专利名称：人促红细胞生成素的纯化工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质纯化领域。更具体地，本发明提供了一种高效生产重组人促 红细胞生成素(rhEP0)的纯化方法。
背景技术：
促红细胞生成素(erythropoietin,简称EP0)最早于1906年被发现。EP0属唾液 糖蛋白激素，为人体内源性化合物，相对分子质量为34， 000道尔顿，由165个氮基酸 组成。它主要来源于肾脏(少量来源于肝脏)，由皮质管周围的间质细胞合成。由基 因重组技术合成的rhEP0相对分子质量为30， 400道尔顿，其理化性质和生物学活性 与天然内源性红细胞生成素相同。其不同点是基因位点在7号染色体为糖蛋白。EP0 的生理作用是通过它与幼红细胞集落形成单位(CFu-E)或其早幼阶段的红细胞系爆 裂形成单位(BFu-E)的受体结合，并促进其向红细胞前体(网织红细胞)和原红细胞 分化，最后生成红细胞(RBC)。当人的肾功能发生严重损害时，如在急慢性肾衰竭或 肾切除的情况下，EPO的产生减少，出现贫血。因此EPO对绝大多数肾性贫血患者均有 很好的疗效。在基因重组技术诞生之前，EPO主要从贫血患者的尿和绵羊血中提取， 提取率非常低，且极不稳定，理化和生物性质难以测定，亦无法大规模应用。1985年 人EPO基因克隆和表达的成功，使rhEPO的制备成为现实。1989年美国FDA己批准 rhEPO的临床试用，日本，法国等也批准其上市，主要用于肾透析贫血患者的治疗。大 量的临床试验证明，rhEPO不仅对肾性贫血疗效好，对非肾性贫血也有良好的治疗前 景，是抗贫血药物研究中的重大进展。人红细胞生成素(hEP0)是健康人的肾分泌的，能够促进红细胞生成的细胞生 长因子，临床用于治疗肾衰竭、贫血，与抗艾滋病药物叠氮胸苷合用可以治疗艾 滋病、改善癌症引起的贫血，还可用于预防手术中的失血，具有促进自身输血作 用。 '本发明经过大量的优化后，获得了高纯度的重组人促红细胞生成素(rhEP0) 的纯化方法。通过该方法，每升发酵罐培养液可获得4.9X105IU以上、纯度大于95 %重组人促红细胞生成素
发明内容
本发明的目的就是提供一种高效和/或简便的纯化重组人促红细胞生成素的方法。在本发明的第一方面，提供了一种重组人促红细胞生成素纯化方法，该方法包 括步骤' i) 根据重组人促红细胞生成素的发酵表达形式，采取合适的方式获得含有重组人促红细胞生成素的液体； ii)对发酵上清进行层析纯化，所述的层析选自阴离于交换层析、 反相层析、凝胶过滤层析及其组合。通过以上方法，可以获得纯度大于95%、得率在20%以上的重组人促红细胞生成 素纯品。在本发明的一优选例中，含有重组人促红细胞生成素的液体经阴离子交换层析 (DEAE S印harose F. F)、反相层析(RPC30)、凝胶过滤层析(S200)得到纯度大于 95%、活性得率在20%以上的纯品。
无。
具体实施方式
本发明人通过深入而广泛的研究，通过对EPO蛋白理化性质的分析，纯化工艺 条件的摸索，从而实现了人EPO的高效纯化工艺。在此基础上完成了本发明。对表达的重组人促红细胞生成素蛋白进行分离纯化。通常，如果表达的重组人 促红细胞生成素蛋白在发酵上清，则发酵液先离心或过滤获得细胞上清；如果表达 的重组人促红细胞生成素蛋白在发酵菌体内，则发酵液先离心或过滤获得细胞，然 后细胞破碎获得含有重组人促红细胞生成素蛋白的液体。将含有重组人促红细胞生成素蛋白的液体依次经阴离子交换层析(DEAE S印harose F. F)、反相层析(RPC30)、凝胶过滤层析(S200)，可以获得高纯度的重 组人促红细胞生成素蛋白。由于本发明的重组人促红细胞生成素的表达存在于发酵上清，所以，发酵液通 过离心，获得发酵上清，含有重组人促红细胞生成素。在本发明的一个实例中，发酵上清经一系列纯化步骤后可得到纯品得率95%以 上，活性为4.9Xl()5lU/L。中试研究表明，产品制造工艺稳定，操作简单，周期短，成本低，每升细胞上 清可获得重组人促红细胞生成素纯品4.9X10511]，适合产业化生产。本发明的优点在于1) 确定了较佳的工艺路线，纯化工艺流程简单；2) 能得到高纯度高活性的重组人促红细胞生成素蛋白，每升发酵罐培养液可 获得活性在4.9X105lU以上、纯度大于95%重组人促红细胞生成素。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常 按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1重组人促红细胞生成素DEAE反穿纯化柱子规格5.5X9.0cm， 220mL平衡10mMTris-HCl+lMNaCl，pH7.010mM Tris-HCl+75mM NaCl, pH7.0上样上样洗脱lOmMTris-HCl+lMNaCl, pH7.0洗脱结合在柱上的杂质b实施例2重组人促红细胞生成素DEAE正挂纯化 柱子规格5.5X9.0cm， 220mL平衡10mM Tris-HCl， pH6.0+100mM NaCl 10mM Tris-HCl, pH6.0+25mM N'aCl 上样上样洗脱用10mMTris-HCl,pH6.0+100mMNaCl洗脱，收集目的蛋白。实施例3重组人促红细胞生成素Resource30RPC层析纯化 柱子规格1.6X7.5cm， 15mL平衡10mM Tris-HCl ,pH7.0平衡上样上样(总蛋量不超过225mg)清洗用10mM Tris-HCl ，pH7.0清洗洗脱梯度洗脱0—100%无水酒精，收集目的蛋白，峰下降至约50mAU时结束收集。实施例4重组人促红细胞生成素S200层析纯化 柱子规格2.6X100cm， 500ml;平衡20mM的拧檬酸缓冲液(pH7.0) +100mMNaCl平衡上样将Source30 RPC洗脱峰上样，上样量小于25ml，上样完后用20mM的柠檬酸 缓冲液(pH7.0)洗脱，收集蛋白峰。
权利要求
1.重组人促红细胞生成素的纯化方法，其特征在于，该方法包括步骤a.根据重组人促红细胞生成素的发酵表达形式，采取合适的方式获得含有重组人促红细胞生成素的液体；b.对该液体进行层析纯化，所述的层析选自阴离子交换层析、反相层析、凝胶过滤层析及其组合。
2. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，步骤(a)所示的发酵表达形式可以是分 泌表达或者胞内表达。
3. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，步骤(a)所示的合适的方式有离心，过滤和机械破碎。
4. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，步骤(b)所示的层析为阴离子交换层析、 反相层析、凝胶过滤层析及其组合。
全文摘要
本发明提供了一种重组人促红细胞生成素(rhEPO)的纯化方法，经过了一系列的工艺优化，得到了较佳的工艺路线，使纯化工艺流程简单，能得到高纯度高活性的重组人促红细胞生成素蛋白，每升培养液可获得4.9×10<sup>5</sup>IU以上、纯度大于95％重组人促红细胞生成素。
文档编号C07K14/435GK101153058SQ20071016296
公开日2008年4月2日 申请日期2007年9月28日 优先权日2006年9月29日
发明者军 任, 凯 周, 郭学彦, 黄阳滨 申请人:上海新生源医药研究有限公司