专利名称：：无水帕拉米韦晶体及其药物组合物的制作方法
技术领域：
：本发明属于有机药物化学
技术领域：
，涉及一种流感神经氨酸酶抑制剂无水帕拉米韦(Peramivir)的结晶形态和制备该结晶的方法以及含有该晶体所组成的药物组合物。
背景技术：
：流感病毒才艮据其核蛋白和基质蛋白的抗原特性可以分为三个血清型，即A型、B型和C型流感病毒，其中A型流感病毒能感染多种动物，包括人、禽、猪、马等，而B型和C型流感病毒一般多见于人的感染。禽流感病毒是曱型(即A型)流感病毒之一。理论上讲，用于治疗和预防人类曱型流感的药物对禽流感应该有效。例如目前的金刚曱烷(amantadine)、金刚乙胺(rimantadine),4L那米韦(Zanamivir,商品名Relenza)和奥司他韦(Oseltamivir，商品名达菲Tamiflu)等等已经批准用于临床治疗人类曱型流感；其中的金刚胺类药物是流感病毒基质蛋白M2离子通道的抑制剂，在病毒复制的早期起抑制作用，可抑制病毒的脱壳。此类药物是目前常用的甲型流感临床治疗药物。但存在神经毒性、长期用药易产生耐药性，对乙型流感病毒无效等缺陷(MZ蛋白仅存在于曱型流感病毒)。另外一种神经氨酸酶(NA)抑制剂达菲和扎那米韦属于NA抑制剂。M的主要功能是促进新形成的病毒粒子从感染细胞中分离与扩散，促进病毒粒子从感染的呼吸道粘膜向周围组织扩散。此外，NA还具有增强病毒抹的毒性和引起细胞凋亡，导致流感症状、气道炎症发生的功能。NA抑制类药物能抑制流感病毒的复制，降低其致病性，可减轻流感发病时的症状、缩短病程、减少并发症。目前上市的此类药物有两种扎那米韦和达菲。扎那米韦是一种雾化吸入剂，应用后能在上呼吸道达到高浓度，抑制病毒复制与释放，且无全身不良反应，被批准用于治疗无并发症的、年龄>7岁的急性流感患者，最好在流感症状发作2天内应用。达菲是口服剂，被批准用于>1岁的无并发症、发病2天内的患者。然而，此类药物对婴幼儿的安全性还需进一步评估，且此类药物较为昂贵限制其推广使用。再有一种神经氨酸酶抑制类的新药就是帕拉米韦(Peramivir),它是一种流感神经氨酸酶抑制剂。Peramivir可以杀死高致病性的H5Nl禽流感病毒，可以有效对抗H5N1禽流感病毒。临床前研究结果显示，它可以有效地作用于多种流感病毒(包括H5N1病毒)。它是一种以流感病毒表面糖蛋白神经氨酸酶为作用靶点的新型环戊烷类抗流感药物。实验室的测试显示，Peramivir能有效对抗每一种已知的H5N1病毒，而且杀伤力特强，不容易令病毒出现抗药性。关于帕拉米韦的中国专利申请有申请号为98812351.7的专利申请公开了帕拉米韦化合物、制备方法及其用途，另外申请号为00809622.8、00809654.6的专利申请公开了帕拉米韦的制备方法和含结晶水的A、B晶体结构，但是尚未见有关于无水帕拉米韦晶体的报道。本发明人发现了无水帕拉米韦晶体结构，其不同于已知的A、B两种晶体，从而完成本发明。
发明内容本发明一个目的是提供一种无水帕拉米韦晶体。本发明另一个目的是提供无水帕拉米韦晶体的制备方法。本发明再一个目的是提供含有无水帕拉米韦晶体的药物组合物。本发明还一个目的是公开了含有帕拉米韦晶体组合物在制备用于抑制流感病毒神经氨酸酶药物中的应用。本发明的具体技术方案如下本发明制备的无水帕拉米韦晶体，具有如下特征1、X射线粉末衍射仪器日本理学D/MAX-2500X射线衍射仪乾Cu-Ka辐射(A-1.5405A)，28=2-40。C阶跃角0.041C计算时间0.5秒管压40KV管流100mA扫描速度8°C/min滤片石墨单色器<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>2、差示扫描量热法(DSC):仪器METTLERTOLEDO型差示扫描量热仪范围30.0-160.0€升温速度10。C/分钟无水帕拉米韦晶体吸热转变在约303。C。3、热重-差热分析(TG-DTA):仪器日本理学标准型TG-DTA分析仪TG量程5mgDTA量禾呈±250uV参比物A1203温度范围室温-400X:升温速度10匸/min结果表明帕拉米韦晶体不含水和结晶溶剂，其吸热转变在305。C。4、红外光谱(IR):仪器Nicolet公司Magna-560FTIR型红外光谱仪无水帕拉米韦结晶体(溴化钾压片)的红外光谱波数(cm—1)为3361，2965，2936，2877，1678，1637，1554，1459，1387,1334，1291,1261,1179,1146，1111，1086，1041，991，963，825，781，755，640，586。本发明制备无水帕拉米韦晶体的方法，包括将含结晶水的帕拉米韦粗品加入一定量的有机溶剂中，搅拌溶解，脱水，浓缩，析出，过滤，60-80r真空干燥，得白色固体。具体是将含结晶水的帕拉米韦粗品加入一定量的有机溶剂中，搅拌溶解得透明溶液，然后加入干燥剂(无水硫酸钠、硫酸镁等)，摇晃、静置7-20小时，过滤除去千燥剂，浓缩至体积的1/5-3/5，析出固体，室温放置2-8小时后，过滤，60-80lC真空干燥，得白色固体。本发明所述的有机溶剂为曱醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯曱烷、三氯曱烷、乙醇、异丙醇或四氢呋喃一种或一种以上的混合液。本发明浓缩至体积的1/5-3/5的目的是为了使产品易于析出，以便可以获得较高的收率。另外根据选用的有机溶媒不同，可以在室温或升温60。C以下搅拌，例如当选用乙酸乙酯时，为了加快溶解速度可升温至60。C，同时也节省溶剂的用量。本发明进一步考察了无水帕拉米韦稳定性，其试验结果如下1、光照试验试验方法将本品平铺于扁形称量瓶中，开盖，于4500土500勒克司照度下，分别于5、10天取样，观察外观、有关物质、含量、熔点和晶型的变化。试验结果见表l。表1无水帕拉米韦对光的稳定性试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>试验结果本品经光照10天，外观、有关物质、晶型和含量与O天的同批样品比较基本一致，说明本品对光稳定。2、高温试验试验方法将样品平铺于扁称量瓶中，置60"C恒温箱中，分别于5、10天取样，观察样品外观，测定有关物质、含量、熔点和晶型的变化，试验结果见表2。表2无水帕拉米韦60'C加热稳定性试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>试验结果本品经60X:加热10天，外观、有关物质、晶型和含量与O天的同批样品比较基本一致，说明本品对光稳定。3、高湿试验试验方法将样品平铺于扁形称量瓶中，敞口^L在RH75y。土5。/。(含饱和NaCL水溶液)的干燥器内，分别于5、IO天取样，观察样品外观，测定有关物质、含量:、熔点和晶型的变化，结果见表3。表3无水帕拉米韦相对湿度75%的稳定性试验结果放置时间外观有关物质％含量％熔点"C晶型o天白色粉末0.8499.39>285分解如图15天白色粉末0.8699.30〉285分解不变10天白色粉末0.8799.22〉285分解不变试验结果，经相对湿度75%的放置10天增重仅为0.3%，外观、有关物质、晶型及含量与O天同批样品基本一致，说明本品对湿稳定。本发明的帕拉米韦晶体与现有技术相比所具有的积极效果在于按照文献CN1367776A条件重结晶可得到A形或B形其一或两种的混合物，制备重复性较差，很难一次获得需要的某种晶体；此外由于A形或B形均为含水晶体，对干燥条件也有一定要求，否则晶体容易失去水分，或/和在干燥过程中产生晶型转化。而本发明公开的无水晶体克服了以上缺陷，制备重现性好，容易干燥，对光、湿、热稳定，适合长期贮存，更适合工业化大生产。本发明还提供一种药物组合物，该组合物含有药理学上有效量的无水帕拉米韦晶体和药理学上可接受的赋形剂。一般的，本发明提供的組合物经口给药，但也可以其他形式如直肠、鼻、局部(包括眼睛、口腔和舌下)、阴道和胃肠外(包括皮下、肌肉、静脉内、皮内、鞘内和硬脑膜外)给药。虽然无水帕拉米韦晶体可以纯化合物的形式给药，但以药学制剂的形式为佳。适合口服的形式可为片剂或胶嚢；粉剂或颗粒剂；在水性溶液或非水性液体中的溶液或混悬液；水包油或油包水型液体乳液；也可为大丸剂或糊剂。本发明所述的赋形剂包括稀释剂、填充剂(如甘露醇、乳糖、聚乙二醇)、粘合剂(淀粉、微晶纤维素)、崩解剂(如羧曱基纤维素、低取代的羟丙基纤维素)、润滑剂(如滑石粉、硬脂酸镁)、湿润剂(如丙二醇、乙醇)、稳定剂(EDTA-2Na、^琉代石克酸钠、焦亚碌b酸钠、亚辟u酸钠、乙醇胺、碳酸氩钠、烟酰胺)等等。可接受的口服固体制剂有普通片剂、分散片、緩控释、肠溶片、颗粒、胶嚢、滴丸、散剂等等；口服液体制剂有口服液、乳剂；注射剂有小水针、输液、冻干粉针等等。一般制剂可含5-1000mg，优选10-800mg,更加优选为100-800mg的无水帕拉米韦晶体。优选组合物为含有100-400mg无水帕拉米韦晶体的注射液。也可以是含有400-800mg无水帕拉米韦晶体的片剂或胶嚢。最优的剂型是含有100-400mg无水帕拉米韦晶体的注射液。上述辅料可以是常用剂量，以常用的配比与无水帕拉米韦晶体混合，当无水帕拉米韦晶体用量确定后，各药用辅料之间的配比可以根据需要适当调节。图l是无水帕拉米韦晶体X-射线粉末衍射图镨。图2是无水帕拉米韦晶体DSC图谱。图3是无水帕拉米韦晶体差热分析-热重(DTA-TG)图镨。图4是无水帕拉米韦晶体红外光谙图谱。具体实施例方式本发明所采用的含结晶水的帕拉米韦粗品的制备方法，参考文献CN1358170A、CN1367776A公开的方法制备。实施例l酒石酸(1S,4R)4-氨基环戊-2-l-羧酸曱酯的制备将(±)-2-氮杂双环[2.2.1〗庚-5-烯-3-酮(100.0g，0.916mol)溶于曱醇(83.0g)，形成棕色溶液。小心地通入HC1气37.8g，持续20分钟。完成HC1引入后，将混合物冷却至20。C。依次加入L-酒石酸(82.5g，0.55mol)和水(50.0g),然后加入三乙胺(60.0g,0.596nuil)，当溶液的PH达到2.0时，加入少量L-酒石酸(1S，4R)4-氨基环戊-2-烯-1-羧酸曱酯晶体作为晶种。将此混合物冷却至22'C过滤。用曱醇洗涤固体，并在40。C真空("Ombar)干燥。得率(1S，4R)4-氨基环戊-2-烯-1-羧酸曱酯的酒石酸盐(112.Og,83%，HPLC测得的ee》990;mp:174.3-174.9°C;[a]D2。10=-40.0。(c=lg/dL，H20)。实施例2(1S，4R)4-[[(1，1-曱基乙氧基)羰基]氨基]-2-环戊烯-l-羧酸甲酯的制备将L-酒石酸(1S,4R)4-氨基环戊-2-烯-1-羧酸曱酯与二碳酸二叔丁酯(78.8g，0.361mol)悬浮在130g曱醇中。随后滴加三乙胺(80.0g，0.791mol)。将混合物溶液搅拌l小时，将该溶液冷却至5匸，加入水。加入少量(1S，4R)4-[[(1，1-曱基乙氧基)羰基]氨基]-2-环戊烯-l-羧酸曱酯晶体作为晶种，得到白色沉淀。混合物搅拌、过滤。滤得固体用水洗涤，真空干燥。得率(1S，4R)4-[[(l，l-曱基乙氧基)羰基]氨基]-2-环戊烯-l-羧酸酯(79.0g,95.7%);即51.9—52.4°C;[a]D2°、一52.0。(c=lg/dL，cHcl3)。实施例3(3aR，4R，6S,6aS)-[[(1，l-二曱基乙氧基)羰基]氨基]-3-(l，-乙基丙基)-3a，5，6，6a-四氢-4H-环戊烷并[d]异噁唑-6-羧酸2，2-二曱基乙基铵的制备将(1S,4R)-(-)-[[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]环戊-2-烯-1-羧酸曱酯(50g,0.207mol)溶于曱苯和三乙胺(62.9g，0.622mol)，并将该反应混合物加热至70'C。向该溶液中加入2-乙基-N-羟基丁亚氨酰氯(93.0g,0.622mol)的曱苯溶液，形成白色固体沉淀。加完后，反应混合物继续搅拌5小时。将反应混合物冷却，过滤去除沉淀，用曱苯洗涤滤饼。合并滤液，在15X:用氢氧化钠(12.4g)水(37.3g)溶液处理。用水-稀释该反应混合物，用水萃取有机相，合并后的水相用曱苯萃取。向水相中加入叔丁基曱基醚(250g)，用酸PH调节至4.0。相分离后，用#又丁基曱基醚萃取水相。合并有机相，干燥。滤除干燥剂，用叔丁基曱基醚洗涤。并用叔丁基胺在25匸处理。产物为白色固体沉淀。混合物搅拌3小时，然后过滤收集沉淀，40匸干燥16小时。得率56.68g(66%)，纯度(LC)>98%。实施例4(3aR，4R，6S，6aS)-(+)+[[(1，l-二曱基乙氧基)羰基]氨基]-3-(l，-乙基丙基)-3a，5，6，6a-四氢-4H-环戊烷并[d]异噁唑-6-羧酸曱酯的制备将(3aR，4R，6S，6aS)-4-[[(l，l-二曱基乙氧基)羰基]氨基]-3-(l，-乙基丙基)-4，5，6，6a-四氢-3aH-环戊烷并[d]异噁唑-6-羧酸l，1-二曱基乙基铵(lOOg，O.242mol)悬浮于曱醇中。加入原曱酸三甲酯(30.8g，0.290mol)，将反应混合物冷却至20'C。向反应混合物中吹入HC1气体，持续15分钟；混合物变成澄清的溶液。该溶液在18X:搅拌3小时。加入二碳酸二叔丁酯(BOC酐)(13.2g，0.06mol)，然后加入三乙胺(9.Og，0.089mol)将pH调节至8。该溶液搅拌30分钟，然后冷却用水稀释。在溶液中加入晶种并搅拌出现白色沉淀。过滤收集产物，用水洗涤，50。C真空干燥。得率82.82g(96.6%),mp66。C，纯度(LC)99.2°/。。实施例5(1S，2S，3S，4R，l，S)-3-[(1，-氨基-2，-乙基)丁基〗-4-[[1，1-二曱基乙氧基]羰基]氨基]-2-羟基环戊烷-l-羧酸曱酯的制备将(3aR，4R，6S，6aS)-(+)-4-[[(1，l-二甲基乙氧基)羰基]氨基]+(l，-乙基丙基)-3a，5，6，6a-四氢-4H-环戊烷并[d]异噁唑-6-羧酸曱酯(100g，0.282mol)和六水合氯化镍(70.4g，0.296mol)溶于曱醇。将该溶液冷却至0"C,将氢氧化钠(0.5g，0.Ollmol)和硼氲化钠(28.0g,0.741mol)溶液曱醇中，在(TC加入反应混合物。硼氢化物溶液加完后，反应混合物搅拌30分钟。加入亚硝酸钠(20g，0.291mol)、氯化铵(56.lg,1.05mol)和25%氢氧化铵水溶液，2(TC搅拌16小时。过滤收集沉淀，用25%氬氧化铵水溶液洗涤，得湿的粗制产物(300g)。将该湿粗产物悬浮于曱苯和25%氢氧化钠水溶液中。在70r加热60分钟。相分离后加入有机溶剂(乙酸乙酯)，再加入25°/。氢氧化铵水溶液150g，加热至70^C进行相分离。然后再加入EDTA饱和水溶液200ml，于80TC加热60分钟，，分离出有机相，0匸继续搅拌3小时后，过滤收集产物，用曱苯洗涤。湿产物在50。C真空干燥。得率74.0g(73.2W。实施例6(1S，2S，3S，4R，l，S)-(-)—3-[(1，—氨基-2，-乙基)丁基]-4—[[(狄亚氨基)曱基]氨基]-2-羟基环戊烷-l-羧酸(帕拉米韦)粗品的制备将(1S,2S，3S，4R，l，S)-3-[(1，-氨基-2，-乙基)丁基]-4-[[1，l-二曱基乙氧基]羰基]^JJ-2-羟基环戊烷-l-羧酸曱酯(21.16g，0.060mol),悬浮在曱苯(88.7g)中，冷却至0。C。在0。C加入乙酸酐(7.02g，0.069mol)。反应混合物室温搅拌，然后用碳酸钠(5.Og，O.047mol)的水溶液萃取。弃去水相，在0。C将有机相加到37wt。/。盐酸中搅拌分层，用水洗涤有机相。合并水相，用30wty。氢氧化钠水溶液处理，在(TC緩慢加入，同时将pH调节至12左右。在0€加入盐酸l，2，4-三唑-l-曱脒(10.78g，0.073mo1)。该悬浮液搅拌15分钟，加入30。/。氢氧化钠水溶液调节至pH8.5左右，得到澄清溶液。开始沉淀出白色固体。该反应混合物室温搅拌过夜。过滤收集产物，用水洗涤产物经空气干燥，得到帕拉米韦的粗品。实施例7A晶型帕拉米韦的制备将粗制(1S,2S,3S，4R，l，S)-(-)-3-[(1，-氨基-2，-乙基)丁基]-4-[[(氨基亚氨基)曱基]氨基]-2-羟基环戊烷-1-羧酸(97.0g,0.273mol,倍半水合物)与蒸馏水(600ml)和曱醇(70ml)混合。将该混合物加热至沸腾，直至固体溶解。蒸馏掉曱醇，直至最终溶液体积约为7ml/g。将该混合物冷却至室温搅拌过夜。过滤收集固体，用冷水洗涤，空气干燥，得产物的A晶型白色晶体。分离固体的得率88.5g(理论得率:84.7%)，mp256-258'C(分解)。实施例8帕拉米韦无水物的制备取粗品35g(含结晶水)加入曱醇5000ml搅拌溶解，加入无水石克酸钠350g，搅拌5小时，静置14小时，过滤干燥剂，浓缩至2000ml左右析出大量固体，室温放置4小时后过滤得白色固体，真空60。C干燥，得28g固体。mp〉285lC分解。无水帕拉米韦晶体X-射线粉末衍射图镨见图1。'HNMR(400MHzD20):5ppm0.83(m，3H),0.88(m，3H)，0.99(m，2H)，1.44(m，3H)，1.75(m，1H)，1.91(s，3H)，2.16(m，1H)，2.49(m，1H)，2.67(m，1H)，3.79(m，1H)，4.31(m，2H)。实施例9帕拉米韦无水物的制备取粗品llg(含结晶水)加入乙酸乙酯2100ml，升温60。C,搅拌溶解，加入无7jC辟u酸镁100g,搅拌5小时，过滤干燥剂，浓缩至1300ml左右析出大量固体，室温放置6小时后过滤得白色固体，真空6(TC干燥得9.4g固体，mp>285'C分解，无水帕拉米韦晶体X-射线粉末衍射图语见图1。实施例IO帕拉米韦无水物的制备取粗品llg(含结晶水)加入曱醇+乙醇共2100ml，搅拌溶解，加入无水硫酸钠100g，搅拌5小时，过滤干燥剂，浓缩至1500ml，析出大量固体，室温放置8小时后，过滤得白色固体，真空60。C干燥得9.lg固体。mp〉285。C分解。无水帕拉米韦晶体X-射线粉末衍射图傳见图1。实施例ll片剂400mg无水帕拉米韦晶体400g微晶纤维素80g乳糖283.6g交联羧曱基纤维素钠24g3%羟丙基纤维素水溶液适量硬脂酸镁4g制成1000片实施例12含有200mg帕拉米韦晶体的注射液。无水帕拉米韦晶体200mg甘露醇适量盐酸适量注射用tK加至100mL。实施例13含有200mg帕拉米韦晶体的冻干粉针。无水帕拉米韦晶体200mg甘露醇适量盐酸适量注射用水加至20mL。常规冻干制得粉针剂。权利要求1、一种无水帕拉米韦结晶体，其特征在于使用Cu-Ka辐射λ＝1.5405id="icf0001"file="A2007100574970002C1.tif"wi="4"he="4"top="29"left="182"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>以2θ表示的X射线粉末衍射光谱特征如下<tablesid="tabl0001"num="0001"></tables><tablesid="tabl0002"num="0002"></tables>其DSC吸热转变在303℃；红外光谱波数为(cm-1)3361，2965，2936，2877，1678，1637，1554，1459，1387，1334，1291，1261，1179，1146，1111，1086，1041，991，963，825，781，755，640，586。2、如权利要求l的无水帕拉米韦结晶体，其X射线粉末衍射图大致如图l所示。3、一种制备权利要求l所述无水帕拉米韦晶体的方法，所述方法包括将含结晶水的帕拉米韦粗品加入一定量的有机溶剂中，搅拌溶解，脱水，浓缩，析出，过滤，真空干燥，得白色固体。4、如权利要求3的方法，其中所述脱水是指加入干燥剂搅拌、静置、过滤除去干燥剂。5、如权利要求4的方法，所述干燥剂为硫酸钠或硫酸镁。6、如权利要求3的制备方法，其中所述的有机溶剂为曱醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯曱烷、三氯甲烷、乙醇、异丙醇、四氢呋喃一种或一种以上的混合液。7、一种药物组合物，其特征在于该组合物含有治疗有效量的权利要求l所述的无水帕拉米韦结晶体和药理学上可接受的一种或多种药用赋形剂。8、如权利要求7所述的组合物，其特征在于所述的组合物为片剂、胶嚢、注射液或冻干粉针。9、如权利要求8所述的组合物，其特征在于所述的组合物为含有5-1000mg无水帕拉米韦晶体的注射液或冻干粉针。10、如权利要求8所述的组合物，其特征在于所述的组合物为含有5-1OOOmg无水帕拉米韦晶体的片剂或胶嚢。11、权利要求l所定义的无水帕拉米韦结晶体作为活性成分在制备用于抑制流感病毒神经氨酸酶药物中的应用。全文摘要本发明涉及无水帕拉米韦晶体化合物以及该晶体化合物的制备方法，同时本发明进一步公开了含有无水帕拉米韦晶体化合物的药物组合物，以及该组合物在制备治疗流感病毒及禽流感病毒药物中的应用。文档编号C07C279/00GK101314579SQ20071005749公开日2008年12月3日申请日期2007年5月30日优先权日2007年5月30日发明者刘玉凤,孙继铨,张村子,伟王,田青松,健赵,华陈申请人:天津泰普药品科技发展有限公司