经标记的牛病毒性腹泻病毒疫苗的制作方法

专利名称：经标记的牛病毒性腹泻病毒疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种经标记的牛病毒性腹泻病毒疫苗。

背景技术：
牛病毒性腹泻病毒(BVD病毒，或BVDV)是一种瘟病毒属(Pestivirus)黄病毒科(Flaviviridae)的小RNA病毒。其与作为羊边缘病和猪典型猪瘟的病原体的病毒密切相关。BVDV导致的疾病广泛传播，并且在经济上能够造成毁灭性打击。BVDV能够导致牛群的繁殖问题，并且能够导致流产或早产。BVDV能够透过孕牛的胎盘，可能导致生下持久性感染(persistently viremic，PI)的小牛，这些小牛对病毒具有免疫耐受性，并且在它们的余生中都会持续性地在血中带有病毒(Malmquist，J.Am.Vet.Med.Assoc.152763-768(1968)；Ross等，J.AmVet.Med.Assoc.188618-619(1986))。感染牛还会具有“粘膜病”，该疾病的特征在于温度升高、腹泻、咳嗽和患部粘膜溃疡(Olafson等，CornellVet.36205-213(1946)；Ramsey等，NorthAm.Vet.34629-633(1953))。这些持续性感染的动物提供了牛群中进一步爆发粘膜病的病毒散播源(Liess等，Dtsch.Tieraerztl.Wschr.81481-487(1974))，并且非常容易被微生物感染而引起肠道疾病或肺炎(Barber等，Vet.Rec.117459-464(1985))。
BVD病毒被分类为两种生物型之一。“cp”生物型的那些在培养细胞中诱发细胞病理效应，而“ncp”生物型的那些则不会(Gillespie等，Cornell Vet.5073-79(1960))。此外，识别了两种主要的基因型(1型和2型)，二者均显示引发多种临床综合征(Pellerin等，Virology 203260-268(1994)；Ridpath等，Virology 205-66-74(1994))。BVD病毒体(virion)的直径为40-60纳米。BVDV的核衣壳(nucleocapsid)由单个RNA分子和衣壳蛋白C组成。核衣壳被其中锚定有两个糖蛋白(E1和E2)的脂质膜所围绕。第三糖蛋白Ems与包膜(envelope)松散地相连。BVDV基因组的长度为约12.5kb，并且含有单个开放的读取框(open reading frame)，该读取框位于5’和3’-非转译区(NTR)之间(Collett等，Virology165191-199(1988))。约438kD的多蛋白(polyprotein)由该开放读取框转译，并被细胞蛋白酶和病毒蛋白酶处理成至少11种病毒结构蛋白和非结构(NS)蛋白(Tautz等，J.Virol.71-5415-5422(1997)；Xu等，J.Virol.715312-5322(1997)；Elbers等，J.Virol.704131-4135(1996)；以及Wiskerchen等，Virology 184341-350(1991))。BVDV的基因顺序为p20/Npro、p14/C、gp48/Erns、gp25/E1、gp53/E2、p54/NS2、p80/NS3、p10/NS4A、p32/NS4B、p58/NS5A和p75/NS5B。p20/Npro(Stark等，J.Virol.677088-7093(1993)；Wiskerchen等，Virol.654508-4514(1991))是顺式作用的类木瓜酶蛋白酶，其可以将其自身从合成蛋白的其余部分上裂解。衣壳蛋白(C)，也称为p14，是一种碱性蛋白，其在染色体RNA的封装和包被(enveloped)病毒体的形成中发挥作用。p14/C是不同瘟病毒之间的保留性基因组。三种包被蛋白，gp48/Erns、gp25/E1和gp53/E2均经重度糖基化。Erns形成通过二硫键共价连接的同型二聚体。不存在疏水膜锚定区，显示Erns与包膜松散地相连。Erns在感染牛中诱发高抗体效价(titer)，但是抗血清(antisera)限制了病毒中和活性。发现E1在病毒体中通过二硫键与gp53/E2共价连接。E1含有两个用于将蛋白锚定在膜中的疏水区，并且作为引发移位(translocation)的信号多肽。E1不会在感染牛中诱发明显的抗体反应，这显示其并未暴露在病毒体表面。与E1类似，E2也在其C-端具有膜锚定区。但是，与E1不同，E2非常具有抗原性(antigenic)，其是BVDV的最具免疫显性(immunodominant)的蛋白之一。与E2结合的抗体可以有效地中和病毒感染，显示其可能涉及病毒入侵。结构蛋白下游的多蛋白区编码非结构蛋白，并且被两种病毒解蛋白酶(viral proteolytic enzyme)处理。NS2-NS3结合被NS2编码的锌依赖蛋白酶(zinc-dependent蛋白酶)裂解。编码NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B的BVDV多蛋白的C-端部分被NS3的N-端域所编码的丝氨酸蛋白酶处理。NS3是另一种主要的BVDV免疫原(immunogen)，因为感染牛对其显示强烈的体液反应(strong humoral response)。相反，在BVDV感染的牛中未发现对其它非结构蛋白的血清抗体，而仅仅能够检测到对NS4A的弱体液免疫反应。
在细胞致病性BVDV分离株中排他性地发现NS3，且根据BVDV亚型与其它瘟病毒之间的比较，编码该蛋白的区域是BVDV基因组中最具保留性的区域之一。NS3的C-端部分编码RNA-依赖型NTP酶(NTPase)/解螺旋酶，根据高保留性解螺旋酶氨基酸序列之间的比较，BVDV解螺旋酶被分类为解螺旋酶超科-2(SF2)。在该超科中，有得自马铃薯y病毒(poty virus)、黄病毒和瘟病毒的类似蛋白，包括猪霍乱(典型猪瘟)病毒NS3解螺旋酶和得自其它黄病毒如西尼罗河病毒(WestNile virus)、黄热病病毒、丙型肝炎病毒(HCV)和日本脑炎病毒的RNA解螺旋酶。HCV NS3的蛋白酶域和解螺旋酶域的分子结构已经被破译(Yao等，Nat Struct Biol.4463-7(1997)；Jin和Peterson，Arch BioxchemBiophys 32347-53(1995))。蛋白酶域包括双筒状折叠，其常见于胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶族成员中。解螺旋酶域含有两个结构相关的β-α-β子域、以及由7个螺旋和3个短β股组成的第三子域，后者通常称为解螺旋酶α-螺旋子域。三磷酸核苷(NTP)和RNA-结合位点以及解螺旋酶活性位点暴露在表面上，而蛋白酶位点则否，其面对解螺旋酶域取向。蛋白酶和解螺旋酶域通过短的表面暴露股共价连接，并且在大表面积上(

)上相互作用。但是，解螺旋酶活性位点远离该相互作用区取向。
目前可用的BVDV疫苗有那些含有化学上不活泼的野生型病毒的疫苗(McClurkin等，Arch.Virol.58119(1978)；Fernelius等，Am.J.Vet.Res.331421-1431(1972)；以及Kolar等，Am.J.Vet.Res.331415-1420(1972))。这些疫苗通常需要多次给药，并引起短期免疫反应，它们还不能防止病毒传递给胎儿(Bolin，Vet.Clin.North Am.Food Anim.Pract.11615-625(1995))。对于羊，已经报道了基于纯化E2蛋白的亚单位疫苗(Bruschke等，Vaccine 151940-1945(1997))。尽管该疫苗显示保护胎儿免于被感染，但是保护仅限于病毒的同源菌株，而且在抗体效价和保护之间没有关联。
已经使用下述病毒来制造修饰(modified)活病毒(MLV)BVDV疫苗该病毒通过在牛或猪细胞中重复传代(passageing)来减毒(attenuated)(Coggins等，Cornell Vet.51539(1961)；以及Phillips等，Am.J.Vet.Res.36135(1975))，或者通过为病毒赋予温度敏感性表现型的化学诱导突变来减毒(Lobmann等，Am.J.Vet.Res.452498(1984)；和Lobmann等，Am.J.Vet.Res.47557-561(1986))。已经证明单剂MLV BVDV疫苗足以提供对感染的保护，且免疫有效期在接种疫苗的牛中能够延续多年(Coria等，Can.J.Con.Med.42239(1978))。此外，已经报道了使用MLV疫苗时的交叉保护(Martin等，在“Proceedings of the Conference ofResearch Workers in Animal Diseases”，75183(1994)中)。但是，包括疫苗菌株向胎儿传播在内的安全考量是使用这些修饰活病毒疫苗的主要考虑因素(Bolin，Vet.Clin.NorthAm.Food Anim.Pract.11615-625(1995)). 基于以上说明，很明显需要更有效的新型疫苗以控制BVDV的传播。这种疫苗在未来的国家或地区性BVDV根除计划中可能是非常宝贵的，而且还能够与其它经标记的牛疫苗组合，表示畜牧业中的重大进展。一种这样的疫苗是“经标记”的疫苗。这种疫苗缺少野生型病毒中存在的免疫原决定子(determinant)。被野生型病毒感染的动物出现对“标记”免疫原决定子的免疫反应，而接种疫苗的未感染动物则不会，因为在经标记的疫苗(marked vaccine)中不存在决定子。通过使用针对标记决定子的免疫检测分析，能够将感染动物与接种疫苗的未感染动物区分开来。通过将感染动物剔除出来，牛群能够随时间而变成无BVD的。除了去除BVD疾病威胁的好处之外，作为无BVD牛群的证明具有直接自由贸易的经济利益。


发明内容
本发明涉及一种牛病毒性腹泻病毒，其包括至少一个解螺旋酶域氨基酸突变，其中NS3域中的突变导致野生型NS3的单克隆抗体丧失识别力，但是其中病毒性RNA的复制和传染性病毒的产生仍然保留。
本发明还涉及一种经标记的新型牛病毒性腹泻病毒疫苗，其包括具有至少一个解螺旋酶域氨基酸突变的牛病毒性腹泻病毒，其中NS3不被NS3标准单克隆抗体如20.10.6、1.11.3、21.5.8和24.8所识别，但其中病毒RNA的复制和传染性病毒的产生仍然保留。
本发明还涉及一种检测动物属于下述何种情况的方法已经接种疫苗、或者未接种或感染BVDV。
在本发明的一个实施方式中，提供了一种包括至少一个解螺旋酶域氨基酸突变的牛病毒性腹泻病毒，其中NS3的解螺旋酶域突变导致野生型牛病毒性腹泻病毒的NS的单克隆抗体丧失识别力，但是其中病毒性RNA的复制和传染性病毒的产生仍然保留。
在本发明的另一个实施方式中，提供了一种包括至少一个解螺旋酶域氨基酸突变的牛病毒性腹泻病毒，其中NS3不被NS3的单克隆抗体所识别，且其中NS3抗体选自20.10.6、1.11.3、21.5.8和24.8，但其中病毒性RNA的复制和传染性病毒的产生仍然保留。
在本发明的另一个实施方式中，病毒疫苗包括单个解螺旋酶域氨基酸突变。
在本发明的另一个实施方式中，病毒疫苗包括在IGR环(IGR loop)中的解螺旋酶域突变。
在本发明的另一个实施方式中，牛病毒性腹泻病毒包括在IGR环中在氨基酸残基1841处的解螺旋酶域突变. 在本发明的另一个实施方式中，牛病毒性腹泻病毒包括在IGR环中在氨基酸残基1843处的解螺旋酶域突变。
在本发明的另一个实施方式中，牛病毒性腹泻病毒包括在IGR环中在氨基酸残基1845处解螺旋酶域突变。
在本发明的另一个实施方式中，牛病毒性腹泻病毒包括在KHP环中的解螺旋酶域突变。
在本发明的另一个实施方式中，牛病毒性腹泻病毒包括在KHP环中在氨基酸残基1867处的解螺旋酶域突变。
在本发明的另一个实施方式中，牛病毒性腹泻病毒包括在KHP环中在氨基酸残基1868处的解螺旋酶域突变。
在本发明的另一个实施方式中，牛病毒性腹泻病毒包括在KHP环中在氨基酸残基1869处的解螺旋酶域突变。
在本发明的另一个实施方式中，牛病毒性腹泻病毒包括在SES环中的解螺旋酶域突变。
在本发明的另一个实施方式中，牛病毒性腹泻病毒包括在SES环中在氨基酸残基1939处的解螺旋酶域突变。
在本发明的另一个实施方式中，牛病毒性腹泻病毒包括在SES环中在氨基酸残基1942处的解螺旋酶域突变。
在本发明的另一个实施方式中，牛病毒性腹泻病毒包括两个、三个或四个解螺旋酶域氨基酸突变。
在本发明的另一个实施方式中，牛病毒性腹泻病毒包括两个解螺旋酶域突变。
在本发明的另一个实施方式中，牛病毒性腹泻病毒包括在IGR环中的两个解螺旋酶域突变。
在本发明的另一个实施方式中，牛病毒性腹泻病毒包括在IGR环中在氨基酸残基1843和1845处的两个解螺旋酶域突变。
在本发明的另一个实施方式中，牛病毒性腹泻病毒包括在SES环中的两个解螺旋酶域突变。
在本发明的另一个实施方式中，牛病毒性腹泻病毒包括在SES环中在氨基酸残基1939和1942处的两个解螺旋酶域突变。
在本发明的另一个实施方式中，牛病毒性腹泻病毒包括三个解螺旋酶域突变。
在本发明的另一个实施方式中，牛病毒性腹泻病毒包括在IGR环中的三个解螺旋酶域突变。
在本发明的另一个实施方式中，牛病毒性腹泻病毒包括在IGR环中在氨基酸残基1867、1868和1869处的三个解螺旋酶域突变。
在本发明的另一个实施方式中，牛病毒性腹泻病毒包括在IGR环和SES环中在氨基酸残基1845、1868和1939处的三个解螺旋酶域突变。
在本发明的一个特别优选的实施方式中，提供了一种经标记的牛病毒性腹泻病毒疫苗，其包含包括至少一个解螺旋酶域氨基酸突变的牛病毒性腹泻病毒，在该病毒中，NS3的解螺旋酶域突变导致引起野生型牛病毒性腹泻病毒的NS3的单克隆抗体丧失识别力，但其中病毒性RNA的复制和传染性病毒的产生仍然保留。
在本发明的另一个实施方式中，提供了一种区分被牛腹泻病毒感染的动物与用牛腹泻病毒疫苗接种的动物的方法。在该实施方式中，牛腹泻病毒疫苗是包括至少一个解螺旋酶域氨基酸突变的经标记的疫苗，且该方法包括 从试验动物上获得试样； 在试样中检测牛腹泻病毒；和 检测牛腹泻病毒是否包含突变。
在本发明的另一个实施方式中，检测牛腹泻病毒的方法使用至少一个单克隆抗体。
一种优选的方法包括包含在NS3的解螺旋酶域中的解螺旋酶域氨基酸突变的经标记的疫苗。
例如，该区分检测方法的实施方式可以包括以下步骤 向试样中加入能够检测野生型牛腹泻病毒或能够检测突变牛腹泻病毒的经标识的抗体(labelled antibody)，其中该试样含有来自试验动物的体液；以及 通过将至少一种单克隆抗体与野生型牛腹泻病毒或突变牛腹泻病毒接触，来测量经标识的抗体与野生型牛腹泻病毒或与突变牛腹泻病毒的结合亲和力；以及 通过比较使用单克隆抗体与野生型BVDV的结合亲和力结果相对于单克隆抗体与具有突变NS3的BVDV的结合亲和力结果，来确定试验动物的疫苗接种状态。
优选方法包括加入针对不同于突变NS3的域的经标识的第一抗体；和 加入针对NS3突变部分的经标识的第二抗体。
在该方法的一个实施方式中，第一抗体针对野生型病毒。
在该方法的另一个实施方式中，第二抗体针对NS3的突变部分。
在该方法的另一个实施方式中，第二抗体针对NS3，并且选自20.10.6、1.11.3、21.5.8和24.8。
在该方法的另一个实施方式，第二抗体针对选自IGR环、KHP环和SES环的至少一个NS3突变部分。
在该方法的另一个实施方式中，牛病毒性腹泻病毒包括在IGR环中在选自1841、1843和1845的氨基酸残基处的至少一个解螺旋酶域氨基酸突变。
在该方法的另一个实施方式中，牛病毒性腹泻病毒包括在KHP环中在选自1867、1868和1869的氨基酸残基处的至少一个解螺旋酶域氨基酸突变。
在该方法的另一个实施方式中，牛病毒性腹泻病毒包括在SES环中在选自1939和1942的氨基酸残基处的至少一个解螺旋酶域氨基酸突变(mutation)。
在该方法的另一个实施方式中，牛病毒性腹泻病毒包括在IGR环和SES环中在氨基酸残基1845、1868和1939处的至少一个解螺旋酶域氨基酸突变。



参考以下说明、所附权利要求和附图来举例说明本发明的这些和其它特征、方面和优点，其中 图1描绘了NS3域。
图2显示了BVDV和HCV解螺旋酶域的序列校准。
图3显示了BVDV解螺旋酶分子结构的图示。
图4显示了扫描突变体的位置。
图5显示了完整全长(complete full length)BVDV前体和BVDV亚病毒复制子结构的域图(domain map)。
序列表说明 SEQ ID NO.1是来自牛病毒性腹泻病毒的全长未处理多蛋白。该序列中的残基编号对应于本文所述的突变。例如，被描述为“K1845A”的突变表示SEQ ID NO.1的1845位置处的赖氨酸残基已经被置换为丙氨酸残基； SEQ ID NO.2是侧出(flank)于p15aDI克隆位点(cloning site)的5’端以产生示例性突变的DNA质粒碎片序列； SEQ ID NO.3是侧出于p15aDI克隆位点的3’端以产生示例性突变的DNA质粒碎片序列； SEQ ID NO.4是用于导入本文所述的I1841A突变的DNA 5’引物(primer)序列； SEQ ID NO.5是用于导入本文所述的I1841A突变的DNA 3’引物序列； SEQ ID NO.6是用于导入本文所述的R1843A突变的DNA 5’引物序列； SEQ ID NO.7是用于导入本文所述的R1843A突变的DNA 3’引物序列； SEQ ID NO.8是用于导入本文所述的K1845A突变的DNA 5’引物序列； SEQ ID NO.9是用于导入本文所述的K1845A突变的DNA 3’引物序列； SEQ ID NO.10是用于导入本文所述的K1867A突变的DNA 5’引物序列； SEQ ID NO.11是用于导入本文所述的K1867A突变的DNA 3’引物序列； SEQ ID NO.12是用于导入本文所述的H1868A突变的DNA 5’引物序列； SEQ ID NO.13是用于导入本文所述的H1868A突变的DNA 3’引物序列； SEQ iD NO.14是用于导入本文所述的P1869A突变的DNA 5’引物序列； SEQ ID NO.15是用于导入本文所述的P1869A突变的DNA 3’引物序列； SEQ ID NO.16是用于导入本文所述的E1939A突变的DNA 5’引物序列； SEQ ID NO.17是用于导入本文所述的E1939A突变的DNA 3’引物序列； SEQ ID NO.18是用于导入本文所述的R1942A突变的DNA 5’引物序列； SEQ ID NO.19是用于导入本文所述的R1942A突变的DNA 3’引物序列； SEQ ID NO.20是经转译的BVDV的NS3区的域1(解螺旋酶)和域2(NTP酶)的肽序列；且 SEQ ID NO.21是经转译的丙型肝炎病毒(HCV)的NS3区的域1(解螺旋酶)和域2(NTP酶)的肽序列 定义 以下定义可以应用于本发明实施方式的说明中所使用的术语。以下定义优先于通过引用方式并入本文的个别参考文件中所含的任何矛盾定义。
除非在本文中另行定义，本发明所使用的科技术语将具有本领域一般技术人员通常理解的含义。而且，除非上下文另外要求，单数形式的术语将包括复数含义，而复数形式的术语也将包括单数含义。
本文所使用的术语“氨基酸”是指天然和合成氨基酸、以及以与天然氨基酸相似的方式发挥作用的氨基酸类似物和拟氨基酸(aminoacid mimetic)。天然氨基酸是那些通过遗传密码(genetic code)编码的氨基酸、以及后来经过修饰的那些氨基酸，例如，羟基脯氨酸、羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。二十种常规氨基酸的立体异构体(例如D-氨基酸)、非天然氨基酸如α-氨基酸和α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其它非常规氨基酸也可以是本发明的多肽的合适组分。非常规氨基酸的例子包括4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基蛋氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸和其它类似氨基酸及亚氨酸(imino acid)。氨基酸类似物是指具有与天然氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即，碳与氢、羧基、氨基和R基团连接。示例性的氨基酸类似物包括，例如，同丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜和蛋氨酸甲基锍。这种类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但是保留了与天然氨基酸相同的基本化学结构。拟氨基酸是指其结构与氨基酸的一般化学结构不同但以与天然氨基酸相似的方式发挥作用的化合物。
在本文中，氨基酸可以以其公知的三字母符号来指代，或者用IUPAC-IUB生物化学命名委员会所推荐的一字母符号来称呼。
氨基酸-单字母代码三字母代码 全名 GGly甘氨酸 VVal缬氨酸 氨基酸-单字母代码三字母代码 全名 LLeu亮氨酸 AAla丙氨酸 IIle异亮氨酸 SSer丝氨酸 DAsp天冬氨酸 KLys赖氨酸 RArg精氨酸 HHis组氨酸 FPhe苯丙氨酸 YTyr酪氨酸 TThr苏氨酸 CCys半胱氨酸 MMet蛋氨酸 EGlu谷氨酸 WTrp色氨酸 PPro脯氨酸 NAsn天冬酰胺 QGln谷氨酰胺 XXaa未指明的氨基酸 本文所使用的术语“动物对象”表示包括任何对BVDV感染易感的动物，如牛、羊和猪。“治疗”或“疫苗接种”表示预防BVDV有毒菌株的感染或降低被其感染的风险、改善BVDV感染的症状、或加快从BVDV感染中恢复。
本文所使用的BVD“病毒”、“病毒分离株”或“病毒菌株”是指由病毒基因体、相关蛋白和其它化学成分(如脂质)组成的BVD。通常，BVD病毒具有RNA形式的基因体。RNA能够逆转录为DNA以用于克隆(clone)。因此，当本文提及核酸和BVD病毒序列时，包括病毒RNA序列和衍生自病毒RNA序列的DNA序列。为方便起见，下文的序列表中所描绘的BVD基因序列是指多肽序列和用于制造示例性突变的引物DNA序列。其各自所对应的RNA序列对本领域技术人员来说是容易和明显的。
多种I型和II型BVD病毒对本领域技术人员来说是已知的，并且可以通过，例如，American Type Culture Collection(美国种型培养收集会)得到。
本文所使用的术语“保守性氨基酸置换”是通常在其侧链相关的氨基酸族中发生的那些。特别是，本文所使用的保守性氨基酸置换是下述情况与野生型来源的多肽相比，其对指定多肽的抗体识别没有效果。基因编码的氨基酸通常分为四组(1)酸性氨基酸＝天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性氨基酸＝赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸＝丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸；和(4)无电荷极性氨基酸＝甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸还同时被分类为芳族氨基酸。
因此，本文所使用的术语“非保守性氨基酸置换”是容易具有不同性质、特别是对抗体识别可能具有不同性质的那些。因此，非保守性氨基酸置换将引起不同的免疫反应，例如，引起野生型来源多肽的抗体丧失识别力。
本文所使用的术语“致免疫(immunogenic)”是指突变BVD病毒或野生型BVD病毒在动物中激发对I型和/或II型BVD病毒的免疫反应的能力。免疫反应可以是主要由细胞毒性T-细胞介导的细胞免疫反应、或者主要由助手T-细胞(helper T-cells)介导的体液免疫反应，其又激活B-细胞导致产生抗体。
本文所使用的术语“裸DNA”是指包括编码本发明的药剂的核苷酸序列以及用于控制其产生的短启动子区的质粒。其被称为“裸DNA”的原因在于质粒没有负载在任何递送介质上。当这种DNA质粒进入宿主细胞如真核细胞时，其所编码的蛋白在细胞中转录和转译。
本文所使用的术语“质粒”是指编码可表达基因的任何核酸，包括线形或圆形核酸以及双股核酸(double strand nucleic acid)或单股核酸。核酸可以是DNA或RNA，可以包括修饰核苷酸或核糖和核苷酸，并且可以通过例如甲基化或者加入保护基或帽结构或尾结构的方式来进行化学修饰。
本发明所使用的术语“疫苗”是指预防感染或降低感染风险或改善感染症状的组合物。疫苗组合物对病原体的预防效果通常是通过在对象体内诱发免疫反应(细胞介导的免疫反应和/或体液免疫反应)来实现的。通常来说，BVDV感染发生的消除或减少、症状的改善、或者加快从感染对象中清除病毒是疫苗组合物保护效果的指示。本发明的疫苗组合物提供了对BVD病毒引起的感染的保护效果。
本文所使用的术语“媒介物”是指允许或帮助核酸从一个环境转移到另一个环境中的工具。根据本发明，例如，在重组DNA技术中使用的一些媒介物允许核酸如DNA片段(例如异源DNA片段，例如异源cDNA片段)转移到宿主或靶细胞中以便复制核酸和/或由该核酸表达的蛋白。重组DNA技术中使用的媒介物的例子包括但不限于质粒、染色体、人工染色体和病毒。

具体实施例方式 以下详细说明用于帮助本领域技术人员实施本发明。虽然如此，该详细说明不应被视为不适当地限制本发明，因为本领域技术人员在不背离本发明发现的精神或范围的情况下可以对本文所讨论的实施方式加以修改和变化。
本文所引用的各参考文件的内容，包括在这些主要参考文件中引用的参考文件的内容，通过引用的方式并入本文。
标准程序可用于传播和纯化本发明可用的质粒。用于传播质粒的优选原核宿主细胞是E.coli GM2163细胞系，但是一些其它细胞型也可以使用。从质粒转录的RNA可以通过转染而被引入能够支持病毒生产的真核宿主细胞如MDBK细胞内。病毒可以在这种宿主细胞生产，并且使用已知分离技术如蔗糖梯度离心而以高纯形式从其中分离。
在一个实施方式中，本发明提供了其中包括一种或多种上述突变BVD病毒的致免疫组合物。
本发明的另一个实施方式涉及经分离的(isolated)上述突变BVD病毒的基因核酸分子。本发明所使用的核酸分子包括RNA和DNA。
在该实施方式中，经分离的BVD病毒基因核酸分子含有I型病毒的核酸序列，其中NS3域的至少一部分在解螺旋酶域突变。
在另一个实施方式中，本发明提供了其中已经加入上述BVD病毒的基因核酸序列的媒介物。这种媒介物可以被引入适用于生产大量基因核酸分子或适用于生产后裔突变BVD病毒的宿主细胞中。媒介物可以含有其它序列成分以促进媒介物的传播、分离和次克隆(subclone)；例如，允许在细菌和宿主细胞中传播和选择的可选择标记基因和复制起点。本发明的特别优选的媒介物是p15aDI(参见图5)。
本发明的又一个实施方式涉及其中已经引入了本发明的突变BVD病毒的基因核酸分子的宿主细胞。本文所使用的“宿主细胞”包括用突变BVD病毒的基因核酸分子、包括通过合适的媒介物提供的基因核酸分子来转化的任何原核细胞。本文所使用的“宿主细胞”还包括用突变BVD病毒感染或以其它方式携带突变BVD病毒的基因核酸分子的任何真核细胞。用于质粒传播的优选原核宿主细胞是大肠杆菌GM2163细胞系，但是其它细胞型也可以使用。优选的真核宿主细胞包括哺乳动物细胞如MDBK细胞(ATCC CCL 22)。但是，其它培养细胞也可以使用。本发明还包括在这种宿主细胞中生产的任何后裔病毒。
在本发明的另一个实施方式中，病毒可以在用于致免疫组合物中之前通过化学钝化或在细胞培养中经过连续传代来减毒。减毒方法对本领域技术人员来说是公知的。
本发明的致免疫组合物还可以包括另外的活性成分如针对BVDV的其它致免疫组合物，例如，在共同未决的美国专利申请08/107,908、美国专利6,060,457、美国专利6,015,795、美国专利6,001,613和美国专利5,593,873中所述的那些，所有这些参考文件通过引用的方式以其整体并入本文。
而且，本发明的致免疫组合物可以包括一种或多种兽医可接受的载体。本文所使用的“兽医可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣(coating)、辅剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、杀细菌剂和杀真菌剂、等渗剂、吸收延缓剂、(adsorption delaying agents)等。稀释剂可以包括水、盐水、葡萄糖、乙醇、缩水甘油醇等。等渗剂可以包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇和乳糖等。稳定剂包括白蛋白等。辅剂包括但不限于RIBI辅剂系统(Ribi inc.)、明矾、氢氧化铝凝胶、水包油乳液、油包水乳液(如Freund′s完全和不完全辅剂)、嵌段共聚物(CytRx，Atlanta Ga.)、SAF-M(Chiron，Emeryville Calif.)、

辅剂、皂草甘、Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Inc.，CambridgeMass.)、或其它皂草苷部分、单磷酸脂质A、Avridine脂质胺辅剂、得自大肠杆菌的热不稳定的肠毒素(重组或其它)、霍乱毒素或b胞壁酰二肽等。致免疫组合物还可以包括一种或多种其它免疫调节剂，例如白细胞间介素、干扰素或其它胞质激素。
本发明的致免疫组合物可以根据给药途径来制成各种形式。例如，致免疫组合物可以制成适合注射用途的无菌水溶液或分散液形式，或者使用冻干技术制成冻干形式。冻干的致免疫组合物通常在4℃下保存，并且可以在有或没有辅剂的情况下在稳定溶液如盐水和HEPES中重新构建(reconsitute)。
本发明的致免疫组合物可以给予动物对象以诱发对BVD病毒的免疫反应。因此，本发明的另一个实施方式提供了通过对动物对象给予有效量的上述本发明的致免疫组合物来刺激对BVD病毒的免疫反应的方法。
根据本发明的方法，用于对动物对象给药的优选致免疫组合物包括突变BVD病毒。将含有突变病毒(优选通过化学钝化或在培养中连续传代来减毒)的致免疫组合物给予牛群，优选通过肠胃外途径，尽管其它给药途径也可使用，例如，经口、经鼻内、肌内、淋巴结内、皮内、腹内、皮下、直肠或阴道给药、或通过多种途径的组合给药。
免疫方案可以使用本领域公知的技术来优化。可以对动物给予单一剂量，或者，可选的是，可以以2到10周的间隔对动物接种两次或更多次。在牛中诱发的免疫反应的程度和性质可以通过使用多种技术来评价。例如，可以从被接种的动物收集血清，并且检测BVD病毒的特异性抗体是否存在，例如，通过常规的病毒中和检测方法。在淋巴组织中检测反应性CTL(responding CTL)可以通过例如T细胞增生的检测方法来实现，后者是诱发细胞免疫反应的指示。相关技术在本领域中有详细说明，例如Coligan等，Current Protocols in Immunology(免疫学的现行方案)，John Wiley & Sons Inc.(1994). 本发明的另一个实施方式涉及疫苗组合物。
在一个实施方式中，本发明的疫苗组合物包括有效量的一种或多种上述突变BVD病毒。纯化的突变病毒可以直接用于疫苗组合物中，或者突变病毒可以通过化学钝化或体外连续传代来进一步减毒。通常，疫苗在0.5到5毫升中含有约1×106到约1×108个病毒粒子、以及兽医可接受的载体。有效提供保护效果的疫苗组合物中的病毒的精确量可以由兽医领域技术人员来确定。适用于疫苗组合物中的兽医可接受的载体可以是上述任何一种载体。
在另一个实施方式中，本发明的疫苗组合物包括突变病毒的氨基酸分子。编码全部或部分BVD病毒基因组的DNA或RNA分子可以用于疫苗中。DNA或RNA分子可以以“裸”形式存在，或者可以与促进细胞摄取的药剂(如脂质体或阳离子脂质)一起给药。典型的给药途径是肌内注射约0.1到约5毫升疫苗。疫苗中的总多核苷酸通常应当是约0.1毫克/毫升到约5毫克/毫升。多核苷酸可以作为悬浮剂、溶液或乳液的一部分存在，但是通常优选水性载体。使用核酸(DNA或mRNA)的疫苗和接种程序在本领域中已有详细说明，例如美国专利5,703,055、美国专利5,580,859、美国专利5,589,466，上述参考文件全部通过引用并入本文。
本发明的疫苗组合物还可以包括另外的活性成分如BVDV的其它疫苗组合物，例如，如美国专利6,060,457、6,015,795、6,001,613和5,593,873中所述的那些。
疫苗接种可以通过一次接种或通过多次接种来进行。如果需要，可以从被接种动物收集血清并检测是否存在BVD病毒的抗体。
在本发明的另一个实施方式中，上述本发明的疫苗组合物用于治疗BVDV感染。因此，本发明提供了通过对动物给予治疗有效量的本发明的突变BVD病毒来治疗动物对象中由BVD病毒引起的感染的方法。
本领域技术人员可以容易地确定基因工程病毒(geneticallyengineered virus)是否需要在给药之前减毒。本发明的突变病毒可以直接给予动物对象而无需额外的减毒。治疗有效的病毒量可以根据所使用的具体病毒、牛的状况和/或感染程度而改变，并且可以由兽医确定。
在本发明的实施中，本发明的疫苗组合物优选通过肠胃外途径给予牛，尽管其它给药途径也可以使用，例如，经口、经鼻内、肌内、淋巴结内、皮内、腹内、皮下、经直肠或经阴道给药、或通过多种途径的组合给药。可能需要追加给药，可以对用法用量进行调整以提供最佳免疫。
本发明的另一个方面提供了确定之前疫苗接种的减毒病毒是存在于动物对象内的BVD病毒的来源的方法。
本发明的突变BVD病毒与野生型BVD菌株在基因组成和所表达的蛋白中均可以区别。这种区别使得可以区分接种了疫苗的动物和感染动物，并且允许在声称爆发了与疫苗有关的事件时识别BVDV。例如，可以确定在某些实验室测试中被测试为阳性的动物是否携带毒性或致病性BVD病毒，或者仅携带先前通过疫苗接种而接种的本发明的突变BVD病毒。
可以采用多种检测方法来进行这种测定。例如，可以从测试为BVD阳性的动物对象中分离病毒，基于核酸的检测方法可以用于确定是否存在突变BVD病毒基因，其是在之前的疫苗接种中使用的BVD病毒的指示。基于核酸的检测方法包括南方墨点分析或北方墨点分析(Southern or Northern blot analysis)、PCR定序。或者，可以使用基于蛋白的检测方法。在基于蛋白的检测方法中，可以从测试为BVDV阳性的动物分离疑似感染的细胞或组织。可以从这些细胞或组织来制备细胞提取物，并使用病毒性蛋白的合适抗体来进行西方墨点分析，该抗体可以清楚地识别是否存在之前所接种的突变病毒而不是识别是否存在野生型BVDV。
剂型和给药 肠胃外给药 本发明的化合物还可以直接给药到血流、肌肉、或内脏器官中。合适的肠胃外给药方式包括静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、室内(intraventricular)、尿道内、胸内、颅内、肌内和皮下等给药途径。合适的肠胃外给药装置包括针(包括微针)注射器、无针注射器和输注技术。
肠胃外制剂通常是水溶液，其可以含有赋形剂如盐、碳水化合物和缓冲剂(优选pH为3到9)，但对于某些用途，它们可能更适合配制成无菌非水溶液、或者作为与合适的载体如无菌无热原水联合使用的干燥剂型。
在无菌条件下制备肠胃外制剂如通过冻干可以使用本领域技术人员公知的标准制药技术来实现。
在制备肠胃外溶液中使用的式I的化合物的溶解度可以通过使用合适的配制技术来增加，如加入提高溶解度的药剂。
肠胃外给药制剂可以配制为立即释放和/或改型释放的。改型释放制剂包括延迟释放、持续释放、脉冲释放、控制释放、定向释放和按计划释放(programmed release)的。因此本发明的化合物可以配制为固体、半固体或触变液体，以便作为提供活性化合物的改型释放的植入型存储器来给药。这种制剂的例子包括涂药支架和聚(dl-乳酸-共乙醇酸)(PGLA)微珠。
局部给药 本发明的化合物还可以对皮肤或粘膜局部给药，即，经皮或经粘膜。用于该目的的典型制剂包括凝胶、水凝胶、洗剂、溶液、乳膏、软膏、撒布粉剂、敷料、泡沫、薄膜、皮肤贴剂、糯米纸(wafer)、植入体、海绵、显微、绷带和微乳液。也可以使用脂质体。典型的载体包括醇、水、矿物油、液体石蜡、白石蜡、甘油、聚乙二醇和丙二醇。可以加入穿透促进剂——参见，例如，Transdermal PenetrationEnhancers.Applications，Limitations，and Potential(透皮渗透促进剂应用、限制和潜力)J.Pharm Sci，88(10)，955-958，by Finnin and Morgan(October 1999)。
其它局部给药的方式包括通过电泳、离子电泳、光子电泳、声波电泳、以及微针或无针(例如PowderjectTM、BiojectTM等)注射来递送。
局部给药制剂可以配制为立即释放和/或改型释放的。改型释放制剂包括延迟释放、持续释放、脉冲释放、控制释放、定向释放和按计划释放的。
吸入/鼻内给药 本发明的化合物还可以经鼻内或通过吸入给药，通常是以干粉的形式(单独、或作为混合物如与乳糖的干掺合物、或作为混合组分颗粒如与磷脂如磷脂酰胆碱混合)由干粉吸入器给药；或者作为气溶胶由压力容器、泵、喷射器、雾化器(优选使用电水动力学的雾化器来产生细雾)、或喷雾器来给药，其中使用或不使用合适的推进剂如1，1，1，2-四氟乙烷或1，1，1，2，3，3，3-七氟丙烷。对于鼻内用途，粉末可以包括生物粘着剂如壳聚糖或环糊精。
压力容器、泵、喷射器、雾化器或喷雾器含有本发明化合物的溶液或悬浮液，该溶液或悬浮液包括例如乙醇、含水乙醇、或适用于活性物的分散、增溶或延长释放的其它试剂、作为溶剂的推进剂、以及任选的表面活性剂(如脱水山梨糖醇三油酸酯、油酸或寡乳酸)。
在用于配制干粉或悬浮剂之前，药物产品被微粉化至适合通过吸入输送给药的尺寸(通常小于5微米)。这可以通过任何合适的粉化方法来实现，例如通过螺旋喷射研磨、流体床喷射研磨、超临界流体加工以形成纳米颗粒、高压均化或喷干。
用于吸入器或吹入器的胶囊(例如由明胶或羟丙基甲基纤维素制成)、泡罩(blister)和卡筒可以配制为含有本发明的化合物、合适的粉末基质如乳糖或淀粉、以及改性剂(如l-亮氨酸、甘露醇或硬脂酸镁)的混合物。乳糖可以是无水的，或者可以是一水合物形式，优选后者。其它合适的赋形剂包括葡聚糖、葡萄糖、麦芽糖、山梨糖醇、木糖醇、果糖、蔗糖和海藻糖。
在使用电水动力学来产生细雾的雾化器中使用的合适溶液制剂的每次促动(per actuation)可以含有1微克到20毫克本发明的化合物，且促动体积可以为1微升到100微升。典型制剂可以包括式I的化合物、丙二醇、无菌水、乙醇和氯化钠。可以替代丙二醇使用的可选溶剂包括甘油和乙二醇。
可以向那些计划用于吸入/鼻内给药的本发明的制剂中加入合适的矫味剂如薄荷脑和左旋薄荷脑、以及甜味剂如糖精或糖精钠。
用于吸入/鼻内给药的制剂可以配制为立即释放和/或改型释放的(使用，例如，PGLA)。改型释放制剂包括延迟释放、持续释放、脉冲释放、控制释放、定向释放和按计划释放的。
在干粉吸入器和气溶胶的情况中，剂量单位由输送计量量(metered amount)的阀的方式来确定。本发明的单位通常设为给予含有10纳克到100微克的式I的化合物的一个计量量或“一喷”。总日剂量通常为1微克到100毫克，其可以在单剂中给予，或者更通常地在一日内分为多剂给予。
直肠/阴道内给药 本发明的化合物可以以例如栓剂、阴道环剂或灌肠剂的形式来经直肠或经阴道给药。可可脂是传统的栓剂基质，但是可以根据需要使用各种替代产品。
用于直肠/阴道给药的制剂可以配制为可以配制为立即释放和/或改型释放的。改型释放制剂包括延迟释放、持续释放、脉冲释放、控制释放、定向释放和按计划释放的。
眼部/耳部给药 本发明的化合物还可以直接给药到眼部或耳部，通常是以在调节了pH的等渗无菌盐水中的微粉化悬浮液或溶液的滴剂的形式给予。适用于眼部和耳部给药的其它制剂包括软膏、可生物降解的植入体(例如，可吸收的凝胶海绵、胶原)和不能生物降解的植入体(如聚硅氧烷)、糯米纸、透镜(lense)、以及颗粒或泡沫系统如纳米微粒或脂质体。聚合物如交联聚丙烯酸、聚乙烯醇、透明质酸、纤维素聚合物(如羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素或甲基纤维素)、或者杂多糖聚合物如结冷胶(gelan gum)可以与防腐剂如苯扎氯铵(benzalkonium chloride)一起加入。这种制剂也可以通过离子电泳来输送。
用于眼部/耳部给药的制剂可以配制为立即释放和/或改型释放(modified released)的。改型释放制剂包括延迟释放、持续释放、脉冲释放、控制释放、定向释放和按计划释放的。
组分试剂盒(KIT-OF-PARTS) 因为可能需要将活性化合物组合给药以便例如治疗特定疾病或症状，本发明的范围内还包括将两种或更多种药物组合物(其中至少一种含有根据本发明的疫苗)方便地以适于将多种组合物共同给药的试剂盒的形式组合。
因此，本发明的试剂盒包括两种或更多种单独的药物组合物(其中至少一种包括根据本发明的疫苗)、以及用于独立地保存所述组合物的器件(例如，如容器、分隔瓶(divided bottle)或分隔式铝箔包装)。这种试剂盒的例子是注射器和注射针等。
本发明的试剂盒特别适用于给予不同剂型，例如，用于以不同给药间隔来给予独立的组合物的口服或肠胃外制剂、或者用于滴定彼此独立的组合物。为帮助兽医，试剂盒通常包括给药指示。
本发明通过以下实施例进一步说明，但是不表示受其限制。
实施例 实施例1.NS3域抗原决定部位的定位 使用抗原决定部位定位方法来识别NS3蛋白中由一组mAb辨识的特定抗原决定部位。该方法需要将各个试验片段进行PCR放大，然后在体外转译截断蛋白(truncated protein)，最后用各种mAb测试其反应性。为了初步识别NS3上的抗原区，将表现该区域的一组7个DNA片段(图1)放大。每个片段在其5’端包含T7启动子，然后是起始密码子(initiation codon)，并在3’端包含终止密码子。这些DNA片段用作模板以使用

兔网状细胞溶解产物系统(Promega；Madison，WI)和放射性标记的蛋氨酸和半胱氨酸通过体外转录/转译来产生S35-标记的蛋白片段。得到的转译蛋白片段包括全长NS3蛋白、解螺旋酶和蛋白酶、以及解螺旋酶的各个子域。(根据BVDV和HCV NS3蛋白的序列校准来识别蛋白酶、解螺旋酶和解螺旋酶子域的边界。)一组识别BVDVNS3的12个mAb，包括若干由诊断实验室使用以检测牛的BVDV感染的mAb，用于将转译蛋白免疫沉淀。这些单克隆抗体在本领域是已知的并且如Deregt等，Mapping of two antigenic domains on the NS3protein of the pestivirus bovine viral diarrhea virus(瘟病毒牛腹泻病毒的NS蛋白上两个抗原域的定位)，Veterinary Microbiology(2005)，108(1-2)，13-22中的“previously prepared(先前制备)”部分所述。然后通过SDS-PAGE和荧光图象摄影来分析免疫沉淀物。
免疫沉淀(immunoprecipitation)概述在表1中。所有12个mAb和多克隆血清(polyclonal serum)均识别全长NS3和一个或多个解螺旋酶子域，同时都不识别蛋白酶片段。3个mAb(1.11.3、21.5.8和24.8)使全长解螺旋酶和域1-域2(d1-d2)片段免疫沉淀，但不能使d2-d3片段免疫沉淀，显示这些3抗体识别解螺旋酶蛋白的域1。mAb 21.5.8和24.8与d1片段结合，但mAb 1.11.3则否，显示1.11.3抗体比21.5.8和24.8mAb对抗原决定部位构造更敏感。mAb 2.32.5识别全长解螺旋酶，并一定程度上识别d1-d2片段，但不识别d2-d3片段，显示其也可以识别域1。d1-d2片段的弱结合可能暗示d1-d2片段和全长解螺旋酶之间由2.32.5识别的抗原决定部位不同。mAb 4.11.4和16.1.5均与全长NS3和解螺旋酶结合，但仅与d1-d2和d2-d3片段弱结合，显示它们可能对解螺旋酶第二域中的抗原决定部位具有特异性。4个mAb 5.2.1、9.10.4、12.7.3和15.14.6识别全长NS3和解螺旋酶。它们还与d2-d3片段弱结合，但是不与d1-d2片段结合，显示它们识别域3中的抗原决定部位。它们均不与单个d3片段结合，显示在没有其它子域的情况下可能不会发生d3的正确折叠。mAb 19.7.6与NS3和全长解螺旋酶结合，但是不与任何其它片段结合。该抗体的识别可能需要存在未扰动的解螺旋酶蛋白。mAb 20.10.6与NS3、全长解螺旋酶、以及d1-d2和d2-d3片段非常好地结合。其还识别单个d2片段，显示该抗体所识别的域2中的抗原决定部位不受缺少域1和3的影响。12个mAb均不与全长蛋白酶结合，这并不令人惊讶，因为甚至来自感染了BVDV的牛的多血清(POLY)在我们的试验中也不识别蛋白蛋白酶，这明显表示蛋白酶的抗原性不高。这与HCV中的蛋白酶、解螺旋酶和NS4A(蛋白酶辅助因子)蛋白的取向是一致的，在HCV中蛋白酶在解螺旋酶和NS4A蛋白之间的取向使其极少留下容易与抗体结合的表面结构。根据这些结果，域1是引入得到经标记的病毒的突变的示例性目标。
表1.NS3子域的免疫沉淀
实施例2.BVDV和HCV解螺旋酶的序列校准 为了基于BVDV解螺旋酶域1中的突变来产生经标记的病毒，需要进一步精制(refinement)该域中的抗原决定部位。希望去除免疫主导的(immunodominant)抗原决定部位，而不会明显改变解螺旋酶的功能。为了帮助识别待突变的候选抗原决定部位，BVDV解螺旋酶的分子模型非常有用。由于HCV解螺旋酶的分子模型是已知的，其可以用作建模(modeling)的样板。对BVDV和HCV解螺旋酶的域1的氨基酸序列进行校准，以开始产生域1的分子模型的过程。它们之间的主要序列相同性(primary sequence identity)为约34％。为说明BVDV解螺旋酶域1的次级结构，使用来自Genetic Computer Group软件包(University ofWisconsin；Madison，WI)的Pileup程序，并使用NADL BVDV菌株作为原型序列，来校准衍生自各种BVDV分离株和其它瘟病毒的47个NS3序列。由所校准的序列，产生多重序列档案(multiple sequence file，MSF)，并将其提交到JPred服务器(Cuff等，Bioinformatics，14892-893(1998))，以便使用PHD预测方法来进行次级结构预测(Rost and Sander，J.Mol.Biol.23513-26(1993)。Silicon Graphics Indigo2 Impact 10000工作站(Silicon Graphics；Mountain View，CA)用于所有分子建模研究。Molecular Operating Environment(MOE)2001.01版(ChemicalComputing Group，Inc.；Montreal，Quebec)和SYBYL 6.7软件(TriposAssociates Inc.；St.Louis，MO)用于分子建模和可视化(visualizations)。来自HCV(SEQ ID NO.21)和BVDV(SEQ ID NO.20)NS3蛋白的域1和域2的氨基酸序列是根据初级序列(primary sequence)同源性和次级结构预测来校准的(图2)。然后使用HCV蛋白的相应区域作为样板来产生BVDV NS3的域1和域2的初步分子模型。如图3所示，在α-螺旋和β-股之间存在若干环和回转(turn)，包括α1-β2(IGR环)、α2-β3(KHP)、β4-β5(DMA)和α3-β7(SES)，导致形成远离解螺旋酶催化中心和解螺旋酶-蛋白酶交互表面的暴露表面。该区域可能成为高抗原性区。选择所识别的三个环KHP环、IGP环和SES环作为致突变(mutagenesis)研究的目标。
实施例3通过扫描突变发生来定位mAb结合位点 为进一步确定域1中与多个mAb结合的抗原决定部位，采用扫描突变发生的方法。简要的说，使用PCR放大，将BVDV解螺旋酶域1序列的短片段(SEQ ID NO.20)用相应的HCV序列(SEQ ID NO 21)置换，然后对得到的片段用限制性内切酶消化和接合，得到图4所示的“扫描突变体”。如实施例1中所述进行体外转录和转译、以及免疫沉淀。各种mAb与突变体的反应性的概述如表2所示。
Table 2.扫描突变体与mAb的反应性 实施例4.通过丙氨酸置换突变发生来详细分析mAb结合位点 为进一步确定域1中与多个mAb结合的抗原决定部位，并识别这些区域中用于抗体结合的关键残基，在三个区域I1841-R1846、K1867-S1872和S1938-I1941中共产生16个单个氨基酸(丙氨酸)置换突变，并测试其抗体结合。氨基酸残基的坐标是根据SEQ ID NO.1。因此，“I1841A”表示在SEQ ID NO.1中编号为1841的坐标处用丙氨酸置换异亮氨酸。当然，在其它BVDV分离株中，不同的特定氨基酸可以存在于示例性序列的特定坐标处。因此，在变异BVD病毒或构造以表达变异BVD病毒的质粒的解螺旋酶域的相同位置处的突变将导致变异的未修饰病毒多肽的抗体的识别力的同等丧失。使用本领域已知的PCR重叠延长技术(PCR overlap extension technique)来构造置换突变体(参见，例如，Ho等，Gene，77(1)51-9(1989))。简言之，PCR用于产生各自编码解螺旋酶的域1和域2的丙氨酸置换片段。每个片段在其5’端编码T7启动子序列和转译起始密码子，并在3’端编码终止密码子。最初，进行两个独立的反应以产生编码置换区域的5’半部和3’半部的重叠片段。在重叠区，通过在PCR中使用的致突变寡核苷酸引物来将单个氨基酸突变引入两个片段的序列中。通过在琼脂糖凝胶中电泳来分离每个PCR的产物，从每个反应中纯化具有正确尺寸的单个谱带。将纯化的DNA片段混合并用作第二PCR的样板，以产生单一的置换片段。重复该全过程以产生每一种所需置换片段。各片段的序列通过DNA测序来证实。使用这些片段作为样板，通过如上所述的体外转录/转译来产生S35-标记的蛋白片段。使用mAb来进行免疫沉淀，然后进行SDS-PAGE分析，这用于确定突变的抗原决定部位是否仍然能被抗体识别。
E1939A和R1942A完全破坏了与mAb 1.11.3的结合，显示这两个残基对于抗体结合非常关键。这两种氨基酸位于同一个α3-β7(SES)环上(图3)，显示被该抗体识别的抗原决定部位通过该环形成。位于解螺旋酶分子的两个独立区域(α1-β2(IGR)和α2-β3(KHP)环)上的两个其它突变I1841A和K1867A，显示与mAb 21.5.8的结合显著降低，而其它抗体则否。可以由这些结果得到的一个结论是该mAb所识别的抗原决定部位可能包括在天然分子中位置紧密相邻的两个不同的环。这与图3所示的分子模型相符。突变R1843A破坏了与mAb 24.8的结合，但对与其它抗体的结合没有效果。同样，这显示了该残基是位于α1-β2(IGR)环上的关键抗原决定部位的一部分。R1942A突变对于与mAb 24.8的结合的部分效果显示，α3-β7(SES)环与α1-β2(IGR)环一起构成被该抗体识别的抗原决定部位。总而言之，在BVDV解螺旋酶的域1中准确地定位了三个mAb识别的抗原决定部位。识别了那些抗原决定部分中的关键残基，其位于初级序列地三个独立区域中，但在三级构造中紧密相邻。这些抗原决定部位的功能在BVDV亚病毒复制子的部分进一步检验。
表3.丙氨酸置换突变体的免疫沉淀
实施例5.亚病毒BVDV复制子方面的解螺旋酶域1突变的构造亚病毒复制子的结构 制造成功的病毒疫苗的所需品质是获得高效价病毒收率的能力。因此，标记突变(marker mutation)不应显著干扰病毒复制。由于解螺旋酶活性对于BVDV RNA的复制是必要的，我们不仅需要评估所制造的全部域1点突变体的抗体识别力丧失，还需要评估其解螺旋酶催化活性的保留。全长BVDV前病毒分子克隆(molecular clone)在大肠杆菌(E.coli)中的复制和基因操作是困难的，因为质粒在增殖过程中是不稳定的。因此，构建p15aDI以帮助对突变体的筛选，该p15aDI含有表达NS3并支持病毒RNA复制的截断(truncated)亚病毒复制子，但是缺少病毒结构基因。p15aDI来源于含有全长BVDV基因的传染性前病毒亲代质粒(pNADLp15a)。其更具可操作性，因为其缺乏大多数结构基因和NS2编码区，位于NS3上游的唯一序列由部分N蛋白与与牛泛素(ubiquitin)之间的融合构成(图5)。只有当有效RNA复制导致转录放大、由此引起病毒蛋白表达提高时，才可以通过免疫组织化学来检测由该复制子表达的NS3蛋白。因此，NS3的检测可以用作有效RNA复制和解螺旋酶催化活性的间接证明。
BVDV解螺旋酶域1突变的产生 在亚病毒复制子方面产生一组12个不同的解螺旋酶域1突变，并且分析病毒RNA复制和抗原决定部位识别丧失。这些突变中的8个仅含有一个氨基酸改变，包括IGR环中，I＞A(氨基酸残基1841)，R＞A(1843)和K＞A(1845)；KHP环中，K＞A(1867)，H＞A(1868)和P＞A(1869)；SES环中，E＞A(1939)和R＞A(1942)。2个突变体含有两个氨基酸改变，包括IGR环中，R＞A(1843)和K＞A(1845)；以及SES环中，E＞A(1939)和R＞A(1942)。2个突变体含有三个氨基酸改变K＞A(1867)，H＞A(1868)和P＞A(1869)，均在IGR环中；以及K＞A(1845)，H＞A(1868)和E＞A(1939)，影响多个环。尽管为方便起见在示例性突变中使用丙氨酸，但非保守性氨基酸置换可以用作合适的突变。每个突变体均使用上述的重叠PCR策略产生。为每个所需突变设计一组特定的重叠引物(表4)。为筛选目的，每个引物组还含有额外的沉默核苷酸变化(silentnucleotide change)，其将导致在突变位点附近产生独特的新限制性内切酶裂解位点。重叠PCR片段用作第二轮放大的样板，并且仅使用两个外侧引物(outside primer)来进行。为产生含有多个氨基酸变化的片段，使用先前的突变片段作为样板，重复放大反应。然后，通过在PCR过程中产生的两个独特的限制性内切酶位点(Bsm B I and Sma I)来将完全突变片段克隆到亚病毒复制子骨架中。突变的PCR片段和亚病毒复制子骨架均用Bsm B I和Sma I消化，用碱性磷酸酶(NEB，Inc.)处理，用琼脂糖凝胶电泳来纯化，并使用T4DNA接合酶(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA)在16℃接合(ligate)过夜。用接合反应等分试样(aliquotof lighted reaction)将STBL2大肠杆菌细胞(Invitrogen；Carlsbad，CA)转化并接种于选择性培养基上。通过质粒DNA纯化、然后用限制性内切酶消化来筛选菌落。通过序列分析来进一步确定具有所需尺寸的质粒。
表4 实施例6.突变亚病毒复制子的表征 体外转录和RNA转染 使用T7RNA聚合酶和MEGAscriptTM(Ambion；Austin，TX)，在体外合成转录体。DNA样板用Ksp I线性化，并且用T4DNA聚合酶处理以除去3’外悬部分。在转染之前，通过琼脂糖凝胶电泳来分析转录反应的产物。将1-5微克RNA加入到含有6微克Lipofectin(Invitrogen)的200微升Opti-MEM(Invitrogen)中，并且在室温培养10到15分钟。同时，在六孔板(直径为35毫米)中生长的Madin Darby牛肾(MDBK)细胞单层(50到60％融合)用不含RN酶(RNase-free)的PBS洗涤两次，并用Opti-MEM洗涤一次。在最终洗涤之后，将转染混合物加入到每个孔中，然后在室温在轻轻摇动下培育10分钟。然后，向每个孔中加入1毫升Opti-MEM，并且将板在37℃继续培养3小时。然后，向每个孔中加入含有2-3％牛供体小牛血清的3毫升Opti-MEM。
RNA复制和抗体识别的分析 在37℃培养24-48小时后，将转染细胞用80％并同固定，并根据生产商的指示，使用Vectastain Elite ABC试剂盒(Vector Laboratories；Burlingame，CA)来进行免疫组织化学分析(IHC)。识别解螺旋酶域2的单克隆抗体20.10.6用于使NS3阳性的细胞可视化，作为有效RNA复制的指示剂。用野生型BVDV RNA转染的细胞以及多种突变体复制子显示可用mAb 20.10.6强力染色，显示各突变病毒解螺旋酶支持有效的vRNA复制。只有突变K1867A/H1868A/P1869A不能产生可检测的NS3蛋白，显示这组突变显著干扰病毒RNA的复制。
用野生型或突变复制子转染的所有细胞也都使用mAb 1.11.3、21.5.8和24.8来测试(表5)。各个环显示被这三种抗体之一所识别，因为每个环中的突变均导致三种抗体之一的识别力丧失。特别是，IGR环中的残基突变R1843A和/或K1845A导致mAb 24.8识别的完全丧失。同时，未影响mAb 20.10.6、1.11.3和21.5.8的识别。在KHP环中，突变K1867A消除了mAb 21.5.8的识别，而不会影响被其它三种抗体的识别。同样，在SES环中的两个点突变导致mAb 1.11.3识别的丧失，如同双重突变体一样。此外，三重突变体(K1845A/H1868A/E1939A)导致被1.11.3和24.8mAb识别的丧失，而不会影响mAb 20.10.6和21.5.8的抗体识别。
总之，识别了导致消除mAb识别和结合的三个解螺旋酶环中的若干突变。此外，发现可以同时破坏两种抗体的识别位点，而仍然保持解螺旋酶功能。因此，这些独立的突变体中的每个或它们的结合能够用作包括解螺旋酶区域突变的经标记的BVDV疫苗。
表5.mAb与解螺旋酶突变体的免疫反应活性
实施例7.经标记的病毒的产生和分析 为评价所关注的NS3蛋白中突变对病毒复制和传染性的效果，必须将突变移动到含有全长BVDV序列的前病毒引物(pNADLp15A)中。选择用于进一步研究的三个突变序列是K1845A-H1868A-E1939A、R1942A和E1939A。含有所关注的每个单独的变异序列的DNA片段被克隆到pNADLp15A中，再利用独特的Bsm BI和Sma I限制性内切位点。接合混合物转移到大肠杆菌GM2163细胞(New England Biolabs，Inc.；Beverly，MA)中，然后接种到选择性培养基商。培养过夜后，筛选存在含有正确序列的质粒的菌落。选择表示每个突变的一个克隆体(R1942A、E1939A和K-H-E)，并且如实施例6中所述地从这些克隆体来制备病毒RNA。MDBK细胞用每个RNA制剂转染，并在37℃培养64小时。为各突变体建立RD细胞(ATCC；Rockville，MD)的重复转染。如实施例6所述地固定一组转染细胞以进行IHC染色，并且从第二组中，从接种瓶(seeded flask)中刮取细胞，并在-80℃存储以用于未来增殖的原料。
为进一步评价由这些克隆体生产的病毒，将从转染试验收获的培养液通到新鲜的RD细胞单层上。在吸附和培养过夜后，固定细胞以进行IHC分析。分析结果在表6中显示。野生型和突变病毒均被mAb20.10.6(对照抗体)所识别。野生型病毒也被mAb 1.11.3和24.8所识别。突变体E1939A与mAb 24.8结合，但是不与1.11.3结合。突变体K-H-E仅被mAb 20.10.6识别，且不被1.11.3或24.8识别。突变体R1942A验证了与mAb 24.8的反应性，但是与1.11.3则没有。
表6.用经标记的病毒感染的细胞的IHC分析
还评价每种经标记的病毒的生长动力学。使用标准病毒滴定方案来预先确定各种原料病毒的效价。在时间过程研究中，将新鲜的RD细胞单层接种在组织培养瓶中，培养过夜，并在第二天用预定量的各种病毒感染。在吸附和洗涤后，收集初始组样品，(第“0”小时)。随后，在感染后第14、19、24、39、43、47和65小时收集样品。使用Spearman-Karber法(Hawkes，R.A.In E.H.Lennette(ed.)，DiagnosticProcedures for Viral，Rickettsial and Chlamydial Infections(病毒、里克次氏体属微生物和衣滴虫感染的诊断程序)，p.33-35；第七版.AmericanPublic Health Association Publications，Washington，D.C.)来确定病毒效价，并且以TCID50/毫升表示。与野生型(亲代)BVD病毒相比，所有突变体以类似于、或者在某些情况中稍好于野生型的速度生长(表7)。
表7.野生型和突变BVD病毒的效价(TCID50/毫升)比较
当通过一组单克隆抗体来测定时，某些产生的突变导致特定免疫特征明显(immunologically distinct)的抗原决定部位改变。当在传染性病毒颗粒方面分析抗体识别时，得到类似结果。含有不会干扰传染性病毒的产生的突变的克隆体仍将导致mAb的识别的丧失，表示可用作有效的经标记的BVDV疫苗菌株的新菌株。
实施例8.在幼龄小牛模型中检测的疫苗效力 得到BVDV阴性的健康小牛，随机分为多个研究组，并且保持在临床兽医师的监督之下。将测试疫苗与无菌辅料结合，并且通过肌内(IM)或皮下(SC)注射来给药。相距21到28天来给予两剂疫苗。然后在最后一次疫苗接种1型或2型BVDV菌株之后21到28天来激发(challenge)动物。激发接种体以分为每鼻孔2毫升的4毫升剂量经鼻内给予。对照组由未接种、未激发动物和/或未接种、激发动物组成，其也在整个研究过程中保持。
每日监控临床参数，包括直肠温度、忧郁、厌食和腹泻。使用与1型或2型BVDV菌株组合的一系列血清稀释液来通过牛细胞培养中的恒定病毒、血清降低检测试验来测定血清中和效价。尝试由周围血液来进行牛细胞培养中的BVDV的激发后分离。通过间接免疫荧光分析来测定BVDV阳性细胞培养。为了验证激发后的保护，必须证实接种疫苗的组中的感染比对照组中的感染降低。
实施例9.孕母牛-小牛模型中的疫苗效力试验 得到BVDV阴性的育龄母牛和育龄小母牛，随机分为疫苗接种试验组和安慰剂(对照)组。相隔21到28天，通过肌内(IM)或皮下(SC)注射来对母牛接种疫苗或安慰剂两次。第二次接种后，所有母牛接受IM前列腺素注射来使其同步发情。显示发情的母牛使用合格的BVDV阴性精液来人工受精育种。怀孕约60天后，通过直肠触诊来测定母牛的怀孕状态。约6周后，从各实验组随机选出已证实怀孕的母牛。通过鼻内接种BVDV 1型或2型来激发每头母牛。在激发日及激发后多个时间间隔收集血样，以进行BVDV分离。
激发后28天，进行左侧剖腹手术，由各母牛中抽取羊水。就在手术之前，从各母牛收集血样以进行血清中和试验。剖腹分娩之后，由各胎牛收集血样。然后对胎牛实施无痛致死术，以无菌方式收集组织以分离BVDV。在发生自然流产时，在检得流产及两周后由母牛收集血样。将对应得血样和流产胎牛进行血清学检验和病毒分离。通过不存在胎牛感染和后期流产来证实疫苗效力。
实施例10.经标记的疫苗得诊断检测 根据指示，用活减毒BVDV疫苗或钝化的NS3-突变(经标记)的BVDV疫苗来接种各年龄的牛。在接种疫苗后2-3周或更晚收集血样。为了区分接受经标记的BVDV疫苗的牛和被BVDV田间(野生型)菌株感染的牛，可以通过差异诊断检测来测试血样。具有抗原决定部位特异性氨基酸突变的NS3蛋白当以经标记的疫苗形式呈现在牛群中时，可以引起产生与NS3蛋白的突变的抗原决定部位结合、但不与野生型病毒上存在的未突变抗原决定部位结合的特异性抗体的生产。在野生型病毒方面，相反叙述为真，即特异性抗体可以识别NS3蛋白上的野生型抗原决定部位，但不能识别突变形式。检测抗体结合特异性和亲和力的方法在本领域中是公知的，包括但不限于免疫检测分析如ELISA、竞争性免疫检测分析、放射性免疫检测分析、西方墨点、间接免疫荧光检测分析等。
竞争性ELISA可以是间接或直接检测方法。直接竞争性检测方法的一个例子如本文所述。所有或部分野生型病毒抗原，包括NS3蛋白(天然或合成来源的)可以用作抗原源。在碱性条件下用抗原涂布ELISA板之后，将牛血清样品和稀释剂与抗原决定部位mAb的最佳稀释剂一起加入，并培养30-90分钟。将山葵过氧化酶或碱性磷酸酶与mAb结合，以允许进行结合的比色分析。洗涤培养板之后，加入对酶具有特异性的发色基质，在最终培养步骤后，在适合所用基质的波长下测量各孔的光密度。根据牛血清与涂布培养板的NS3蛋白的反应性水平，可以抑制标识mAb的结合。不与mAb结合表示在识别野生型特异性抗原决定部位的牛血清中存在抗体，其是自然感染(野生型)干扰的指示。相反，用具有抗原决定部位特异性突变的经标记疫苗来免疫的牛血清将不含与涂布培养板的NS3蛋白结合的抗体。因此，mAb将与NS3蛋白结合，并且导致随后的发色。
本领域技术人员在考虑上述公开内容后能够得到多种变化。例如，其它BVDV病原性菌株可以以类似于本文所揭示的方式通过NADL菌株在NS3解螺旋酶域中突变。尽管本文的示例性突变使用了丙氨酸，但是其它非保守性氨基酸置换或其它导致保留复制但丧失对野生型NS3的抗体的识别力的其它突变也包括在本发明的范围内。这些例子仅仅是示例性的。
序列表
<110>辉瑞产品有限公司
<120>经标记的牛病毒性腹泻病毒疫苗
<130>PRH47110AJ
<140>PCT/IB2006/003412
<141>2006-11-24
<150>60/748312
<151>200512-7
<160>21
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>3906
<212>PRT
<213>人工牛病毒性腹泻病毒多蛋白
<220>
<223>得自BVD病毒的RNA样板的未加工多肽，NADL分离株
<400>1
Leu Lys Pro Gly Pro Leu Phe Tyr Gln Asp Tyr Lys Gly Pro Val Tyr
1 5 10 15
His Arg Ala Pro Leu Glu Leu Phe Glu Glu Gly Ser Met Cys Glu Thr
20 25 30
Thr Lys Arg Ile Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly Lys Leu Tyr His
35 40 45
Ile Tyr Val Cys Ile Asp Gly Cys Ile Ile Ile Lys Ser Ala Thr Arg
50 55 60
Ser Tyr Gln Arg Val Phe Arg Trp Val His Asn Arg Leu Asp Cys Pro
65 70 75 80
Leu Trp Val Thr Thr Cys Ser Asp Thr Lys Glu Glu Gly Ala Thr Lys
85 90 95
Lys Lys Thr Gln Lys Pro Asp Arg Leu Glu Arg Gly Lys Met Lys Ile
100 105 110
Val Pro Lys Glu Ser Glu Lys Asp Ser Lys Thr Lys Pro Pro Asp Ala
115 120 125
Thr Ile Val Val Glu Gly Val Lys Tyr Gln Val Arg Lys Lys Gly Lys
130 135 140
Thr Lys Ser Lys Asn Thr Gln Asp Gly Leu Tyr His Asn Lys Asn Lys
145 150 155 160
Pro Gln Glu Ser Arg Lys Lys Leu Glu Lys Ala Leu Leu Ala Trp Ala
165 170 175
Ile Ile Ala Ile Val Leu Phe Gln Val Thr Met Gly Glu Asn Ile Thr
180 185 190
PRH47110AJ SEQ ID NOS
Gln Trp Asn Leu Gln Asp Asn Gly Thr Glu Gly Ile Gln Arg Ala Met
195 200 205
Phe Gln Arg Gly Val Asn Arg Ser Leu His Gly Ile Trp Pro Glu Lys
210 215 220
Ile Cys Thr Gly Val Pro Ser His Leu Ala Thr Asp Ile Glu Leu Lys
225 230 235 240
Thr Ile His Gly Met Met Asp Ala Ser Glu Lys Thr Asn Tyr Thr Cys
245 250 255
Cys Arg Leu Gln Arg His Glu Trp Asn Lys His Gly Trp Cys Asn Trp
260 265 270
Tyr Asn Ile Glu Pro Trp Ile Leu Val Met Asn Arg Thr Gln Ala Asn
275 280 285
Leu Thr Glu Gly Gln Pro Pro Arg Glu Cys Ala Val Thr Cys Arg Tyr
290 295 300
Asp Arg Ala Ser Asp Leu Asn Val Val Thr Gln Ala Arg Asp Ser Pro
305 310 315 320
Thr Pro Leu Thr Gly Cys Lys Lys Gly Lys Asn Phe Ser Phe Ala Gly
325 330 335
Ile Leu Met Arg Gly Pro Cys Asn Phe Glu Ile Ala Ala Ser Asp Val
340 345 350
Leu Phe Lys Glu His Glu Arg Ile Ser Met Phe Gln Asp Thr Thr Leu
355 360 365
Tyr Leu Val Asp Gly Leu Thr Asn Ser Leu Glu Gly Ala Arg Gln Gly
370 375 380
Thr Ala Lys Leu Thr Thr Trp Leu Gly Lys Gln Leu Gly Ile Leu Gly
385 390 395 400
Lys Lys Leu Glu Asn Lys Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Ala
405 410 415
Ser Pro Tyr Cys Asp Val Asp Arg Lys Ile Gly Tyr Ile Trp Tyr Thr
420 425 430
Lys Asn Cys Thr Pro Ala Cys Leu Pro Lys Asn Thr Lys Ile Val Gly
435 440 445
Pro Gly Lys Phe Gly Thr Asn Ala Glu Asp Gly Lys Ile Leu His Glu
450 455 460
Met Gly Gly His Leu Ser Glu Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Val Leu
465 470 475 480
Ser Asp Phe Ala Pro Glu Thr Ala Ser Val Met Tyr Leu Ile Leu His
485 490 495
PRH47110AJ SEQ ID NOS
Phe Ser Ile Pro Gln Ser His Val Asp Val Met Asp Cys Asp Lys Thr
500 505 510
Gln Leu Asn Leu Thr Val Glu Leu Thr Thr Ala Glu Val Ile Pro Gly
515 520 525
Ser Val Trp Asn Leu Gly Lys Tyr Val Cys Ile Arg Pro Asn Trp Trp
530 535 540
Pro Tyr Glu Thr Thr Val Val Leu Ala Phe Glu Glu Val Ser Gln Val
545 550 555 560
Val Lys Leu Val Leu Arg Ala Leu Arg Asp Leu Thr Arg Ile Trp Asn
565 570 575
Ala Ala Thr Thr Thr Ala Phe Leu Val Cys Leu Val Lys Ile Val Arg
580 585 590
Gly Gln Met Val Gln Gly Ile Leu Trp Leu Leu Leu Ile Thr Gly Val
595 600 605
Gln Gly His Leu Asp Cys Lys Pro Glu Phe Ser Tyr Ala Ile Ala Lys
610 615 620
Asp Glu Arg Ile Gly Gln Leu Gly Ala Glu Gly Leu Thr Thr Thr Trp
625 630 635 640
Lys Glu Tyr Ser Pro Gly Met Lys Leu Glu Asp Thr Met Val Ile Ala
645 650 655
Trp Cys Glu Asp Gly Lys Leu Met Tyr Leu Gln Arg Cys Thr Arg Glu
660 665 670
Thr Arg Tyr Leu Ala Ile Leu His Thr Arg Ala Leu Pro Thr Ser Val
675 680 685
Val Phe Lys Lys Leu Phe Asp Gly Arg Lys Gln Glu Asp Val Val Glu
690 695 700
Met Asn Asp Asn Phe Glu Phe Gly Leu Cys Pro Cys Asp Ala Lys Pro
705 710 715 720
Ile Val Arg Gly Lys Phe Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly Pro Ala Phe
725 730 735
Gln Met Val Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Thr Val Ser Cys Thr Ser
740 745 750
Phe Asn Met Asp Thr Leu Ala Thr Thr Val Val Arg Thr Tyr Arg Arg
755 760 765
Ser Lys Pro Phe Pro His Arg Gln Gly Cys Ile Thr Gln Lys Asn Leu
770 775 780
Gly Glu Asp Leu His Asn Cys Ile Leu Gly Gly Asn Trp Thr Cys Val
PRH47110AJ SEQ ID NOS
785 790 795 800
Pro Gly Asp Gln Leu Leu Tyr Lys Gly Gly Ser Ile Glu Ser Cys Lys
805 810 815
Trp Cys Gly Tyr Gln Phe Lys Glu Ser Glu Gly Leu Pro His Tyr Pro
820 825 830
Ile Gly Lys Cys Lys Leu Glu Asn Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Val Asp
835 840 845
Ser Thr Ser Cys Asn Arg Glu Gly Val Ala Ile Val Pro Gln Gly Thr
850 855 860
Leu Lys Cys Lys Ile Gly Lys Thr Thr Val Gln Val Ile Ala Met Asp
865 870 875 880
Thr Lys Leu Gly Pro Met Pro Cys Arg Pro Tyr Glu Ile Ile Ser Ser
885 890 895
Glu Gly Pro Val Glu Lys Thr Ala Cys Thr Phe Asn Tyr Thr Lys Thr
900 905 910
Leu Lys Asn Lys Tyr Phe Glu Pro Arg Asp Ser Tyr Phe Gln Gln Tyr
915 920 925
Met Leu Lys Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Phe Asp Leu Glu Val Thr Asp
930 935 940
His His Arg Asp Tyr Phe Ala Glu Ser Ile Leu Val Val Val Val Ala
945 950 955 960
Leu Leu Gly Gly Arg Tyr Val Leu Trp Leu Leu Val Thr Tyr Met Val
965 970 975
Leu Ser Glu Gln Lys Ala Leu Gly Ile Gln Tyr Gly Ser Gly Glu Val
980 985 990
Val Met Met Gly Asn Leu Leu Thr His Asn Asn Ile Glu Val Val Thr
995 1000 1005
Tyr Phe Leu Leu Leu Tyr Leu Leu Leu Arg Glu Glu Ser Val Lys
1010 1015 1020
Lys Trp Val Leu Leu Leu Tyr His Ile Leu Val Val His Pro Ile
1025 1030 1035
Lys Ser Val Ile Val Ile Leu Leu Met Ile Gly Asp Val Val Lys
1040 1045 1050
Ala Asp Ser Gly Gly Gln Glu Tyr Leu Gly Lys Ile Asp Leu Cys
1055 1060 1065
Phe Thr Thr Val Val Leu Ile Val Ile Gly Leu Ile Ile Ala Arg
1070 1075 1080
PRH47110AJ SEQ ID NOS
Arg Asp Pro Thr Ile Val Pro Leu Val Thr Ile Met Ala Ala Leu
1085 1090 1095
Arg Val Thr Glu Leu Thr His Gln Pro Gly Val Asp lle Ala Val
1100 1105 1110
Ala Val Met Thr Ile Thr Leu Leu Met Val Ser Tyr Val Thr Asp
1115 1120 1125
Tyr Phe Arg Tyr Lys Lys Trp Leu Gln Cys Ile Leu Ser Leu Val
1130 1135 1140
Ser Ala Val Phe Leu Ile Arg Ser Leu Ile Tyr Leu Gly Arg Ile
1145 1150 1155
Glu Met Pro Glu Val Thr Ile Pro Asn Trp Arg Pro Leu Thr Leu
1160 1165 1170
Ile Leu Leu Tyr Leu Ile Ser Thr Thr Ile Val Thr Arg Trp Lys
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Val Asp Val Ala Gly Leu Leu Leu Gln Cys Val Pro Ile Leu Leu
1190 1195 1200
Leu Val Thr Thr Leu Trp Ala Asp Phe Leu Thr Leu Ile Leu Ile
1205 1210 1215
Leu Pro Thr Tyr Glu Leu Val Lys Leu Tyr Tyr Leu Lys Thr Val
1220 1225 1230
Arg Thr Asp Thr Glu Arg Ser Trp Leu Gly Gly Ile Asp Tyr Thr
1235 1240 1245
Arg Val Asp Ser Ile Tyr Asp Val Asp Glu Ser Gly Glu Gly Val
1250 1255 1260
Tyr Leu Phe Pro Ser Arg Gln Lys Ala Gln Gly Asn Phe Ser Ile
1265 1270 1275
Leu Leu Pro Leu Ile Lys Ala Thr Leu Ile Ser Cys Val Ser Ser
1280 1285 1290
Lys Trp Gln Leu Ile Tyr Met Ser Tyr Leu Thr Leu Asp Phe Met
1295 1300 1305
Tyr Tyr Met His Arg Lys Val Ile Glu Glu Ile Ser Gly Gly Thr
1310 1315 1320
Asn Ile Ile Ser Arg Leu Val Ala Ala Leu Ile Glu Leu Asn Trp
1325 1330 1335
Ser Met Glu Glu Glu Glu Ser Lys Gly Leu Lys Lys Phe Tyr Leu
1340 1345 1350
Leu Ser Gly Arg Leu Arg Asn Leu Ile Ile Lys His Lys Val Arg
1355 1360 1365
PRH47110AJ SEQ ID NOS
Asn Glu Thr Val Ala Ser Trp Tyr Gly Glu Glu Glu Val Tyr Gly
1370 1375 1380
Met Pro Lys Ile Met Thr Ile Ile Lys Ala Ser Thr Leu Ser Lys
1385 1390 1395
Ser Arg His Cys Ile Ile Cys Thr Val Cys Glu Gly Arg Glu Trp
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Lys Gly Gly Thr Cys Pro Lys Cys Gly Arg His Gly Lys Pro Ile
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Thr Cys Gly Met Ser Leu Ala Asp Phe Glu Glu Arg His Tyr Lys
1430 1435 1440
Arg Ile Phe Ile Arg Glu Gly Asn Phe Glu Gly Met Cys Ser Arg
1445 1450 1455
Cys Gln Gly Lys His Arg Arg Phe Glu Met Asp Arg Glu Pro Lys
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Ser Ala Arg Tyr Cys Ala Glu Cys Asn Arg Leu His Pro Ala Glu
1475 1480 1485
Glu Gly Asp Phe Trp Ala Glu Ser Ser Met Leu Gly Leu Lys Ile
1490 1495 1500
Thr Tyr Phe Ala Leu Met Asp Gly Lys Val Tyr Asp Ile Thr Glu
1505 1510 1515
Trp Ala Gly Cys Gln Arg Val Gly Ile Ser Pro Asp Thr His Arg
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Glu Tyr Asn Gly Phe Val Gln Tyr Thr Ala Arg Gly Gln Leu Phe
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Leu Arg Asn Leu Pro Val Leu Ala Thr Lys Val Lys Met Leu Met
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PRH47110AJ SEQ ID NOS
Ala Tyr Thr His Gln Gly Gly Ile Ser Ser Val Asp His Val Thr
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Ala Ser Gly Thr Pro Ala Phe Phe Asp Leu Lys Asn Leu Lys Gly
1745 1750 1755
Trp Ser Gly Leu Pro Ile Phe Glu Ala Ser Ser Gly Arg Val Val
1760 1765 1770
Gly Arg Val Lys Val Gly Lys Asn Glu Glu Ser Lys Pro Thr Lys
1775 1780 1785
Ile Met Ser Gly Ile Gln Thr Val Ser Lys Asn Arg Ala Asp Leu
1790 1795 1800
Thr Glu Met Val Lys Lys Ile Thr Ser Met Asn Arg Gly Asp Phe
1805 1810 1815
Lys Gln Ile Thr Leu Ala Thr Gly Ala Gly Lys Thr Thr Glu Leu
1820 1825 1830
Pro Lys Ala Val lle Glu Glu Ile Gly Arg His Lys Arg Val Leu
1835 1840 1845
Val Leu Ile Pro Leu Arg Ala Ala Ala Glu Ser Val Tyr Gln Tyr
1850 1855 1860
Met Arg Leu Lys His Pro Ser Ile Ser Phe Asn Leu Arg Ile Gly
1865 1870 1875
Asp Met Lys Glu Gly Asp Met Ala Thr Gly Ile Thr Tyr Ala Ser
1880 1885 1890
Tyr Gly Tyr Phe Cys Gln Met Pro Gln Pro Lys Leu Arg Ala Ala
1895 1900 1905
Met Val Glu Tyr Ser Tyr Ile Phe Leu Asp Glu Tyr His Cys Ala
1910 1915 1920
Thr Pro Glu Gln Leu Ala Ile Ile Gly Lys Ile His Arg Phe Ser
PRH47110AJ SEQ ID NOS
1925 1930 1935
Glu Ser Ile Arg Val Val Ala Met Thr Ala Thr Pro Ala Gly Ser
1940 1945 1950
Val Thr Thr Thr Gly Gln Lys His Pro Ile Glu Glu Phe Ile Ala
1955 1960 1965
Pro Glu Val Met Lys Gly Glu Asp Leu Gly Ser Gln Phe Leu Asp
1970 1975 1980
Ile Ala Gly Leu Lys Ile Pro Val Asp Glu Met Lys Gly Asn Met
1985 1990 1995
Leu Val Phe Val Pro Thr Arg Asn Met Ala Val Glu Val Ala Lys
2000 2005 2010
Lys Leu Lys Ala Lys Gly Tyr Asn Ser Gly Tyr Tyr Tyr Ser Gly
2015 2020 2025
Glu Asp Pro Ala Asn Leu Arg Val Val Thr Ser Gln Ser Pro Tyr
2030 2035 2040
Val Ile Val Ala Thr Asn Ala Ile Glu Ser Gly Val Thr Leu Pro
2045 2050 2055
Asp Leu Asp Thr Val Ile Asp Thr Gly Leu Lys Cys Glu Lys Arg
2060 2065 2070
Val Arg Val Ser Ser Lys Ile Pro Phe Ile Val Thr Gly Leu Lys
2075 2080 2085
Arg Met Ala Val Thr Val Gly Glu Gln Ala Gln Arg Arg Gly Arg
2090 2095 2100
Val Gly Arg Val Lys Pro Gly Arg Tyr Tyr Arg Ser Gln Glu Thr
2105 2110 2115
Ala Thr Gly Ser Lys Asp Tyr His Tyr Asp Leu Leu Gln Ala Gln
2120 2125 2130
Arg Tyr Gly Ile Glu Asp Gly Ile Asn Val Thr Lys Ser Phe Arg
2135 2140 2145
Glu Met Asn Tyr Asp Trp Ser Leu Tyr Glu Glu Asp Ser Leu Leu
2150 2155 2160
Ile Thr Gln Leu Glu Ile Leu Asn Asn Leu Leu Ile Ser Glu Asp
2165 2170 2175
Leu Pro Ala Ala Val Lys Asn Ile Met Ala Arg Thr Asp His Pro
2180 2185 2190
Glu Pro Ile Gln Leu Ala Tyr Asn Ser Tyr Glu Val Gln Val Pro
2195 2200 2205
PRH47110AJ SEQ ID NOS
Val Leu Phe Pro Lys Ile Arg Asn Gly Glu Val Thr Asp Thr Tyr
2210 2215 2220
Glu Asn Tyr Ser Phe Leu Asn Ala Arg Lys Leu Gly Glu Asp Val
2225 2230 2235
Pro Val Tyr Ile Tyr Ala Thr Glu Asp Glu Asp Leu Ala Val Asp
2240 2245 2250
Leu Leu Gly Leu Asp Trp Pro Asp Pro Gly Asn Gln Gln Val Val
2255 2260 2265
Glu Thr Gly Lys Ala Leu Lys Gln Val Thr Gly Leu Ser Ser Ala
2270 2275 2280
Glu Asn Ala Leu Leu Val Ala Leu Phe Gly Tyr Val Gly Tyr Gln
2285 2290 2295
Ala Leu Ser Lys Arg His Val Pro Met Ile Thr Asp Ile Tyr Thr
2300 2305 2310
Ile Glu Asp Gln Arg Leu Glu Asp Thr Thr His Leu Gln Tyr Ala
2315 2320 2325
Pro Asn Ala Ile Lys Thr Asp Gly Thr Glu Thr Glu Leu Lys Glu
2330 2335 2340
Leu Ala Ser Gly Asp Val Glu Lys lle Met Gly Ala Ile Ser Asp
2345 2350 2355
Tyr Ala Ala Gly Gly Leu Glu Phe Val Lys Ser Gln Ala Glu Lys
2360 2365 2370
Ile Lys Thr Ala Pro Leu Phe Lys Glu Asn Ala Glu Ala Ala Lys
2375 2380 2385
Gly Tyr Val Gln Lys Phe Ile Asp Ser Leu Ile Glu Asn Lys Glu
2390 2395 2400
Glu Ile Ile Arg Tyr Gly Leu Trp Gly Thr His Thr Ala Leu Tyr
2405 2410 2415
Lys Ser Ile Ala Ala Arg Leu Gly His Glu Thr Ala Phe Ala Thr
2420 2425 2430
Leu Val Leu Lys Trp Leu Ala Phe Gly Gly Glu Ser Val Ser Asp
2435 2440 2445
His Val Lys Gln Ala Ala Val Asp Leu Val Val Tyr Tyr Val Met
2450 2455 2460
Asn Lys Pro Ser Phe Pro Gly Asp Ser Glu Thr Gln Gln Glu Gly
2465 2470 2475
Arg Arg Phe Val Ala Ser Leu Phe Ile Ser Ala Leu Ala Thr Tyr
2480 2485 2490
PRH47110AJ SEQ ID NOS
Thr Tyr Lys Thr Trp Asn Tyr His Asn Leu Ser Lys Val Val Glu
2495 2500 2505
Pro Ala Leu Ala Tyr Leu Pro Tyr Ala Thr Ser Ala Leu Lys Met
2510 2515 2520
Phe Thr Pro Thr Arg Leu Glu Ser Val Val Ile Leu Ser Thr Thr
2525 2530 2535
Ile Tyr Lys Thr Tyr Leu Ser Ile Arg Lys Gly Lys Ser Asp Gly
2540 2545 2550
Leu Leu Gly Thr Gly Ile Ser Ala Ala Met Glu Ile Leu Ser Gln
2555 2560 2565
Asn Pro Val Ser Val Gly Ile Ser Val Met Leu Gly Val Gly Ala
2570 2575 2580
Ile Ala Ala His Asn Ala Ile Glu Ser Ser Glu Gln Lys Arg Thr
2585 2590 2595
Leu Leu Met Lys Val Phe Val Lys Asn Phe Leu Asp Gln Ala Ala
2600 2605 2610
Thr Asp Glu Leu Val Lys Glu Asn Pro Glu Lys Ile Ile Met Ala
2615 2620 2625
Leu Phe Glu Ala Val Gln Thr Ile Gly Asn Pro Leu Arg Leu Ile
2630 2635 2640
Tyr His Leu Tyr Gly Val Tyr Tyr Lys Gly Trp Glu Ala Lys Glu
2645 2650 2655
Leu Ser Glu Arg Thr Ala Gly Arg Asn Leu Phe Thr Leu Ile Met
2660 2665 2670
Phe Glu Ala Phe Glu Leu Leu Gly Met Asp Ser Gln Gly Lys Ile
2675 2680 2685
Arg Asn Leu Ser Gly Asn Tyr Ile Leu Asp Leu Ile Tyr Gly Leu
2690 2695 2700
His Lys Gln Ile Asn Arg Gly Leu Lys Lys Met Val Leu Gly Trp
2705 2710 2715
Ala Pro Ala Pro Phe Ser Cys Asp Trp Thr Pro Ser Asp Glu Arg
2720 2725 2730
Ile Arg Leu Pro Thr Asp Asn Tyr Leu Arg Val Glu Thr Arg Cys
2735 2740 2745
Pro Cys Gly Tyr Glu Met Lys Ala Phe Lys Asn Val Gly Gly Lys
2750 2755 2760
Leu Thr Lys Val Glu Glu Ser Gly Pro Phe Leu Cys Arg Asn Arg
2765 2770 2775
PRH47110AJ SEQ ID NOS
Pro Gly Arg Gly Pro Val Asn Tyr Arg Val Thr Lys Tyr Tyr Asp
2780 2785 2790
Asp Asn Leu Arg Glu Ile Lys Pro Val Ala Lys Leu Glu Gly Gln
2795 2800 2805
Val Glu His Tyr Tyr Lys Gly Val Thr Ala Lys Ile Asp Tyr Ser
2810 2815 2820
Lys Gly Lys Met Leu Leu Ala Thr Asp Lys Trp Glu Val Glu His
2825 2830 2835
Gly Val Ile Thr Arg Leu Ala Lys Arg Tyr Thr Gly Val Gly Phe
2840 2845 2850
Asn Gly Ala Tyr Leu Gly Asp Glu Pro Asn His Arg Ala Leu Val
2855 2860 2865
Glu Arg Asp Cys Ala Thr Ile Thr Lys Asn Thr Val Gln Phe Leu
2870 2875 2880
Lys Met Lys Lys Gly Cys Ala Phe Thr Tyr Asp Leu Thr Ile Ser
2885 2890 2895
Asn Leu Thr Arg Leu Ile Glu Leu Val His Arg Asn Asn Leu Glu
2900 2905 2910
Glu Lys Glu Ile Pro Thr Ala Thr Val Thr Thr Trp Leu Ala Tyr
2915 2920 2925
Thr Phe Val Asn Glu Asp Val Gly Thr Ile Lys Pro Val Leu Gly
2930 2935 2940
Glu Arg Val Ile Pro Asp Pro Val Val Asp Ile Asn Leu Gln Pro
2945 2950 2955
Glu Val Gln Val Asp Thr Ser Glu Val Gly Ile Thr Ile Ile Gly
2960 2965 2970
Arg Glu Thr Leu Met Thr Thr Gly Val Thr Pro Val Leu Glu Lys
2975 2980 2985
Val Glu Pro Asp Ala Ser Asp Asn Gln Asn Ser Val Lys Ile Gly
2990 2995 3000
Leu Asp Glu Gly Asn Tyr Pro Gly Pro Gly Ile Gln Thr His Thr
3005 3010 3015
Leu Thr Glu Glu Ile His Asn Arg Asp Ala Arg Pro Phe Ile Met
3020 3025 3030
Ile Leu Gly Ser Arg Asn Ser Ile Ser Asn Arg Ala Lys Thr Ala
3035 3040 3045
Arg Asn Ile Asn Leu Tyr Thr Gly Asn Asp Pro Arg Glu Ile Arg
PRH47110AJ SEQ ID NOS
3050 3055 3060
Asp Leu Met Ala Ala Gly Arg Met Leu Val Val Ala Leu Arg Asp
3065 3070 3075
Val Asp Pro Glu Leu Ser Glu Met Val Asp Phe Lys Gly Thr Phe
3080 3085 3090
Leu Asp Arg Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ser Leu Gly Gln Pro Lys
3095 3100 3105
Pro Lys Gln Val Thr Lys Glu Ala Val Arg Asn Leu Ile Glu Gln
3110 3115 3120
Lys Lys Asp Val Glu Ile Pro Asn Trp Phe Ala Ser Asp Asp Pro
3125 3130 3135
Val Phe Leu Glu Val Ala Leu Lys Asn Asp Lys Tyr Tyr Leu Val
3140 3145 3150
Gly Asp Val Gly Glu Leu Lys Asp Gln Ala Lys Ala Leu Gly Ala
3155 3160 3165
Thr Asp Gln Thr Arg Ile Ile Lys Glu Val Gly Ser Arg Thr Tyr
3170 3175 3180
Ala Met Lys Leu Ser Ser Trp Phe Leu Lys Ala Ser Asn Lys Gln
3185 3190 3195
Met Ser Leu Thr Pro Leu Phe Glu Glu Leu Leu Leu Arg Cys Pro
3200 3205 3210
Pro Ala Thr Lys Ser Asn Lys Gly His Met Ala Ser Ala Tyr Gln
3215 3220 3225
Leu Ala Gln Gly Asn Trp Glu Pro Leu Gly Cys Gly Val His Leu
3230 3235 3240
Gly Thr Ile Pro Ala Arg Arg Val Lys Ile His Pro Tyr Glu Ala
3245 3250 3255
Tyr Leu Lys Leu Lys Asp Phe Ile Glu Glu Glu Glu Lys Lys Pro
3260 3265 3270
Arg Val Lys Asp Thr Val Ile Arg Glu His Asn Lys Trp Ile Leu
3275 3280 3285
Lys Lys Ile Arg Phe Gln Gly Asn Leu Asn Thr Lys Lys Met Leu
3290 3295 3300
Asn Pro Gly Lys Leu Ser Glu Gln Leu Asp Arg Glu Gly Arg Lys
3305 3310 3315
Arg Asn Ile Tyr Asn His Gln Ile Gly Thr Ile Met Ser Ser Ala
3320 3325 3330
PRH47110AJ SEQ ID NOS
Gly Ile Arg Leu Glu Lys Leu Pro Ile Val Arg Ala Gln Thr Asp
3335 3340 3345
Thr Lys Thr Phe His Glu Ala Ile Arg Asp Lys Ile Asp Lys Ser
3350 3355 3360
Glu Asn Arg Gln Asn Pro Glu Leu His Asn Lys Leu Leu Glu Ile
3365 3370 3375
Phe His Thr Ile Ala Gln Pro Thr Leu Lys His Thr Tyr Gly Glu
3380 3385 3390
Val Thr Trp Glu Gln Leu Glu Ala Gly Val Asn Arg Lys Gly Ala
3395 3400 3405
Ala Gly Phe Leu Glu Lys Lys Asn Ile Gly Glu Val Leu Asp Ser
3410 3415 3420
Glu Lys His Leu Val Glu Gln Leu Val Arg Asp Leu Lys Ala Gly
3425 3430 3435
Arg Lys Ile Lys Tyr Tyr Glu Thr Ala Ile Pro Lys Asn Glu Lys
3440 3445 3450
Arg Asp Val Ser Asp Asp Trp Gln Ala Gly Asp Leu Val Val Glu
3455 3460 3465
Lys Arg Pro Arg Val Ile Gln Tyr Pro Glu Ala Lys Thr Arg Leu
3470 3475 3480
Ala Ile Thr Lys Val Met Tyr Asn Trp Val Lys Gln Gln Pro Val
3485 3490 3495
Val Ile Pro Gly Tyr Glu Gly Lys Thr Pro Leu Phe Asn Ile Phe
3500 3505 3510
Asp Lys Val Arg Lys Glu Trp Asp Ser Phe Asn Glu Pro Val Ala
3515 3520 3525
Val Ser Phe Asp Thr Lys Ala Trp Asp Thr Gln Val Thr Ser Lys
3530 3535 3540
Asp Leu Gln Leu Ile Gly Glu Ile Gln Lys Tyr Tyr Tyr Lys Lys
3545 3550 3555
Glu Trp His Lys Phe Ile Asp Thr Ile Thr Asp His Met Thr Glu
3560 3565 3570
Val Pro Val Ile Thr Ala Asp Gly Glu Val Tyr Ile Arg Asn Gly
3575 3580 3585
Gln Arg Gly Ser Gly Gln Pro Asp Thr Ser Ala Gly Asn Ser Met
3590 3595 3600
Leu Asn Val Leu Thr Met Met Tyr Gly Phe Cys Glu Ser Thr Gly
3605 3610 3615
PRH47110AJ SEQ ID NOS
Val Pro Tyr Lys Ser Phe Asn Arg Val Ala Arg Ile His Val Cys
3620 3625 3630
Gly Asp Asp Gly Phe Leu Ile Thr Glu Lys Gly Leu Gly Leu Lys
3635 3640 3645
Phe Ala Asn Lys Gly Met Gln Ile Leu His Glu Ala Gly Lys Pro
3650 3655 3660
Gln Lys Ile Thr Glu Gly Glu Lys Met Lys Val Ala Tyr Arg Phe
3665 3670 3675
Glu Asp Ile Glu Phe Cys Ser His Thr Pro Val Pro Val Arg Trp
3680 3685 3690
Ser Asp Asn Thr Ser Ser His Met Ala Gly Arg Asp Thr Ala Val
3695 3700 3705
Ile Leu Ser Lys Met Ala Thr Arg Leu Asp Ser Ser Gly Glu Arg
3710 3715 3720
Gly Thr Thr Ala Tyr Glu Lys Ala Val Ala Phe Ser Phe Leu Leu
3725 3730 3735
Met Tyr Ser Trp Asn Pro Leu Val Arg Arg Ile Cys Leu Leu Val
3740 3745 3750
Leu Ser Gln Gln Pro Glu Thr Asp Pro Ser Lys His Ala Thr Tyr
3755 3760 3765
Tyr Tyr Lys Gly Asp Pro Ile Gly Ala Tyr Lys Asp Val Ile Gly
3770 3775 3780
Arg Asn Leu Ser Glu Leu Lys Arg Thr Gly Phe Glu Lys Leu Ala
3785 3790 3795
Asn Leu Asn Leu Ser Leu Ser Thr Leu Gly Val Trp Thr Lys His
3800 3805 3810
Thr Ser Lys Arg Ile Ile Gln Asp Cys Val Ala Ile Gly Lys Glu
3815 3820 3825
Glu Gly Asn Trp Leu Val Lys Pro Asp Arg Leu Ile Ser Ser Lys
3830 3835 3840
Thr Gly His Leu Tyr Ile Pro Asp Lys Gly Phe Thr Leu Gln Gly
3845 3850 3855
Lys His Tyr Glu Gln Leu Gln Leu Arg Thr Glu Thr Asn Pro Val
3860 3865 3870
Met Gly Val Gly Thr Glu Arg Tyr Lys Leu Gly Pro Ile Val Asn
3875 3880 3885
Leu Leu Leu Arg Arg Leu Lys Ile Leu Leu Met Thr Ala Val Gly
3890 3895 3900
PRH47110AJ SEQ ID NOS
Val Ser Ser
3905
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物-侧出于突变片段的p15aDI克隆位点的5’端
<400>2
gaggccgtta acatatca18
<210>3
<211>27
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物-侧出于突变片段的p15aDI克隆位点的3’端
<400>3
cctaaatcac tttgaccctg ttgctgt27
<210>4
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物-用于引入I1841A突变的5’引物
<400>4
gaggcagggc gccacaagag agtattagtt30
<210>5
<211>32
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于引入I1841A突变的3’引物
<400>5
cttgtggcgc cctgcctcct ctataactgc tt32
<210>6
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于引入R1843A突变的5’引物
<400>6
gagataggcg cccacaagag agtattagtt30
<210>7
<211>27
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于引入R1843A突变的3’引物
<400>7
PRH47110AJ SEQ ID NOS
cttgtgggcg cctatctcct ctataac27
<210>8
<211>32
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于引入K1845A突变的5’引物
<400>8
atagggcgcc acgcgagagt attagttctt at32
<210>9
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于引入K1845A突变的3’引物
<400>9
tctcgcgtgg cgccctatct cctctataac30
<210>10
<211>34
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于引入K1867A突变的5’引物
<400>10
ttggctcacc catcgatctc ttttaaccta agga34
<210>11
<211>37
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于引入K1867A突变的3’引物
<400>11
agagatcgat gggtgagcca atctcatata ctggtag37
<210>12
<211>31
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于引入H1868A突变的5’引物
<400>12
aaagctccat cgatctcttt taacctaagg a31
<210>13
<211>34
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于引入H1868A突变的3’引物
<400>13
agagatcgat ggagctttca atctcatata ctgg34
PRH47110AJ SEQ ID NOS
<210>14
<211>34
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于引入P1869A突变的5’引物
<400>14
cacgcgagca taagctttaa cctaaggata gggg34
<210>15
<211>36
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于引入P1869A突变的3’引物
<400>15
ttaaagctta tgctcgcgtg tttcaatctc atatac36
<210>16
<211>32
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于引入E1939A突变的5’引物
<400>16
ccatcgattt tcagcgagta taagggttgt cg32
<210>17
<211>32
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于引入E1939A突变的3’引物
<400>17
ctcgctgaaa atcgatggat cttcccgata at32
<210>18
<211>42
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于引入R1942A突变的5’引物
<400>18
ccatcgattt tcagagagta tagcggttgt cgccatgact gc 42
<210>19
<211>41
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于引入R1942A突变的3’引物
<400>19
accgctatac tctctgaaaa tcgatggatc ttcccgataa t 41
<210>20
<211>166
<212>PRT
PRH47110AJ SEQ ID NOS
<213>人工
<220>
<223>BVDV的NS3域的片段
<400>20
Ser Lys Asn Arg Ala Asp Leu Thr Glu Met Val Lys Lys Ile Thr Ser
1 5 10 15
Met Asn Arg Gly Asp Phe Lys Gln Ile Thr Leu Ala Thr Gly Ala Gly
20 25 30
Lys Thr Thr Glu Leu Pro Lys Ala Val Ile Glu Glu Ile Gly Arg His
35 40 45
Lys Arg Val Leu Val Leu Ile Pro Leu Arg Ala Ala Ala Glu Ser Val
50 55 60
Tyr Gln Tyr Met Arg Leu Lys His Pro Ser Ile Ser Phe Asn Leu Arg
65 70 75 80
Ile Gly Asp Met Lys Glu Gly Asp Met Ala Thr Gly Ile Thr Tyr Ala
85 90 95
Ser Tyr Gly Tyr Phe Cys Gln Met Pro Gln Pro Lys Leu Arg Ala Ala
100 105 110
Met Val Glu Tyr Ser Tyr Ile Phe Leu Asp Glu Tyr His Cys Ala Thr
115 120 125
Pro Glu Gln Leu Ala Ile Ile Gly Lys Ile His Arg Phe Ser Glu Ser
130 135 140
Ile Arg Val Val Ala Met Thr Ala Thr Pro Ala Gly Ser Val Thr Thr
145 150 155 160
Thr Gly Gln Lys His Pro
165
<210>21
<211>145
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>HCV的NS3域的片段
<400>21
Pro Pro Ala Val Pro Gln Thr Phe Gln Val Ala His Leu His Ala Pro
1 5 10 15
Thr Gly Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln
20 25 30
Gly Tyr Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Leu Gly
35 40 45
Phe Gly Val Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Ile Asp Pro Asn Ile Arg
50 55 60
PRH47110AJ SEQ ID NOS
Thr Gly Val Arg Ala Ile Thr Thr Gly Gly Pro Ile Thr Tyr Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Gly Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp
85 90 95
Ile Ile Ile Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ser Thr Ser Ile Leu
100 105 110
Gly Ile Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala G1u Thr Ala Gly Ala Arg Leu
115 120 125
Val Val Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Hly Ser Ile Thr Val Pro His
130 135 140
Pro
14权利要求
1.一种牛病毒性腹泻病毒，其包括至少一个解螺旋酶域氨基酸突变，其中NS3的解螺旋酶域中的突变导致野生型牛病毒性腹泻病毒的NS3的单克隆抗体丧失识别力，但其中病毒RNA的复制和传染性病毒的产生仍然保留。
2.一种牛病毒性腹泻病毒，其包括至少一个解螺旋酶域氨基酸突变，其中NS3不被NS3单克隆抗体所识别，其中所述NS3抗体选自20.10.6、1.11.3、21.5.8和24.8，但其中病毒RNA的复制和传染性病毒的产生仍然保留。
3.如权利要求1所述的牛病毒性腹泻病毒，其中病毒疫苗包括一个解螺旋酶域氨基酸突变。
4.如权利要求1所述的牛病毒性腹泻病毒，其包括在IGR环中的解螺旋酶域突变。
5.如权利要求4所述的牛病毒性腹泻病毒，其包括在IGR环中在氨基酸残基1841处的解螺旋酶域突变。
6.如权利要求4所述的牛病毒性腹泻病毒，其包括在IGR环中在氨基酸残基1843处的解螺旋酶域突变。
7.如权利要求4所述的牛病毒性腹泻病毒，其包括在IGR环中在氨基酸残基1845处的解螺旋酶域突变。
8.如权利要求1所述的牛病毒性腹泻病毒，其包括在KHP环中的解螺旋酶域突变。
9.如权利要求8所述的牛病毒性腹泻病毒，其包括在KHP环中在氨基酸残基1867处的解螺旋酶域突变。
10.如权利要求8所述的牛病毒性腹泻病毒，其包括在KHP环中在氨基酸残基1868处的解螺旋酶域突变。
11.如权利要求8所述的牛病毒性腹泻病毒，其包括在KHP环中在氨基酸残基1869处的解螺旋酶域突变。
12.如权利要求1所述的牛病毒性腹泻病毒，其包括在SES环中的解螺旋酶域突变。
13.如权利要求12所述的牛病毒性腹泻病毒，其包括在SES环中在氨基酸残基1939处的解螺旋酶域突变。
14.如权利要求12所述的牛病毒性腹泻病毒，其包括在SES环中在氨基酸残基1942处的解螺旋酶域突变。
15.如权利要求1所述的牛病毒性腹泻病毒，其中所述病毒包括两个、三个或四个解螺旋酶域氨基酸突变。
16.如权利要求15所述的牛病毒性腹泻病毒，其包括两个解螺旋酶域突变。
17.如权利要求16所述的牛病毒性腹泻病毒，其中所述两个解螺旋酶域突变是在IGR环中。
18.如权利要求17所述的牛病毒性腹泻病毒，其中所述在IGR环中的两个解螺旋酶域突变是在氨基酸残基1843和1845处。
19.如权利要求16所述的牛病毒性腹泻病毒，其中所述两个解螺旋酶域突变是在SES环中。
20.如权利要求19所述的牛病毒性腹泻病毒，其中所述在SES环中的两个解螺旋酶域突变是在氨基酸残基1939和1942处。
21.如权利要求15所述的牛病毒性腹泻病毒，其包括三个解螺旋酶域突变。
22.如权利要求21所述的牛病毒性腹泻病毒，其中所述三个解螺旋酶域突变是在IGR环中。
23.如权利要求22所述的牛病毒性腹泻病毒，其中所述在IGR环中的三个解螺旋酶域突变是在氨基酸残基1867、1868和1869处。
24.如权利要求21所述的牛病毒性腹泻病毒，其包括在IGR环和SES环中在氨基酸残基1845、1868和1939处的三个解螺旋酶域突变。
25.一种经标记的牛病毒性腹泻病毒疫苗，其包括包含至少一个解螺旋酶域氨基酸突变的牛病毒性腹泻病毒，其中NS3的解螺旋酶域突变导致野生型牛病毒性腹泻病毒的NS3的单克隆抗体丧失识别力，但是其中病毒RNA的复制和传染性病毒的产生仍被保留。
26.一种区分被牛腹泻病毒感染的动物与用牛腹泻病毒疫苗接种的动物的方法，其中所述牛腹泻病毒疫苗是包括至少一个解螺旋酶域氨基酸突变的经标记的疫苗，所述方法包括
从试验动物得到试样；
检测所述试样中的牛腹泻病毒；和
确定该牛腹泻病毒是否包括突变。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述检测牛腹泻病毒的方法使用至少一种单克隆抗体。
28.如权利要求26所述的方法，其中所述经标记的疫苗的解螺旋酶域氨基酸突变是在NS3的解螺旋酶域中。
29.如权利要求27所述的方法，其包括下述步骤
向试样中加入能够检测野生型牛腹泻病毒或能够检测突变牛腹泻病毒的标识抗体，其中该试样含有得自试验动物的体液；以及
通过将至少一种单克隆抗体与所述野生型牛腹泻病毒或与所述突变牛腹泻病毒接触，来测量所述标识抗体与所述野生型牛腹泻病毒或与所述突变牛腹泻病毒的结合亲和力；以及
比较使用针对野生型BVDV病毒的单克隆抗体与针对带突变NS3的BVDV病毒的单克隆抗体的结合亲和力结果，来确定试验动物的疫苗接种状态。
30.如权利要求27所述的方法，其包括下述步骤
加入针对非突变NS3的域的经标识的第一抗体；以及
加入针对NS3突变部分的经标识的第二抗体。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述第一抗体针对野生型病毒。
32.如权利要求30所述的方法，其中所述第二抗体针对NS3的突变部分。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述第二抗体针对NS3，并且选自20.10.6、1.11.3、21.5.8和24.8。
34.如权利要求32所述的方法，其中所述第二抗体针对选自IGR环、KHP环和SES环的至少一个NS3突变部分。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述牛病毒性腹泻病毒包括在IGR环中在选自1841、1843和1845的氨基酸残基处的至少一个解螺旋酶域氨基酸突变。
36.如权利要求34所述的方法，其中所述牛病毒性腹泻病毒包括在KHP环中在选自1867、1868和1869的氨基酸残基处的至少一个解螺旋酶域氨基酸突变。
37.如权利要求34所述的方法，其中所述牛病毒性腹泻病毒包括在SES环中在选自1939和1942的氨基酸残基处的至少一个解螺旋酶域氨基酸突变。
38.如权利要求34所述的方法，其中所述牛病毒性腹泻病毒包括在IGR环和SES环中在氨基酸残基1845、1868和1939处的至少一个解螺旋酶域氨基酸突变。
全文摘要
本发明涉及一种牛病毒性腹泻病毒，其包括至少一种解螺旋域氨基酸突变，其中NS3域中的突变导致野生型NS3的单克隆抗体丧失识别力，但是其中病毒RNA的复制和传染性病毒的产生仍然保留。本发明可用于例如生产经标记的牛病毒性腹泻病毒疫苗或用于识别已接种和已感染或未接种的动物。
文档编号C07K14/18GK101355963SQ200680050797
公开日2009年1月28日 申请日期2006年11月24日 优先权日2005年12月7日
发明者黄骐骐, G·谢泼德 迈克尔·, 曹雪梅, 加布里埃尔·齐巴思 申请人:辉瑞产品公司