专利名称：贝类外套膜胶原蛋白及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物资源与环境技术领域，具体涉及一种贝类外套膜胶原蛋白 产品及其制备方法。
背景技术：
胶原蛋白是动物体尤其是哺乳动物体内含量最多的蛋白质，广泛存在于动物 的皮、骨、软骨、牙齿、肌腱、韧带和血管中，占人体蛋白质总量的30%，是结 缔组织极重要的蛋白结构，起着支撑器官、保护肌体的功能。目前，胶原蛋白己 被广泛应用于美容化妆品、人工皮肤、组织工程等生物医用材料和食品保健等方 面。工业生产中的胶原蛋白主要来源于牛皮、猪皮和骨骼中。由于疯牛病和口蹄 疫等传染病的发生，利用牛皮、猪皮提取胶原蛋白已使人们对牲畜胶原制品安全 性产生疑虑，为了解决这一问题，寻找新的提取胶原蛋白的原料愈来愈迫切。水 产动物废弃物中含有丰富的胶原蛋白，具有很大开发利用潜力。
目前国内对胶原蛋白的研究主要集中在鱼鳞、鱼皮、海蜇、海洋空肠生物等， 己公开的专利主要有"未变性鱼鳞胶原的制备方法"(公开号[CN1948411A])、"从 鱼鳞中提取胶原蛋白的脱脂脱灰工艺"(公开号[CN1800216A])、"鱼鳞胶原蛋白 的生产方法"(公开号[CN1628540A])、"一种从鱼鳞中提取胶原蛋白的方法"(公 开号[CN1888075A])、"鱼鳞胶原蛋白及其制造方法"(公开号[CN1986828A])、 "一种鱼鳞胶原蛋白生产工艺"(公开号[CN1775950A])、 "II型胶原蛋白复合 物制备工艺"(公开号[CN1721546A])、"海蜇胶原蛋白及其制备方法"(公开号 [CN1803836A])等，但还未见贝类动物胶原蛋白产品及其制备方法的专利及研究 报道。据调查，目前全国育珠面积已超过85万亩，年接种珠蚌约5亿 8亿只。随着 我国淡水珍珠产量的逐年增加，采珠后蚌废弃物的产量也在增加，每年采珠后我 国约有3万吨的蚌废弃物产生，其中软体部分的废弃物约达到1.2万吨，废弃物中 只有不到O. 1%的部分得到了开发利用，除加工成低附加值的饲料外，往往都被丢 弃，没有得到充分利用，这样做不但对环境遭成了重大污染，同时也是对资源的 一种浪费，更加剧了现今珍珠产业的负担。经我们研究，蚌外套膜中蛋白质含量 约占总干物质的50%，其中近一半为胶原蛋白，因此回收蚌外套膜中的胶原蛋白， 不但可以把采珠后的废弃物充分利用，而且还可以作为一种新的胶原蛋白原料， 同时还保护了环境，提高珍珠产业的附加值。发明内容本发明的目的是提供一种贝类外套膜胶原蛋白产品及其制备方法。为达到上述目的， 一方面本发明公开了一种贝类动物胶原蛋白，所述胶原蛋 白从贝类的外套膜中提取，呈白色、絮状、无腥味，其a肽链的分子量为430KD， 变性温度31 'C，特征粘度11.2 dL/g，每1000个氨基酸残基中含甘氨酸、脯氨酸 和羟脯氨酸分别为265、 88、 56。另一方面，上述对胶原蛋白进行提取回收的方法具体实施如下-a) 清洗贝类外套膜；b) 均质加入1 20倍体积的含0.1 5%磷酸盐的洗出液，捣碎均质后， 再搅拌处理O. 5h 10h;c) 去除杂蛋白离心，5000 10000g, 10 30min，去除上清液；d) 重复进行步骤b和c操作l 3次；e) 抽提胶原蛋白步骤d)所得沉淀加入l 20倍体积0.5M弱酸，5 15 'C下提取2 72h;f) 盐析离心取上清液，加入1 5M中性盐使胶原蛋白在该体系中沉淀出 来；g) 透析、干燥。
其工艺流程如图2。所述贝类可为马氏珍珠贝、白碟贝黑碟贝、企鹅贝、三角帆蚌、褶纹冠蚌池 碟蚌或背角无齿蚌中之一或组合。所述贝类的外套膜，可为新鲜原料或经过低温保藏处理的冷冻原料及其捣碎 原料。所述所用水可以为蒸馏水、纯净水，最好为去离子水。 上述0.1 5% (w/v)磷酸盐溶液洗出液优选磷酸氢二钠。 所述的抽出液为0.1-0.5M弱酸可以为醋酸、柠檬酸和乳酸等，以醋酸为最 佳，可添加或不添加各种来源的酸性蛋白酶。 所述的中性盐可采用KC1、 NaCl等。所述干燥方法最好用真空干燥以及冷冻干燥，以避免蛋白质变性，影响其功 能特性。本发明所获得的胶原蛋白同陆生动物来源(如牛、猪、鼠)及己有报道的鱼 类I型胶原蛋白均有很大的区别(1)本发明所获胶原蛋白a肽链的分子量约为 430KD，而来自于牛皮、猪皮以及鼠尾胶原蛋白的a肽链分子质量均在300KD左 右；(2)本发明所获胶原蛋白分子中仅含有非常微量的二聚体(e)，没有发现 三聚体(Y)，而牛皮、猪皮以及鼠尾胶原分子中则含有相当多的二聚体和三聚 体。具体见附图.本发明具有如下有益效果1. 原料的选择为贝类外套膜，属于采珠后副产物，通常被丢弃。通过本发明 回收利用该原料中含量丰富的胶原蛋白，可"变废为宝"，既能提(高产品的附加 值，又能缓解环境受污染的程度。2. 本发明公开的贝类外套膜胶原蛋白提取方法，使用常见的试剂(NaCl、 KC1、磷酸盐、醋酸等)和简易的物理方法(组织捣碎、搅拌、离心、透析、干
燥)，成本低廉，安全无毒，适合工业化生产。
图l.三角帆蚌外套膜胶原蛋白的SDS-PAGE电泳图谱。其中，MW为标准 分子量蛋白，M、 S、 P、 B、 R分别表示来源于三角帆蚌外套膜、鱿鱼皮、猪皮、 牛皮和鼠尾的胶原蛋白。图2是工艺流程图具体实施下面通过具体得实施方案来说明最佳提取条件的确定。本方案只用于对本发 明的进一步阐述和说明，不能认为是对本发明的保护范围的限制。实施例l1. 原料收集与清洗约为4 5龄的育珠三角帆蚌，珍珠己养育成熟，杀蚌后取出珍珠，收集三角帆 蚌外套膜，用蒸馏水清洗干净。2. 采用洗出液去除杂蛋白将经过清洗的三角帆蚌外套膜装入组织捣碎机中捣碎，加入IO倍本发明所 采用的洗出液进行均质。经搅拌处理30min后，离心取沉淀，再加入洗出液重复 处理1 2次。3. 采用提取液抽提胶原蛋白去除杂蛋白后的沉淀，加入10倍的抽出液在5'C的低温条件下提取72h，使 胶原蛋白充分溶解在抽提液中，然后离心取上清液，获得胶原蛋白溶液。在该溶 液中加入KC1，调节其浓度使胶原蛋白形成沉淀，然后离心取沉淀，经透析获得 胶原蛋白湿品。
4.冷冻干燥采用冷冻干燥方法，对上述胶原蛋白湿品进行干燥，可以防止胶原蛋白质变 性，干燥后的胶原蛋白为白色、絮状物，可溶于水，无异味，其a肽链分子量约 430KD，变性温度31 °C,特征粘度11.2 dL/g,每1000个氨基酸残基中含甘氨酸、 脯氨酸和轻脯氨酸分别为265、 88、 56。实施例2采珠后的三角帆蚌外套膜，用去离子水清洗干净，称取一定的量，加入5 倍本发明所采用的洗出液进行捣碎均质。经搅拌处理40min后，离心取沉淀，再 加入5倍洗出液重复处理2次。在离心后的沉淀中加入10倍的抽出液在l(TC的 条件下提取48h，离心取上清液；在上清液中加入NaCl，使其终浓度达12%， 然后离心取沉淀，经透析和干燥后获得白色、絮状、无腥味的三角帆蚌外套膜胶 原蛋白产品。该产品的a肽链分子量为430KD，纯度约90%。实施例3采珠后的三角帆蚌软体原料，用蒸馏水清洗干净，放入其组织捣碎机中，加 入2倍洗出液进行均质，然后再加入为原料8倍的洗出液，继续均质使原料与洗 出液充分作用，离心去除上清液，再加入为原料10倍的洗出液，进行重复处理。 离心去除上清液，在沉淀中加入15倍的抽出液在5'C条件下提取60h，离心去除 沉淀，在上清液中加入KC1，使其终浓度达15%，然后离心取沉淀，经透析和干 燥后获得胶原蛋白产品。该产品呈白色、絮状、无腥味、a肽链分子量约430KD， 纯度大于90%。实施例4将实施例l提取的三角帆蚌外套膜胶原蛋白和牛、猪、鼠及己有报道的鱼类 I型胶原蛋白进行SDS-PAGE电泳。结果如图1所示三角帆蚌外套膜胶原蛋白(M)与鱿鱼皮(S)、猪皮(P)、
牛皮(B)和鼠尾(R)胶原蛋白的SDS-PAGE电泳比较.其中，MW为标准分子量 蛋白。鱿鱼皮(S)、猪皮(P)、牛皮(B)和鼠尾(R)胶原蛋白的a肽链分子量 均在300KD左右'，且分子中含大量二聚体和三聚体(来源于鱿鱼皮的除外)。而 三角帆蚌外套膜胶原蛋白a肽链分子量为430KD，仅含有非常微量的二聚体 (e)，没有发现三聚体(Y)。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被 单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本 领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所 附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1、一种贝类动物胶原蛋白，其特征在于所述胶原蛋白从贝类的外套膜中提取，呈白色、絮状、无腥味。其α肽链的分子量为430KD，变性温度31℃，特征粘度11.2dL/g，每1000个氨基酸残基中含甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸分别为265、88、56。
2、 一种权利要求l所述贝类动物胶原蛋白的制备方法，包括下列步骤，a) 清洗贝类外套膜；b) 均质加入1 20倍体积的含0.1 5%磷酸盐的洗出液，捣碎均质后， 再搅拌处理O. 5h 10h;c) 去除杂蛋白离心，5000 10000g, 10 30min，去除上清液；d) 重复进行步骤b和c操作l 3次；e) 抽提胶原蛋白步骤d)所得沉淀加入l 20倍体积0.5 M弱酸，5 15 'C下提取2 72h;f) 盐析离心取上清液，加入1 5M中性盐使胶原蛋白在该体系中沉淀出 来；g) 透析、干燥。
3、 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤b)中所述磷酸盐溶液为磷 酸氢二钠溶液。
4、 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤e)中所述弱酸选自醋酸、 柠檬酸或乳酸中之一。
5、 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤e)中所述弱酸为醋酸。
6、 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤f)中所述中性盐可采用 KC1或NaCl。
7、 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤g)中所述干燥方式为真空 千燥或冷冻干燥。
全文摘要
本发明属于生物资源与环境技术领域，具体涉及一种贝类外套膜胶原蛋白产品及其制备方法。本发明公开了一种贝类动物胶原蛋白，所述胶原蛋白从贝类的外套膜中提取，呈白色、絮状、无腥味，α肽链分子量约430KD，有别于陆生动物来源(如牛、猪、鼠)及已有报道的鱼类I型胶原蛋白，它们的α肽链分子质量均在300KD左右(具体见附图)。贝类外套膜，如三角帆蚌外套膜，属于采珠后副产物，通常被丢弃。通过本发明回收利用该原料中含量丰富的胶原蛋白，可“变废为宝”，既能提高产品的附加值，又能缓解环境受污染的程度。本发明公开的贝类外套膜胶原蛋白提取方法，使用常见的试剂和简易的物理方法，成本低廉，安全无毒，适合工业化生产。
文档编号C07K14/435GK101157723SQ20071004630
公开日2008年4月9日 申请日期2007年9月24日 优先权日2007年9月24日
发明者刘承初, 周海燕, 李家乐, 李应森, 王金余 申请人:上海水产大学