专利名称：：棘刺锚参抗肿瘤因子、其组合物及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种棘剌锚参抗肿瘤因子、其组合物及制备方法和应用。
背景技术：
：海洋棘剌锚参(protankyrabidentata)为一种海洋棘皮动物；呈细圆筒状，外形象蠕虫，无管足和疣足，触手12个，每个触手上端有两对指状小枝，体壁内的骨片为锚和锚板；生长于海洋潮间带的粗泥沙到水深15米的泥底，体呈肉红色。棘剌锚参在我国沿海均有生长，蕴藏量极大。它性咸寒，含丰富的蛋白质，味极鲜美，有滋阴降火、补虚清肺、降血压、消肿止痛、防癌等功效，有较高药用和食疗价值。我国多种本草记载海洋棘刺锚参可用于痈疮毒肿，具有消肿止痛、敛疮生肌等功效。现代医学研究表明海洋棘剌锚参中含有丰富的多种蛋白水解酶，此外未见有其它研究报道。
发明内容本发明所要解决的技术问题是公开一种具有抗肿瘤活性的棘刺错参抗月中瘤活性因子(protankyrabidentataanti—tumorfactor,简称PBATF)、其组合物及其制备方法和应用。本发明公开的PBATF是以棘刺锚参为原料，采用抽提、盐析、离子交换层析、分子筛层析、HPLC步骤分离纯化得到的具有抗肿瘤活性的蛋白质，其分子量为38000道尔顿。本发明还包括药物组合物，其含有本发明所述的PBATF和药学可接受的载体。另一方面，本发明公开了PBATF制备方法，包括下列步骤a)新鲜海洋棘刺锚参用3~5倍体积的含NaCl、EDTA的磷酸缓冲溶液匀浆抽提；b)抽提液高速离心后，上清液用硫酸铵分级沉淀，得到硫酸铵饱和浓度介于40%60%之间的组分；c)离子交换层析，用含0lmol/LNaCI的10mmol/L的PB缓冲液进行线性梯度洗脱，收集0.45mol/L0.65mol/LNaCl梯度活性组分；d)浓縮后进行分子筛层析，得到三个洗脱峰，收集活性峰；e)进行HPLC层析，收集活性峰，浓縮冻干后即得。本发明所述的磷酸缓冲液(PB)可选用10mmol/LPB或其它浓度的磷酸缓冲液，其中含有l5mmol/L的EDTA，l~2mol/L的NaCl。本发明所述的离子交换层析的介质可选用DEAE-S印haroseCL6B、DEAE-S印hadexA50等阴离子交换剂。本发明所述的分子筛层析介质可选用S印hadexG-75、S印hadexG-IOO、S印hadexG_150、S印hacrylS-300、SephacrylS-200等。本发明所述的活性峰可用参考实施例中细胞生长抑制试验等方法鉴定。在另一方面，本发明还公开了PBATF在制备治疗肿瘤药物中的应用。本发明还包括治疗肿瘤的方法，所述方法包括给需要治疗的哺乳动物施用含有有效量PBATF，以治疗或改善肿瘤疾病。本发明PBATF抗肿瘤效果非常明显，能够非常显著抑制肿瘤细胞的生长和繁殖，非常显著抑制体内肿瘤的生长，且未见明显的毒副作用。棘刺锚参的抗肿瘤活性成分的相关研究，国内外未见报道，其提取得率较高(1%。)，具有极高的开发价值，有望成为新型的、疗效显著的抗肿瘤药物。图1PBATF制备的DEAE-S印haroseCL-6B离子交换层析图谱。图2PBATF制备的S印hacry1-300分子筛层析图谱。图3PBATF的HPLC图谱。图4PBATF的SDS-PAGE图谱。图5PBATF的反相HPLC柱分析。图6PBATF的紫外吸收光谱测定。具体实施例方式下文将进一步详细讨论本发明的多个方面。本文所用术语"药物可接受载体"指的是任何无毒的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、胶囊材料或配制助剂。本文所用术语"非肠道"指的是包括静脉内、肌内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注射和灌注的给药模式。可以方便地以单位剂量形式提供配制剂，可通过药学领域众所周知的任何方法制备所述配制剂。所述方法包括使PBATF与构成一种或多种辅助成分的载体联合的步骤。一般说来，通过使活性成分与液体载体或经细分的固体载体或这两者均匀和密切地混合，然后，必要时使产品成形即可制备出配制剂。可通过任何包括非肠道(如皮下或肌内)注射或静脉内输注的常规方法施用本发明的PBATF或其制剂。治疗由单个剂量或一段时间内的多个剂量组成。尽管本发明的PBATF可以单独施用，但与一种或多种可接受载体一起作为药物制剂的形式被提供也是合乎需要的。在与PBATF相容并且对其受体无害的意义上说，载体必须是"药学可接受的"。一般说来，载体是无菌和无热原质的水或盐水。适用于非肠道给药的配制剂包括含水和不含水的无菌注射溶液，其中可含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使制剂适用于欲治疗受体的溶质；以及含水和不含水的无菌悬浮液，其中包括悬浮剂和增稠剂。可以单位剂量或多剂量容器，例如密封的安培、小管或注射器提供制剂，也可将所述制剂储存于仅需要在使用前添加无菌液体载体。可由无菌粉末制备临时用的注射溶液和悬浮液。适用于本发明的药物组合物包括包含有效量的活性成分以达到其目的的组合物。本发明还提供了治疗和/或改善疾病(例如本文所述的一种或多种疾病)的方法，所述方法为给受试者施用处于有效量的本发明的PBATF。本发明所述肿瘤疾病包括但不限于本文所述和本领域己知的恶性肿瘤、实体肿瘤和癌症(有关所述疾病的评述可参见Fishlnan等，Medicine,2dEd.，J.B.LippincottCo.,Philadelphia(1985))。可用本发明的PBATF治疗的肿瘤包括但不限于实体肿瘤，包括前列腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、喉癌、食管癌、睾丸癌、肝脏癌、腮腺癌、胆道癌、结肠癌、直肠癌、宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、肾脏癌、膀胱癌、甲状腺癌；原发性肿瘤和转移；黑素瘤；胶质母细胞瘤；卡波济氏肉瘤(Kaposi'ssarcoma);平滑肌肉瘤；非-小细胞肺癌；结肠直肠癌；晚期恶性肿瘤；和血液肿瘤，如白血病。例如，可以局部传递本发明的融合蛋白和/或编码本发明的PBATF的多核苷酸，以治疗诸如皮肤癌、头颈肿瘤、乳腺癌和卡波济氏肉瘤的癌症。本发明提供了治疗肿瘤疾病的方法，所述方法包括给需要治疗的个体施用治疗有效量的本发明的PBATF。本文中"有效量"。例如，决定欲传递之物质的有效量取决于多个因素，包括例如物质的化学结构和生物活性，患者的年龄和体重，需要治疗的准确病情及其严重程度和给药的途径。治疗的频率取决于多个因素，如每个剂量施用的PBATF的量，以及受试者的健康状况和病史。医生或兽医可决定精确的量、剂量数目和剂量的时间安排。本发明的PBATF可施用给任何动物，优选施用给哺乳动物和鸟类。优选的哺乳动物包括人、狗、猫、小鼠、大鼠、兔、绵羊、牛、马和猪，特别优选施用于人。作为一般性的建议，本发明的PBATF的治疗有效剂量指的是足以导致症状改善或疾病稳定化或患者存活期延长或生命质量改善的化合物的量。可通过口服、直肠、非肠道、淋巴间隙内、阴道内、腹膜内、局部(通过粉末、软膏、凝胶、滴剂或经皮膏药)、口腔、或作为口或鼻喷雾剂施用PBATF和/或多核苷酸。本发明的PBATF可以单独施用或与其它治疗剂联合施用。可与本发明的PBATF联合施用的药剂包括但不限于化学治疗剂、抗生素、类固醇和非类固醇抗炎症剂、常规的免疫治疗剂和/或如美国临时申请流水号60/355，547和W001/79480(列入本文作为参考)中所述的治疗。组合物可相伴使用，例如作为混合物，分开但同时施用；或依次施用。它包括作为治疗混合物同时施用组合药剂，以及分开但同时(例如通过分开的静脉内线进入相同的个体)施用组合药剂。"联合"给药还包括分开施用首先使用的一种化合物或药剂，接着施用第二种。发明说明鉴于上文对本发明的一般性描述，参考下文的实施例将更容易理解本，提供下述实施例只是为了阐明而不是限制本发明。无需进一步描述，可以相信本领域技术人员可使用上文的描述和下文性的实施例来制备和利用本发明中检测到的改变并且实践所要求的方法。因此，下述工作实施例具体描述了本发明的某些实施方案，不能将其看成是对其余内容的限制。原料和试剂Tris，SDS，四甲基偶氮唑蓝(MTT)，Sigma公司;胰蛋白酶1:250，Difco进口分装；RPMI-1640培养基，Scientific产品；小牛血清，胎牛血清，上海华美生物工程公司；DEAE-S印haroseCL-6B，S印hacrylS300，Amershampharmaciabi0tech产品5Z0rbaxEclipseXDB-C8、Z0RBAXGF-250HPLC柱，Agilent公司；其余为一般常用试剂。Wistar大鼠由上海中科院实验动物中心提供，合格证号沪动合证字第106号。C57BL/6小鼠由上海医药工业研究院药理室提供，合格证号沪动合证字第107号。小鼠Lewis肺癌、大鼠Walker-256癌肉瘤模型，上海医药工业研究院药理室；Hela细胞，929成纤维细胞，7901细胞，NCI细胞，中科院细胞所细胞库，BaEC细胞，本实验室原代培养。棘刺锚参原料购自浙江温州地区。实施例1.新鲜冷冻的海洋锚参，用含1mol/LNaCl的10mmol/LPB抽提24h，8000rpm高速冷冻离心，上清用(NH4)2504分级沉淀，将饱和度40%60%的沉淀组分进行DEAE-S印haroseCL-6B离子交换层析，用含0lmol/LNaCl的PBS缓冲液进行线性梯度洗脱，流速30ml/h，收集0.45mol/L0.65mol/LNaCl梯度活性组分(第二峰，如图1所示)，进行S印hacryl-300柱(1.6X50cm)，洗脱液10画1/LPB，pH7.2的缓冲液，流速20ml/h，收集活性峰(第一峰，如图2所示)，浓縮后组分进行HPLC柱:ZORBAXGF-250，9.4X250腿,4-Micron,洗脱液10mmol/LPB，流速1ml/min，柱温20°C，收集活性峰(如图3所示)，冻干后得到PBATF。实施例2.新鲜冷冻的海洋锚参，用4倍体积含2mol/LNaCI的15mmol/LPB缓冲溶液抽提24h，10000rpm高速冷冻离心，上清用(NH4)2S04分级沉淀，将饱和度40%60%的沉淀组分进行DEAE-S印hadexA50离子交换层析，用含0~lmol/LNaCI的15mmol/L的PB缓冲液进行线性梯度洗脱，收集0.45mol/L0.65mol/LNaCl梯度活性组分，进行S印hadexG-100分子筛层析，收集活性峰，浓縮后组分进行HPLC层析(Z0RBAXGF-250，9.4X250mm，4-Micron),收集活性峰，冻干后得到PBATF。实施例3.新鲜冷冻的海洋锚参，用3倍体积含1.5mol/LNaCI的20mmol/LPB缓冲溶液抽提24h，10000rpm高速冷冻离心，上清用(NH4)2S04分级沉淀，将饱和度40%60%的沉淀组分进行DEAE-S印hadexA50离子交换层析，用含0~lmol/LNaCI的20腿ol/L的PB缓冲液进行线性梯度洗脱，收集0.45mol/L0.65mol/LNaCl梯度活性组分，进行S印hadexG-150分子筛层析，收集活性峰，浓縮后组分进行HPLC层析(Z0RBAXGF-250，9.4X250咖，4-Micron),收集活性峰，冻干后得到PBATF。实施例4.PBATF的SDS-PAGE分析采用垂直平板电泳。上样缓冲液为1XSDS凝胶加样缓冲液50mmol/LTris.Cl(pH6.8)，100咖ol/LDTT，2%SDS，0.1%溴酚蓝，10%甘油。采用5%的浓縮胶以及12%的分离胶，0.8mm胶厚的SDS-PAGE电泳。lmgPBATF溶解于1ml的H20中，离心取上清100力QlOOul2X上样缓冲液，水浴煮沸3min，冰浴后离心，取上清100nl上样。100V电泳lh后，样品进入分离胶，增加电压至200V，电泳4h。考马斯亮蓝染液染色过夜，10%的冰醋酸10%甲醇溶液脱色4h，扫描记录结果。结果如图4所示，1为PBATF制备经过DEAE-S印haroseCL-6B离子交换层析获得的活性组分，2为经过S印hacrylS-300分子筛柱层析获得的活性组分，3为经过HPLCZORBAXGF-250柱层析获得的活性组分。HPLC层析后得到PBATF染色显示一条带，说明达到电泳纯。实施例5.PBATF的HPLC分析PBATF用水溶解200ug/ml，用反相HPLC鉴定其纯度。Z0RBAXEclipseCDB-C8柱，4.6X150mm5-Micron。洗脱液H20含0.02%线3,1/LEDTA，pH7.2，060%的乙腈梯度，流速lml/min,柱温20。C，检测波长280nm。结果如图5所示，海洋锚参抗肿瘤因子有一明显的吸收峰，说明达到较高纯度。实施例6.PBATF的吸收光谱分析PBATF用H20配置成2.4mg/ml溶液，用紫外可见分光光度计进行全波长扫描。结果如图6所示，在280nm处有最大吸收峰。实施例7.PBATF对肿瘤细胞生长抑制的测定采用MTT测定法。选择人胃癌细胞7901、人子宫颈癌细胞Hela和人非小细胞肺癌细胞NCI为研究对象，小鼠皮肤成纤维细胞929和小牛主动脉血管内皮细胞(BaEC)为对照。所有细胞选择对数生长期细胞，将2X103/200y1细胞加入96孔细胞培养板，在37。C，5%C02条件下培养12h，按终浓度分别为0"g/ml、10ng/ml、20wg/ml、40ug/ml、80ug/ml、160ug/ml、320ixg/ml，加入海洋锚参抗肿瘤因子，在相同条件下继续培养48h，倒去培养板内培养液，每孔加入200u1以RPMI—1640培养基配置的MTT溶液(0.4mg/ml)，继续培养4h，倾去培养液，每孔加入DMSO200ul，室温振荡20min，用酶标仪在波长570nm处测定吸收值。实验重复3次，每次38个平行样品。对结果进行t检验，统计分析各处理组差异。结果选择人胃癌细胞7901、人子宫颈癌细胞Hela和人非小细胞肺癌细胞NCI为研究对象，小鼠皮肤成纤维细胞929和小牛主动脉血管内皮细胞(BaEC)为对照。如表1所示，PBATF对三种肿瘤细胞均具有显著的生长抑制效应，并有明显的剂量依赖关系，而对正常细胞小鼠成纤维细胞和小牛主动脉血管内皮细胞只在高浓度时有抑制作用，在低浓度时无明显影响。表1海洋锚参抗肿瘤因子对肿瘤细胞生长的抑制效应浓度A570證mg/ml7901HelaNCI929BaEC3200.009±0.002**0.008±0.006**0.033±0.001**0.093±0.021**0.283±0.091**1600.041±0.009**0.433±0.031**0.109±0.072**0.409±0.087**0.769±0.084**800.589±0.095**0.561±0.093**0.284±0.073**1.265±0.234*1.295±0.143400.873±0.089**0.989±0.132**0.590±0.041**1.450±0.2111.500±0.111201.098±0.120*1.316±0.089*0.892±0.077**1.609±0.3071.623±0.207101.400±0.2371.334±0.2251.059±0.129*1.859±0.2151.559±0.11501.886±0.1361.675±0.1371.640±0.1281.989±0.2211.231±0.088*与浓度为0的对照组比较P<0.05，**与浓度为0的对照组比较PO.01实施例8.PBATF对荷瘤小鼠肿瘤生长抑制的测定小鼠Lewis肺癌接种C57BL/6种小鼠，大鼠Walker-256癌肉瘤接种Wistar大鼠。C57BL/6种小鼠1820克；Wistar大鼠5060克。试验组及阳性对照组C57BL/6小鼠或Wistar大鼠每组均10只，阴性对照每次各为两组。PBATF对小鼠Lewis肺癌以及对大鼠Walker-256癌肉瘤，高、中及低剂量分别为5mg/kg.d、1mg/kg.d及0.5mg/kg.d。阴性对照给以与试验组高剂量等体积的生理盐水；阳性对照环磷酰胺CTX小鼠为30mg/kg，大鼠为15mg/kg，每天一次，连续7天。腹腔注射给药，每天1次，连续8天。小鼠Lewis肺癌、大鼠Walker-256癌肉瘤模型均采用腋皮下接种肿瘤的方法，三周左右处死各组动物，剖取肿瘤称重，按下列公式计算肿瘤抑制率肿瘤抑制率％=[(对照组平均瘤重一给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重]X蘭o。实验结果表明，PBATF体内对小鼠Lewis肺癌腋皮下接种模型的疗效，高剂量组5mg/kgipX8qd方案具有56.89%，中剂量组1mg/kgipX8qd方案的抑瘤率为52.00%，低剂量组0.5mg/kgipX8qd方案的抑瘤率为32.00%,详细结果见表2。表2PBAIF对小鼠Lewis肺癌疗效试验<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>*与阴性对照组比较P<0.05，**与阴性对照组比较PO.01PBATF对大鼠Walker-癌肉瘤腋皮下接种模型的疗效，高剂量组5mg/kgipX8qd方案具有64.15%的抑瘤率，中剂量组1mg/kgipX8qd方案的抑瘤率为55.82%，低剂量0.5mg/kgipX8qd方案的抑瘤率为44.05%，详细结果见表3。表3PBAIF对W-256癌肉瘤疗效试验样品剂量给药方案动物数动物体重瘤重X土SD(g)抑瘤率mg/kg始/终始/终(g)%PBAIF5ipX8qd10/1053.3/63.5承*2.71±0.9164.15PBAIF1ipX8qd10/1053.5/62.8承*3.34±0.7655.82PBAIF0.5ipX8Qd10/1053.4/63.24.23±0.87*44.05阳性对照CTX15ipX7qd10/1052.9/52.9**0.56±0.2491.80阴性对照生理盐水ipX8qd20/2053.2/67.87.56±0.59*与阴性对照组比较PO.05，**与阴性对照组比较P<0.01本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只欲作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。权利要求1.一种棘刺锚参抗肿瘤因子，其特征在于所述抗肿瘤因子是一种以棘刺锚参为原料，采用抽提、盐析、离子交换层析、分子筛层析和HPLC步骤纯化分离得到的具有抗肿瘤活性的蛋白质，其分子量为38000道尔顿。2.如权利要求1所述的棘刺锚参抗肿瘤因子，其特征在于所述棘刺锚参抗肿瘤因子采用下列步骤制备得到a)新鲜海洋棘刺锚参用35倍体积的含NaCl、EDTA的磷酸缓冲溶液研磨抽提，-b)抽提液高速离心后，上清液用硫酸铵分级沉淀，得到硫酸铵饱和浓度介于40%60%之间的组分；c)离子交换层析，用含0lmol/LNaCl的10mmol/L的磷酸缓冲液进行线性梯度洗脱，收集0.45mol/L0.65mol/LNaCl梯度活性组分；d)浓縮后进行分子筛层析，得到三个洗脱峰，收集活性峰；e)进行HPLC层析，收集活性峰，浓縮冻干后即得；其中，所述磷酸缓冲液可选用1020mmol/L磷酸缓冲液，其中含有15mmol/L的EDTA，12mol/L的NaCl;所述离子交换层析的介质为阴离子交换剂。3.—种药物组合物，其特征在于其含有权利要求1或2所述棘剌锚参抗肿瘤因子和药学可接受的载体。4.如权利要求1棘刺锚参抗肿瘤因子制备方法，包括下列步骤a)新鲜海洋棘剌锚参用3~5倍体积的含NaCl、EDTA的磷酸缓冲溶液研磨抽提；b)抽提液高速离心后，上清液用硫酸铵分级沉淀，得到硫酸铵饱和浓度介于40%60%之间的组分；c)离子交换层析，用含01mol/LNaCI的10mmol/L的磷酸缓冲液进行线性梯度洗脱，收集0.45mol/L0.65mol/LNaCl梯度活性组分；d)浓縮后进行分子筛层析，得到三个洗脱峰，收集活性峰；e)进行HPLC层析，收集活性峰，浓縮冻干后即得；其中，所述磷酸缓冲液可选用1020mmol/L磷酸缓冲液，其中含有15mmol/L的EDTA，12mol/L的NaCl;所述离子交换层析的介质为阴离子交换剂。5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述离子交换层析介质可选用DEAE-S印haroseCL-6B或DEAE-SephadexA-50中之6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述分子筛层析介质可选用SephadexG-75、SephadexG國100、SephadexG-150、SephacrylS-300或SephacrylS-200中之一。7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述离子交换层析介质为DEAE-SepharoseCL-6B，分子筛层析介质可为SephacrylS-300。8.棘刺锚参抗肿瘤因子在制备治疗肿瘤药物中的应用。9.权利要求8所述棘刺锚参抗肿瘤因子的应用，其特征在于所述肿瘤包括实体肿瘤和血液肿瘤。全文摘要本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种棘刺锚参抗肿瘤因子、其组合物及制备方法和应用。本发明公开的棘刺锚参抗肿瘤因子是一种以棘刺锚参为原料，采用抽提、盐析、离子交换层析、分子筛层析和HPLC步骤纯化分离得到的具有抗肿瘤活性的蛋白质，其分子量为38000道尔顿。该抗肿瘤因子能够非常显著抑制肿瘤细胞的生长和繁殖，非常显著抑制体内肿瘤的生长，且未见明显的毒副作用，可作为抗肿瘤药物的活性成分。文档编号C07K4/12GK101165066SQ200710045340公开日2008年4月23日申请日期2007年8月28日优先权日2007年8月28日发明者杰栾,沈先荣,蒋定文,谷爱梅,贾福星,伟陈申请人:中国人民解放军海军医学研究所