识别水禽共同IgY抗原的单克隆抗体及其制备方法

专利名称：：识别水禽共同IgY抗原的单克隆抗体及其制备方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，涉及抗体工程技术，具体为识别不同水鸟和水禽共同IgY抗原的单克隆抗体及其制备方法。技术背景野生水鸟和水禽(为书写简捷文中多处简称水禽)是禽流感病毒的自然储存宿主，对于禽流感病毒的繁殖、传播具有重要作用。资料显示，禽流感的16个HA亚型和IO个NA亚型都已从野生水鸟、水禽体内分离到。在水鸟、水禽中，流感病毒主要在其肠道内复制，并通过粪便排出体外，再经污染的水源或空气进行传播。因此，为了有效控制禽流感病毒在家禽和人之间的流行，必需建立一套完整的监测体系，对野生水鸟、水禽的病毒抗体水平进行调査，掌握疫病发生发展规律，才能建立可靠的防治程序。对于流感病毒的诊断，现已建立了多种检测家禽流感病毒的检测方法如鸡流感琼脂扩散(AGP)、血球凝集抑制试验(HI)、间接酶联免疫吸附试验(ELISA)等血清学检测技术。然而，由于水鸟和水禽的品种繁多，流动性大的特殊性，其流行病抗体的检测方法一直是困惑水鸟和水禽疫苗免疫效果评估和禽流感诊断的难题。研制高质量的识别不同水鸟和水禽共同IgY抗原的单克隆抗体，可为建立适用于基层使用的水鸟和水禽流感抗体检测器具提供诊断试剂，对水禽流行病的防治，尤其是禽流感的预防和控制有重要意义。
发明内容本发明的目的是提供一种可以识别15种水鸟和水禽(简称水禽)共同IgY抗原的单克隆抗体，并提供其制备方法。15种水禽是斑头雁、鸿雁、鸬鹚、夜鹭、白鹭、遗鸥、斑尾塍鹬、中杓鹬、绿翅鸭、花脸鸭、赤颈鸭、斑嘴鸭、麻鸭、番鸭和鹅。本发明识别15种水禽共同IgY抗原的单克隆抗体，是用纯化的斑头雁、鸬鹚、鸭和鹅的血清IgY蛋白为抗原进行联合免疫，通过杂交瘤细胞方法纯化和筛选获得的，能特异识别15种水禽共同IgY抗原的单克隆抗体。本发明识别15种水禽共同IgY抗原的单克隆抗体的制备方法包括以下步骤(1)用辛酸-硫酸铵盐析法从斑头雁、鸬鹚、鸭和鹅的血清中粗提IgY蛋白，经Superdex200凝胶层析获得纯化的斑头雁、鸬鹚、鸭和鹅的血清IgY蛋白；(2)用纯化的斑头雁、鸬鹚、鸭和鹅4种血清IgY蛋白为抗原，将此4种抗原按4种免疫组合免疫小鼠，诱导产生针对不同水禽的共同IgY抗原的抗体；4种免疫组合分别为斑头雁IgY-鸭IgY-鹅IgY，斑头雁IgY-鸬鹚IgY-鹅IgY，斑头雁IgY-鸬鹚IgY-鸭IgY，鸬鹚IgY-鸭IgY-鹅IgY;(3)通过杂交瘤细胞方法，以上述4种免疫组合小鼠脾细胞制备分泌抗水禽IgY单克隆抗体的杂交瘤细胞株；(4)用间接ELISA方法，以15种水禽的纯化IgY为检测抗原检测上述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，筛选出识别15种水禽共同IgY抗原的单克隆抗体。本发明的抗水鸟和水禽共同IgY抗原的单克隆抗体是用纯化的斑头雁、鸬鹚、鸭和鹅等水鸟、水禽血清IgY蛋白为抗原进行联合免疫，通过杂交瘤细胞方法获得的，特异识别不同水鸟、水禽共同IgY抗原的单克隆抗体。该单克隆抗体的具体制备方法进一步叙述如下采集斑头雁、鸬鹚、鸭和鹅等水禽外周血，离心分离血清，用辛酸-硫酸铵盐析法从血清中粗提IgY蛋白，以Superdex200凝胶层析进一步纯化，获得4种水鸟、水禽IgY纯化抗原。用纯化的斑头雁、卢鸟鹚、鸭和鹅的血清IgY抗原按不同免疫组合联合免疫6-8周龄BALB/c小鼠，联合方法为斑头雁IgY-鸭IgY-鹅IgY、鸬鹚IgY-鸭IgY-鹅IgY、鸭IgY-斑头雁IgY-鸬鹚IgY、鹅IgY-斑头雁IgY-鸬鹚IgY,诱导产生针对不同水禽共同IgY抗原的免疫应答。取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0在聚乙二醇作用下进行细胞融合，以HAT培养基选择性培养后，经间接ELISA筛选和有限稀释法克隆化，获得分泌抗水鸟和水禽IgY单克隆抗体的杂交瘤细胞株；将杂交瘤细胞注入经降殖垸致敏的BALB/c小鼠诱生腹水，获得抗水鸟和水禽IgY单克隆抗体，测定腹水效价。用单克隆抗体亚型测定试剂盒鉴定抗水鸟和水禽IgY单克隆抗体Ig亚类，以ELISA测定抗水鸟和水禽IgY单克隆抗体对不同水鸟和水禽IgY的反应性，筛选识别不同水禽共同IgY抗原的单克隆抗体，Westernblot鉴定抗水鸟和水禽IgY单克隆抗体识别的IgY轻链或重链。本发明的优点是(1)本发明提供的水鸟和水禽IgY蛋白制备方法简单，纯度高；(2)本发明提供的水鸟和水禽IgY单克隆抗体识别不同水禽共同IgY抗原，特异性强，识别谱广；(3)识别15种不同水鸟禽共同IgY抗原的单克隆抗体可用于水鸟和水禽禽流感等疫病的抗体:图说明图1为水禽血清IgY的Superdex200凝胶层析纯化图谱。图2为抗水鸟(禽)IgY单克隆抗体识别水鸟(禽)IgY亚基的Westernblot鉴定图。具体实施例方式1、水鸟和水禽IgY蛋白的纯化采集斑头雁、鸬鹚、鸭和鹅的外周血，离心分离血清，用辛酸沉淀血清白蛋白和其他非IgY蛋白，硫酸铵盐析法粗提IgY蛋白，以Superdex200凝胶层析进一步纯化鹅IgY蛋白。2、免疫小鼠用纯化的斑头雁、鸬鹚、鸭和鹅4种不同水鸟和水禽血清IgY为抗原联合免疫6-8周龄BALB/c小鼠，其免疫组合为第一组首免斑头雁IgY、次免鸭IgY、三免鹅IgY，第二组首免斑头雁IgY、次免鸬鹚IgY、三免鹅IgY，第三组首免斑头雁IgY、次免鸬鹚IgY、三免鸭IgY，第四组首免鸬鹚IgY、次免鸭IgY、三免鹅IgY，诱导产生针对不同水鸟和水禽共同IgY抗原的免疫应答。3、抗水鸟和水禽IgY蛋白单克隆抗体的制备取4种免疫组合的免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0在聚乙二醇作用下进行细胞融合，用HAT培养基进行选择性培养；以纯化的水鸟和水禽IgY蛋白为检测抗原，用间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞培养上清，对阳性杂交瘤进行连续3次有限稀释法克隆化，获得稳定分泌抗水鸟和水禽IgY单克隆抗体的杂交瘤细胞株；以降殖烷致敏BALB/c小鼠后，将杂交瘤细胞注入致敏小鼠腹腔诱生腹水，获得抗水鸟和水禽IgY单克隆抗体，测定腹水效价。4、水鸟和水禽IgY单克隆抗体的特性鉴定用SBA公司ClonotypingSystem/HRP亚型测定试剂盒鉴定4组抗水鸟和水禽IgY单克隆抗体重链和轻链的Ig亚类；以斑头雁、鸿雁、鸬鹚、夜鹭、白鹭、遗鸥、斑尾塍鹬、中杓鹬、绿翅鸭、花脸鸭、赤颈鸭、斑嘴鸭、麻鸭、番鸭和鹅等水鸟和水禽的纯化IgY为检测抗原，用间接ELISA方法测定4组抗水鸟和水禽IgY单克隆抗体对以上15种不同水鸟和水禽IgY的反应性，筛选识别15种水鸟和水禽共同IgY抗原表位的单克隆抗体；SDS-PAGE分离水鸟和水禽IgY蛋白，以Westernblot鉴定抗水鸟和水禽IgY单克隆抗体识别的IgY重链或轻链。实施例一水鸟和水禽血清IgY蛋白的纯化采集水鸟和水禽外周血，分离血清，通过辛酸-硫酸铵盐析法和凝胶层析等方法纯化水鸟和水禽血清IgY，获得了高度纯化的血清IgY，制备免疫抗原和检测抗原备用。具体步骤如下1、4种水禽血清制备分别采集斑头雁、鸬鹚、番鸭和鹅的外周血液，静置待血液完全凝固，4000r/min离心10min，吸取上清，获4种水禽血清。2、水禽血清IgY的粗提将收集的血清于4000r/min离心3-4次，每次10min，去除残留的红细胞和其它杂质。采用辛酸-硫酸铵盐析法提取水禽血清IgY，首先用4倍血清体积的0.06MpH4.8醋酸缓冲液稀释血清，以1MNaOH调pH至4.5;在室温下边搅拌边逐滴加入辛酸，每毫升血清加入25nL辛酸，4'C静置2h，12000r/min离心30min，取上清；在溶液中加10倍体积磷酸盐缓冲液PBS，用5MNaOH调pH至7.4，冰浴至4'C;按每毫升混合液加0.277g硫酸铵并搅拌30min，4。C静置4h，12000r/min离心30min，弃上清；沉淀以0.05MPBSpH7.4重悬于，透析除盐，直至用BaCl2检测无白色沉淀为止，用PEG8000进行浓缩。3、Superdex200凝胶层析纯化水禽IgY蛋白利用GE公司AKATpurifier蛋白纯化系统以Hiload16/60Superdex200preppg凝胶过滤预装柱纯化粗提的水鸟禽IgY蛋白。用0.22pm滤器过滤粗提的水禽IgY蛋白溶液，并经超声波除气；将Hiload16/60Superdex200preppg凝胶过滤预装柱与AKATpurifier蛋白纯化系统相连接，先用ddH20清洗柱子，接着用含0.15MNaCl的0.05M磷酸盐缓冲液(PBS,pH8.0)平衡柱子，流速为2mL/min，直至UV280的吸光值和电导值基线稳定，平衡柱子时要清洗各阀位。将过滤的水禽IgY蛋白样品用注射器(上样前注意排空注射器里的气泡，以免损害柱子)注入样品环中，设置洗脱速度和报警压，进行上样和洗脱，流速为lmL/min。观察UV280值基线的变化，收集紫外吸收峰的洗脱峰，每管收集2mL，SDS-PAGE电泳检测脱蛋白(图1)，合并收集液，装入透析袋，放入PEG8000中浓縮。样品分离结束后，分别用两个柱体积的去离子水和20%的乙醇洗脱与保存层析柱。4、蛋白含量测定取适量浓缩的水禽IgY作20倍稀释，用Nanodrop1000分光光度仪测OD娜和OD260吸光值，并根据公式计算IgY含量蛋白含量(mg/mL)-(1.45xOD28o-0.74xOD26Q)x20(稀释倍数)，测得纯化血清IgY的蛋白含量为5.4-6.0mg/mL，用于免疫抗原和检测抗原。实施例2小鼠免疫分别将纯化的水禽IgY蛋白与弗氏佐剂等比例混合，充分乳化，制备水禽IgY免疫抗原，按不同免疫组合联合免疫6-8周龄BALB/c纯系小鼠各10只，诱导产生针对不同水禽共同IgY抗原的免疫应答，其免疫组合为第一组首免斑头雁IgY、次免鸭IgY、三免鹅IgY，第二组首免斑头雁IgY、次免鸬鹚IgY、三免鹅IgY，第三组首免斑头雁IgY、次免鸬鹚IgY、三免鸭IgY,第四组首免鸬鹚IgY、次免鸭IgY、三免鹅IgY;免疫程序为首免以弗氏完全佐剂乳化水鸟禽IgY免疫抗原，背部皮下、皮内多点注射，每只100吗(0.2mL);间隔20天，用弗氏不完全佐剂乳化水禽IgY免疫抗原进行第二次免疫，腹腔注射，每只100吗(0.2mL);间隔20天，用不加佐剂的水禽IgY抗原进行三免，肌肉注射，每只100吗(0.2mL);免疫15天后，尾静脉采血，以水禽IgY为检测抗原，用间接ELISA方法测定免疫小鼠血清的抗体水平，免疫小鼠抗体滴度达到1:3200以上，表明小鼠获得良好免疫效果。实施例3杂交瘤细胞株的建立1、细胞融合细胞融合前3天，进行超强免疫，以不加佐剂的水禽IgY尾静脉注射小鼠，每只50pg(0.1mL)。免疫小鼠经眼眶放血，收集血清，拉颈致死后，无菌取小鼠脾脏，分离脾细胞，经台盼兰染色计数，按5:1的比例与SP2/0骨髓瘤细胞(2xl0》混合，在PEG4000作用下进行细胞融合；融合细胞经洗涤后，用HAT选择培养基重悬，置5XC0237'C进行选择性培养，5天后半量换液，IO天后改为HT培养基。待细胞克隆长至1/5-1/2培养孔时，吸取细胞培养上清检测分泌抗体。2、杂交瘤细胞筛选用纯化的水鸟和水禽IgY蛋白作检测抗原，检测杂交瘤细胞培养上清中的分泌抗体，筛选阳性杂交瘤细胞。以0.05M碳酸盐包被缓冲液(pH9.6)稀释水鸟和水禽IgY蛋白至2Hg/mL，加入酶标板，100pL/孔，37。C包被lh后转入4。C包被过夜，用含0.05%吐温20的PBS缓冲液(PBST)洗涤3次，力B5%脱脂奶粉37。C封闭1h，每孔加入杂交瘤细胞培养上清100^L，37。C孵育2h;PBST洗3次，加入1:5000倍稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗小鼠IgG抗体，37。C孵育1h，PBST洗4次，加入显色底物OPD-H202，避光反应10min后，用2MH2S04终止反应，用酶标仪读取OD柳值，以与阴性OD柳值的比值大于2.1判为阳性。3、有限稀释法克隆化用HT培养基制备阳性杂交瘤细胞悬液，取样进行台盼兰染色和计数；以HT培养基将杂交瘤细胞稀释至20个/mL和10个/mL，将稀释细胞悬液分别加入96孔培养板，每孔O.lmL，细胞含量分别为2个/孔和1个/孔，置5%<:02371:培养，5-7天观察细胞克隆生长情况，选取单克隆生长孔细胞上清，以ELISA检测分泌抗体；对阳性克隆进行连续2次克隆，使其抗体分泌阳性率达95%以上，扩大培养，冻存细胞，四个水鸟和水禽IgY免疫组合小鼠共获得稳定分泌抗水鸟和水禽IgY单克隆抗体的杂交瘤细胞株33株。实施例4抗水鸟和水禽IgY单克隆抗体的腹水诱生用降植烷腹腔注射成年雌性BALB/c小鼠，0.2mL/只，致敏1周后，腹腔注射鹅IgY杂交瘤细胞悬液5xl(^-lx107，7-10天后采集小鼠腹水，1200g离心3min，收集上清，-70°C冻存。实施例5抗水鸟和水禽IgY单克隆抗体的腹水效价测定用PBS缓冲液1000倍稀释抗水鸟和水禽IgY单克隆抗体腹水，经倍比稀释后，分别加入水鸟和水禽IgY蛋白(21ig/mL)包被的酶标板，100nL/孔，37'C孵育2h;PBST洗涤3次，加入1:5000稀释的HRP标记羊抗小鼠IgY抗体，37。C孵育1h，PBST洗涤后，加入显色底物OPD-H202，避光反应10min，用2MH2S04终止反应，用酶标仪读取OD4卯值，以与阴性OD49。值的比值大于2.1判为阳性，以阳性孔的最大稀释度为抗鹅IgY单克隆抗体腹水效价，所获抗水鸟和水禽IgY单克隆抗体的腹水效价在2.0x105以上。实施例6抗水鸟和水禽IgY单克隆抗体的Ig亚型测定利用SBA公司ClonotypingTMSystem/HRP亚型测定试剂盒测定抗水鸟和水禽IgY单克隆抗体Ig亚型，多数抗水鸟和水禽IgY单克隆抗体的重链为IgGl，轻链为k。实施例7抗水鸟和水禽IgY单克隆抗体的识别谱测定用纯化的斑头雁、鸿雁、鸬鹚、夜鹭、白鹭、遗鸥、斑尾塍鹬、中杓鹬、绿翅鸭、花脸鸭、赤颈鸭、斑嘴鸭、麻鸭、番鸭、鹅等15种水禽IgY蛋白为检测抗原包被酶标板，按实施例3所述ELISA方法测定抗水鸟和水禽IgY单克隆抗体与不同水禽IgY的反应性，结果见表1,共筛选获得特异识别水禽共同IgY抗原的单克隆抗体4株，分别命名为Wl、W2、W3和W4。实施例8抗水鸟和水禽IgY单克隆抗体的识别亚基鉴定以Westernblot鉴定抗水鸟和水禽IgY单克隆抗体识别IgY蛋白的亚基。用SDS-PAGE电泳分离水鸟和水禽IgY蛋白，电转移至硝酸纤维素膜后，用含5%脱脂奶的封闭液37'C封闭lh,洗涤后与抗水鸟和水禽IgY单克隆抗体(一抗)37。C孵育lh,用含0.5%Tween-20的Tris盐缓冲液(TBST)漂洗3次，然后与HRP标记羊抗小鼠IgY抗体(二抗)37'C孵育1h，TBST漂洗3次，加底物TMB显色，出现明显的条带后用水冲洗终止反应。结果单克隆抗体W1、W2、W3和W4均识别15种水禽的IgY轻链(图2)。表1抗水鸟和水禽IgY单克隆抗体对不同动物IgY的识别谱<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>权利要求1、一种识别15种水禽共同IgY抗原的单克隆抗体，所述15种水禽为斑头雁、鸿雁、鸬鹚、夜鹭、白鹭、遗鸥、斑尾塍鹬、中杓鹬、绿翅鸭、花脸鸭、赤颈鸭、斑嘴鸭、麻鸭、番鸭和鹅，其特征在于该单克隆抗体是用纯化的斑头雁、鸬鹚、鸭和鹅的血清IgY蛋白为抗原进行联合免疫，通过杂交瘤细胞方法筛选获得的能特异识别上述15种水禽共同IgY抗原的单克隆抗体。2、如权利要求1所述识别15种水禽共同IgY抗原的单克隆抗体的制备方法，其特征在于以下步骤-(1)用辛酸-硫酸铵盐析法从斑头雁、鸬鹚、鸭和鹅的血清中粗提IgY蛋白，经Superdex200凝胶层析获得纯化的斑头雁、鸬鹚、鸭和鹅的血清IgY蛋白；(2)用纯化的斑头雁、鸿鹚、鸭和鹅的血清IgY蛋白为抗原，将此4种抗原按4种免疫组合免疫小鼠，诱导产生针对不同水禽的共同IgY抗原的抗体；4种免疫组合为斑头雁IgY-鸭IgY-鹅IgY，斑头雁IgY-鸬鹚IgY-鹅IgY，斑头雁IgY-鸬鹚IgY-鸭IgY，鸬鹚IgY-鸭IgY-鹅IgY;(3)通过杂交瘤细胞方法，以上述4种免疫组合小鼠脾细胞制备分泌抗水禽IgY单克隆抗体的杂交瘤细胞株；(4)用间接ELISA方法，以15种水禽的纯化IgY为检测抗原，检测上述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，筛选出识别15种水禽共同IgY抗原的单克隆抗体。全文摘要本发明的识别水禽共同IgY抗原的单克隆抗体及制备方法属于生物
技术领域：
，涉及抗体工程技术。用辛酸-硫酸铵盐析法和Superdex200凝胶层析法从斑头雁、鸬鹚、鸭和鹅的血清中提取IgY蛋白；用纯化的IgY蛋白联合免疫BALB/c小鼠，用小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，以HAT培养基选择性培养，用15种水禽IgY蛋白进行间接ELISA筛选和有限稀释法克隆化，获得分泌抗15种水禽共同IgY抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中2A12、5D4、3A8和5H9识别水鸟和水禽IgY轻链，7D3、6A2和6D11识别水鸟和水禽IgY重链，其腹水的ELISA效价为0.5-1.0×10⁶，Ig亚型重链为IgG1，轻链为κ。本发明为水鸟和水禽流行病尤其是禽流感抗体检测提供诊断试剂。文档编号C07K16/18GK101157727SQ20071007132公开日2008年4月9日申请日期2007年9月14日优先权日2007年9月14日发明者周继勇,李玲燕,蒋媛媛,郭军庆申请人:浙江大学