专利名称：利用研磨法从凝胶中纯化小片段dna的方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及一种利用研磨法从凝胶中纯化小片段 DNA的方法和用途。
背景技术：
分离纯化DNA是基因工程领域中的一项基本技术，目前，DNA回收的主 要方法是通过凝胶电泳分离DNA片段，然后切割含有目的片段的凝胶，在NaI 的作用下溶解凝胶，然后过柱或玻璃株回收DNA。该方法对分离分子量DNA 是非常有效的，然而，DNA的回收得率是和DNA的分子量相关的，当DNA的 分子量在合适的范围时可以得到很高的回收率；当分子量大于20kb时，回收率 只有20。/^左右，同样的对于小分子量DNA,其回收效率也是很低的，尤其是分 子量少于100bp的片段，甚至不能得到目的片段，不能满足常规实验的要求。
目前有多家生物公司开发了可用于回收DNA的试剂盒，这些试剂盒对一般 分子量大小的DNA是有效的，但因自身缺陷而对于小分子量DNA回收效率低 下，甚至不能得到目的片段。本发明提供了一种高得率小分子量DNA的回收方 法，该方法尤其适合于回收分子量低于100 bp的DNA片段，而且对大分子量 DNA的回收同样有效。同时该方法可用于回收PCR产物、小片段DNA或小分 子量肽，以及用于提高表达产量而构建的多基因串连产物。
发明内容
本发明针对现有对小分子量DNA回收技术的缺陷，提供一种用研磨法从凝 胶中高效纯化小片段DNA的方法和用途。
利用研磨法从凝胶中纯化小片段DNA的方法包括如下步骤-
1) 在回收包含PCR或酶切产生的小分子量DNA片段的高浓度凝胶中，加 入400 800 u10.1倍TE缓冲液或灭菌水，用匀浆器研磨破碎，10000 12000 rpm离心5 10分钟，取上清；
2) 在上清液中加入l/3体积pH为5.2的3MNaAc和2倍体积的无水乙醇， 或者0.6倍体积的异丙醇，以沉淀DNA; 10000 12000rpm离心5 10分钟， 弃上清；
3) 用600 1000 lU 70X的冷乙醇洗涤DNA沉淀，10000 12000 rpm离
心3 5分钟，弃上清；
4) 真空抽干DNA沉淀，让残留的乙醇挥发干净，将DNA沉淀溶解在O.l
倍TE缓冲液或灭菌水中，-20 'C保存。 所述的小分子量DNA片段小于100 bp。
纯化的小分子量DNA用于克隆、转化、转染、DNA疫苗接种和/或PCR反应。
本发明具有如下优点
1. 本发明凝胶磨碎采用匀桨器，免去了酚/氯仿等有害物质的污染；
2. 与其他类似的DNA纯化试剂盒相比，本发明可以有效的从凝胶中纯化分 子量低于100bp的DNA片段，提高了小分子量DNA的回收效率，同样，本发 明也可有效的回收分子量大于100bp的DNA片段；
3. 本发明为需要回收小分子量DNA的克隆、转化、基因转导、突变检测、 基因诊断和治疗等研究和应用提供了一种新的手段和方法。
图1为DNA的凝胶电泳图，是本发明所用方法与其他公司试剂盒纯化DNA 之间的比较；图中泳道l、 2、 3为试剂盒纯化DNA，分子量分别为72 、 98、 225 bp;泳道4为50 bpDNA分子量Marker;泳道5、 6、 7为本发明方法纯化分 子量为72 、 98、 225bpDNA。
与参考DNA相比由本方法纯化的小分子量DNA得率明显高于对照。显然，本 方法与其他试剂盒提取DNA相比，显著提高了纯化效率。
图2为本发明纯化的DNA进行常规连接、转化后挑取单克隆进行PCR鉴 定的凝胶电泳图；图中泳道1为50 bpDNA分子量Marker;泳道2、 3、 4为 分子量为72 、 98、 225bp的PCR产物。
具体实施例方式
本发明以匀浆器研磨破碎电泳结束后切割的带有目的条带的凝胶，使凝胶 中的小分子量DNA释放到缓冲液中，在离心力的作用下实现DNA与凝胶的分 离；在通过盐离子和有机溶剂的作用使DNA沉淀下来，从而实现对小分子量 DNA的高效纯化，建立一种新的基于匀浆器研磨的小分子量DNA的快速高效 纯化方法。
实施例1
1) 在回收包含70bpDNAPCR产物的高浓度凝胶中，加入400 ul 0.1倍 TE缓冲液或灭菌水，用匀浆器研磨破碎，10000 rpm离心10分钟，取上清;
2) 在上清液中加入l/3体积pH为5.2的3MNaAc和2倍体积的无水乙醇， 或者0.6倍体积的异丙醇，以沉淀DNA; 10000 rpm离心10分钟，弃上清；
43) 用600 u 1 70%的冷乙醇洗涤DNA沉淀，10000 rpm离心5分钟，弃上清；4) 真空抽干DNA沉淀，让残留的乙醇挥发干净，将DNA沉淀溶解在O.l 倍TE缓冲液或灭菌水中，-20 "C保存。取5ul电泳结果如图l所示。实施例21) 在回收包含98 bp DNA PCR产物的高浓度凝胶中，加入800 y 1 0.1倍 TE缓冲液或灭菌水，用匀浆器研磨破碎，12000卬m离心5分钟，取上清；2) 在上清液中加入l/3体积pH为5.2的3MNaAc和2倍体积的无水乙醇， 或者0.6倍体积的异丙醇，以沉淀DNA;12000rpm离心5分钟，弃上清；3 )用1000 U 1 70%的冷乙醇洗涤DNA沉淀，12000 rpm离心3分钟，弃 上清；4)真空抽干DNA沉淀，让残留的乙醇挥发干净，将DNA沉淀溶解在O.l 倍TE缓冲液或灭菌水中，-20 'C保存。取5ul电泳结果如图l所示。 实施例31) 在回收包含酶切产生的225bpDNA片段的高浓度凝胶中，加入600 ul 0.1倍TE缓冲液或灭菌水，用匀浆器研磨破碎，11000 rpm离心6分钟，取上清；2) 在上清液中加入l/3体积pH为5.2的3MNaAc和2倍体积的无水乙醇， 或者0.6倍体积的异丙醇，以沉淀DNA; 11000rpm离心6分钟，弃上清；3) 用800 lU 70%的冷乙醇洗涤DNA沉淀，11000 rpm离心6分钟，弃上清；4) 真空抽干DNA沉淀，让残留的乙醇挥发干净，将DNA沉淀溶解在O.l 倍TE缓冲液或灭菌水中，-20 'C保存。取5ul电泳结果如图l所示。实施例4将纯化的70， 98和225bp的DNA片段1. PCR扩增约不同长度的DNA片段150 !U，取IOO u 1等分两个加样孔中 电泳，切下扩增片段；2. 参照试剂盒说明书对一份DNA样品进行纯化，最后溶在30 li 1的0.1 X TE缓冲液中；将另外的一份样品放在匀桨器中，采用本发明所述的方法进行纯 化，最后同样溶在30 Pl的0.1XTE缓冲液中；3. 将纯化的30 ulDNA样品分别取5 "1进行2。％浓度的凝胶电泳，紫外 灯下观察电泳DNA条带的明亮程度并进行密度扫描；4. 将本方法纯化的DNA进行常规生物学操作，并对连接产物进行PCR鉴定。
权利要求
1.一种利用研磨法从凝胶中纯化小片段DNA的方法，其特征在于包括如下步骤1)在回收包含PCR或酶切产生的小分子量DNA片段的高浓度凝胶中，加入400～800μl 0.1倍TE缓冲液或灭菌水，用匀浆器研磨破碎，10000～12000rpm离心5～10分钟，取上清；2)在上清液中加入1/3体积pH为5.2的3M NaAc和2倍体积的无水乙醇，或者0.6倍体积的异丙醇，以沉淀DNA；10000～12000rpm离心5～10分钟，弃上清；3)用600～1000μl 70％的冷乙醇洗涤DNA沉淀，10000～12000rpm离心3～5分钟，弃上清；4)真空抽干DNA沉淀，让残留的乙醇挥发干净，将DNA沉淀溶解在0.1倍TE缓冲液或灭菌水中，-20℃保存。
2. 根据权利要求1所述的采用研磨法快速高效回收小分子量DNA的方法， 其特征在于所述的小分子量DNA片段小于100 bp。
3. —种如权利要求1所述的方法纯化的小分子量DNA的用途，其特征在于 用于克隆、转化、转染、DNA疫苗接种和/或PCR反应。
全文摘要
本发明公开了一种利用匀浆器研磨凝胶快速高效纯化回收小片段DNA的方法。将包含目的小片段DNA的凝胶在TE缓冲液中直接用匀浆器研磨后，离心收集上清，在盐离子和无水乙醇的作用下沉淀DNA，再将沉淀的DNA重溶于TE缓冲液中，从而实现小片段DNA的高效纯化回收。该方法操作步骤简单，提高了回收效率。该方法同时为基因克隆、突变检测、基因诊断和治疗等研究和应用中小分子量DNA的纯化回收提供了一种新的手段。
文档编号C07H1/00GK101125874SQ20071007118
公开日2008年2月20日 申请日期2007年9月18日 优先权日2007年9月18日
发明者杰 严, 林旭瑷, 寅 陈 申请人:浙江大学