专利名称：：一种与抗砷相关蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一种与抗砷相关的蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
：砷自被发现以来就以其毒性而闻名。砷是环境常见污染物之一，砷可能通过抑制DNA修复并发突变(Lieta7.，1989)，并且可以诱导姊妹单体交换(JhaefW.，1992)、基因扩增(RossmanandWolosin，1992)、非整倍性(Gurreta厶1993)和染色体畸变(Jha"W.，1992)。砷在水生生物中易富集，使得水产品中的砷含量往往比陆生动植物高几倍到几十倍，人等动物若摄入过多的砷则会引起癌变，因此，人们越来越关注砷对水产养殖产品的安全性问题，水产品国际贸易往来中对砷的检测要求也越来越高。砷中毒对动物和人类的毒性危害已受到广泛关注，但其中作用机理仍不十分清楚，尤其对鱼类毒性机制更是处于非常薄弱的环节。随着分子生物学和基因工程技术的迅猛发展，鼠和人体分离到一些抗砷基因片段，还很难进行砷抗性综合性分析，抗(耐)砷机制的研究逐步深化(RomachWa7，2000)。在生物进化的过程中，许多生物产生了抗(耐)砷的生理机制。水环境中生活的鱼类体内很容易富集砷，它们只有产生应答砷毒的抗性机能，才能不被环境淘汰。而鲇鱼生活在水体底部，各类有害物质的综合富集量一般高于其它水生生物，具有掠食性特征的鲇鱼应该只有进化出比其它鱼类抗(耐)砷毒能力更强的应答机制才能够很好的生存和繁衍，因此鲇鱼可能具有比其他植食性和杂食性鱼类更强的抗(耐)砷能力。但是砷对鲇鱼的毒作用机理与抗(耐)砷基因的研究未见报道，因此加强该方面的研究工作具有理论意义和实际意义。
发明内容本发明的目的是提供一种蛋白，该蛋白的表达能增加鱼类的抗砷能力。本发明所提供的蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与抗重金属相关的由(a)衍生的蛋白质。本发明的另一个目的是提供一种编码上述蛋白的基因。本发明所提供的编码上述蛋白的基因为如下l)或2)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与l)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子。本发明的另一个目的是提供一种含有上述任一种基因的重组表达载体。所述重组表达载体具体为在表达载体pGEX-4T-1的Aco^/和5"W/位点间插入序列表中序列1所示的核苷酸序列得到的重组表达载体pGEX-^WA5;所述重组表达载体还可为在表达载体pCMVnramp的fcoy/和5"a7/酶切位点间插入序列表中序列1所示的核苷酸序列得到的重组表达载体pCMVnramp-5^7A5"。含有上述任一种基因的转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。本发明的另一个目的是提供一种培育抗重金属鱼的方法。本发明所提供的培育抗重金属鱼的方法,是将上述任一种重组表达载体导入鱼的受精卵细胞中，培养得到抗重金属鱼。其中，重金属可为砷、镉等。鱼具体可为鲇鱼。实验结果表明转入重组表达载体pCMVnra卿-57^I5"鲇鱼与转入空载体pCMVnra即鲇鱼相比，其肌肉和肝脏代谢砷的能力显著增强，脑和鳃代谢砷的能力增强更显著。因此本发明的抗砷相关蛋白及其编码基因，以及培育抗砷鱼的方法将对改善水生生物抗砷等其它重金属的表现特征方面具有重要意义，在鱼的育种中有巨大的应用前景。图1为鲇鱼^TA5"基因在大肠杆菌中的体外表达鉴定。图2力57W5"基因在鲇鱼基因组中的拷贝数分析。图3为鲇鱼5YW5"基因在砷胁迫条件下的表达特征。图4转入重组表达载体pC匿nramp-57W5"鲇鱼与转入空载体pCMVnramp鲇鱼各组织中砷含量测定结果。图5为在砷胁迫下的转入重组表达载体pCMVnramp-A7AS"鲇鱼和转入空载体pCMVnramp鲇鱼表型。具体实施例方式实施例l、兰州鲇(577wiAs7朋z力owe/2^;9)cDNA文库的构建、SiRAS基因cDNA克隆及序列分析以0.lmg/LNaAs(U秀导兰州鲇(577"/t/s7朋z力o"e/sA)幼苗15天，采用SuperscriptPlasmidSystemwithGatewayTechnologyforcDNASynthesisandCloning(Invitrogen)构建鱼占鱼cDNA文库，按照InvitrogenLifeTechnologiesInstructionManual操作。首先禾偶RNAgentsTotalRNAIsolationSystem(Promega)提取鲇鱼幼苗总RNA，利用PolyATtractmRNAIsolationSystems(Promega)分离出mRNA，然后在含有/位点的Oligo(dT)锚定引物作为反转录引物合成cDNA第一链以及cDNA第二链，在cDNA第一链末端连接&7/接头，然后定向插入载体中，插入DNA片段大于1Kb。鲇鱼幼苗cDNA文库的库容为1X106个克隆，重组率达97%，构建成鲇鱼cDNA文库。以鼠ars2cDNA(源于#^/jwascw7m,注册号为BC066831)为探针筛选了2.5乂105未扩增斑得到2个阳性斑，其插入片段为2718bp，具有完整的阅读框(其核苷酸序列如序列表中序列1所示)，编码由906个氨基酸残基组成的多肽(其氨基酸序列如序列表中序列2所示)。实施例2、SiRAS基因在大场杆菌中的体外表达鉴定(一)SiRAS基因的获得提取实施例1中用0.lmg/LNaAs(U秀导兰州鲇(67hrws〗朋z力owe7幻's)幼苗的总RNA，反转录得到cDNA。设计扩增SiRAS基因的引物，并使引物含有限制性内切酶^o;/和5^/的识别位点，设计的引物序列如下(5YjA5^F):5，—ACAAGAATTCGAGTTCCTICTGTCTCTG—3，，(57錯一R)5，-AAC牟TCGA争TCTCAGGCAIAGITGG-3，。以上述反转录得到的cDNA为模板，用上述设计的引物进行PCR扩增，对该PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果得到2700bp左右的DNA片段，回收纯化PCR产物，对该PCR产物进行测序，测序结果表明，得到的PCR产物具有序列表序列1的核苷酸序列。该核苷酸序列编码序列表中序列2的SiRAS蛋白。(二)SiRAS基因在大肠杆菌中表达用限制性内切酶fc^/和5^7/双酶切纯化后的PCR产物，并将酶切产物进行纯化；同样，用限制性内切酶^^/和5^/酶切pGEX-4T-l质粒(Promega)，获得线状载体片段；通过T4DNA连接酶将酶切后的PCR产物及线状载体进行连接，得到含有SiRAS基因的重组表达载体pGEX-57/AS";经鉴定，pGEX-57tA在fco^/禾卩&7/位点插入了SiRAS基因(序列表序列l)。将重组表达载体pGEX-^724S"转化至大肠杆菌(￡sc/eWch'acoh')XL1-Blue菌株，筛选转入重组表达载体pGEX-^TA5"的阳性重组体，在重组体中，目的SiRAS基因整合到GST末端，表达产物与GST形成融合蛋白。IPTG诱导蛋白在大肠杆菌中表达，用SDS-PAGE检测蛋白表达情况。结果表明该基因能够在大肠杆菌中进行体外翻译表达(图1)。泳道1为Marker;泳道2为经IPTG诱导，未转入&7AS"基因的pGEX-4T-1质粒中GST基因在大肠杆菌中表达；泳道3为经IPTG诱导，重组表达载体pGEX-57W6"中融合蛋白在大肠杆菌中表达；泳道4为未诱导的pGEX-57yAS"在大肠杆菌中没有蛋白条带出现。实施例3、5YyAS"基因在鲇鱼基因组中的拷贝数分析利用CTAB法提取鲇鱼基因组DNA，通过0.8%琼脂糖凝胶检测提取的鲇鱼基因组DNA，选择完整、纯的基因组DNA样品。利用经同位素ct-32p标记的&7A5"cDNA编码区为探针，与经三种限制性内切酶(HindIII、Sall、Xhol)消化的20pg鲇鱼基因组DNA，通过毛细管作用被原封不动地转移到尼龙膜(Nylon+)上，进行Southern杂交分析，并经过高严谨度洗膜(高严谨度的条件是0.5XSSC，0.1XSDS，65°C)。结果如图2所示通过HindIII、Sall、XhoI3种酶消化，产生了清晰的杂交带。在5^7必cDNA中没有发现HindIII、SalI、XhoI酶切位点，说明577A5"在鲇鱼基因组DNA是以单拷贝数存在。实施例4、鲇鱼SiRAS基因在砷胁迫条件下的表达特征提取经O.lmg/LNaAs(U秀导的鲇鱼幼苗不同组织中的总RNA，取相同质量(20yg)的各样品在变性1.2%琼脂糖凝胶中分离，将RNA分别转移至带正电荷的尼龙膜上(Nylon+)，利用经同位素a-32P标记的5"j7AS"cDNA编码区为探针(Takaralabelinganddetectionkit,TakaraBioTech(dalian)Co.Ltd)，提取的总RNA与ATPAScDNA探针进行Northern杂交分析。结果如图3所示，其中脑、心脏、肾、肝脏、鳃、骨骼肌肉都有表达，但在不同组织中5^7S^mRNA累积量不同。^TA5"基因在肾中转录水平高，脑、肝脏、鳃转录水平低于肾。^VA9基因在骨骼肌肉中只能检测到痕量转录水平。实施例5、培育抗砷转基因鲇鱼的方法(一)重组表达载体的构建将pCMVnra卿质粒表达载体(Promega)用限制性内切酶&^/和5"a7/进行酶切；以实施例2中构建的重组表达载体pGEX-^'7AS为模板，以(TF):5'-ACCAGAATTCATGGGTGACAGTGATGATGA-3，(TR)5'-AACAJGTCGAC^TCCACATCATCAGGTGCGT-3、为引物进行扩增，得到57W堪因，并用Aco//和5"37/限制性内切酶酶切A7A5基因；将酶切后的577AS基因插入到表达载体pCMVnra即的^bo7/和5^/酶切位点，得到重组表达载体pCMVnramp-&7AS"。(二)培育转基因鱼苗采用显微注射法进行鲇鱼转化。兰州鲇(677w27/s^3/7Wowe/7w\s0亲鱼来自宁夏水产研究所繁殖实验基地，肌肉注射激素，用LHRH-A人工催产。采集高质量成熟卵子和精子，干法受精获得大量鲇鱼受精卵，加水激活后取上层优质浮卵于10-14'C条件下培养，取l-2细胞期的胚胎用于显微注射。显微注射DNA溶液的配置用限制性内切酶&7/将重组表达载体pCMVnramp-5YMS"线性化，并将其溶解于Tris-HC1(pH:7.6)溶液中，使其终浓度为100ng/叱，再将其用0.02Wn滤器过滤除菌，得到的溶液即为显微注射DNA溶液。采用Nikon公司的拉针仪和磨针仪，制成针尖约为4-9Mm注射针，针尖要求尖锐，能够刺穿受精卵膜，并用Nikon公司的显微注射仪将转基因表达载体射入鱼单细胞期受精卵动物极细胞质内。每卵注射50pL上述显微注射DNA溶液(浓度为50ng/wL)。筛选出产生绿色荧光的转基因胚胎，检测&7A5基因在体内的整合和表达，证实SiRAS基因能够在兰州鲇胚胎内超表达。将显微注射受精卵置于培养皿中，用Danieau，s液培养(1.74mol/LNaCl，21腦1/LKC1，12mmol/LMgS04，18,1/LCaCl2,150mmol/LHEPES，pH:7.6)，每5小时换培养液。孵化后转入无菌的暴气自来水中培养。得到转入重组表达载体pCMVnramp-^7^5的仔鱼，仔鱼孵化3天后开始饲喂。按照上述方法，将空载体pCMVnra即用限制性内切酶5"W/线性化后，转入鱼中，培育得到转入空载体pCMVnramp的仔鱼，作为对照。(三)转入重组表达载体pCMVnramp-&72^鲇鱼的砷代谢特征检测取转入重组表达载体pCMVnramp-5"i/AS"的鲇鱼苗和转入空载体pCMVnramp的鲇鱼苗，其体长均5cm，体重均45g。饵料为水蚯蚓。饲养鱼苗采用过滤自来水，水质参数为pH:7.3±0.27，碱度186.65±22.4mg/L，Cr<13mg/L，K+、Na+〈24.3mg/L，Ca2+〈29.5mg/L，P〈0.01mg/L，H2S、Hg、As未检出。水温2226。C。实验用水族箱规格为200cmX100cmX75cm，整体并联lkw罗磁鼓风机增氧设备一套。每一水族箱配置日生外置式CY-165水质过滤器一台。实验前14d，将鱼苗投放到水族箱以适应环境。取4只水族箱，分别加入1200L水，再分别加入NaAs02至终浓度为1.288mg/L。向其中的2只水族箱分别放入50尾上述转入重组表达载体口0^^虹31^-&7^5"的鱼苗，另外2只水族箱分别放入50尾上述转入空载体pCMVnramp的鱼苗。每24h换一次含有1.288mg/LNaAs02的水。培养21天以后，撤离NaAs02，改用无NaAs02的无菌清水饲养。其中，在培养第4d、7d、14d、21d、28d、35d和42d分别各采集5尾转入重组表达载体pCMVnramp-5Y7AS和转入空载体pCMVnramp的鱼的脑、鳃、肝脏、肌肉，进行砷含量测定。砷含量测定分别称取上述组织样品0.5000g置于高压消解罐中，加入7mL浓HN03和lmL浓HC104，在微波消解系统中消解。温度下降后，样品用灭菌去离子水转移至100mL烧杯，置电热板上，170。C赶酸至消解液剩约lmL，冷却后，用5%盐酸转移至25mL比色管中，加入5%抗坏血酸和5%硫脲各5mL，用5%盐酸定容至25mL，混匀，放置30min后上机测定。仪器测定条件还原试剂1%NaBH4溶液+0.3y。NaOH溶液；载流2%盐酸；载气Ar(99.99%)，流量0.4L/min;屏蔽气Ar(99.99%)，流量0.8L/min;负高压260V;灯电流50mA;原子化器高度12mm。输入参数样品质量(g)、稀释体积(mL)、位置号、样品空白，并选择mg/kg浓度单位，逐步将炉温升至所需温度，稳定后测量，连续用标准空白进样，待读数稳定后，在转入试样测量之前，先进行试剂空白消化液进样，空白测定，仪器自动扣除空白值。测定样品。样品中砷含量按下式计算X=(d-C。)V/1000m(其中X—试样中砷的含量(mg/kg)，d—试样消化液测定浓度(ng/mL)，C。一试剂空白液测定浓度(ng/mL)，V—试样消化液的总体积(mL)，m—试样质量(g)。)两种鱼中不同组织的含砷量结果见表1。表l相同浓度的各待测样品在相同条件下测得的含砷量(mg/kg)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>结果表明被NaAs02染毒的转入重组表达载体pCMVnramp-6"iWS的鲇鱼和转入空载体pCMVnramp的鲇鱼的脑、鳃、肝脏、肌肉都表现为对砷有富集，分布规律是鳃>肌肉>脑>肝脏(图4)。转入重组表达载体pCMVnramp-67yAS"鲇鱼与转入空载体pCMVnramp鲇鱼相比，其肌肉和肝脏代谢砷的能力显著增强，脑和鳃代谢砷的能力增强更显著(图4，其中a为转入重组表达载体pCMVnramp-^z7AS"鱼的脑、鳃、肝脏、肌肉砷含量，b为转入载体pCMVnramp鱼的脑、鳃、肝脏、肌肉砷含量)。转入重组表达载体pC匿nramp-5YW6"鲇鱼各组织的抗砷次序为肝脏〉脑〉肌肉〉鳃。在砷胁迫下的转基因鲇鱼和未转基因鲇鱼见图5。厅夕u衣<160〉2<210>1<211>2718<212>DNA<213〉鲇属兰州鲇(5^7wr〃s7朋z力o〃朋w-s)<400>18tgggtgElC3gtgatgstg3gtacgatcggCggCgC3gggataagttccggcggg卿gg60agtgactacgatcggtcacgagagcgagaagaccggcgcagagacgactggsgcgatcgg120cggccgtcggcacggg犯tggg織gcggg3ggg3g3ggCggagtcgtggagagtaccgt180gagtacg卿gaggacggagagagagattctC3CC3CCCCga_c3cga_ca_tgagcccacag240cagaaacgcatg鄉鄉g3ctgggatgatC3tggaggagacccgtatcatggaggttat300gatttgggtt3tggtgg3ggtggtggaggtggaggacccagttatgcaccccctcagccc360tggggtcaccctgatatccatctcatgcagccacaccatgctatccccatccaggccagg420ttgggg犯gatccatgacctgaatctgggtCCtCCCCC3Ccggtgatgaagacctttaaa■gagttcctgctgtctctggatgactccgtggatg卿ccga_a_tctgtcaa_acgctacaac540gagtataagattgacttcag3cggcagcagatgcaggactcgctccataaaggagaagag600tggttccgctctaaatatcaccctgatgagtcggggaaaccggaaggccgacgcccacgc660cgctctgcag33CCgCtg犯cgcgttccagtacttaatggagaacagctggttcgataac720atcaccatggacatcgaccgtgcaccacag8tCCtg3gg3tcctcgacgctgcggtaata780aagatgg鄉gaggggccgagtacgatctgcgcatcctcgagcagcccattg3ggatgag840gatg卿g观agagaccgacgCCCgg3gg3ccgccgtctgacgtgacgag■acc卿ggsgCCg3g3tCgElgcgc犯3gtgtctgtca^geiaggatgtcaaggaggg卿g960actggagatgttggsgtaB61a_g3tgcaga_tgctgaagcaggaagtg肌3g3gaca^cct1020gataatgaagctccacctgaggagatatcgg3gccg犯geiagatgagtaagaag￡igga_ag1080agggiagcax:61gcggtgacagtgaggatgaggcgagcgcctcagagagcgagtcagactcc1140gactccgactcgaactctcactcctcagaga^accc3cgga_gagacagaggg鄉cggag1200ggag肌gg昭atatggaggg卿aggggatggtggEt肌tga卿agg,卿gaaggag1260gatga卿ggaag叫gagggtga卿tgtg卿ggg卿aagga卿gaagc鄉gtgag1320邓gg卿aagg肌ga^3gteieiaggatgatcagcctcctaaacctcggccg1380ctccacatgacgtgctccctgtttatgaggagcatcgctccgaccatctctaaagcagag1440atcgtggctctgtgtcgtcgttttcctggattcatgcgtgtatgtttgtctgaaccacaa1500ccggagcgcaggttcttcaggcgatgctgggtgacctttgaccgaggtgtcaacatcaaa1560gagatctgctggaacctacactgcgtgactgtgagttagctcccggagtg1620aatcgagatttagcgcggcgtgtgaga33cgtt33CggC3tcacgcagca1680ctt3gaascgacatcaaactgtccgctaaactcatacacgcgctggacgagagggagggg1740ctgtggggtc3CCg3g3CgCacacactgctgagcttccagctcagaaccccattctcaaa1800aacatcacagattacctcattgaggaagtaagtgctgagg3gg鄉8gCtactgggaaat丄加ugtgggcggggttgacttggagg3Cggg認aaagaaggcaatccceictgagatcaccgtg1920gag卿geicgagaaacttgtc犯ggtgttggatcgtctgttgttctacctgcg犯ttgtt1980cattctattgattattataaceitgtgtgaatacacgagtgaggatgagatgcccaaccgc2040tgtgggatcatccatgtccgcggacccattccaccgaaccgcatcacacacagggaggta2100agtgactgggagaagacgttctcggccccttgttcagcgtgaaggaaacc2160ctgtctgaggaggaagccattaaaatgggtcggaaagatccggaacaggaagtgg卿ag2220tttgtgtctgcgei3C3cgc3ggagctcggga^ggsca^gtggctgtgtcctctcagtggg2280aagaagttcaagggtccggagtttgtg肌gaaacacatcctgaacaaacatggagataaa23403tcg邓gaggtg￡iaga_aggaagtagagttcttcsacaacttcctgatggatgccaaaaga2400ccatctatccctgagataaagcccctccctcctccaggccccacccctggtgtgatgtct2460cctggtggtcctccattccaccctcagggtcctcaggtcttgctggg8tttgggcagccc2520agacctccagtg3tggg3t3tggaggtcctccatatcctcctaaccagtatggtggagga2580aa呵gggg3tttccgtggtcagggtggttatcctgcaaaacccagaaac2640aaccggatgatgcgcggtgatcctcgtaacatcatcgagtatcgtgacctggacgcacct2700gatgatgtggatttcttt2718<210〉2<211>906<212〉PRT〈213〉鲇属兰州鲇(&7wr〃s7a/2z力o〃e/2W's)〈400>2MetGlyAspSerAspAspGluTyrAspArgArgArgArgAspLysPhe151015ArgArgGluArgSerAspTyrAspArgSerArgGluArgGluAspArg202530ArgArgAspAspTrpSerAspArgArgProSerAlaArgGluTrpAsp354045ArgGlyArgGluArgArgSerArgGlyGluTyrArgGluTyrGluArg505560GlyArgArgGluArgPheSerProProArgHisAspMetSerProGin65707580GinLysArgMetArgArgAspTrpAspAspHisGlyGlyAspProTyr859095HisGlyGlyTyrAspLeuGlyTyrGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGly100105110ProSerTyrAlaProProGinProTrpGlyHisProAsplieHisLeu115120125MetGinProHisHisAlalieProlieGinAlaArgLeuGlyLyslie130135140HisAspLeuAsnLeuGlyProProProProValMetLysThrPheLys145150155160GluPheLeuLeuSerLeuAspAspSerValAspGluThrGluSerVal165170175LysArgTyrAsnGluTyrLyslieAspPheArgArgGinGinMetGin180185190AspSerLeuHisLysGlyGluGluTrpPheArgSerLysTyrHisPro195200205AspGluSerGlyLysProGluGlyArgArgProArgArgSerAlaGlu210215220ProLeuAsnAlaPheGinTyrLeuMetGluAsnSerTrpPheAspAsn225230235240lieThrMetAsplieAspArgAlaProGinlieLeuArglieLeuAsp245250255AlaAlaVallieLysMetGluGlyGlyAlaGluTyrAspLeuArglie260265270LeuGluGinProlieGluAspGluAspGluArgGluArgProThrPro275280285GlyGlyProProSerGluThrGinLysArgAspGluThrArgGlyAla290295300GlulieGluArgLysValSerValLysLysAspValLysGluGlyGlu305310315320ThrGlyAspValGlyValLysAspAlaAspAlaGluAlaGlySerGlu325330335ArgAspLysProAspAsnGluAlaProProGluGlulieSerGluPro340345350LysLysMetSerLysLysArgLysArgLysHisSerGlyAspSerGlu355360365AspGluAlaSerAlaSerGluSerGluSerAspSerAspSerAspSer370375380AsnSerHisSerSerGluLysProThrGluArgGinArgGluAlaGlu385390395400GlyGluGlyAspMetGluGlyGluGlyAspGlyGlyAsnGluGluGly405410415GluGluLysGluAspGluGluGluGluGluGlyGluAspValLysGly420425430ArgLysGluGluLysGinSerGluArgGluLysGluLysGluGluLys435440445LysValLysAspAspGinProProLysProArgProLeuHisMetThr450455460CysSerLeuPheMetArgSerlieAlaProThrlieSerLysAlaGlu465470475480lieValAlaLeuCysArgArgPheProGlyPheMetArgValCysLeu485490495SerGluProGinProGluArgArgPhePheArgArgCysTrpValThr500505510PheAspArgGlyValAsnlieLysGlulieCysTrpAsnLeuGinAsn515520525lieArgLeuArgAspCysGluLeuAlaProGlyValAsnArgAspLeu530535540AlaArgArgValArgAsnValAsnGlylieThrGinHisLysGinVal545550555560LeuArgAsnAsplieLysLeuSerAlaLysLeulieHisAlaLeuAsp565570575GluArgGluGlyLeuTrpGlyHisArgAspAlaHisThrAlaGluLeu580585590ProAlaGinAsnProlieLeuLysAsnlieThrAspTyrLeulieGlu595600605GluValSerAlaGluGluGluGluLeuLeuGlyAsnValGlyGlyVal610615620AspLeuGluAspGlyAsnLysGluGlyAsnProThrGlulieThrVal625630635640GluArgAspGluLysLeuValLysValLeuAspArgLeuLeuPheTyr645650655LeuArglieValHisSerlieAspTyrTyrAsnMetCysGluTyrThr660665670SerGluAspGluMetProAsnArgCysGlylielieHisValArgGly675680685ProlieProProAsnArglieThrHisArgGluValSerAspTrpGlu690695700LysThrPheGluGluLysLeuGlyProLeuPheSerValLysGluThr705710715720LeuSerGluGluGluAlalieLysMetGlyArgLysAspProGluGin725730735GluValGluLysPheValSerAlaAsnThrGinGluLeuGlyLysAsp740745750LysTrpLeuCysProLeuSerGlyLysLysPheLysGlyProGluPhe755760765ValLysLysHislieLeuAsnLysHisGlyAspLyslieGluGluVal770775780LysLysGluValGluPhePheAsnAsnPheLeuMetAspAlaLysArg785，m■ProSerlieProGlulieLysProLeuProProProGlyProThrPro805810815GlyValMetSerProGlyGlyProProPheHisProGinGlyProGin820825830ValLeuLeuGlyPheGlyGinProArgProProValMetGlyTyrGly835840845GlyProProTyrProProAsnGinTyrGlyGlyGlyLysArgGlyAsn850855860TyrAspSerPheArgGlyGinGlyGlyTyrProAlaLysProArgAsn865870875880AsnArgMetMetArgGlyAspProArgAsnlielieGluTyrArgAsp885890895LeuAspAlaProAspAspValAspPhePhe90090权利要求1、一种蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与抗重金属相关的由(a)衍生的蛋白质。2、权利要求l所述蛋白的编码基因。3、根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述蛋白编码基因为如下1)或2)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与l)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子。4、含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体。5、根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为在pGEX-4T-1的^co//和/位点间插入序列表中序列1所示的核苷酸序列得到的重组表达载体pGEX-^7AS"。6、根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为在表达载体pCMVnramp的fc^/和&7/酶位点间插入序列表中序列1所示的核苷酸序列得到的重组表达载体pCMVnramp-ATPAS;7、含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞系或重组菌。8、一种培育抗重金属鱼的方法，是将权利要求4、5或6所述的重组表达载体导入鱼的受精卵细胞中，培养得到抗重金属鱼。9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述重金属为砷。10、根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于所述鱼为鲇鱼。全文摘要本发明公开了一种与抗砷相关的蛋白及其编码基因与应用。该抗砷相关的蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与抗重金属相关的由(a)衍生的蛋白质。本发明的抗砷相关蛋白及其编码基因将对改善水生生物抗砷以及抗重金属等表现特征具有重要意义，在鱼的育种中有巨大的应用前景。文档编号C07K14/46GK101186641SQ20071017835公开日2008年5月28日申请日期2007年11月29日优先权日2007年11月29日发明者侯士聪,侯玉霞,吴旭东,奇张,龚玉梅申请人:宁夏回族自治区水产研究所;中国农业大学