阳离子寡核苷酸、制备阳离子寡核苷酸的自动化方法及其用途的制作方法

专利名称：阳离子寡核苷酸、制备阳离子寡核苷酸的自动化方法及其用途的制作方法
阳离子寡核苷酸、制备阳离子寡核苷酸的自动化方法及其用途
本发明涉及可在寡核苷酸合成仪上分步合成的阳离子寡核苷酸，即寡 核苷酸-寡阳离子分子，在本说明书中也称为阳离子寡核苷酸(不论其总电荷 多少)。本发明还涉及它们在分子生物学、诊断学和治疗应用中的用途。
寡核苷酸在分子生物学和诊断学中应用非常广泛，有可能成为许多疾 病治疗的一类高度选择性药物。
寡核苷酸是与其他聚阴离子核酸上携带的互补序列杂交后可发挥其特 异活性的聚阴离子。
作为药物候选物，它们还必须能够跨越带负电的细胞膜。
从静电学方面稍加考虑便可推断出向寡核苷酸结构加入阳离子基团有 助于杂交能量和细胞结合。
为了实现这一目的，已探究了许多用于向寡核苷酸引入铵基和胍基的 合成方法磷酸骨架置换、核糖或核酸碱基修饰和末端结合聚阳离子。但 是杂交特异性、核酸-加工酶活性以及代谢物毒性方面的考虑都表明嵌段方
法(block approach)是最佳的解决方法，其中聚阳离子被附加到原本天然的寡 核苷酸上。但可惜的是，寡核苷酸-阳离子肽缀合物的分步自动化合成尚未 普遍实施。另一方面，预形成的大嵌段之间的结合化学反应并不简单，尤 其是水中"超级"两性离子会引起难溶、纯化和鉴定问题。此外，分子生物学 和诊断学应用需要快速简便地合成连接到任何有机阳离子长度上的任何给 定碱基序列。
本发明人业已发现通过将含有适宜地被活化和保护的寡阳离子衍生物 的小瓶插入加有四种天然碱基的小瓶的寡核苷酸合成仪可以实现寡核苷酸-寡阳离子的在线电脑驱动合成。
因此本发明的一个目的是提供新的阳离子寡核苷酸。 本发明的另一目的是提供所述阳离子寡核苷酸的高产率自动化合成。 本发明的又一目的涉及所述阳离子寡核苷酸的应用、尤其是在分子生 物学、诊断学和治疗学中的应用。
因此本发明涉及可通过自动化亚磷酰胺化学即聚磷酸二酯而合成的混 合寡核苷酸寡阳离子分子。
更具体地，本发明所述阳离子寡核苷酸AjBjH具有寡核苷酸部分Ai和 寡阳离子部分Bj，其屮
.Aj是i聚体的寡核苷酸残基，i=5-50，其中核苷酸A是具有天然或非 天然核碱基和/或戊呋喃糖基和/或天然磷酸二酯键的寡聚体。
.Bj是j聚体的有机寡阳离子部分，j=l-50，其中B选自包括以下基团 的组
-HPOrR^X-R^nrX-RLO-,其中R1、 1^和113是相同或不同的低级亚 烷基，X是NH或NC(nh2)2，n为1-5， nl=2-20，
-HP03-RtCH(RSx')-R6-0，其中R"是低级亚烷基，115和116是相同或 不同的低级亚烷基，X"为腐胺、亚精胺或精胺残基，
-HP03-R7-(aa)n2-R8-0-，其中R"是低级亚垸基，118是低级亚烷基、丝氨 酸、天然氨基醇，(aa)^是含有带阳离子侧链的天然氨基酸如精氨酸、赖氨 酸、鸟氨酸、组氨酸、二氨基丙酸的肽，n2=2-20。
本说明书和权利要求书所使用的"低级垸基"和"低级亚烷基"优选地分 别系指任选取代的Cl-C5直链或支链烷基或亚垸基。
例如A选自包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、锁定(LNA)核苷酸以 及它们的化学修饰或取代如硫代磷酸酯(phosphorothioate)(也被称为硫代磷 酸酯(thiophosphate))， 2'-氟基，2'-0-烷基或标记基团如荧光剂的组。
本发明的混合寡核苷酸-寡阳离子分子具有3'A5'-B序列。
本发明的其他分子具有B」'as'序列。
本发明的其他分子具有B-3'A5'-B或3、5'各3、5'序列。
通过具有下列结构的寡核苷酸-精胺分子在实施例中例示了该序列
<formula>formula see original document page 6</formula>
其中A、 i和j的定义同上。 '
考虑到其生物学应用，具有A为硫代磷酸核苷酸的分子特别有利，这 是因为硫代磷酸寡核苷酸在生物学液体中不被水解。
上述定义的阳离子寡核苷酸与其互补序列在链置换的背景下和甚至质 粒链侵入的背景下形成快速稳定的复合物，正如实施例所例示。 由于末端缀合，序列选择性如对于天然核苷酸一样高。
因此，本发明所述阳离子寡核苷酸非常适合于分子生物学、研究试剂
和诊断应用，例如PCR、实时PCR、基因型分型、原位杂交和DNA芯片。 这些应用也被涵盖在本发明中，而且还包括使用如上定义的寡核苷酸-寡阳离子分子。
与阴离子寡核苷酸不同的是，实施例所显示的本发明阳离子寡核苷酸 可自发进入活细胞的细胞质和细胞核。
鉴于其增强的杂交和细胞穿透性质，它们也能用于治疗方法，例如通 过信使RNA的反义和siRNA降解、通过信使RNA成熟过程中的外显子跨 跃、通过与染色质形成三螺旋、通过染色质链侵入(基因修正)而介导的这些 治疗方法。
因此本发明还涉及含有有效量的如上定义的寡核苷酸-寡阳离子和药用 载体的药物组合物。
因此本发明还涉及包括使用有效量的如上定义的寡核苷酸-寡阳离子以 及药用载体的治疗方法。
上述定义的混合寡核苷酸-寡阳离子分子在寡核苷酸合成仪上通过亚磷 酰胺路径根据如下方法分步合成是有利的，这一方法包括
-将含有被活化和保护的寡阳离子B的小瓶插入加有如上定义的寡核苷 酸A的小瓶的寡核苷酸合成仪，或颠倒顺序，
-达到所需长度时，停止合成，
-将寡聚体从固相载体上切割下来，以及
-除去保护基团。
本发明密切涉及用于构造寡阳离子重复嵌段B的自动化合成的亚磷酰 胺试剂。下列亚磷酰胺试剂可以用于这一目的
P(OR9)(N(R0)2)-O-R'-(X-R2n)n广X誦R3画O-Prot，其中R1、 R2、 R3、 n禾口nl 的定义同上，X是适宜地被保护的NH或NC(NH2)2， ！^是-CH2CH2CN或低 级烷基，R^是低级烷基，或-N(R")2是吡咯垸基(pyrrolidinogroup)、哌啶基
(piperidino group)或吗啉基(morpholino group), Prot是用于寡核苷酸合成的 保护基，例如DMT、 MMT;
P(OR9)(N(R10)2)-O-R4-CH(R5Xl)-R6-O-Prot，其中R4、 R5、 116是低级亚 垸基，X'是适宜地被保护的腐胺、亚精胺或精胺，W和RW的定义同上；
P(OR9)(N(R10)2)-O-R7-(aa)n2-R8-O-Prot，其中R7、 R8、 R9、 R10、 n2和 Prot的定义同上，(aa)n2是含有带有适宜地被保护的阳离子侧链的天然氨基 酸例如精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸，组氨酸、二氨基丙酸的肽，ri2=2-20。
适宜地被保护的NH或NC (NH2)2意味着保护基分别位于氨基或胍基 上，使得其功能性对所述试剂所处的化学反应条件具有惰性。
这类保护基为例如酞酰亚胺(PHTH)、三氟乙酸、烯丙氧羰基(Alloc)、 苄氧羰基(CBZ)、氯苄氧羰基、叔丁氧羟基(Boc)、芴甲氧羰基(Fmoc)和异烟 酰氧基(i-Noc)。
根据本发明的一个实施方式，所述核苷酸序列的分步合成后接着进行 所述寡阳离子部分的分步合成，以获得具有序列(3'八5'- B)的化合物。
根据另一实施方式，进行逆向步骤，寡阳离子部分的分步合成后接着 进行寡核苷酸序列的分步合成，以获得(BJ'as')序列的化合物。
根据又一实施方式，合成混合序列。
具体而言，两端加帽的寡核苷酸序列(B J'aS'-B)可以抵抗生物学液体中 的外切核酸酶，被阳离子打断的序列(3'八5'-8-3'八5')允许邻近核酸序列的靶向 作用。
通过使用天然胺(如精胺)或肽(如寡精氨酸)，可以避免代谢物的潜在毒 性。细胞内确实存在毫摩尔浓度的精胺，其末端烷基化是无害的。而且， 许多核蛋白都具有碱性肽序列。
通过保护多胺的氨基和随后进行a， co-双羟垸基化以形成适合寡核苷酸 合成的二醇来获得被活化和保护的寡阳离子B是有利的。
经典的DMT和亚磷酰胺延伸化学反应与碱基不稳定的TFA保护基一 起进行，这是有利的。
受化学保护的二醇是新的产物并进入本发明的范围内。
本发明特别涉及选自包括以下中间体的组的中间体
P(OR9)(N(R10)2)-O-R'-(X-R2n)nl-X-R3-O-Prot,其中R1、 R2、 R3、 n禾口 nl 的定义同上，X是适宜地被保护的NH或NC(NH2)2， R9是-CH2CH2CN或低 级垸基，R1Q是低级烷基，或-N(R 是吡咯烷基、哌啶基或吗啉基，Prot 是用于寡核苷酸合成的保护基，例如DMT、 MMT;
P(OR9)(N(R10)2)-O-R4-CH(R5Xl)-R6-O-Prot，其中R4、 R5、 R6是低级亚 烷基，X'是适宜地被保护的腐胺、亚精胺或精胺，尺9和111()的定义同上；
P(OR9)(N(R10)2)-O-R7-(aa)n2-R8-O-Prot，其中R7、 R8、 R9、 R1。、 n2和 Prot的定义同上，(aak是含有带有适宜地被保护的阳离子侧链的天然氨基 酸如精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、组氨酸、二氨基丙酸的肽，n2=2-20。
下文给出了本发明的其它特征和优点。具体而言，具有精胺(S)的十聚 体寡核苷酸序列(A,。)(下文称为A,oSJ的合成将通过例示的方式给出，但不 用于限制本发明。在实施例中，将分别参照

图1至14，其分别代表 -图1，阳离子寡核苷酸N,。Sn(n-l-2)在反相柱上的HPLC分析， -图2，纯化寡核苷酸N,。Sn(n-l-6)在阴离子交换柱上的HPLC分析， -图3，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析N,eSn(t^l-6)的电泳迁移率， -图4， NH)与NnrCH)在各种温度下的自发交换， -图5，经聚丙烯酰胺凝胶电泳揭示N，o与N,()Sn之间的链交换， -图6， Nu)S^Cu)双链体(其中C是与N互补的核苷酸)的熔解温度， -图7: Nl0Sn (11=0-6)与5'GTGGC^TCGC3'和与5'GTGGCQTCGC3'之间 形成的双链体的熔解温度的比较结果，
-图8，纯化Nu)Sn(i^l-6)寡核苷酸的ES-MS分析，
-图9，硫代磷酸寡核苷酸Nl2SnF (9A)和N^S2F(犯)的HPLC谱图，
-图10， N12S2F (IOA)和N12SnF (IOB)的MALDI-TOF MS质谱，
-图11， N,4S4F(llA)和N2oS5F(llB)的HPLC谱图，
-图12， N14S4F (12A)和N20S5F (12B)的MALDI-TOF MS质谱，
-图13， N14SnF (13A)和N2()SnF (13B)对pGL2和pGL3质粒的链侵入。
-图14A和14B,阳离子寡核苷酸F-S,8Nw穿透到Hela细胞中。
实施例l:亚磷酰胺精胺合成子的合成
根据下列路线图1从精胺合成与精胺连接的亚磷酰胺1:<formula>formula see original document page 10</formula>由精胺制备的四(2,4，6-三甲苯磺酰基)精胺2被双垸基化成3。在酸性条 件下对3完全去保护后，以三氟乙酸酐的吡啶溶液将粗双(C4-OH))精胺四 氢溴化物4完全保护，然后在中性条件下将5的两个末端酯基水解形成二 醇6。使用1摩尔当量的DMTC1试剂通过统计学方式进行5的单三苯甲基 化反应，以提供产率为43%的7。在弱酸性条件下(三氟乙酸的二氯甲垸溶 液)回收和重平衡未反应的二醇6和双三苯甲基化合物8以提供7。7亚磷酸 化后生成所需的亚磷酰胺1。
V， V，《V七四(2，4，6-三甲苯磺酰基)精胺(2》根据参考文献Bergeron 等人丄Med. Chem. 2001， 44， 232- 244制备该化合物。
V， A^-双[4-(叔丁基二甲基硅氧基)丁基]-A^， V， iV9， A^-四(2，4，6-三甲 苯磺酰基)-精胺(3):将氯化钠(60%， 1.0 g, 25 mmol)分次加入到2(9.31 <formula>formula see original document page 10</formula>
mmol)的DMF(20 ml)溶液，在N2下于0。C搅拌。室温下搅拌30分钟后， 一次加入叔丁基(4-碘丁氧基)二甲基硅垸(7.86 g， 25 mmol)。该混合物于室温 过夜搅拌，继而在H2OCH2Cl2 (100 mL/100 mL)之间进行分配。分离有机相， 并使用CH2C12(50 mL)对水相进行3次萃取。合并后的有机相以NaHC03(1 M) 溶液洗涤并继而以MgS04干燥。蒸发后，糊状残余物以1:4 AcOEt:环己烷 作为洗脱剂经快速色谱法纯化。将含有3的部分蒸发成糊状油，后者又进 一步以冷戊烷洗涤以除去快速移动的杂质并继而在真空下抽吸以提供9.97 g (76%)呈油状的3: TLC (AcOEt/环己垸1 :4): Rf = 0.28. -IR (KRS-5): 2937， 1604， 1471, 1320, 1151， 1101, 838， 777, 657， 578 cm隱1. -'H画R (300 MHz， CDC13): S = -0.01 (s， 12 H)， 0.85 (s, 18 H), 1.20-1.45 (m， 12 H)， 1.62 (m, 4 H), 2.28 (s， 6 H), 2.29 (s， 6 H), 2.53 (s, 12 H)， 2.54 (s， 12 H)， 2.90-3.10 (m, 16 H)， 3.42 (t， >/= 6.1 Hz， 4 H)， 6.91 (s， 4 H), 6.92 (s， 4 H). -l3C NMR (75 MHz， CDC13): S = 4.7， 18.9， 21,6, 23.4, 23.5, 24.1 ， 24.9, 25.7， 26.6, 30.4, 43.5， 43.6， 45.6， 45.7， 62.9, 132.59， 132.64， 133.8, 140.7， 143.0， 143.1 -MS-ESI (MeOH): w/z =1325.85 [M + Na]+， 1303.83 [M + H]+. -C66H110N4O10S4Si2 (Mw =1304.03) 计算值.C 60.79, H 8.50， N 4.30， S 9.84;测量值C 60.74， H 8.55， N 4.21, S 9.63.
< iV"-双(4-羟丁基)精胺四氢溴化物(4):将溴化氢的醋酸溶液(33%重 量的溶液，80 mL, 1.4 mol)滴加到3(9.87 g， 7.57 mmol)和苯酚(29.0 g, 0.31 mo1,40当量)的CH2Cl2(80mL)溶液。该反应混合物于室温下搅拌过夜。冰 浴冷却后，搅拌下加入冷水(100 mL)。分离出有机层，并以水(20mL)对有 机层萃取3次。合并后的水层以CH2C12 (30 mL)洗涤5次，然后蒸发干燥。 形成的湿固体残余物以乙醚悬浮，并以刮铲(spatula)研磨，弃去乙醚上清层。 重复这些操作(5次)，直至得到固相悬浮液。真空蒸发和干燥后，得到固态 的化合物4(5.32 g)。该粗物质使用时无需进一步纯化NMR (300 MHz, D20): S = 1.75-2.10 (m, 12 H), 2.27 (m, 4 H)， 3.15-3.35 (m， 16 H)， 3.76 (t, / = 12.2 Hz, 4 H). -13C NMR (75固z, D20): S =22.9, 23.2， 23.4， 29.0， 45.0, 45.2, 47.7, 48.3， 61.5. -MS-ESI (MeOH): w/z = 347.39 [M + H]+.
A^-双[4-(三氟乙酰氧基)丁基)-V, V，《iV、四(三氟乙酰基)-精胺 (5)(来自4，使用TFA20/NEt3): —次往4 (5.3 g， 7.6 mmol)的CH2C12 (50 mL)
悬浮液中加入三乙胺(11.5g， 114mmol, 15当量)。冰浴冷却该混合物，继而 滴加三氟乙酸酐(19.1g，90.9mmo1, 12当量)，同时在N2下搅拌。该混合物 于室温搅拌3.5h。冰浴冷却后，形成的溶液以冷水(20 mL)洗涤3次，以 MgS04进行干燥，然后蒸发生成油状残余物(11.7g)，该残余物含有此反应 的次要产物(TFA)2C-CH-NEt2(参看Schreber, S. L., Tetrahedron Lett 1980, 21， 1027)。通过两次连续快速色谱法(洗脱剂1 :1-60:40 AcOEt:环己烷，之后为 5-10% Et20/CH2Cl2)去除该次要产物以获得油状的5(5.59 g， 81%): TLC (AcOEt/环己烷1 :1): Rf = 0.25. -IR(KRS-5): 2955, 1789, 1690, 1467， 1352， 1 197， 1147， 759， 731， 692 cm: -'HNMR(300 MHz, CDC13): 5 = 1.52- 2.06 (m， 16 H)， 3.33-3.49 (m, 16 H)， 3.38 (m, 4 H). -13C NMR (75 MHz, CDC13):四个 胺基的旋转异构使得该谱更加复杂。仅高强度共振信号按照如下进行描述-S = 23.3， 23.9， 24.1, 24.8, 25.3, 25.6, 26.0, 26.55, 26.61， 44.4, 44.8, 45.7， 46.1, 46.4， 47.3, 48.0, 56.6, 67.3， 67.5, 116.6 (q， </= 288 Hz), 156.9， 157.4， 157.8, 158.6.
< A^-双(4-羟丁基)-A^， < A^-四(三氟乙酰基)精胺(6):向5(5.39 g， 5.84 mmol)的MeOH (50 mL)溶液中一次加入NaHCO3(0.1 g,固体)，形成的 悬浮液在室温下搅拌2h。蒸发后，将油状残余物溶解在CH2Cl2(提供有些纤 维状NaHC03悬浮液)中，并以5-10。/。MeOH/CH2Cl2进行洗脱经快速色谱法 进行纯化，以提供油状的3.61g (85。/。)的6:TLC (MeOH 5%/CH2Cl2): Rf =0.14. (MeOH 10%/CH2C12): Rf = 0.45.」H NMR (300 MHz， CDC13): S =1.51-2.02 (m: 18 H), 3.33-3.51 (m， 16 H)， 3.68 (m, 4 H). - MS-ESI(MeOH): m/z= 753.33 [M + Na]+. - C26H3SF12N406.H20 (Mw = 748.60)计算值.C 41.72, H 5.39， N 7.48, S 30.45;测量值C 41.97, H 5.26, N 7.37 , S 30.14。
从4(先使用TFA20/吡啶，然后使用NaHC03)制备6:往4 (15.3 g， 22.8 mmol)的CH2C12 (100 ml)和吡啶(44 ml， 0.54 mol)悬浮液滴加三氟乙酸酐(46 mL，0.33mo1)，冰浴冷却，在N2下进行搅拌。该混合物在室温下搅拌3h。 加入冷水(100mL)分解过量的三氟乙酸酐，冰浴冷却，然后以CH2Cl2(4次， 100 mL+50 mL+25 mLx2)萃取形成的溶液。合并后的萃取液以冷水(50 mL x 3)洗涤，以MgS04干燥，并蒸发生成油状的粗5(19.4 g， 92 %)。将该油溶解 于MeOH(100mL)中。加入NaHC03 (固体，0.1 g)，悬浮液过夜搅拌。蒸发
溶剂后，使用5-7MMeOH:CH2Cl2作为洗脱剂经快速色谱法对残余物进行纯 化以生成油状的10.1 g(61 %)的6。
V-[4-(二甲氧三苯甲氧基)丁蜀-A^-(4-羟丁基)-A^， < ;v9, V-:四(三氟-乙酰基)-精胺(7):往6(1.46 g, 2.00 mmol)的吡啶(3mL)溶液加入DMTC1 (757 mg，2.23mmol)，使用lmL吡啶漂洗。该混合物于室温N2下搅拌4h，然后 采用甲苯经反复共蒸发除去吡啶。残余物经两次连续的快速色谱法(洗脱剂 2-5%MeOH/CH2Cl2，后为10-15%丙酮/012(:12)纯化以生成泡沫状的7 (879 mg, 43。/。)和双-DMT衍生物8 (648 mg， 24%)。另外还回收起始的二醇6 (350 mg, 24%)。 7的数据TLC (丙酮/CH2Cb 1:9): Rf =0.20. -'H NMR (300 MHz, CDC13): 5 =1.51- 2.03 (m, 17 H)， 3.11 (m， 2 H), 3.32-3.51 (m, 16 H)， 3.71 (m, 2 H)， 3.81 (s， 6H), 6.84 (m， 4 H), 7.19-7.46 (m， 9 H).國MS-ESI(MeOH):附/z =1055.52[M +Na]+. -C47H56F12N408 (Mw=1032.95)计算值.C 54.65, H 5.46， N 5.42， F 22,07;测量值C 54.46, H 5.58, N 5.37 ， F 21.63.
来自二醇(6)和双-DMT衍生物(8)的化合物(7):往6(1.4g， 1.9mmol)和8 (2.5 g， 1.9 mmol)的012<:12溶液加入三氟乙酸(50 0.6 mmol)，室温下搅拌 30min。该溶液以1M的Na2C03溶液洗涤3次，再以MgS04干燥，并蒸发。 使用连续的5。/。AcOEt/CH2Cl2 (750mL)、 33% AcOEt/CH2Cl2 (500 mL)、 7% MeOH/CH2Cl2 (500 mL)和10% MeOH/CH2Cl2 (500 mL)经快速色谱法分离残 余物(柱直径50mm,SiO2高度15 cm)，以生成8 (1.1 g), 7 (1.2 g)和6 (1.3 g)。
连接精胺的亚磷酰胺(l):往7 (844 mg， 817 pmol)和三乙胺(230 pl， 1.65 mmol, 2当量)的CH2C12 (4 mL)溶液加入2-氰乙基-(iV，7V-二异丙氨基)氯亚磷 酸(205 pL， 0.92 mmol， U当量)，该混合物在室温N2下搅拌40 min。该混 合物流经以NEt3 (1% NEt3的CH2Cl2:环己垸1 :2溶液；400 mL)饱和(先后使 用125 mL的1% NEt3的CH2Cl2:环己烷1 :2溶液和100 mL的1% NEt3 CH2Cl2:环己烷1 :1溶液)的Si02柱(直径:20 mm，高度:15 cm)以生成油状的 1(735 mg， 73%):HNMR(200 MHz,CDCl3): S = 1.13-1.35 (m, 12 H)， 1.51-2.06 (m， 16 H)， 2.66 (t， /= 6.4 Hz, 2 H), 3.11 (m, 2 H), 3.32-3.98 (m， 20 H), 3.81 (s， 6H), 6.84 (m， 4 H), 7.15-7.51 (m, 9 H). - 31P NMR (81 MHz, CDC13): 148.06, 148.13， 148.19， 148.3 (因胺基旋转异构而拆分)。
实施例2:具有下列结构式的十聚体寡核苷酸的合成、纯化和鉴定
<formula>formula see original document page 14</formula>
所述寡核苷酸此后称为N,。S。(N^ -寡核苷酸部分；S =精胺残基，n =1-6) 自动化合成根据下列路线图，在Expedite DNA合成仪上使用标准固
相氰乙基亚磷酰胺化学合成一系列具有相同序列N1G=3CACCGTAGCG5>n
数目不断增加的精胺残基S的十聚体寡核苷酸
H
精胺
分步合成
精胺合成子l
在线合成
<formula>formula see original document page 14</formula>
根据经典的寡核苷酸合成，最后的N部分为核苷。
用于自动化DNA合成的试剂购自Glen Research (Eurogentec)。
自动化合成时，除精胺亚磷酰胺l的偶联是通过延长偶联时间(15min)
和使用浓度稍高的亚磷酰胺溶液(l mL亚磷酰胺(amidite) (90 mg)乙腈溶液)
以外，使用标准的lumol偶联循环。
收集三苯甲基组分，进行稀释，并以分光光度计进行分析以测定分步 偶联的产率。
四种天然核苷酸的偶联产率超过97%，而精胺亚磷酰胺的偶联产率在 上述偶联条件下为90-96%。
出于纯化-鉴定目的，在所有情况下均使用DMT-ON (ON-寡核苷酸)模 式，同时保持寡聚体上的5'-端DMT基团不被切割。
合成后处理自动化合成后，使用标准条件(浓氨水室温下处理90min 进行切割，然后55°C下过夜进行脱保护)将寡聚体从固相载体上切割下来 并进行完全脱保护。
纯化最初两个阴离子寡核苷酸N,。S,和N^S2在DMT-on状态下在反 相nudeosil C-18柱(Macherey-Nagel 10x250 mm)上通过乙腈(5-35%， 20 min) 醋酸铵溶液(pH 7， 20 mM)的线性梯度洗脱以标准HPLC方法进行纯化。然 后纯化寡核苷酸以AcOH/H20 = 4/l (500 ml)在室温下处理20 min，脱去三 苯甲基。用水(5mL)稀释后，经乙醚萃取(3x2ml)去除DMT-OH，并浓縮水 相以生成寡聚体。
图1给出了寡核苷酸N,。S,和N1()S2的HPLC分析，使用反相nudeosil C-18柱(Macherey-Nage4.6x250画)以乙腈(5-35%， 20 min)醋酸铵溶液(pH 7，20mM)进行线性梯度洗脱a)Nu)Sb粗的，DMT-ON; b) N,。S,，纯化的c) N10S2，粗提液，DMT-ON; d)N1()S2,纯化的。*苯甲酰胺；**截短序列。
除了最后的寡核苷酸洗脱是通过乙腈/浓氨水/水(20:4:80)进行以外，按 照制造商说明使用Poly-Pak IP"m (Glen Research/Eurogentec)柱纯化中性寡聚 体N1()S3和阳离子寡聚体N1()S4、 N1()S5和N,oS6(携带或不携带DMT基团)。 使用TLC板可以显示含有寡核苷酸的部分。收集各部分后，冻干除去溶剂。 以此方法收集的寡聚体一般含有苯甲酰胺污染。寡聚体溶解到稀释氨水溶 液(50 mM)后，经乙醚(3次)萃取除去苯甲酰胺。将纯化的寡核苷酸溶解在 稀释的氨水溶液(50 mM)，使用下列消光系数(260 nm， morMm、m—')测定其
浓度 、
e =(15.4 NA + 11.5NG + 7.4 Nc + 8.7NT) x 0.9xl03. 图2给出了纯化寡核苷酸的HPLC分析在阴离子交换柱(Dionex PA-100 9x250 mm)上使用NaCl(100-350 mM， 10 min期间)/NaOH 25mM (pH
12.4)进行线性梯度洗脱:a) Nk)S,, b) N10S2, c) N10S3， d) N10S4, e)N10S5, f) N10S6。
由于使用了结合化学，每个多胺都带有一个磷酸基，因此导致额外的 净正电荷。7个寡核苷酸(N,oS^"n-0...6，在完全电离时分别携带-9， -6,-3，0, +3，+6，+9的总电荷，因此可获得80到250纳摩尔的量。
电泳迁移率.-
采用聚丙烯酰胺凝胶电泳研究它们在pH7时电场的迁移，并以银镜染 色显示其迁移。将含有化合物(0.5 nmol)的1(^1上样缓冲液(IO mM HEPES pH7.4， 150mMNaCl，甘油)上样到非变性聚丙烯酰胺凝胶上(15%， TAEpH 7)。在5V/cm和4。C下电泳17h。根据Rabilloud等人，Electrophoresis， 1987,9， 288-291进行银染。图3给出了结果。没有精胺的寡核苷酸Nu)(泳道l)向阳 极移动的速度最快，并在显示含多胺寡核苷酸的条件下仅显示出微弱的银 染。
Nu)与NHrC,。的自发交换
往荧光Nn)C双链体溶液(50pmol，HEPES 1 OmM pH7.4， NaCl 150mM) 加入寡核苷酸C化(其中C是与N互补的核苷酸)(50pmo1或500pmo1)。该混 合物于37°C、 20°C或10°C温育4 h，然后上样到非变性聚丙烯酰胺凝胶 (15%,TAE pH 7)。在5 V/cm和4。C电泳17 h。使用Typhoon 8600 Imager 扫描凝胶对C,。'进行检测。如图4给出结果所示，10。C时，Nh)与NhtC,o 之间的自发交换不明显。
Nu)和Nu)Sn之间的链交换
在生理盐条件下检测N1QSn对天然双链体N1G，C1()的链置换能力。 将精胺缀合物N1QSn (50或500 pmol)加入到荧光Nwd,双链体溶液 (50pmol， 10 mM HEPES pH7.4， 150 mM NaCl)。该混合物于10°C下温育4 h， 然后上样到非变性聚丙烯酰胺凝胶(15Q/。，TAE pH 7)。在5 V/cm和4°C下电 泳17 h。使用Typhoon 8600Imager经凝胶扫描检测荧光。
精胺缀合对如图5所示的链交换反应有显著影响。随着竞争性Nl0Sn 的精胺残基数目增多，对应于N^Cu;的条带也变得更微弱，从而促进移动 更慢、负电荷更少的NH)Sn《u;复合物的形成。这一效应对于N1()S3即对于 不再携带形式上的负电荷的缀合物尤为显著。确实，精胺通过在小沟形成NH2+二齿氢键的链间网络切断双链体DNA结构，因此精胺更易与N,。Sn而 非N10结合。但是当链交换发生在预先形成的(N,oSn)M/(N,o.C,。，静电复合 物时另外一个有利动力学因素也可发挥作用，n>3时即会如此。
N，oSn《K)双链体的熔解温度
通过测量其熔解温度即互补链相互分开时的温度，比较双链核酸的稳 定性。记录N,。Sn，do溶液在260nm处相对于温度T时的光密度(O.D.)。
在HEPES 10 mM pH 7.4 (黑线，菱形)和HEPES 10 mM pH 7.4 + 150 mM NaCl (灰线，圆圈)中测量熔解温度Tm。使用配有温度控制单元的CARY 4000分光光度计，逐渐加热样品(l。C/min)，同时记录260nm处的吸光度， 从而获得所有双链体(3.75nmo1， 1 ml缓冲液)的熔解曲线。双链体的熔解导 致增色迁移(hyperchromic shift), Tm则是第一个衍生物曲线dO.D./dT- f(T) 达到最大值时的温度。图5给出了该结果。
HEPES溶液(IO mM, pH 7.4 )中的天然双链体在Tm= 30°C时熔解(图5)。 精胺结合数目的增多导致Tm显著升高。Nn^Cu)在Tn^75.2。C时熔解，比 天然双链体约高45。C。 Tm-f(n)曲线呈S形，其拐点对应于中性N,oS3寡核 苷酸。
同时还记录了生理盐条件下的熔解温度。Tm -f(n)曲线看起来减弱 (damped)很多，值得注意的是它与对应于N,()S3之前的曲线相交。因此，n<3 时，N，oSn和C,。寡核苷酸均为阴离子，在双链体中相互排斥；盐^^度升高
屏蔽了排斥力，从而增加了Tm。当!1>3时，Nu)Sn成为阳离子并吸引Cu)，
此时盐诱导的静电屏蔽降低了稳定性。
对于中性Nu)S3，双链体的稳定性不依赖于盐浓度。
N10Sn (n-0-6)与5'GTGGCATCGC3'和与5'GTGGCQTCGC3'之间形成双 链体熔解温度的比较结果
检测寡核苷酸-精胺缀合物的单碱基错配辨别。在C1() ^'GTGGC^TCG(5的序列背景内，文献资料推荐位于中央的A到G转化作 为最为严格的测试。
在HEPES 10 mM pH 7.4 + NaCl 150 mM中测量熔解温度Tm。使用配 有温度控制单元的CARY 4000分光光度计，逐渐加热样品(l。C/min)，同时 记录260nm处的吸光度，从而获得所有双链体(3.75 nmol， 1 ml缓冲液)的熔解曲线。L是第一个衍生物曲线(101)./訂=盯)达到最大值时的温度。图
7给出了这些结果(菱形对应于5'GTGGCATCGC3'，三角形对应于 5'GTGGQQTCGC3)。
150 mM NaCl中的天然N1()，C1()双链体的转变温度从50.6。C降低到 42.9°C，即出现错配时DTm = 7.7°C。原则上，因非特异性末端结合的静电 力而引起的稳定性升高不应损害表示为AAG的碱基对特异性。观察结果确 实如此，因为互补和错配耙寡核苷酸表示出具有平均ATm-7.9。C的拟平行 (quasi-parallel) Tm = f(n)曲线。
纯化N1()Sn寡核苷酸的ES-MS分析
寡核苷酸溶解在含有终浓度为5xl0—5 M的1%三乙胺的50%乙腈水溶 液(v/v)。将lOOmL等分试样以5 mL/min的流速加入到Applied Biosystems Mariner 5155质谱仪的离子源内。图8给出了结果(嵌图去巻积谱 (deconvoluted spectra)): a) Ni。S,， b) N10S2, c) N10S3, d) N10S4, e) N10S5, f) N1()S6。中性和阳离子寡聚体Nu)S3.6的电离变得更加困难，因此有必要积累 数个谱来获得可接受的信噪比。
实施例3:具有下列结构式的12聚体硫代磷酸寡核苷酸的合成、纯化和鉴 定
s'GCG ACTCATGAA 硫代磷酸寡核苷酸
N12SnF
所述寡核苷酸此后称为Nl2SnF(N=12聚体硫代磷酸寡核苷酸部分；S= 精胺残基，11=2或11; F-结合到胸腺嘧啶上的荧光素)。
自动化合成..使用固相氰乙基亚磷酰胺化学在ExpediteDNA合成仪上 合成接有2个或11个精胺残基S的12聚体硫代磷酸寡核苷酸序列N12= 3'GCGACTCATGAA5'。使用超级温和的CE亚磷酰胺和超级温和的载体 (Glen Research / Eurogentec)以避免检查过程中的寡聚体切割。使用标准的硫 化试剂(Glen Research/Eurogentec)生成12聚体寡核苷酸部分内的硫代磷酸
酯键。使用荧光素-dT亚磷酰胺(Glen Research/Eurogentec)用于5，-末端标记。 使用实施例2所述的偶联方案进行精胺亚磷酰胺偶联。
收集三苯甲基组分，对其进行稀释，并在分光光度计上分析以测定分 步偶联的产率。
出于纯化-鉴定目的，在所有情况下均使用DMT-ON模式，同时保持寡 聚体上的5'-端DMT基团不被切割。
合成后处理，自动化合成后，使用浓氨水室温过夜处理，将寡聚体从 固相载体上切割下来并进行完全脱保护。
纯化.'按照制造商说明，使用Poly-Pak IFM柱(Glen Research/Eurogentec) 纯化DMT-ON化合物N12S2F和N12SHF。
在阴离子交换层析柱(SAX1000-8)上使用水相碱性条件(100 mM氨7K, pH ll)利用NaCl梯度(0.75-2.5 M，20 min)分析纯化的寡核苷酸NnSJF (n = 2: 11)。图9显示了 HPLC谱图(A:N,2S"F，B: N12S2F)。
舰絲微鼓^"/-膨MS1分桥
将寡核苷酸溶解在500&的去离子水。在板上混合样品和HPA基质。 一旦结晶，便使用BRUKERUltraflexMS设备分析该样品。图10A: N12S2F 计算值5460，测量值5459(上)和图10B : N12SnF计算值9135测量值: 9125 (下)显示了该结果。
实施例4: 14聚体和20聚体荧光寡核苷酸对质粒DNA的链侵入
<formula>formula see original document page 19</formula>
如上所示的化合物此后称为N14SnF (N-寡核苷酸部分；S =具有n = 2-4 的精胺残基;F =荧光素残基)和N2QSnF( N =寡核苷酸部分；S =具有n = 3-5的 精胺残基;F-荧光素残基)。
按照实施例2所述的步骤合成这些荧光寡核苷酸。5'-荧光素亚il酰胺 (GlenResearch/Eurogentec)用于5'-末端标记。图11和12分别示出了取代最 多的N14S4F和N2QS5F化合物的分析级HPLC谱图和MALDI-TOF质谱图， 以作为纯度和结构(N,4S4F计算值6470,测量值6478; N20S5F计算值8813， 测量值8815)的证据。
选择位于pGL3对照质粒(Promega)的荧光素酶基因序列内的寡核苷酸 序列N14SnF和N2()SnF。为了评估链侵入的序列特异性，使用pGL2对照质 粒(Promega)。 GL2荧光素酶序列与GL3有95%相同，N14SnF和N20SnF所 靶向的序列分别含有一个和两个错配。
在生理盐和温度条件下检测N14SnF和N2。SnF链侵入pGL3而非pGL2 质粒的能力。
往质粒溶液(l .5吗，0.43 pmol ， 10 mM HEPES pH 7.4， 150 mM NaCl)加 入荧光缀合物N14SnF和N2。SnF(8.65 pmol)。该混合物于37°C下温育24 h， 然后上样到琼脂糖凝胶(1，/。,TAE pH 7.4)。室温下电泳45min，之后使用 Typhoon 8600Imager经凝胶扫描检测发射出的绿色荧光。凝胶在溴化乙锭 溶液中温育15 min后，使用UV透照灯拍摄凝胶的红色荧光照片。图13给 出了这些结果。
红色荧光和绿色荧光分别是双链质粒DNA和荧光寡核苷酸的证据。因 此它们与pGL3而非pGL2共定位证实了链侵入。化合物N14S3F和N2()SnF 与pGL3而非pGL2温育时，表现出与质粒相关的微弱绿色荧光条带。
实施例5:阳离子寡核苷酸穿透细胞
实验前一天，将在含10% (v/v)胎牛血清的MEM培养基中培养的Hela 细胞以50-6(^103细胞/孔接种到4孔室硼硅酸酯Lab-Tek培养皿。完全培 养基更换为0.5ml不含血清的MEM培养基。以无菌PBS制备5'-端结合阳 离子荧光素的寡核苷酸F-S18N19制剂(其中 N19为 TCGAAGTACTCAGCGTAAG)。将其加入到细胞，终浓度为2pM。 4小时
后，培养基更换为1 ml新鲜含血清培养基。使用配有FITC滤镜的Zeiss axkwert25荧光显微镜拍摄第一张照片(图14A，左)。所有细胞均带有荧光， 其中有些荧光位于细胞内的泡中，最重要的是，荧光还分散于整个细胞质 和细胞核。24 h后，培养基更换为l ml不含苯酚红的MEM培养基。加入 碘化丙啶(lmM,水)，使其终浓度为10nM。 IO分钟后，拍下第二张照片， 显示多数不含丙啶(propidiumless)的健康细胞仍具有荧光(图14B，右)。使 用F-N19寡核苷酸在类似条件下温育的对照细胞未表现出荧光。
因此本发明提供了甚至可在链侵入背景下与其互补序列形成快速稳定 复合物的阳离子寡核苷酸的灵活自动化合成。由于末端缀合，对天然寡核 苷酸的序列选择性仍一样高。而且，由于其阳离子性质，细胞内输送不需 要与阳离子载体分子形成的复合物。总之，这些性质使得寡核苷酸-寡阳离 子缀合物成为替代用于分子生物学、诊断学以及治疗用途的寡核苷酸的有 吸引力的选择。
权利要求
1.寡核苷酸-寡阳离子分子AiBjH，其可以通过自动化亚磷酰胺化学合成，所述分子具有寡核苷酸部分Ai和寡阳离子部分Bj，其中. Ai是i-聚体寡核苷酸残基，i＝5-50，其中核苷酸A是具有天然或非天然核碱基和/或戊呋喃糖基和/或天然磷酸二酯键的寡聚体，例如选自包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、锁定(LNA)核苷酸以及其化学修饰或取代如硫代磷酸酯、2′-氟基、2′-O-烷基或标记基团如荧光剂的组，Bj是j-聚体的有机寡阳离子部分，j＝1-50，其中B选自包括以下基团的组-HPO3-R1-(X-R2n)n1-X-R3-O-，其中R1、R2n和R3是相同或不同的低级亚烷基，X是NH或NC(NH2)2，n为1-5，n1＝2-20，-HPO3-R4-CH(R5X1)-R6-O-，其中R4是低级亚烷基，R5和R6是相同或不同的低级亚烷基，X1为腐胺、亚精胺或精胺残基，-HPO3-R7-(aa)n2-R8-O-，其中R7是低级亚烷基，R8是低级亚烷基、丝氨酸、天然氨基醇，(aa)n2是含有具有阳离子侧链的天然氨基酸如精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、组氨酸、二氨基丙酸的肽，n2＝2-20。
2、 如权利要求l所述的分子，其具有s'AS'-B序列。
3、 如权利要求l所述的分子，其具有B」'aS'序列。
4、 如权利要求l所述的分子，其具有bJ'AS'-B或s'aS'-BJ'AS'序列以及 它们的组合。
5、 一种获得如权利要求1至4任一项所述的寡核苷酸-寡阳离子分子的 方法，通过在寡核苷酸合成仪上使用分步合成经亚磷酰胺路径进行，所述 方法包括-将含有被活化和保护的寡阳离子B的小瓶插入加有寡核苷酸A的小瓶 的寡核苷酸合成仪，或颠倒顺序， -获得所需长度时停止合成， -将寡聚体从固相载体上切割下来，以及 -除去保护基团。
6、 如权利要求5所述的方法，其中所述亚磷酰胺试剂选自包括以下试剂的组P(OR9)(N(R'0)2)扁O-R'-(X-R2n)n广X-R3-O-Prot，其中R1、 R2、 R3、 n禾flnl 的定义同上，X是适宜地被保护的NH或NC(NH^， R9是-CH2CH2CN或低 级烷基，R1Q是低级垸基，或-N(R1 是吡咯烷基、哌啶基或吗啉基，Prct 是用于寡核苷酸合成的保护基，例如DMT、 MMT;P(OR9)(N(R10)2)-O-R4-CH(R5Xl)-R6-O-Prot，其中R4、 R5、 116是低级亚 烷基，X"是适宜地被保护的腐胺、亚精胺或精胺，R^和R"的定义同十.；P(OR9)(N(R'。)2)-0-R7画(aa)n2-R8-0-Prot，其中R7、 R8、 R9、 R10、 n2、 (aa)n2 和Prot的定义同上。
7、 如权利要求5或6所述的方法，其中所述寡核苷酸序列的分步合成 后接着进行寡阳离子部分的分步合成，以获得具有序列C'A、B)的化合物。
8、 如权利要求5或6所述的方法，其中所述寡阳离子部分的分步合成 后接着进行寡核苷酸序列的分步合成，以获得(BJ'AS')序列的化合物。
9、 如权利要求5或6所述的方法，其包括混合序列的合成。
10、 如权利要求9所述的方法，其包括两端加帽的寡核苷酸序列 (BJ'AS'-B)或寡核苷酸序列被阳离子打断的序列fAS'-BJAS')的合成。
11、 如权利要求5至10任一项所述的方法，其中通过保护多胺的氨基 和随后进行a， o)-双羟烷基化以形成适合寡核苷酸合成的二醇来获得所述被 活化和保护的寡阳离子B。
12、 作为中间体化合物的结构式如下的亚磷酰胺试剂 P(OR9)(N(R'0)2)-O-R'-(X-R2丄广X-R3画O-Prot，其中R1、 R2、 R3、 n禾口nl的定义同上，X是被适宜保护的NH或NC(NH2)2， R9是-CH2CH2CN或低级 烷基，R^是低级烷基，或-N(R^2是吡咯垸基、哌啶基或吗啉基，Prot是 用于寡核苷酸合成的保护基，例如DMT、 MMT;P(OR9)(N(R1())2)-0-R4-CH(R5Xl)-R6-0-Prot，其中R4、 R5、 R6是低级亚 垸基，X"是适宜地被保护的腐胺、亚精胺或精胺，W和R^的定义同上；P(OR9)(N(R。)2)-0-R7-(aa)n2-R8-0-Prot，其中R7、 R8、 R9、 R10、 n2和 Prot的定义同上。
13、 分子生物学和诊断学应用，如PCR、实时PCR、基因型分型、原 位杂交和DNA芯片，其包括使用根据权利要求1至4任一项所述的寡核苷酸-寡阳离子分子。
14、 含有有效量的如权利要求1至4任一项所述的寡核苷酸-寡阳离子分子以及药用载体的药物组合物。
全文摘要
本发明涉及可以通过自动化亚磷酰胺反应合成的具有寡核苷酸部分A_i和寡阳离子部分B_j的寡核苷酸-寡阳离子分子A_iB_jH，其中A_i是i-聚体寡核苷酸残基，i＝5-50，其中核苷酸A是具有天然或非天然核碱基和/或戊呋喃糖基和/或天然磷酸二酯键的寡聚体，例如选自包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、锁定(LNA)核苷酸以及其化学修饰或取代如硫代磷酸酯、2′-氟基、2′-O-烷基或标记基团如荧光剂的组，Bj是j-聚体的有机寡阳离子部分，j＝1-50，其中B选自包括·-HPO₃-R¹-(X-R²_n)_n1-X-R³-O-，其中R¹、R²_n和R³是相同或不同的低级亚烷基，X是NH或NC(NH₂)₂，n为1-5，n1＝2-20；·-HPO₃-R⁴-CH(R⁵X¹)-R⁶-O-，其中R⁴是低级亚烷基，R⁵和R⁶是相同或不同的低级亚烷基，X¹为腐胺、亚精胺或精胺残基；·-HPO₃-R⁷-(aa)_n2-R⁸-O-，其中R⁷是低级亚烷基，R⁸是低级亚烷基、丝氨酸、天然氨基醇，(aa)_n2是含有具有阳离子侧链的天然氨基酸如精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、组氨酸、二氨基丙酸的肽，n2＝2-20。
文档编号C07H21/00GK101370817SQ200680051086
公开日2009年2月18日 申请日期2006年12月14日 优先权日2005年12月15日
发明者B·庞斯, E·瓦兰, J-P·贝尔, J-S·雷米, 小寺光治 申请人:国立科学研究中心;宝利普拉斯生物转染公司