专利名称：一种二甲氧基磷酸酯类农药通用半抗原的合成方法
技术领域：
一种二甲氧基磷酸酯类农药通用半抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。
背景技术：
有机磷农药的基本化学结构为
二甲氧基磷酸酯是R和RZ均为甲基、Y为氧的一种结构，针对具有这种结 构的一类农药来合成通用半抗原O， O-二甲基-O- (4-丙酸基苯基)磷酸酯。有 机磷农药由于其杀虫广谱，药效高，在我国的农业生产实践中得到了广泛的应 用，由于其使用量大，应用面广，在环境保护和食品安全方面受到了普遍关注。 免疫检测方法在农药残留检测上的发展非常迅速，目前已经有十几种常用的有 机磷农药建立了免疫检测方法，但都是针对一种农药。而进出口贸易中，对一 种产品往往规定若干个农药残留标准，再加上农药的混配生产和使用剧增，因 此开展农药的多残留免疫分析具有更新的现实意义。多残留免疫分析的原理就 是针对一组或一类化合物的共性结构特征来设计和合成半抗原，从而得到对于 特定的一组或一类化合物都具有识别和检测能力的抗体，即具有宽谱特异性 (broad specificity)，这种抗体有望用于某一类化合物的多残留ELISA分析。对 于有机磷农药的多残留ELISA研究，国内外都进行了一些尝试，但到目前为止， 对于久效磷、磷胺、速灭磷、百治磷、敌敌畏等几种高毒磷酸酯类农药国内外 尚未见其多残留分析研究的报道。而合成针对该类物质的通用半抗原是建立多 残留免疫分析的前提。
发明内容
本发明的目的是合成一种针对二甲氧基磷酸酯类农药的通用半抗原，该物 质与蛋白偶联之后可以作为此类农药酶联免疫检测过程中的包被抗原，利用包 被抗原与免疫原结构上的差异来进一步提高检测灵敏度，降低检测限。
本发明的技术方案 一种二甲氧基磷酸酯类农药通用半抗原的合成方法， 合成过程分酯化、酰化、水解三个步骤，首先将对羟基苯丙酸与甲醇发生酯化 反应，使羧基甲酯化；然后所得的对羟基苯丙酸甲酯再与二甲氧基磷酰氯反应， 得到二甲氧基磷酸酯；最后是将第一步酯化形成的甲酯再水解，将羧基还原出 来得O， O-二甲基-O- (4-丙酸基苯基)磷酸酯；此磷酸酯与卵清蛋白偶联，作 为二甲氧基磷酸酯类农药多残留ELISA分析的包被抗原；第一步以对羟基苯丙
酸为原料进行甲酯化先将羧基保护；第二步是用前一步的产物对羟基苯丙酸甲
酯与二甲氧基磷酰氯发生酰化，形成磷酸酯；第三步是将甲酯水解羧基脱保护。 其反应方程式为
HO-
-CH2CH2COOH
CH30H 浓硫酸
120'C回流2h
ho'
(ch2)2cooch3
合成步骤为 O)酯化
在50mL烧瓶中加入对羟基苯丙酸3.5g和甲醇14mL，对羟基苯丙酸与甲醇 的质量/体积比为1 : 4，和加lmL浓硫酸，120'C加热回流2h，之后先蒸出5mL 的甲醇，加入碳酸钠饱和溶液直到无气体产生；然后用二氯甲烷萃取，萃取液 经35'C旋转蒸发除去溶剂，再真空干燥得的红棕色油状物对羟基苯丙酸甲酯， 纯度达99%以上。 (2)酰化
在50mL的圆底烧瓶中加入10 15mL乙腈作溶剂，加入第一步产物对羟基 苯丙酸甲酯和二甲氧基磷酰氯，两者为等摩尔配比，对羟基苯丙酸甲酯lOmmol、 二甲氧基磷酰氯10mmo1、 2.5g碳酸钾，常温下磁力搅拌2h，反应过程中不断用 薄层层析监测反应进度，直到酰氯完全反应；然后静置一段时间，上层液体再 经0.5pm的滤膜过滤得澄清液体，旋转蒸发将溶剂除去后得黄色油状物，再经 硅胶柱色谱分离得到目标产物二甲氧基磷酸酯，纯度大于90%;
分离过程
①展开剂的选择取一块2cmx5cm大小的硅胶板，在距硅胶板下边缘0.8cm 处用铅笔作一水平线。将样品溶于甲醇配成1%左右的溶液，用内径lmm管口 平齐的毛细管点样，垂直轻轻地点在起始线上，吹干。然后将薄板放入层析液 中层析，层析液是石油醚/乙酸乙酯=7 : 3(v/v)，当溶剂前沿距薄板上边缘0.8cm
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时将板取出，吹干。将薄板放入紫外分析仪中观察，可发现板上有两个点，其
中上方的点为过量的对羟基苯丙酸甲酯Rf=0.647、下方的点为目标物其 Rf=0.162。
② 装柱将2cmx30cm的空柱洗净干燥，垂直固定在铁架上，在柱底铺一 层脱脂棉，再在上面覆盖一层厚0.5 lcm的石英砂。按湿法装柱装入约2/3高 度的硅胶，再在上方盖一层0.5 lcm的石英砂。
③ 加样及洗脱将配成适当浓度的样品沿管壁加入色谱柱，并用少量溶剂 洗涤柱壁上所沾的样品。加样完毕后，首先用石油醚/乙酸乙酯=7 : 3 (v/v)的 洗脱液进行洗脱，收集过程中通过在硅胶板上不断的点样来确定分离组分的流 出。当过量的对羟基苯丙酸甲酯全部被洗脱下来之后，换用乙酸乙酯进行洗脱， 并收集目标产物。
(3)水解
在20mL的乙醇溶液中加入lmmol纯化后的第二步产物二甲氧基磷酸酯， 然后加入7mLlM的氢氧化钾，室温下搅拌45min，然后用1M的盐酸酸化，再 用乙酸乙酯来萃取，萃取液经旋转蒸发除去溶剂得浅黄色油状物，再经硅胶柱 色谱分离，得到最终目标产物0， O-二甲基-O- (4-丙酸基苯基)磷酸酯，纯度 大于97%。
分析经LC-MS分析得到的产物不纯，含有一种主要杂质。需要过硅胶柱 进行分离。
分离过程
1. 分离条件选择取一块2cmx5cm大小的硅胶板，在距硅胶板下边缘0.8cm 处用铅笔作一水平线。将所得样品溶于甲醇配成1%左右的溶液，用内径lmm 管口平齐的毛细管点样，垂直轻轻地点在起始线上，吹干。然后将薄板放入层 析液中层析，层析液是氯仿/乙酸乙酯/乙酸=65 : 35 : 1 (v/v/v)，当溶剂前沿距 薄板上边缘0.8cm时将板取出，吹干。将薄板放入紫外分析仪中观察，可发现 板上有两个点，其中上方的点RfN).428、下方的点R—0.328。
2. 装柱同上(略)。
3. 加样及洗脱将配成适当浓度的样品沿管壁加入色谱柱，并用少量溶剂洗 涤柱壁上所沾的样品。加样完毕后，用氯仿/乙酸乙酯/乙酸=65 : 35 : 1 (v/v/v) 的洗脱液进行洗脱，收集过程中通过不断的点样确定分离组分的流出，将两种 物质分离开来，并收集。
经LC-MS测试，确定下方的点Rf=0.328为要合成的目标物0， O-二甲基-O-(4-丙酸基苯基)磷酸酯。
本发明的有益效果该物质与蛋白偶联之后可以作为此类农药酶联免疫检 测过程中的包被抗原，因为此结构中含有苯环，利用包被抗原与免疫原结构上
的差异来进一步提高检测灵敏度，降低检测限。
图l O， O-二甲基-O- (4-丙酸基苯基)磷酸酯的液相色谱图。 图2 O， O-二甲基-O- (4-丙酸基苯基)磷酸酯的质谱图。
具体实施例方式
(1) 酯化
在50mL烧瓶中加入对羟基苯丙酸3.5g (21mmo1 )、 14mL甲醇和lmL浓 硫酸，12(TC加热回流2h。之后先蒸出5mL左右的甲醇，加入碳酸钠饱和溶液 直到无气体产生。然后用二氯甲烷萃取，萃取液经35'C旋转蒸发除去溶剂，再 真空干燥得的红棕色油状物，此产物纯度达99°/。以上。
(2) 酰化
在50mL的圆底烧瓶中加入10 15mL乙腈作溶剂，加入第一步产物对羟基 苯丙酸甲酯1.9280g (10mmoL)、 二甲氧基磷酰氯10mmoL、 2.5g碳酸钾，常温 下磁力搅拌大约2h，反应过程中不断用TLC监测反应进度，直到酰氯完全反应。 然后静置一段时间，上层液体再经0.5pm的滤膜过滤得澄清液体。将溶剂旋转 蒸发掉后得黄色油状物。
分离纯化将2cmx30cm的空柱洗净干燥，垂直固定在铁架上，在柱底铺 一层脱脂棉，再在上面覆盖一层厚0.5 lcm的石英砂。按湿法装柱装入约2/3 高度的硅胶，再在上方盖一层0.5 lcm的石英砂。将配成适当浓度的样品，沿 管壁加入色谱柱，并用少量溶剂洗涤柱壁上所沾的样品。加样完毕后，首先用 石油醚/乙酸乙酯=7 : 3 (v/v)的洗脱液进行洗脱，收集过程中通过不断的点样 确定分离组分的流出。当过量的对羟基苯丙酸甲酯全部被洗脱下来之后，换用 乙酸乙酯进行洗脱，并收集目标产物。
(3) 水解
在20mL的乙醇溶液中加入0.288g (lmmoL)纯化后的第二步产物，然后 加入7mLlM的氢氧化钾，室温下搅拌45min，然后用1M的盐酸酸化，再用乙 酸乙酯来萃取，萃取液经旋转蒸发除去溶剂得浅黄色油状物。
分离纯化湿法装柱之后，加样、用氯仿/乙酸乙酯/乙酸=65 : 35 : 1 (v/v/v) 的洗脱液进行洗脱，收集目标组分物。
权利要求
1、一种二甲氧基磷酸酯类农药通用半抗原的合成方法，其特征是合成过程分酯化、酰化、水解三个步骤，首先将对羟基苯丙酸与甲醇发生酯化反应，使羧基甲酯化；然后所得的对羟基苯丙酸甲酯再与二甲氧基磷酰氯反应，得到二甲氧基磷酸酯；最后是将第一步酯化形成的甲酯再水解，将羧基还原出来得O，O-二甲基-O-(4-丙酸基苯基)磷酸酯；此磷酸酯与卵清蛋白偶联，作为二甲氧基磷酸酯类农药多残留ELISA分析的包被抗原；合成步骤为(1)酯化在50mL烧瓶中加入对羟基苯丙酸3.5g和甲醇14mL，对羟基苯丙酸与甲醇的质量/体积比为1∶4，和加1mL浓硫酸，120℃加热回流2h，之后先蒸出5mL的甲醇，加入碳酸钠饱和溶液直到无气体产生；然后用二氯甲烷萃取，萃取液经35℃旋转蒸发除去溶剂，再真空干燥得的红棕色油状物对羟基苯丙酸甲酯，纯度达99％以上；(2)酰化在50mL的圆底烧瓶中加入10～15mL乙腈作溶剂，加入第一步产物对羟基苯丙酸甲酯和二甲氧基磷酰氯，两者为等摩尔配比，对羟基苯丙酸甲酯10mmol、二甲氧基磷酰氯10mmol、2.5g碳酸钾，常温下磁力搅拌2h，反应过程中不断用薄层层析监测反应进度，直到酰氯完全反应；然后静置一段时间，上层液体再经0.5μm的滤膜过滤得澄清液体，旋转蒸发将溶剂除去后得黄色油状物，再经硅胶柱色谱分离得到目标产物二甲氧基磷酸酯，纯度大于90％；(3)水解在20mL的乙醇溶液中加入1mmol纯化后的第二步产物二甲氧基磷酸酯，然后加入7mL 1M的氢氧化钾，室温下搅拌45min，然后用1M的盐酸酸化，再用乙酸乙酯来萃取，萃取液经旋转蒸发除去溶剂得浅黄色油状物，再经硅胶柱色谱分离，得到最终目标产物O，O-二甲基-O-(4-丙酸基苯基)磷酸酯，纯度大干97％。
全文摘要
一种二甲氧基磷酸酯类农药通用半抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。本发明的合成过程分酯化、酰化、水解三个步骤，首先将对羟基苯丙酸与甲醇发生酯化反应，使羧基甲酯化；然后所得的对羟基苯丙酸甲酯再与二甲氧基磷酰氯反应，得到二甲氧基磷酸酯；最后是将第一步酯化形成的甲酯再水解，将羧基还原出来得O，O-二甲基-O-(4-丙酸基苯基)磷酸酯；此磷酸酯与卵清蛋白偶联，作为二甲氧基磷酸酯类农药多残留ELISA分析的包被抗原。该物质与蛋白偶联之后作为此类农药酶联免疫检测过程中的包被抗原，因为此结构中含有苯环，利用包被抗原与免疫原结构上的差异来进一步提高检测灵敏度，降低检测限。
文档编号C07F9/12GK101172984SQ200710134520
公开日2008年5月7日 申请日期2007年10月31日 优先权日2007年10月31日
发明者尹丽梅, 彭池方, 李雅丽, 昉 秦, 胥传来, 媛 袁, 伟 陈, 陶冠军 申请人:江南大学