构域或多肽形式的确定的抗原用于筛选和反向筛选。因此，根据本发明可以选择具有如上所定义的本发明期望特性i普的多克隆抗体和单克隆抗体。用于产生抗体的本发明方法可以用于产生各种类型的抗体。这基本上包括人抗体、嵌合抗体、人源化抗体和CDR嫁接抗体、以及其抗原结合部分。用于产生本发明抗体的方法在下面描述。关于这一点，区分为体内方法、体外方法或者这两种方法的组合。体内方法可以通过标准技术，如最初由K6hler和Milstein描述的杂交瘤技术(1975，Nature256:495-497)(还可参见Brown等，(1981)J.Immunol127:539-46;Brown等，(1980)JBiolChem255:4980-83;Yeh等，(1976)PNAS76:2927-31;以及Yeh等，(1982)Int.J.Cancer29:269-75)，从在体内产生抗体的细胞开始，生产单克隆抗体。用于产生单克隆抗体杂交瘤的才支术众所周知(一般参见R.H.Kenneth，inMonoclonalAntibodies:ANewDimensionInBiologicalAnalyses,PlenumPublishingCorp.,NewYork,NewYork(1980);E.A.Lerner(1981)YaleJ.Biol.Med.，54:387-402;M.L.Gefter等，(1977)SomaticCellGenet.，3:231-36)。为此目的，将永生化的细胞系(典型的是骨髓瘤)与用本发明RGM蛋白质或其衍生物/等效物免疫的哺乳动物的淋巴细胞(典型的是脾细胞或淋巴结细胞或者外周血淋巴细胞)融合，并且筛选所得到的杂交瘤细胞的培养上清以鉴定产生对本发明RGM蛋白质或其衍生物/等效物具有特异性的单克隆抗体的杂交瘤。为此目的，可以使用充分熟知的多种用于融合淋巴细胞和永生化细胞系的方法中的任何方法(还可参见G.Galfre等，(1977)Nature266:550-52;Gefter等，SomaticCellGenet.，在上引用；Lerner，YaleJ.Biol.Med.，在上引用；Kenneth,MonoclonalAntibodies,在上引用)。技术人员还知道此类方法的多种不同变型方法，它们同样可以使用。典型地，永生化细胞系(例如骨髓瘤细胞系)与淋巴细胞来源于相同的哺乳动物物种。例如可以通过将用本发明免疫原性制剂免疫的小鼠的淋巴细胞与永生化的小鼠细胞系融合以建立鼠杂交瘤。优选的永生化细胞系是对包含次黄噤呤、M蝶呤和胸苷的培养基(HAT培养基)敏感的小鼠骨髓瘤细胞系。诸多骨髓瘤细胞系中的任何一种都可以用作标准融合中的融合配偶体，例如P3-NSl/l-Ag4-l、P3-x63-Ag8.653或Sp2/0-Agl4骨髓瘤系。这些骨髓瘤细胞系可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Rockville，MD得到。典型地，使用聚乙二醇(PEG)将HAT-敏感性小鼠骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞融合。然后，使用HAT培养基选择来自融合的杂交瘤细胞，由此未融合的以及非生产性融合的骨髓瘤细胞将被杀死(未融合的脾细胞在几天后死亡，因为它们未被转化)。特异性识别本发明RGM蛋白质或者其衍生物/等效物的产生单克隆抗体的杂交瘤细胞通过筛选杂交瘤培养上清中的此类抗体而鉴定出来，例如4吏用标准ELISA分析法篩选，以便选择能够特异性结合本发明RGM蛋白质或者其f汴生物/等效物的那些抗体。可以使用不同的宿主动物进行体内免疫，这依赖于目的抗体的性质。可以使用自身表达内源性目的抗原的宿主。备选地，可以使用对于内源性目的抗原而言为缺陷型的宿主。例如，已经证明，通过在特定内源基因上的同源重组产生的相应内源蛋白质缺陷的小鼠(即敲除小鼠)可以对用于免疫其的该蛋白质产生体液免疫反应，并且因此可以用于产生抗该蛋白质的高亲和性单克隆抗体(见例如Roes，J.等，(1995)J.Immunol.Methods巡:231-237;Lunn，M.P.等，(2000)J.Neurochem.2:404-412)。许多非人哺乳动物适宜作为抗体产生的宿主，用于产生抗本发明RGM蛋白质或其衍生物/等效物的非人抗体。这些动物包括小鼠、大鼠、鸡、骆驼、兔和山羊(以及其基因敲除形式)，但是优选小鼠用于杂交瘤生产。还可以使用表达人抗体i普的非人宿主动物用于生产抗人抗原的具有双重特异性的实质人抗体。此类非人动物包括带有人免疫球蛋白转基因的转基因动物(例如小鼠)(嵌合的hu-PBMC-SCID小鼠)和A/小鼠辐射嵌合体，这些动物在下面详细描述。根据一个实施方案，用本发明RGM蛋白质或其衍生物/等效物免疫的动物是非人哺乳动物，优选带有人免疫球蛋白基因的转基因小鼠，从而在抗原刺激后该非人哺乳动物制造人抗体。有代表性地，具有人种系构型的重链和轻链免疫球蛋白转基因被导入此类动物中，其中所述动物已经被修饰以致于重链和轻链的内源性基因座是失活的。用抗原(例如人抗原)刺激此类动物导致产生衍生自人免疫球蛋白序列的抗体(即人抗体)。人单克隆抗体可以通过标准杂交瘤技术从此类动物的淋巴细胞中产生。对于带有人免疫球蛋白的转基因小鼠及其在人抗体生产中的用途的进一步描述见例如美国专利号5,939,598、，WO96/33735、WO96/34096、WO98/24893和WO99/53049(AbgenixInc.)、以及美国专利号5,545,806、5,569,825、5,625,126、5，633，425、5,661,016、5,770,429、5,814,318、5，877，397和WO99/45962(GenpharmInc.);同样参见MacQuitty，J.J.和Kay，R.M.(1992)Science，1188;Taylor,L.D.等，(1992)NucleicAcidsRes.^:6287-6295;Lonberg，N.等，(1994)Nature巡:856-859;Lonberg，N.和Huszar，D.(199S)Int.Rev.Immunol.J^:65-93;Harding,F.A.undLonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.2^:536-546;Fishwild，D.M.等，(1996)NatureBiotechnologyJi:845-851;Mendez，M.J.等，(1997)NatureGeneticsIf:146-156;Green，L丄.和Jakobovits，A.(1998)J.Exp.Med.188:483-495;Green，L丄.(1999)J.Immunol.Methods231:11-23;Yang，X.D.等，(1999)J.Leukoc.Biol.^￡:401-410;Gallo，M丄.等，(2000)Eur.J.Immunol.^:534-540。在再一实施方案中，用本发明RGM蛋白质或其衍生物/等效物免疫的动物可以是已经用人外周血单核细胞或用淋巴细胞或其前体重构的重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠。被称作嵌合hu-PBMC-SCID小鼠的此类小鼠，已经被证明可以在抗原刺激后产生人免疫球蛋白反应。对于这些小鼠及其用于产生抗体的用途的进一步描述见例如Leader,K.A.等，(1992)Immunology2jl:229-234;Bombil,F.等，(1996)Immunobiol.195:360-375;Murphy,W丄等，(1996)Semin.Immunol.丝:233-241;Herz,U.等，(1997)Int.Arch.AllergyImmunol.JJi:150-152;Albert,S，E.等，(1997)J，Immunol.1393-1403;Nguyen,H.等，(1997)Microbiol.Immunol.U:卯l-907;Arai,K.等，(1998)J.Immunol.Methods^12:79-85;Yoshinari，K.和Arai，K.(1998)Hybridoma12:41-45;Hutchins，W.A.等，(1999)Hybridoma18:121-129;Murphy,W，J.等，(1999)Clin.Immunol.2i_:22-27;Smithson，S丄.等，(1999)Mol.Immunol.^:113-124;Chamat，S.等，(1999)J.Infect.Diseases180:268-277;和Heard,C.等，(1999)Molec.Med,S:35-45。在另一实施方案中，用本发明RGM蛋白质或其衍生物/等效物免疫的动物是已经用致死性全身辐射处理过、随后用来自重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠的骨髓细胞进行辐射保护并且随后移植了功能性人淋巴细胞的小鼠。这种类型的嵌合体^:称作trimera系统，通过用目的抗原免疫该小鼠、随后使用标准杂交瘤技术产生单克隆抗体，该小鼠可以用于生产人单克隆抗体。对于这些小鼠以及其用于产生抗体的用途的进一步描述见例如Eren，R.等，(1998)Immunology2^:154-161;Reisner，Y和Dagan，S.(1998)TrendsBiotechnol.M:242-246;Ilan,E.等，(1999)Hepatology29:553-562;以及Bocher，W.O.等，(1999)Immunology￡^:634-641。体外方法作为通过免疫和选择来产生本发明抗体的一种替代方法，可以通过用本发明RGM蛋白质或其衍生物/等效物筛选重组的组合免疫球蛋白文库、以由此分离特异性结合RGM蛋白质或其衍生物/等效物的免疫球蛋白文库成员，来鉴定和分离本发明的抗体。用于产生和筛选展示文库的试剂盒是商业可得的(例如来自Pharmacia的重组噬菌体抗体系统，目录号27-9400-01;以及来自Stratagene的SurfZAP噬菌体展示试剂盒，目录号240612)。在许多实施方案中，展示文库是scFv文库或Fab文库。用于筛选重组抗体文库的噬菌体展示技术已经有充分描述。特别有利地用于产生和筛选抗体展示文库的方法和化合物的实例可以在例如下列文献中找到McCafferty等，WO92/01047，美国专利号5,969,108和EP589877(特别描述了scFv的展示)，Ladner等，美国专利号5,223,409、5,403,484、5,571,698、5,837,500和EP436597(描述了例如pill融合)；Dower等，WO91/17271，美国专利号5,427,908，美国专利号5,580,717和EP527839(特别描述了Fab的展示)；Winter等，国际公布WO92/20791和EP368，684(特别描述了免疫球蛋白可变结构域序列的克隆)；Griffiths等，美国专利号5,885,793和EP589877(特别描述了j吏用重组文库对抗人抗原的人抗体的分离)；Garrard等，WO92/09690(特别描述了噬菌体表达技术)；Knappik等，WO97/08320(描述了人重组抗体文库HuCal);Salfeld等，WO97/29131(描述了抗人抗原(人肿瘤坏死因子a)的重组人抗体的产生，以及该重组抗体的体外亲和力成熟)以及Salfeld等，美国临时申请号60/126,603和基于其的专利申请(同样描述了抗人抗原(人白细胞介素-12)的重组人抗体的产生，以及该重组抗体的体外亲和力成熟)。对筛选重组抗体文库的其它描述可以在下列科学出版物中找到如Fuchs等，(1991)Bio/Technology9:1370-1372;Hay等，(1992)HumAntibodHybridomas3:81-85;Huse等，(1989)Science246:1275-1281;Griffiths等，(1993)EMBOJ12:725-734;Hawkins等，(1992)JMolBiol226:889-896;Clarkson等，(1991)Nature352:624-628;G腦等，(1992)PNAS89:3576-3580;Garrad等，(1991)Bio/Technology9:1373-1377;Hoogenboom等，(1991)NucAcidRes19:4133-4137;Barbas等，(1991)PNAS88:7978画7982;McCafferty等，Nature(19卯)348:552-554;以及Knappik等，(2000)J.Mol.Biol.296:57-86。作为对使用噬菌体展示系统的一个替代，可以在酵母细胞或者细菌细胞表面上表达重组抗体文库。用于产生和筛选在酵母细胞表面上表达的文库的方法描述于WO99/36569。用于产生和筛选在细菌细胞表面上所表达的文库的方法详细描述于WO98/49286。一旦从组合文库中鉴定出目的抗体，编码抗体轻链和重链的DNA可以通过分子生物学标准技术，如通过PCR扩增来自在文库筛选过程中分离的展示包(displaypackage)(例如噬菌体)的DNA来分离。可以用于产生PCR引物的抗体轻链和重链基因的核苷,列是技术人员已知的。许多此类序列描述于例如Kabat，E.A.等，(1991)SequencesofProteinofImmunologicalInterest,第5版，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242以;5LA种系序列数据库VBASE中。本发明的抗体或抗体部分可以通过在宿主细胞中重组表达免疫球蛋白轻链和重链基因产生。对于抗体的重组表达，宿主细胞用一个或多个带有编码抗体免疫球蛋白轻链和重链的DNA片段的重组表达栽体转染，以致于轻链和重链在宿主细胞中表达，并且优选地分泌进入培养宿主细胞所用的培养基中。抗体可以从该培养基中得到。可以使用标准重组DNA方法得到抗体重链和轻链基因、将这些基因插入到重组表达载体中并且将栽体导入宿主细胞中。该类型的方法描述于例如Sambrook，Fritsch和Maniatis(编者)，MolecularCloning;ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarbor,N.Y"(1989)，Ausubel，F.M.等，(编者)CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssociates,(1989)以及Boss等的美国专利号4,816,397中。一旦得到编码目的抗体VH和VL片段的DNA片段，这些DNA片段可以使用标准重组DNA技术进一步操作，以便例如将可变区基因转变成全长抗体链基因、转变成Fab片段的基因或者转变成scFv基因。这些操作导致编码VL或VH的DNA片段与编码另一蛋白质，例如抗体恒定区或者柔性接头的另一DNA片段有效连接。术语"有效连接"在这里旨在指两个DNA片段以这样一种方式连接在一起，该方法使得两个DNA片段编码的M絲列依然处于读码框中(符合读框的)。通过将编码VH区的DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子有效连接，编码VH区的分离的DNA可以净皮转变成全长重链基因。人重链恒定区基因序列充分已知(见例如Kabat,E.A.等，(1991)SequencesofProteinofImmunologicalInterest，FifthEdition，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices，NIHPublicationNo.91-3242)，并且跨这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增得到。重链恒定区可以是来自IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD的恒定区，优选来自IgGl或IgG4的恒定区。重链Fab片段的基因可以通过将编码VH的DNA与仅编码重链恒定区CHI的另一DNA分子有效连接得到。通过编码VL的DNA与编码轻链恒定区CL的另一DNA分子有效连接，编码VL区的分离的DNA可以转变成全长轻链的基因(和Fab轻链的基因)。人轻链恒定区的基因序列充分已知(见Kabat,E,A.等，(1991)SequencesofProteinofImmunological'Interest,第5版,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242)，并且跨这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增得到。轻链恒定区可以是恒定区K或k,优选恒定区K。scFv基因可以通过有效连接编码VH和VL的DNA片段与编码柔性接头如^J^紗歹'J(Gly4-Ser)3的另一片段而产生，以致于VH和VL序列作为连续的单链蛋白质表达，其中VL和VH区通过该柔性接头连接在一起(见Bird等，(1988)Science242:423-426;Huston等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA^f:5879-5883;McCafferty等，Nature(1990)348:552-554)。对本发明RGM蛋白质或其个汙生物/等效物具有特异性的VH和VL单结构域可以使用上述方法从单结构域文库中分离。可以使用具有目的特异性的两个VH单结构域链(带有或不带有CH1)或两个VL链或一对VH链和VL链来结合本发明的RGM蛋白质或其衍生物/等效物。本发明的重组抗体或抗体部分可以通过将编码部分或全长轻链和重链的DNA插入到表达载体中，使基因与转录和翻译控制序列有效连接来表达。关于这一点，术语"有效连接，，旨在指抗体基因以这样一种方式连接在栽体中，该方式使得载体中的转录和翻译控制序列可以实现它们调节抗体基因的转录和翻译的预期功能。选择表达载体和表达控制序列以便它们与用于表达的宿主细胞兼容。抗体轻链基因和抗体重链基因可以插入到不同的载体中，或者通常情况是两个基因插入到同一个表达载体中。抗体基因通过标准方法(例如将抗体基因片段和栽体上的互补性限制性切割位点连接，或者将钝末端连接(如果不存在限制性切割位点的话))插入到表达载体中。表达载体可以在插入轻链和重链序列之前已经具有抗体恒定区序列。一种方法例如是通过将VH和VL序列插入到已经分别编码重链和轻链恒定区的表达载体中(以致于VH片段与栽体中的CH片段有效连接，并且VL片段与载体中的CL片段也有效连接)从而将VH和VL序列转变成全长抗体基因。另外的或者备选的可能方案是编码信号肽的重组表达栽体，所述信号肽有利于抗体链从宿主细胞的分泌。可以将抗体链的基因克隆到该载体中，使信号肽与抗体链基因的N末端在读框内连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白的信号肽)。本发明表达载体除了具有抗体链的基因以外，还可以具有控制抗体链基因在宿主细胞中表达的调节序列。术语"调节序列"旨在包括控制抗体链基因转录或翻译的启动子、增强子和其它的表达控制元件(例如多腺苷酸化信号)。此类调节序列描述于例如Goeddel;GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego，CA(1990)中。技术人员将明了表达栽体的设计，包括调节序列的选择，可以取决于诸多因素如待转化的宿主细胞的选择、蛋白质表达的目的强度等。对于在哺乳动物宿主细胞中表达而言优选的调节序列包括导致在哺乳动物细胞中蛋白质强表达的病毒元件，如启动子和/或增强子，这些元件可以衍生自巨细胞病毒(CMV)(如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如晚期腺病毒主要启动子(AdMLP，即，AdenovirusMajorLatePromoter的缩写))和多瘤病毒。对于病毒调节元件和其序列的进一步描述见例如Stinski的美国专利号5，168，062、Bdl等的美国专利号4,510,245以及Schaffner等的美国专利号4，968，615。本发明的重组表达栽体除了具有抗体链基因和调节序列之外，还可以具有额外的序列，如调节载体在宿主细胞中的复制的序列(例如复制起点)和选择标记基因。选择标记基因利于选择其中已经导入了载体的宿主细胞(见例如Axd等的美国专利号4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，选择标记基因通常使已经插入了载体的宿主细胞抵抗活性物质，如G418、潮霉素或氨甲蝶呤。优选的选棒标记基因包括二氢叶酸还原酶基因(DHFR)(用于dhfr-宿主细胞和氨甲蝶呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。为了表达轻链和重链，编码重链和轻链的表达载体使用标准技术被转染进入宿主细胞。术语"转染"的各种形式旨在包括通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞的大量技术，例如电穿孔、磷酸钓沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。虽然理论上可以在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但是优选在真核细胞、尤其是哺乳动物宿主细胞中表达抗体，因为在此类真核细胞、尤其是哺乳动物细胞中装配和分泌正确折叠的免疫活性抗体的可能性比在原核细胞中高。已有报道，抗体基因的原核表达无法有效地大量生产活性抗体(Boss，M,A.和Wood,C.R.(1985)ImmunologyTodayg:12画13)。优选用于表达本发明重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括CHO细胞(包括dhfrCHO细胞，其描述于Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA22:4216-4220，并且如例如R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.^2:601-621中所述与DHFR选择标记一起4吏用)、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。如果编码抗体基因的重组表达载体被导入到哺乳动物宿主细胞中，则通过培养宿主细胞直至抗体在宿主细胞中表达或者优选地抗体被分泌到宿主细胞生长所在的培养基中来生产抗体。通过使用純化蛋白质的标准方法可以从培养基中得到抗体。同样可以使用宿主细胞产生完整抗体的部分，如Fab片段或scFv分子。本发明当然包括上述方法的变体。例如可能期望用编码本发明抗体的轻链或重链(但不是两者)的DNA转染宿主细胞。如果存在对于目的抗原的结合而言非必需的轻链或重链，则可以通过重组DNA技术部分地或者全部地缺失掉编码一个此轻链或者一个此重链或者两者的DNA。通过此类截短DNA分子表达的分子同样属于本发明的抗体。还可以通过标准化学方法将本发明的抗体与第二抗体交联来产生双功能性抗体，在该抗体中一个重链和一个轻链是本发明的抗体，而另外的重链和轻链对目的抗原之外的抗原具有特异性。在重組表达本发明抗体或其抗原结合部分的优选系统中，将编码抗体重链和抗体轻链两者的重組表达载体通过磷酸钩介导的转染导入到dhfr-CHO细胞中。在重組表达载体中，抗体重链和轻链的基因各与调节性CMV增强子/AdMLP启动子元件有效连接以使基因强力转录。重组表达载体还可以具有DHFR基因，该基因可以用于通过氨甲蝶呤选择/扩增来选择转染有载体的CHO细胞。培养所选择的转化了的宿主细胞，以表达抗体重链和轻链并且从培养基中得到完整的抗体。可以使用分子生物学标准技术以产生重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化体、培养宿主细胞和从培养基中得到抗体。因此，本发明涉及通过在适宜培养基中培养本发明的宿主细胞直到本发明的重组抗体被合成来合成本发明重组抗体的方法。该方法还可以包括从培养基中分离重组抗体。作为通过噬菌体展示筛选重组抗体文库的替>(戈，可以采用技术人员已知的另外的方法筛选大的组合文库，以鉴定本发明的抗体。在一种类型的备选表达系统中，如Szostak和Roberts的WO98/31700以及Roberts,R.W.和Szostak,J.W.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA21:12297-12302中所述以RNA-蛋白质融合物的形式表达重组抗体文库。在该系统中，通过合成性mRNA的体外翻译在mRNA和其所编码的肽或蛋白质之间产生共价融合，其中该mRNA在其3，末端携带有噤呤霉素，一种肽基接纳体抗生素。因此可以基于所编码肽或蛋白质(例如抗体或其部分)的特性，如抗体或其部分与本发明RGM蛋白质或其f汙生物/等效物的结合，从mRNA的复杂混合物(例如组合文库)中富集特异mRNA。编码抗体或其部分并且从筛选此类文库中得到的核酸序列可以通过重组方法以上述方式表达(例如在哺乳动物宿主细胞中)，此外还可以通过在更多轮中筛选mRNA-肽融合物(在这种情况下突变被引入到最初选择的序列中)或者通过使用重组抗体体外亲和力成熟的其它方法开展进一步的亲和力成熟。体内和体外方法的组合本发明的抗体同样可以通过采用体内和体外方法的组合产生，如以下的方法，即最初允许本发明的RGM蛋白质或其衍生物/等效物在宿主动物中体内作用于抗体谞，以便刺激产生结合RGM蛋白质或者衍生物/等效物的抗体，随后借助于一种或多种体外技术开展进一步的抗体选择和/或抗体成熟(即优化)。根据一个实施方案，此组合方法可以包括首先用本发明的RGM蛋白质或其衍生物/等效物免疫非人动物(例如小鼠、大鼠、兔、鸡、骆駝、山羊或者它们的转基因动物或者嵌合体小鼠)以刺激针对抗原的抗体反应，随后使用来自淋巴细胞(其已经通过RGM蛋白质或衍生物/等效物体内作用而被体内刺激)的免疫球蛋白序列产生并筛选噬菌体展示抗体文库。该组合方法的第一个步骤可以以上述方式结合体内方法开展，而该方法的第二个步骤可以以上述方式结合体外方法开展。用于超免疫非人动物，然后体外筛选从所刺激的淋巴细胞产生的噬菌体展示文库的优选方法包括由BioSiteInc.所描述的那些，见例如WO98/47343、WO91/17271、美国专利号5,427,908和美国专利号5,580,717。才艮据另一实施方案，组合方法包括首先用本发明的RGM蛋白质或其衍生物/等效物免疫非人动物(例如小鼠、大鼠、兔、鸡、骆驼、山羊或者其敲除和/或转基因动物、或嵌合体小鼠)以刺激针对RGM蛋白质或其衍生物/等效物的抗体反应，并且通过筛选杂交瘤(例如由所免疫动物产生)选择产生具有目的特异性的抗体的淋巴细胞。抗体基因或者单结构域抗体的基因从所选择的克隆中分离(通过标准克隆方法，如逆转录酶-聚合酶链式反应)并且体外开展亲和力成熟，由此改善所选择抗体(一种或多种)的结合特性。该方法的第一个步骤可以以上述方式结合体内方法完成，而该方法的第二个步骤可以以上述方式结合体外方法、特别是通过使用如WO97/29131和WO00/56772中描述的那些体外亲和力成熟方法来完成。在另一个组合方法中，重组抗体通过使用技术人员已知的称作淋巴细胞抗体选择方法(SLAM)的程序从单个分离的淋巴细胞中产生，所述方法描述于美国专利号5，627，052、WO92/02551以及Babcock，J.S.等，(1996)Proc，Natl.Acad.Sci,USA￡^:7843-7848中。在该方法中，首先非人动物(例如小鼠、大鼠、兔、鸡、骆驼、山羊或者它们的转基因动物、或者嵌合体小鼠)用本发明的RGM蛋白质或者其衍生物/等效物体内免疫，以刺激针对RGM蛋白质或衍生物/等效物的免疫反应，然后使用抗原特异性的溶血噬斑试验选择分泌目的抗体的单个细胞。为此目的，RGM蛋白质或其衍生物/等效物或者结构相关的目的分子可以使用接头如生物素与绵羊红细胞偶联，从而可以通过溶血噬斑试验鉴定出分泌具有适宜特异性的抗体的各个单细胞。在鉴定出分泌目的抗体的细胞之后，通过逆转录酶-PCR从细胞中得到轻链和重链可变区的cDNA，然后这些可变区可以在哺乳动物宿主细胞如COS或CHO细胞中与适宜的免疫球蛋白恒定区(例如人恒定区)相连接表达。转染该扩增的免疫球蛋白序列(来源于体内选择的淋巴细胞)的宿主细胞然后可以进行进一步体外分析和选择，例如通过扩增转染的细胞以分离表达具有目的特异性的抗体的细胞。此外，所扩增的免疫球蛋白序列还可以体外操作。6.药物组合物本发明还涉及药物组合物，其包含作为活性物质的本发明的蛋白质(RGM蛋白质；RGM蛋白质结合配体，如抗RGM蛋白质的抗体)或者编码RGM蛋白质的核酸序列，以及如果适当的话可药用载体。本发明的药物组合物还可以包含至少一种其它的治疗剂，例如一种或多种用于治疗本文所述疾病之一的其它治疗剂。可药用载体包括所有的溶剂、M介质、包衣料、抗微生物剂、张力剂;sj^迟吸收剂等，只要它们是生理相容性的即可。可药用载体包括例如水、盐溶液、磷酸緩冲盐溶液、乳糖、右旋糖、,蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钓、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钓、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、糖浆和曱基纤维素。制剂还可以包含可药用栽体或常规赋形剂，如润滑剂，例如滑石、硬脂酸镁和矿物油；湿润剂；乳化及悬浮剂；防腐剂，如羟苯甲酸甲酯和羟苯曱酸丙酯；抗氧化剂；抗刺激剂；螯合剂；包衣助剂；乳化稳定剂膜形成剂；凝胶形成剂；遮味剂，掩盖气味的香料，树脂类；亲水胶体(hydrocolloids);溶剂；增溶剂；中和剂；渗透促进剂；色素；季胺类化合物；加脂剂(refattingagent)和富脂剂(superfattingagent);软膏、霜或油的基质；硅氧烷衍生物；扩散助剂(spreadingagent);稳定剂；杀菌剂；栓剂基质；片剂赋形剂如粘合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂或包衣剂；抛射剂；干燥剂；遮光剂；增稠剂；蜡；增塑剂；白油。关于此的安朝一基于吵口在Fiedler,H.P.，LexikonderHilfsstoffeftirPharmazie，KosmetikundangrenzendeGebiete,4thedition，Aulendorf:ECV-Editio-Cantor-Verlag，1996中所述的专业知识进行。还可参考Hager，sHandbuehderPharmazeutischenPraxis，SpringerVerlag,Heidelberg。药物组合物可以适用于例如肠胃外施用。为此目的，活性物质如抗体优选地制备成可注射溶液，其中活性物质含量为0.1-250mg/ml。可注射溶液可以制备成液体形式或者冻干形式放置于无色玻璃小瓶、安瓿瓶中或填充式注射器中作为剂量形式。緩冲液可以包含L-组氨酸(l-50mM，优选5"10mM)并且pH值为5.0-7.0、优选6.0。其它适宜的緩冲液包括但不限于琥珀酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾緩沖液。可使用氯化钠调节溶液的张力至浓度0-300mM(对于液体剂量形式优选150mM)。对于冻干剂量形式，可以包含冷冻保护剂，例如蔗糖(例如0-10%，优选0.5-1.0%(w/w))。其它的适宜冷冻保护剂包括海藻糖和乳糖。对于冻干剂量形式，可以包含填充剂，例如甘露醇(例如1-10%,优选2-4。/。(w/w))。可以在液体剂量形式和冻干剂量形式中使用稳定剂，例如L-甲硫氨酸(例如l-50mM，优选5-10mM)。其它的适宜的填充剂包^"氨酸和精氨酸。同样可以使用表面活性剂，例如聚山梨醇酯80(例如0-0.05%，优选0.005-0.01%(w/w))。其它表面活性剂包括聚山梨醇酯20和BRIJ表面活性剂。本发明的组合物可以采取多种形式。这些形式包括液体剂型、半固体剂型和固体剂型，如液体溶液(例如可注射和可输注溶液剂、洗剂、滴眼剂和滴耳剂)、脂质体、分散剂或混悬剂以及固体剂型如口服散剂、撒布剂(dustingpowder)、颗粒剂、片剂、锭剂、囊剂(sachet)、扁嚢剂(cachet)、包衣片剂、胶嚢剂如硬明胶胶嚢和软明皿嚢、栓剂或阴道药物形式、半固体药物形式如软膏剂、霜剂、7jC凝胶、糊剂或贴剂。还可以使用植入递送装置以施用本发明的活性物质。优选的形式依赖于预期的施用模式和治疗用途。典型地，优选可注射或可输注溶液形式的组合物。适宜的施用途径是例如肠胃外(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌内)。在优选的实施方案中，活性物质通过静脉输注或注射施用。根据另一优选实施方案，活性物质通过肌内或皮下注射施用。治疗组合物典型地必须是无菌的并且在生产和储存条件下是稳定的。组合物可以被配制成溶液、微乳液、分散液、脂质体或适宜高活性物质浓度的其它有序结构。无菌注射溶液可以如下产生，即将所需量的活性化合物(例如抗体)，如适当的话，根据需要与一种上述成分或者上述成分的组合一起加入到适宜溶剂中，然后通过过滤除菌。分歉剂通常如下制备，即将活性化合物加入到无菌载体(vehicle)中，其中载体包含基本的a介质和如适当的话另外的所需成分。对于用于制备无菌注射溶液的无菌冻干粉末，优选的制造方法是真空干燥和喷雾干燥，导致从先前已过滤灭菌的溶液产生活性成分和如适当的话其它期望成分的粉末。可以通过例如使用包衣料如卵磷脂，在M剂的情况下，维持所需的颗粒大小，或者使用表面活性剂来维持溶液的适当流动性。注射组合物的延长吸收可通过向组合物中掺入延迟吸收的药剂，如单硬脂酸盐和明胶来实现。虽然皮下注射、静脉注射或输注是诸多治疗应用的优选施用方式，但'是本发明的活性物质可以使用技术人员已知的大量方法施用。技术人员知道，施用途径和/或模式依赖于期望的结果。根据某些实施方案，活性化合物可以与保护化合物不被快速释放的载体一起制备，例如控释制剂，包括埋植剂、经皮贴剂和^t嚢化递送系统。可以使用生物可降解的生物相容性聚合物，如乙烯-醋酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯类和聚乳酸。制备这些制剂的方法一般是技术人员已知的，见例如SustainedundControlledReleaseDrugDeliverySystems,J.R.Robinson,编，MarcelDekker，Inc.,NewYork,1978。根据某些实施方案，本发明的活性物质可以口服施用，例如在惰性稀释剂中或者可吸收的可食载体中。活性物质(和如需要话其它成分)也可以包在硬或软明皿囊中、压制成片剂或者直接加入到食物中。对于口服治疗施用，可以将活性物质与赋形剂混合并以可吞咽片剂、口含片剂、胶嚢剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂等形式使用。如果本发明的活性成分拟通过非肠胃外的途径施用，则可能需要选择1^止其失活的包衣材料。本发明的活性物质可以与一种或多种可以用于治疗上述疾病的另外的治疗剂一起施用。本发明的药物组合物通常包含治疗有效量或者预防有效量的至少一种本发明的活性物质。可以依据期望的治疗、如是否期望治疗性治疗还是预防性治疗来选择和调整剂量方案。例如，依赖于治疗状况的需要，可以施用单一剂量、分布于一段时间内的多次分开的剂量或者增加的或降低的剂量。特别有利的是配制成单位剂量形式的肠胃外组合物以利于施用和保证剂量的一致性。治疗医师能够容易地确定对于特定治疗和特定活性物质而言最适合的剂量形式、施用方式和剂量。治疗有效量或者预防有效量的本发明活性物质可以是例如在0.1-20mg/kg、并且优选l-10mg/kg范围内，但不限于此。当然，这些量可以随待緩解的疾病状况的性质和严重程度而变化。6.2疫苗本发明的RGM蛋白质和其衍生物/等效物可以用作免疫原，用于对待治疗患者进行疫苗接种。可用于该目的的疫苗一般是包含至少一种本发明RGM蛋白质和/或至少一种其衍生物/等效物的药物组合物。该组合物还可以包含生理耐受性栽体和如适当的话其它赋形剂，例如免疫刺激剂。虽然原则上可以按希望选择适宜的载体，但是载体的性质通常由施用途径所控制。因此，本发明的疫苗特别可以配制成适宜肠胃外，例如静脉内施用、肌内施用和皮下施用的形式。在这些情况下，载体优选包含水、盐溶液、醇、脂肪、蜡和/或緩冲液。可以在本发明的疫苗中使用大量免疫刺激剂中的任何一种。例如可以包括佐剂。大多数佐剂包含旨在保护抗原免受快速降解的物质，如氢氧化铝或矿物油、和矛汙生自脂质A、百日咳博德特菌(Bordetellapertussis)或结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)的蛋白质。适宜的佐剂通常可以商业性获得，例如完全或不完全弗氏佐剂；AS-2;铝盐如氢氧化铝(根据需要以凝胶的形式)或磷酸铝；钙、铁或锌盐；酰化酪氨酸的不溶性悬浮液；酰化糖类；阳离子或阴离子衍生的多糖；聚磷腈；生物可降解微球；单磷酰脂A。细胞因子如GM-CSF或白细胞介素-2、白细胞介素-7或白细胞介素-12同样可用作佐剂。7.治疗方法7.1.神经元疾病的治疗现有技术已经公开，在中枢神经系统损伤的情况中观察到RGM蛋白质在损害部位积累(参见Schwab等，见上引文)。同时，受损神经纤维的重新向外生长由此净皮抑制。对神经纤维生长的这种有害影响是通过RGM与受体分子再生蛋白的结合介导的。因此，调节、特别是抑制RGM与受体分子再生蛋白的相互作用将适用于消除RGM对神经纤维生长的抑制活性。7.2.肿瘤病的治疗长期以来有迹象表明，再生蛋白与肿瘤病的发生和/或*可能存在因i果关联。因此，例如Meyerhardt等在Oncogene(1997)14，1129-1136中报道，在多于50种所研究的癌细胞系中可以检测到再生蛋白，所述细胞系包括成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤、成神经细胞瘤细胞系，以及来自结肠直肠癌、乳腺癌、胰腺癌和宫颈癌的细胞系。在食管癌细胞系中也观察到再生蛋白的过表达(Hue等，ClinicalCancerResearch(2001)7，2213-2221)。最近对3588个基因在211例肺腺癌患者中的表达语的全面研究提供了又一证据，表明再生蛋白参与肿瘤病的发生展和进程(Berrar等，J.Comput.Bio1.(2005)12(5)，534-544)。由于还已知RGM可以通过结合至肿瘤细胞相关再生蛋白受体而阻止细胞死亡从而表现出潜在的肺瘤促进作用(Matsunaga等，NatureCellBiol.6，749-755，2004)，因此可以通过调节RGM-再生蛋白的相互作用、特别是通过借助于特异性抗RGM的抗体阻断这种相互作用而建立治疗肿瘤病的新的治疗方法。7.3.铁代谢障碍的治疗RGMC，也称作血幼素，对人和动物的铁代谢必不可少。年轻型血色素沉着病是遗传性的、相对罕见的铁代谢障碍，其表现为身体中铁超负荷。这种障碍是由于血幼素分子中的突变造成的(参见Huang等，TheJournalofClinicalInvestigation(2005)，115，2087-2091)。因此，本发明的功能性RGM蛋白质或其活性结构域的施用是一种緩解此类铁代谢障碍的有用的治疗方法。7.4.促进骨组织形成在现有技术中有迹象表明，RGM蛋白质家族的一个成员，具体地RGMB(也称作DRAGON)参与骨形态发生。因此，例如Samad等在出版中的JBC论文(2005年1月25日版)中描述了DRAGON与骨形态发生蛋白(BMP)的I型和II型受体的相互作用。因此，可以想到通过施用本发明的RGM多肽产生促进骨生长的作用，并因此产生一种新的治疗具有受损的骨生长的疾病或骨损伤的方法。8.诊断方法物以及抗它们的抗体。因此，本发明通过检测疾病典型抗原或抗体使得尤其可以定性或定量改进地确定上述的病理状态。所述确定优选使用免疫学方法实现。原则上，这可以使用任何采用抗体的分析或诊断测试方法。这些方法包括凝集和沉淀技术、免疫测定法、免疫组织化学方法和免疫印迹技术，例如Western印迹或点印迹方法。还包括体内方法，例如成4象方法。使用免疫测定法是有利的。适用的方法是竟争性免疫测定法和夹心免疫测定法，竟争性免疫测定法即抗原和标记的抗原(示踪物)竟争与抗体结合，夹心免疫测定法即使用通常是标记的第二抗体检测特异性抗体与抗原的结合。这些测定法可以是均相的，即不分成固相和液相，或者是多相的，即例如通过与固相结合的抗体将结合的标记物与未结合的标记物分离。各种多相和均相免疫测定形式可以4艮据标记和测定方法归于特定类型，例如RIA(放射免疫测定法)、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、FIA(荧光免疫测定法)、LIA(发光免疫测定法)、TRFIA(时间分辨FIA)、IMAC(免疫活化)、EMIT(酶扩大免疫测定法)、TIA(免疫浊度测定法)、I-PCR(免疫-PCR)。对于本发明的抗原测定优选竟争免疫测定法。在该情况下，标记的抗原(示踪物)与样品中待定量的抗原竟争与所使用的抗体结合。抗原的量，即样品中抗原的量可以借助于标准曲线根据置换出的示踪物的量确定。在可以得到的用于这些目的的标记物当中，酶被证明是有利的。例如可以使用基于过氧化物酶，特别是辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和(3-D-半乳糖苷酶的系统。这些酶的特异底物是可以得到的，并且可以通过例如光度测定法追踪底物的转化。适宜的底物系统基于用于碱性磷酸酶的对硝基苯基磷酸(p-NPP)、5-溴-4-氯-3-P引哚基磷^/硝基蓝四氮唑(BCIP/NPT)、坚牢红/萘酚-AS-TS磷酸；用于过氧化物酶的2，2-联氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、邻苯二胺(OPD)、3，3，，5，5，-四甲基联苯胺(TMB)、邻联茴香胺、5-氨基水杨酸、3-二甲氨基苯甲酸(DMAB)和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH);用于P-D-半乳糖苷酶的邻硝基苯基(3-D-半乳糖苷(o-NPG)、对硝基苯基P-D-半乳糖苷和4-甲基馓形基(lumbdlifer)卩-D-半乳糖苷(MUG)。这些底物系统在多数情况下是以即用的形式商业可得的，例如以片剂的形式，所述形式也可以包含另外的试剂，如适宜的緩冲液等。为制备示踪物，将标记物与肽或抗体偶联可以以本身已知的方式开展。此外，可以得到许多为了与蛋白质缀合而被有利修饰的标记物，例如生物素一、亲和素-、extravidin-或链霉亲和素-缀合的酶、马来酰亚胺活化的酶等。这些标记物可以与待根据本发明使用的分子直接反应。如果选择多相免疫测定方式，为了分离的目的，可以例如通过偶联至支持物上的抗独特型抗体，例如抗兔IgG的抗体，使抗原-抗体复合物结合至支持物上。用适当抗体包被的支持物、特别是微量滴定板是已知的并且是商业可得的。本发明还涉及具有至少一种上述抗体和另外成分的免疫测定包(set)。这包含通常表现为单元包(packunit)形式的一组用于开展本发明测定的工具的集合。为了使使用最大可能简化，这些工具优选以基本上即用的形式提供。一种有利的配置是通过免疫测定试剂盒提供的。试剂盒通常包含多个容器用于将成分分开放置。所有成分均可以以即用的稀释形式，用于稀释的浓缩物形式或者以用于溶解或悬浮的干物质或冻干物形式提供；单个成分或者全部成分可以冷冻或者储存在环境温度下直至使用。血清优选骤激冷冻(shock-frozen),例如于-20。C下，以致于在这些情况下，免疫测定包必须优选保存在冷冻温度下直至使用。加入到免疫测定包中的另外的成分可以是标准蛋白质、示踪物、对照血清、微量滴定板(优选用抗体包被)、緩沖液(例如用于测试、用于洗涤或者用于底物反应)以及酶底物本身。免疫测定法的一般原理以及抗体的产生和在实验室和临床上的用途可以在例如Antibodies,ALaboratoryManual(Harlow，E.和Lane，D.编，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY，1988)中找到。9.筛选方法本发明还涉及用于检测RGM受体再生蛋白的效应物的方法，其中将怀疑存在效应物的样品与RGM蛋白质或多肽一起孵育并且研究混合物中效应物-RGM蛋白质复合物的形成。此类效应物可以具有激动、部分激动、拮抗或反向激动作用。它们可以是例如合成的低分子量物质、合成肽、天然的或合成的抗体分子或者天然物质。本发明的此类方法通常可以作为体外筛选方法开展，使用该方法可以从大量不同物质中选择出最有希望未来使用的物质。例如，可以通过组合化学的手段构建包含大量潜在活性物质的庞大物质文库。在组合物质文库中篩选具有期望活性的物质可以通过自动化实现。使用机器人篩选设备可以有效评价优选安排在微量滴定板上的各个测定。因此，本发明还涉及筛选方法，即初级筛选方法和次级筛选方法，在其中优选使用至少一个下述方法。如果使用多个方法，可以连续或者同时在同一个样品上或者在待研究物质的不同样品上进行。实施此类方法的一项有效技术是闪烁亲近测定法(scintillationproximityassay)，缩写成SPA，其在活性物质筛选领域是已知的。用于开展此分析的试剂盒和成分可以商业购买，例如从AmershamPharmaciaBiotech购买。原理上，将溶解的或膜结合的受体固定于包含闪烁体的小的焚光微球上。例如，如果放射性配体结合至固定的受体上，因为闪烁体和放射性配体空间接近，则闪烁体被激发而发射出光。开展此类方法的另一个有效技术是活性物质筛选领域已知的FlashPlateR技术。用于开展此分析的试剂盒和成分可以商业购买，例如从NENLifeScienceProducts购买。该原理同样基于用闪烁体包被的微量滴定板(96孔或者384孑L)。本发明同样涉及可以通过这些方法鉴定的物质或者物质混合物的部分。现在，本发明参考下列非限制性的制备和用途实施例更加详细地解释。实验部分1.一般信息分析方法l:在神经元向外生长实验中使用大鼠皮层神经元证明RGM肽的作用通过开展神经元向外生长实验研究RGM肽的体外作用。为此目的，使用下列培养基制备大鼠皮层神经元|&存培养基每升90mlGB5，100ml极限必需培养基—Eagk(10x;Gibco，订货号21430.020)，用Millipore水调节至1000ml。pH7.0,280-310mosm。GB5:每升26.6gNaHC03，44.4g葡萄糖，过滤除菌。平板培养基(PM):每升0.8mM谷氨酰胺，100ml热灭活的胎牛血清(FCS)，100ml热灭活的马血清，用贮存培养基调节至1000ml。维持培养基(MM)每升0.8mM谷氨酰胺，100ml热灭活的马血清，用贮存培养基调节至1000ml。胰蛋白酶溶液在PBS中的0.1%胰蛋白酶，0.04%EDTA,无钩/镁，过滤除菌。颈脱臼法处死怀孕大鼠，打开腹腔，取出带有胚胎的子宫(胎龄18天(E18))并用PBS洗涤，由此得到皮层神经元。使用显微解剖剪纵向切开子宫，取出并暴露胚胎。通过割喉处死胚胎，取出脑并且解剖前脑皮层。皮层在1ml0.1%浓度的胰蛋白酶溶液中37°C孵育5分钟，用维持培养基(MM)终止反应，在总共10ml的MM中孵育5分钟后，用带有渐减管口直径的尖端火焰抛光的巴斯德吸管研磨。细胞悬液于1200转/分离心10分钟，并且上清液i皮吸出并丢弃。向细胞沉淀中加入8mlMM并且小心地重悬。在Neubauer计数板中计数细胞，并且在MM中将细胞数量调整至大约400000个细胞/0.2ml并预聚集。为此目的，将每孔200jul的细胞悬液置于玻璃室载玻片上(LabTek，订货号H7402)并于37°C孵育24h。在此过程中形成神经元聚集物。将10-80^的此聚集物铺于聚D-赖氨酸包被的96孑L板(例如BectonDickinsonBiocoat96孑Lblackplate#354640)的每一孔中，并且根据需要用MM补足至70-卯pl。l小时后，加入10pl体积的各种浓度的RGM肽并且根据需要用MM补足至100pl。24-48h后，首先通过在光学显孩史镜下检查来评定轴突的向外生长，然后培养物通过加入100pi的4%多聚甲醛溶液来固定并于4°C储存至少12小时。通过免疫荧光染色制备^:管蛋白细胞骨架的所有步骤，除了与一级抗体的孵育之外均在室温下进4亍。将孔用100-300piPBS洗涤一次5-15分钟，然后在100pi0.1%TritonX-100中孵育10-20分钟以透化细胞。孔用300piPBS洗涤两次5-15分钟，然后与100piPBS中的1%牛血清白蛋白溶液孵育60分钟。一级抗体(例如Sigma,单克隆抗P-微管蛋白同种型III克隆SDL3D10，#T8660;Abcam，TuJI弁abl4545)用PBS中的1%牛血清白蛋白溶液以1:1000稀释，并且以每孔50pi于4。C孵育过夜。将孔用100-300的PBS洗涤三次，5-15分钟。荧光标记的二级抗体(JacksonImmunoResearch,Cy3缀合的亲和纯化驴抗小鼠抗体#715-165-151)用PBS中的1%牛血清白蛋白溶液以1:500稀释，所述溶液还包含0.5pg/ml双苯甲亚胺(bisbenzimide，H33258)以便显示细胞核，每孔50jtl的该稀释溶液于室温醉育1-2小时或者于4°C孵育过夜。孔用100-300piPBS洗涤两次，5-15分钟，吸掉PBS，向每个孔中加入一滴(约50pl)FluoromouiitG(SouthernBiotechnologyAssociatesInc#010001)。在倒置荧光显微镜(Zeiss，Axiovert200M)中记录图^^，在每一情况下均检测所标记的二级抗体的荧光和双苯甲亚胺的荧光。借助于图像分析程序(MediaCybernetics,Image-ProPlus)确定两种荧光所覆盖的面积。为了确定轴突生长指数(AG-I)，计算二级抗体染色(染色向外生长的轴突和细胞聚集物)与双苯甲亚胺染色(染色细胞聚集物)的面积差并且除以双苯甲亚胺染色的面积。因此，该指数是轴突所覆盖面积相对于细胞聚集物大小的度量。分析方法2:在神经元生长实验中利用人皮层神经元证明RGM肽的作用人多能性癌细胞系Ntera(DSMZACC527)是一个已建立的细胞培养物模型。在本例中，轴突从细胞聚集物中生长出来并且围绕相应聚集物形成轴突冠。为此目的，将2.5x106个Ntera细胞接种于175cm2瓶中并且在10nM^见黄酸(Sigma)(培养基D-MEM(Gibco/Invitrogen31966-021)，10%胎牛血清，100u/ml青霉素，100照/ml链霉素(均来自Gibco/Invitrogen))中分化3周。然后将分化的细胞以1:6分到新的瓶中并且在无视黄酸的情况下再培养2天。附着在所得的细胞层上的神经元细胞通过去覆盖(capping)而分离并且通过在摇瓶中Neurobasal培养基(Neurobasal培养基(Gibco/Invitrogen21103-049),2mML-谷氨酰胺(Gibco/Invitrogen25030-024)，100u/ml青霉素，100照/ml链霉素(均来自Gibco/Invitrogen))中緩慢摇动过夜(在孵育箱中)而聚集。次日，将Ntera聚集物接种于聚D-赖氨酸和层粘连蛋白(Sigma)(10ng/ml)包被的96孑L平板(BiocoatPoly-D-LysineCelhvare96-WellBlack/ClearPlate(BectonDickinson#356640)中。通过加入不同浓度的待测试物质《—斤RGM肽和片段的抑制作用。分析方法3:RGMA-再生蛋白结合试验a)材料ImmunoPlate:Cert.MaxiSorpF96(NUNC，439454)重组人RGMA，R&DSystems;产品号2495-RM(260照/ml)重组人再生蛋白Fc，Abbott;Ludwigshafen(ALU1514/122;425照/ml)过氧化物酶缀合的、亲和纯化的小鼠抗人IgGFc片段Ab(JacksonImmunoResearch,Code:209-035-098(0.8mg/ml))显色底物ImmunoPureTMB底物试剂盒(Pierce，#34021)硫酸(Merck，#4.80354.1000)b)方法1.RGMA结合至immunoplate:50mMNa2C03中的2.5照/mlRGMA(R&D)(50pl/孔)37。C孵育1小时2.洗涤步骤用PBS/0.02%Tween20(100pl/孑L)洗涤3次3.非特异性结合位点的封闭用PBS/0.02%Tween中的3%BSA(200pl/孔)封闭37。C孵育1小时4.再生蛋白结合加入在1%BSAPBS/0.02%Tween中稀释的(最初浓度1照/ml)再生蛋白37。C孵育1小时5.洗涤步骤用PBS/0.02%Tween20(100pl/孑L)洗涤3次6.所结合再生蛋白的抗体检测加入HRP偶联的小鼠抗人IgGFc片段Ab(在PBS/1%BSA中以1:2500稀释)(50jniy孔)37。C孵育l小时一-丄、a，v*7.沈欲，银用PBS/0.02%Tween20(100j^l/孔)洗涤3次8.显色加入50^U/孔显色底物(ImmimoPureTMB底物，Pierce)室温孵育1-30分钟用50pi2.5MH2SCV孔终止反应2.制备实施例制备实施例1:在哺乳动物细胞中制备RGMA蛋白质片段为了在轴突生长和再生蛋白结合分析试验方法中表征活性RGMA结构域，在哺乳动物细胞(HEK293)中以AP融合蛋白形式表达了RGMA(AA168-422)和70-80个氨基酸大小的RGMA片段(片段1:169-238;片段2:218-284;片段3:266-335;片段4:316-386;片段5:369-238;和片段6:168-422))。为此目的，将编码各个片段的DNA克隆进栽体pDESTAP/ccdb/Myc/His(Invitrogen，GatewayVektorSystem)(AP-碱性磷酸酶；PPC-前切割蛋白酶(PreScissonprotease))。为此目的，通过PCR从RZPD克隆(克隆AL136826(DKFZp434D0727);公布的RZPD序歹'J:BC015886,AL136826))扩增编码各个片段的DNA。下列寡核苷酸用于该目的片段169-238:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTTCTGGAA(3TTCTGTTCCAGGGGCCCCCACACCTCAGGACTTTCACCGAC(SEQIDNO:11)G(3GGACCACTTTGTACAAGAAAGCTG(5GTC3CTCGTCCATCTCAGCCTGGTACACC(SEQIDNO:12>片段218-284:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGfCTTTCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCATrATrTTCAAGAACTTCCAGGAGTGTG(SEQIDNO'13>,wbmobAbe^GCCCATCATC^GGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGGCGCACCACGATGGTGGTG卿IDNO:片段316-386:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTTCTGGAAGTTCTGTTCCAGC3GGCCCTCAGGCCAGCACGTGGAGATCC(SEQIDNCM5)^'t^AGQGG^G右CCAC^GTACMG媒GCTGGGTCCTCAGCATTGGTGTGGAAGGCC(SEQ,D片段266-335:GGGGACAAGTTrGTACAAAAAAGCAGGCTTTCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCCTGCGGGGCTGCCCCCTC(SEQIDNO:17)GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGCCCGTGGTGAGGAGGTCG(SEQIDNO:18)片段368-422:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTTCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCCTGCCGGTGGAGGACCTGTAC(SEQIDNO:19>GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTGCCTGGCAGGTCCCGAGTC(SEQIDNO:20)片段169-422:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTTCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCCCACACCTCAGGACTTTCACCGAC(SEQIDNO:21)GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTGCCTGGCAGGTCCCGAGTC(SEQIDNO:22)通过特异性重组(attLxattR)将得到的PCR产物克隆入载体pDESTAP/ccdb/Myc/His，并且通过测序检查正确序列。HEK293细胞(ATCCCRL1573)用质粒转染。为此，在转染前一天，将细胞以80%的密度接种于15cm平板中。次日，按照厂商的方法将DNA与Lipofectamine2000(Invitrogen)混合，并与细胞孵育12小时。随后在选择培养条件下(D-MEM(Gibco/Invitrogen31966-021)，10%胎牛血清，100u/ml青霉素，100jiig/ml链霉素(均来自Gibco/Invitrogen)，150照/mlzeocin/Invitrogen)再培养4周，之后通过检测生长培养基中的碱性磷酸酶来选择稳定表达的克隆。为了产生蛋白质，将稳定表达的细胞在生长培养基中扩增，当达到70%汇合时，转移至生产培养基中(Pro293培养基(BioWhittaker/Cambrex，12-764Q),2mM谷氨酰胺(Invitrogen))。在再培养4天后，收获生产培养基，去除细胞碎片并且通过膜浓缩器(Vivaspin30)浓缩。然后，所表达的AP-RGM融合蛋白通过Ni-螯合亲和层析从上清液中纯化。为此目的，Ni-NTA-琼月旨(Qiagen)在緩冲液A(50mMHEPES-KOH，lOOmMNaCl,10%甘油，10mM咪唑)中平衡。然后，浓缩的上清液与Ni-NTA-琼脂在旋转情况下于4°C孵育1小时。通过离心将Ni-NTA-琼脂洗涤三次，然后用洗脱緩冲液(含250mM咪峻的緩冲液A)洗脱结合的蛋白质。借助于斑点印迹、SDS-PAGE和Western印迹分析开展对蛋白质的分析。通过Bradford蛋白质测定和AP浓度的ELISA测定来确定浓度。3.示例性实施方案示例性实施方案1:用表达再生蛋白的HEK293细胞分析片段b)—般先前已知，鸡的活性RGMA蛋白质的生长抑制活性位于M酸位置150和350之间的区域。因此制备了覆盖该范围的人RGMA蛋白质片段。在其表面上内源性携带RGM受体的HEK293细胞用这些片段转染，以便制备产生各个蛋白质片段并且将它们释放进入培养基中的克隆化细胞培养物。所有片段均作为与碱性磷酸酶连接的融合蛋白质产生。在这些细胞中活性结构域的存在应使其本身可以通过较低的细胞增殖、增加的细胞死亡和/或改变的细胞-基底粘附而被注意到。当然，增加的细胞死亡和较差的增殖对活性片段的产生量具有直接的影响。所产生片段的量借助于半定量斑点印迹试验评定。b)方法将在制备实施例1中所制备的RGMA片段导入HEK293细胞。在培养基(D-MEM(Gibco/Invitrogen31966-021)，10%胎牛血清，100u/ml青霉素，100照/ml链霉素(均来自Gibco/Invitrogen)，150照/mlzeocin(Invitrogen))中培养稳定转染的细胞至汇合。然后，将1ml培养上清通过狭缝印迹槽中的硝酸纤维素膜(Sartorius)过滤。固定在膜上的AP-RGM融合蛋白通过检测碱性磷酸酶活性(通过将硝酸纤维素膜与NBT/BCIP底物(Roche)孵育)检测。所产生的活性片段的量借助于半定量斑点印迹试验确定。基于该分析试验，稳定的细胞克隆被分成下列几类-强生产性细胞克隆(S生产者)-适度强生产性克隆-弱生产性克隆-非生产性克隆(O生产者)。此外，确定了强生产性克隆与非生产性克隆的比率。c)结果对于所分析的各个RGMA片段得到下列数值片段比率强生产性细胞克隆的<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>在该分析试验中片段3和6尤其显示具有显著的活性。示例性实施方案2:在神经纤维生长分析试验中研究合成的RGMA肽为此目的，合成了下列RGMA肽并且在上述的神经纤维生长分析试验中(分析方法1和分析方法2)分析不同浓度的RGMA肽肽1:AA267-285肽2:AA308-325肽3:AA358-377肽4:AA378-400(编号基于SEQIDNO:2)在目前所分析的肽当中，肽1可靠地且可重复地显示抑制活性。因此可以推测肽l(AA267-285)形成了RGM蛋白质的活性结构域的一部分。实验结果示于图3A,B，C和4A，B。图3A显示，与肽4相比，在用大鼠神经元细胞进行的实验中(分析方法1)，10照/ml浓度的肽1明显抑制神经纤维生长。图3B表明不同浓度(0-30pg/ml)的肽1对皮层神经元神经纤维生长的影响。在大于3pg/ml和更高的浓度时可检测到显著的抑制活性。与^目反，在相同条件下肽4没有显示出活性(参见图3C)(AG-I=轴突生长指数，相当于神经元聚集物与相关轴突的总面积减去聚集物的面积)。图4A表明，肽1而非肽4在30照/ml的浓度时(分析方法2)显著抑制人Ntera细胞的神经纤维生长。图4B表明所观察到的肽1的抑制作用具有统计学显著性。示例性实施方案3:在神经纤维生长分析试验中研究合成的RGMA片段在轴突生长试验(参见上面的分析方法2)中使用人Ntera神经细胞分析了如制备实施例1中制备的并列于下面的6个不同的RGMA片段的抑制活性。片段l:氨基酸169-238片段2:氨基酸218-284片段3:氨基酸266-335片段4:氨基酸316-386片段5:^J^酸369-422片段6:氨基酸168-422(每一例中的编号基于SEQIDNO:2)结果总结于后附的图5A，B和C。在Ntera向外生长试验中，总共分析了6个不同的RGMA片段。片度2，3和6具有活性，而片段l，4和5不具有活性。片段6对应于活性的、完全加工的RGMA蛋白质(其也已经在体内描述过)。从这些资料中可以知道，人RGMA蛋白质的重要的神经纤维生长抑制性结构域位于片段2和3的区域中，即在^J^酸218和335之间。为了更准确地表征该抑制性结构域，因此在下一步中分析来自片段2和3的区域中的短RGMA肽。示例性实施方案4:在神经纤维生长分析试验中研究合成的RGMA肽在轴突生长分析试验中(参见上面的分析方法2)分析下表中所示的肽。表合成与肽1邻近的RGMA肽并且用于轴突生长分析试验中<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>在示例性实施方案2中已经分析了肽1。实验结果示于图6A和B。在Ntera生长分析试验中，在所分析的RGMA肽当中有三个导致神经纤维生长极大降低(图6A)。这些活性RGMA肽是如下肽肽1、肽down-l和肽up-l。无活性或仅微弱活性的肽是下列肽肽5-Ak，肽6-Ak和肽7-Ak(图6B)。这表明，RGMA的抑制性结构域之一位于由三个活性RGMA肽固定下来的区域，即大约从位置250延伸至300的人RGMA蛋白质区域，特别是大约260-291，因此包括从位置267至285的核心区(参见SEQIDNO:7，8)。基于肽6-Ak和7-Ak的活性(该两个肽显示在较高的肽浓度下具有抑制生长的趋势(图6B))，完全可以想到RGMA具有其它的抑制性结构域并且因此本发明也涉及位于大约210-260和大约290-350区域中的结构域。示例性实施方案5:用抗体中和RGMA的抑制性结构域该实验的目的是检查针对RGMA抑制性结构域的活性肽产生的多克隆抗体是否能够阻断RGMA与其受体再生蛋白的相互作用以及是否能够体外中和最有效的RGMA活性片段2(参见示例性实施方案2)的神经纤维生长抑制作用。使用肽down-l作为例子，因为其构成活性RGMA片段2的一部分。与载体蛋白(LPH)偶联后，该肽用于按照下面方案免疫2只兔。<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>在几次免疫之后，纯化产生的down-l特异性抗体并且在多种分析试验系统中采用。a)RGMA-再生蛋白结合分析试验该方法如在分析方法3中所述开展；实验结果示于图7A。b)在轴突生长分析试验中对活性RGMA片段的中和作用针对肽down-l产生的多克隆抗体非常有效地阻断RGMA蛋白质与其受体再生蛋白的相互作用。因此，在接下来的分析中，研究了down-l特异性抗体是否能够中和非常有力的RGMA片段2(参见示例性实施方案3)。方法如在分析方法2中所述开展；实验结果示于图7B。总之，在RGMA再生蛋白结合分析试验中抗肽down-l的多克隆抗体阻止了再生蛋白与RGMA的相互作用，并且在轴突生长分析试验中其几乎完全中和了RGMA片段的抑制性活性。因此，位于RGMA蛋白质的氨基端氨基酸250至300、特别是260至291之间的区域对于其抑制性活性而言特别重要，并且因此,皮描述为新的功能相关结构域。权利要求1.排斥性引导分子(RGM)的再生蛋白受体结合结构域。2.权利要求1所述的再生蛋白受体结合结构域，其衍生自哺乳动物RGM。3.权利要求1或2所述的再生蛋白受体结合结构域，其衍生自如SEQIDNO:2所示的人RGMA，如SEQIDNO:4所示的人RGMB或如SEQIDNO:6所示的人RGMC。4.如前述权利要求任何一项所述的再生蛋白受体结合结构域，其包含来自相对于RGD切割位点而言的C-端以及相对于GPI锚区域而言的N-端的RGMM酸序列区域的、长度不超过150个连续氨基酸残基的氨基,列。5.如前述权利要求任何一项所述的再生蛋白受体结合结构域，其特征在于如SEQIDNO:7所示的下列部分序列GX^VEXAAXsYIGTTXAXgRQ其中&至X8是任何氨基酸残基。6.如前述权利要求任何一项所述的再生蛋白受体结合结构域，其包含来自如SEQIDNO:2所示^J^酸位置200-350、来自如SEQIDNO:2所示"^酸位置200-325、或来自如SEQIDNO:2所示^J^酸位置200-300、或来自如SEQIDNO:2所示氨基酸位置200-285、或来自如SEQIDNO:2所示氨基酸位置250-285、或来自如SEQIDNO:2所示氨基酸位置260-285、或来自如SEQIDNO:2所示氨基酸位置215-340、或来自如SEQIDNO:2所示^J^酸位置260-340、或来自如SEQIDNO:2所示氨基酸位置250-300、或来自如SEQIDNO:2所示^J^酸位置260-291、或来自如SEQIDNO:2所示氨基酸位置210-260、或来自如SEQIDNO:2所示氨基酸位置290-350的M酸序列，或其功能性的再生蛋白受体结合片段。7.再生蛋白受体结合结构域或其结合片段，其包含来自如SEQIDNO:2所示位置260-291或267-285的序列区域、来自如SEQIDNO:4所示位置260-325的序列区域、或者来自如SEQIDNO:6所示位置250-300的序列区域的至少10个连续氨基酸残基。8.如前述权利要求任何一项所述的再生蛋白受体结合结构域的抗原性多肽片段。9.如权利要求8所述的抗原性多肽片段，其可以用于产生调节RGM与再生蛋白受体结合的免疫球蛋白分子。10.如权利要求8所述的抗原性多肽片段，其包含具有如SEQIDNO:7、8、9、10或23-29或31-34所示序列之一的肽的至少10个连续氨基酸残基。11.如权利要求1-7中任何一项所述的再生蛋白受体结合结构域或者如^5l利要求7-9中任何一项所述的多肽片段在制备抗RGM的多克隆抗血清或单克隆抗体中的用途。12.如权利要求11所述的用途，其中抗血清或抗体可以调节RGM与再生蛋白受体的结合。13.如权利要求11或12所述的抗RGM的多克隆抗血清或单克隆抗体，其用于诊断或治疗。14.如权利要求13所述的多克隆抗血清或单克隆抗体在制备用于诊断或治疗由再生蛋白受体与RGM或RGM片段的相互作用介导的疾病或疾病状态的药物组合物中的用途。15.如权利要求14所述的用途，其中疾病或疾病状态选自a)头骨，脑和脊髓的机械性损伤，b)l曼性病如神经变性病，炎性疾病和自身免疫病，c)神经元再生、轴突出芽、轴突延伸和神经元可塑性的损害，d)肿瘤病和肿瘤转移。16.如权利要求1-6中任意一项所述的再生蛋白受体结合结构域或者权利要求8-10中任意一项所述的多肽片段在制备用于诊断或治疗由被破坏的或损伤的RGM或RGM片段与相关受体的相互作用所介导的疾病或疾病状态的组合物中的用途。17.如权利要求16所述的用途，其中疾病或疾病状态选自a)由过度轴突出芽和/或病理性突触发生所导致的、精神病和慢性疼痛相关的、改变的轴突发生过程，b)与受损的4失代谢相关的病症，c)与受损的骨生长相关的病症，d)与退行性软骨改变相关的病症，e)与推间盘和推骨损伤相关的病症，f)与失调的、不受控制的细胞迁移过程相关的病症。18.如权利要求1-7中任意一项所述的再生蛋白受体结合结构域或权利要求8-10中任意一项所述的多肽片段作为靶标用于检测或鉴定RGM结合配体的用途。19.如权利要求1-7中任意一项所述的再生蛋白受体结合结构域或权利要求8-10中任意一项所述的多肽片段作为免疫原用于主动或被动免疫的用途。20.可以通过使用抗原量的如权利要求1-7中任意一项所述的再生蛋白受体结合结构域或权利要求8-10中任意一项所述的多肽片段免疫哺乳动物得到的多克隆抗血清。21.适当时人源化形式的、抗如权利要求1-7中任意一项所述的再生蛋白受体结合结构域或权利要求8-10中任意一项所述的多肽片段的单克隆抗体，或其抗原结合片段。22.包含可药用载体和至少一种选自下列的活性成分的药物组合物a)如权利要求1-7中任意一项所述的再生蛋白受体结合结构域或权利要求8-10中任意一项所述的多肽片段，b)如权利要求20或21所述的单克隆或多克隆抗体。23.如权利要求22所述的药物组合物，其用于鞘内施用、静脉内施用、皮下施用、口服或肠胃外施用、经鼻施用或吸入施用。24.表达载体，其包含与至少一个调节性核酸序列有效连接的至少一个编码核酸序列，所述编码核酸序列编码如权利要求1-7中任意一项所述的再生蛋白受体结合结构域或者如权利要求8-10中任意一项所述的多肽片段。25.重组微生物，其含有至少一种如权利要求24所述的载体。26.产生如权利要求21所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。27.用于产生如权利要求1-7中任意一项所述的再生蛋白受体结合结构域或如权利要求8-10中任意一项所述的多肽片段的方法，其中培养如权利要求25所述的重组微生物，并且从培养物中分离所产生的蛋白质产物。28.用于产生如权利要求21所述的单克隆抗体的方法，其中培养如权利要求26所述的杂交瘤细胞系，并且从培养物中分离所产生的蛋白质产物。全文摘要本发明涉及鉴定和使用排斥性引导分子(RGM)蛋白质家族成员的再生蛋白受体结合结构域及衍生自其的多肽片段。本发明结构域，即，肽片段，适宜作为药剂用于主动或被动免疫个体以及作为诊断和治疗剂用于起源或进程涉及RGM家族成员和该分子的细胞受体的疾病或病理状况。本发明还涉及抗本发明结合结构域和抗由其衍生的多肽的单克隆抗体和多克隆抗体，以及制备本发明结构域、多肽和抗体的方法。文档编号C07K16/28GK101277974SQ200680036346公开日2008年10月1日申请日期2006年9月29日优先权日2005年9月30日发明者B·K·米勒,G·舍费尔,R·米勒申请人:阿伯特有限及两合公司