专利名称：新的lxr激动剂及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一类新的化合物，特别涉及肝X受体的激动剂。
背景技术：
肝X受体(liver Xactivated receptors, LXRs)最初作为一个胆固醇代谢的调节因子由Willy在1995年报道，因在肝脏表达最丰富而命名[Genes Dev. 1995May l;9(9):1033-45]。 LXRs是核受体超家族的成员，有LXRa (NR1H3)、 LXR卩(NR1H2)两型，二者间77%的同源性，并有相同的内源性配体。LXR(3表达广泛，而LXRa则主要分布在肝脏、脂肪组织、小肠和巨噬细胞。LXRs被配体激活后，先与视黄醛衍生物受体a(retinoid X re-ceptora)形成LXR/RXR异二聚体，再与靶基因上特异的LXR反应元件(LXRE)结合，在转录水平上调节该基因的表达。LXRE是由AGGTCA组成的重复序列，中间有4个碱基相间隔[J BiolChem，1997, 272, 3137 3140]
LXR是一类在脂、胆固醇代谢的转录控制发挥重要作用的核受体。许多氧化固醇都是LXR的配体，包括24(S),25-环氧化固醇、22(R)-羟基固醇和24(S)-羟基固醇[J Biol Chem,1997，272，3137 3140 ， Vascul Pharmacol 2002 Apr,38(4):249-256]。肝X受体在多类细胞中被氧胆固醇类活化，通过对升高的细胞内胆固醇水平作出应答，从而作为体内内胆固醇感受器发挥作用。肝X受体一旦被活化后就能诱导参与胆固醇的吸收、外流、转运和排泄等一系列基因的表达。LXR还能调节巨噬细胞的免疫和炎症反应[J Clin Invest 2006,116(3):607-614]。所以L^R成为治疗人类代谢性疾病的突出靶点。LXRs与胆固醇
大量研究证明，LXRs是机体保持胆固醇相对稳定的关键感受器，通过调控 胆固醇代谢、储存、吸收和转运等多个环节来维持其自体平衡，而这些调控都 是通过对代谢途径中的关键靶基因的转录调节来实现的。
7a羟化酶(7a-hydroxy-lase， CYP7A1)是胆汁酸中性合成途径的限速酶，由 CYP7A1基因编码。最近研究发现CYP7A1启动子上存在LXRE， LXR和氧化 固醇能激活CYP7A1的表达[Vascul Pharmacol 2002 Apr; 38(4):249-256]。给野生 型小鼠高胆固醇饲料，CYP7A1的表达、胆汁酸合成及分泌都有所提高，而 LXRa/(3-Z-小鼠和LXRa-A小鼠无此表现。但人类CYP7A1基因不含LXRE，因 此LXR不能调节人类CYP7A1基因的表达。LXR在脂肪酸合成过程中也起重要 作用。LXR激活固醇调节元件结合蛋白-lC(sterolregulatory element binding protein, SREBP-lc)，后者能提高不饱和脂肪酸合成和酯化基因的表达。而且氧 化固醇在激活SREBP-lc的同时却抑制SREBP-2的表达，从而抑制胆固醇的合 成[World J Gastroenterol 2004 Novl; 10(21):3081- 3087]。此外，肝脏LXR耙基因 还包括ABCA1、 ABCG5和ABCG8，促进磷脂和胆固醇从肝脏中排出，限制小 肠对类固醇的吸收，并且提高小肠对类固醇的排出[Science，2000,2卯 1771-1775]。外周巨噬细胞LXR的耙基因有ABCAl和ABCGl。LXR诱导ABCAl 的表达，促进胆固醇从巨噬细胞中排出，并被脂肪含量低的脂蛋白摄取，如载 脂蛋白Al(apolipoprotein Al， apoAl)和载脂蛋白E(apolipoprotein E， apoE)，形 成新的HDL， HDL被肝脏摄取完成胆固醇的逆转运过程[Proc Natl Acad Sd USA， 2001b, 98:507-512]。 ABCG1的作用也与胆固醇的排出、HDL的形成有关。 ABCA1的突变可以导致Tangier病，病人以缺乏高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)为牛寺征。LXRs也可通过上调载脂蛋白E(apolipoprotein E， ApoE)转录而使HDL微粒 增多，从而增强外周细胞中胆固醇向肝脏的转运[J Clin Invest,2000,105: 513 520]。游离胆固醇被HDL接收后，被卵磷脂:胆固醇脂酰转移酶酯化。HDL 微粒有两种命运:(l)通过LXRs耙基因编码的胆固醇酯转运蛋白(cholesterol ester transferprotein， CETP)，将胆固醇与其它脂蛋白交换为甘油三酯(脂蛋白随 后被肝脏清除)；(2)将胆固醇酯转运回肝脏以便分解代谢。肝脏对HDL的摄取 需要LXRs另外两个靶基因apoE和脂蛋白脂酶(lipopro-tein lipase, LPL)的介导。 此外，LPL也参与催化脂蛋白中甘油三酯的水解和HDL的成熟[J Biol Chem，2001a, 276 43018~43024]。
LXRs与糖代谢
Cao等观察胰岛素抵抗的Zucker (fa/fa)大鼠发现，给予LXRs激动剂 T0901317 7周后，fa/fa大鼠胰岛素敏感性显著增加，血糖水平降低，其效果为 剂量依赖性，故认为LXRs的激动剂具有抗糖尿病作用[J历o/ C7zew,2003, 278:1131-1136]。 La伍tte等研究发现，使用人工合成的LXRs激动剂GW3965后， 肥胖和胰岛素抵抗的Ztidcer(ob/ob)大鼠肝脏中糖异生的关键酶磷酸烯醇式丙酮 酸羧激酶(PEPCK)、葡萄糖-6-磷酸酶及PPARy协同剌激因子-l(PGC-l)等的表达 均受抑制。在糖异生基因表达减少的同时，葡萄糖激酶的表达水平提高，这最 终导致肝脏糖异生减少，糖原输出减少，而糖利用率提高。所以提高脂肪组织 中LXRa的活性可以有效改善2型糖尿病患者胰岛素抵抗状态[Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100:5419-5424]。
LXRs与炎症
巨噬细胞在免疫以及炎症方面起关键作用，LPS、 TNFou IL-ip的刺激下分 泌多种炎症因子，包括iNOS、 IL-6、 IL-1卩、COX2、 MCP-1 (monocytechemoattractant protein-1)、 MCP-9、 MMP-9等[Nat Med, 2003, 9:213-219， FEBS J 2005; 272: 1546-1556]。 LXRa敲除大鼠炎症反应性降低，iNOS、 TNFa的产生 降低[J Biol Chem, 2002, 277:4713-4721]。有实验证明LXR的活化可以抑制 AP-1， NF-kB， Egr-1 andSpl介导的重要炎症因子组织因子的表达，从而抑制多 种炎症因子的产生[J Invest Dermatol 2003; 120: 246-255]。
综上所述，LXRs作为一种体内胆固醇感受器控制着脂肪和胆固醇的合成、 吸收、转运及分解，调控着机体的脂肪和胆固醇平衡。同时由于其具有的抗炎 作用使得LXR的激动剂可望成为非他丁类的治疗高胆固醇、肥胖症和动脉粥样 硬化的极具潜力的新的药物靶点。LXRs激动剂可促进葡萄糖转运子4的基因转 录，抑制糖异生关键酶的表达，抑制肝糖异生，限制肝糖原输出，提高肝糖利 用率，并且提高外周组织对葡萄糖的摄取，调节胰岛素的合成和分泌，在糖代 谢过程中具有重要作用。LXRs的激动剂成为治疗人体中由于胆固醇代谢、脂 代谢和糖代谢的平衡被打乱而导致的包括糖尿病、高血脂、高胆固醇、高血压、 动脉粥样硬化、冠心病、肥胖症和代谢综合症等多种疾病的治疗药物。目前世界 各大制药公司和研发机构都在积极进行LXR激动剂药物的研发，并有诸多化合 物进行了专利申请，并有多家公司对其新的化合物在中国申请了专利，如瑞典 的阿斯利康有限公司(CN200480019841.1 )，英国的IRM有限责任公司 (CN200580004674.8)、芝加哥大学(CN02807008.9)等。
发明内容
经过大量研究，发明人发现式(1)、 (II)和(III)化合物对LXR表现出很 好的激动活性，因此完成本发明。
具体地，本发明涉及 (1)下式(1)、 (II)或(III)的化合物及其可药用盐或溶剂化物(2) —种制备项(1)任一化合物的方法，包括培养产生所述化合物的 微生物，之后对发酵液进行分离和纯化。
(3) 根据项(2)的方法，其中的微生物为曲霉sp. ) CGMCC No. 2037。
(4) 一种药物组合物，含有项(1)任一化合物作为活性成份和可药用载体。
(5) 项(1)任一化合物在制备预防或治疗LXR介导的疾病的药物中的用途。
(6) 项(1)任一化合物在制备预防或治疗心血管疾病、炎症、肥胖症、
糖尿病或代谢综合症的药物中的用途。
(7) 根据项(6)所述的用途.，其中的心血管疾病为高血压、高血脂、高
胆固醇血症、动脉粥样硬化或冠心病。
本发明涉及的具有上述用途的化合物不仅是化合物本身，适当时也可以 是其药学上可接受的盐(酸或碱加成盐)或其溶剂化物(例如水合物、醇合物
等)，下文中为简便起见，都简称为本发明的化合物。
上述化合物和盐可以形成溶剂化物，例如水合物、醇合物等。还可以是前
药或可在体内代谢变化后释放出所述活性成分的形式。选择和制备适当的前药
衍生物是本领域技术人员公知技术。
本发明还提供了制备上述化合物的方法，该方法包括
1.提供能够通过发酵产生项l化合物的微生物，优选真菌，特别优选曲
霉"spergj'"tAs ) F02Z-1593。该菌种F02Z-1593已于2007年5月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编
号为CGMCC No. 2037。
菌株来源产生菌株F02Z-1593是从我国厦门戴云山自然保护区土壤样 品中分离得到。
菌种鉴定在PDA平板上，26°C， 10-14天菌落直径45 —55腿，质地 丝绒状至絮状，疏松或致密。菌落中央隆起，颜色呈浅棕色，较疏松，分生 孢子结构大量。其他部分，较平坦，呈白色至灰绿色，较致密。边缘菌丝呈 灰绿色，疏松。中央有渗出液，无色或浅棕色。菌落反面中央呈棕色，边缘 也呈棕色、呈环形，其余部分呈浅灰绿色。
分生孢子梗生自基质或气生菌丝，带浅棕色，壁较厚，光滑；分生孢子 头球形，全部表面可育；产孢结构双层；分生孢子稍人，球形，壁较粗糙。
根据以上培养特征可以确定该菌种F02Z-1593为曲霉^邵ergi^"s w.。
2. 选择性地在种子培养基上培养微生物。
3. 提供一种发酵培养基，该培养基为本领域常用培养基，优选含有下列成 份葡萄糖，酵母粉，NaCl， C线。
4. 将微生物在发酵培养基中进行发酵。
5. 选择性地对所得发酵液进行分离和纯化。
本发明的一个实施方案中，优选在PH约为7的条件下发酵。本发明另一 实施方案中，分离包括离心发酵液，收集菌体，用溶剂提取菌体再除去溶剂， 纯化包括硅胶柱层析和选择性的HPLC单组分制备。
本发明方法不受上述顺序的限制，并且所述培养基成分可以在本领域技 术人员可预见的范围内改变。
需要指出的是，本发明的化合物可以但不限于从微生物发酵产物中提取、 分离得到。
本文所述的化合物或其药学上可接受的盐和/或水合物可以单独给药，与 其他本发明化合物联合给药，和/或以与其他已知治疗剂联合的形式给药。 本发明的活性化合物可以本身形式给药的，或者以药物组合物形式给药，
8其中活性化合物是与一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂混合 的。按照本发明使用的药物组合物通常是按常规方式配制的，使用一种或多 种生理学上可接受的载体，包含赋形剂和助剂，它们有利于将活性化合物加 工成可以在药学上使用的制剂。适当的制剂取决于所选择的给药途径，可以 按照本领域熟知的常识进行制造。
本发明的化合物将按照有效提供所需治疗效果的量给药。提供所需治疗 效果所必要的浓度将尤其根据疾病的明确性质、患者的年龄、体重和疾病的 严重性而异。
给药剂量优选地将对患者是无毒的，不过在某些情况下所治疗疾病的严 重性可能迫使给以导致一些毒性迹象的量的化合物。
本发明的化合物或组合物还可以选择性地与已知的抗高血糖剂、抗高血 脂剂、胰岛素抵抗改善剂、糖尿病治疗药、糖尿病并发症、抗动脉粥样硬化剂、
抗炎症剂以及代谢综合症治疗药物和LXR介导的其他疾病的预防和治疗药物联
合给药。当它与已知药物联合给药时，可以同时、分别或顺序给药。
图1为产生菌F02Z-1593的菌落形态照片； 图2为产生菌F02Z-1593的显微照片； 图3为化合物(I)的ESI-MS图； 图4为化合物(I)的^丽R图谱； 图5为化合物(I)的"C丽R图谱； 图6为化合物(II)的ESI-MS图； 图7为化合物(II )的^丽R图谱； 图8为化合物(II)的13C丽R图谱； 图9为化合物(III)的ESI-MS图； 图10为化合物(III)的^ NMR图谱；
图11为化合物(III)的丽R图谱；
具体实施例方式
下面实施例进一步详细说明本发明，但它们并非理解成对本发明范围的任 何限制。
仪器与试剂为本领域技术人员常用的仪器与试剂。除非特别说明，本发 明中所说的％均为重量百分比。
材料L02细胞(购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生
物学研究所)，lipofectamine 2000， Superscript n Reverse Transcriptase (贝勾自 Invi加gen公司)，肝组织总RNA(购自Clontech公司)。
紫外光谱仪Pharmacia公司Ultrospec 2100 Pro型
核磁共振仪Varian公司inova 500
质谱仪Waters公司Micromass
细胞板读板仪Perkin Elmer公司Victor2 1420 Multilabel Counter 中压层析系统德国BUCHI公司
制备型HPLC: Waters公司(pump: 600， Detector: 2487， Injector: 7725i) 实施例1菌种的培养
斜面培养基PDA培养基。
种子培养基淀粉2%，葡萄糖1%，热榨黄豆饼粉0.2%，麦芽粉0.6%， 酵母粉O. 3%， NaClO. 2%， MgS04. 7H20 0.1%, CaC03 0.2% pH7. 0。 发酵培养基大米培养基为每100g大米中加入豆粉2.5g。 由真菌CGMCC No. 2037斜面，接种于种子培养基，27°C ， 72hr培养后，接 入内含量为lOOg大米培养基的750ml三角瓶中，于固体培养基中培养14天。
实施例2化合物(i)、 (n)和(in)的分离及结构
CGMCCNo.2037固体培养物4kg，用4000ml乙酸乙酯浸泡2小时，乙酸乙 酯层经无水Na2S04脱水后，浓縮抽干后，得到褐色物质23.0g。
取22.0g样品，溶解拌样，进行硅胶中压柱(cl)3.5X50cm)色谱分离，洗 脱条件为100%的石油醚至100%的丙酮(不同配比)阶段洗脱，收集合并活性 组分，浓縮抽干后得褐色固体。
10取上述活性物质，使用ODS反相柱(PHENOMENEX ODS小21.2X250mm ) 在制备型HPLC上进行单组分的制备[流动相为CH3CN-(1%。H3P04)H20 (80: 40)，流速为16ml/min，检测波长为254nm]，得到化合物(I) 256.2mg、化合 物(II) 30.0mg和化合物(III) 25.6mg，保留时间分别为12.5min、 15.6min和 20.0min。
(O化合物(I)黄色结晶；分子量(ESI-MS): 351;分子式C19H17N304 UV w (in MeOH): 206， 259， 341 nm
13C NMR (125 MHz， DMSO画^， ppm): 143.6 (C-2)， 117.3 (C画3)， 128.4 (C陽4)， 125.1 (C-5)， 109.8 (C-5a)， 159.6 (C誦6)， 51.5 (C-7)， 165.0 (C-8)， 84.3 (C-10)， 157.7 (C-10a)， 162.3 (C-lla)， 46.4(C-12)， 17.7(C画13)， 134.6 (C-l，)， 130.6(C-2，， C-6')， 128.5 (C画3', C-5，)， 127.3 (C-4')。
^画R(500MHz， DMSO-4 ppm): 6.29(1H， d， J=5.5) (H-2)， 5.81(1H， t， J=5.5)(H-3)， 6.21(1H， dd， J=11.0， 5.5) (H-4)， 4.43 (1H， q， J=6,5)(H-7)， 9.23 (1H， s)(H-9)， 7.12 (1H， s)(10-OH)， 3,06(1H， d, J=12.5) (H-12a)， 3.52 (1H， d， J=12.5) (H-12卩)，0.34 (3H， d, J=6.5) (H-13)， 7.03 (2H， d， J=8.0) (H-2'， H-6，) ， 7.25 (2H， t， J=8.0)(H-3，，H-5，)，7,19(1H， t， J=8.0) (H画4，)
化合物(I)结构如下
(I)
(2)化合物(II)黄色结晶；UV入max (MeOH): 239, 324nm ESI-MS(+)， m/z394,3 [M+H]+;分子式C22H23N304。
13C NMR(125 MHz， DMSO画^， ppm): 144.2 (C-2)， 104.2 (C-3)， 129.6 (C-4)， 130.0 (C-5)， 70.0(C-5a)， 166,2 (C-6)， 56.4 (C-7)， 165.0 (C-8)， 122.1 (C-IO)， 115.7 (C-10a)， 153.4 (C-lla)， 36.3(C-12)， 31.9(C-13)， 25.5(C-14)， 12.0(C-15)， 17.6(C-16)， 135.4 (C画r)， 129.3(C-2，， C-6，)， 128.3 (C画3', C-5，)， 129.6 (C-4，)。
!H画R (500MHz, DMSO-A， ppm): 6.72(1H， d， J=7.5)(H-2)， 5.48(1H， t， J=7.5) (H-3)， 6.17(1H， dd， J=10.0， 7.0) (H-4)， 5.88 (1H， d， J=10.0)(H-5)， 6.38 (1H， s)(5a画OH)， 5.01(1H， dd， J=5.5， 6.5) (H-7)， 9.77 (1H， s)(H-9)， 2.94(1H， dd， J=13.5, 5.5)(H-12a)， 3.03 (1H， dd， J=13.5, 6.5) (H-12卩)，2.80 (1H， m)(H陽13)， 1.16 (2H， m)(H-14)， 0.60 (3H， t, J=7.0) (H-15)， 0.88 (3H， d, J=7.0) (H陽16)， 7.05 (2H， d, J=7.0)(H-2，， H画6'), 7.17-7.24 (3H， m) (H-3', H-4', H-5，)
化合物(II)结构如下
(II)
(3)化合物(III)
无色粉末，UV人max (MeOH): 210， 243， 287nm ESI-MS(+)， m/z 400.6 [M+H]+;分子式C21H25N305
13CNMR(125 MHz， CDC13， ppm): 167.2 (C-l)， 53.2 (C-3)， 166.0 (C-4)， 79.9(C-5a)， 144.4 (C-6a)， 119.1 (C-7)， 131.3 (C画8)， 125.0 (C-9)， 124.8 (C-10)， 127.5 (C-10a)， 39.3(C-11)， 57.9(C-lla)， 87.8(C-llb)， 39.2(C-12)， 24.46(C-13)， 20.9 (C-14)， 23.3(C15)， 169.4 (C-17), 21.2 (C-18) ，171.2 (C-19), 23.5 (C-20)'H画R(500MHz， CDC13， ppm): 5.88(1H， s) (H-2)， 4.02(1H， dd， J=10.5, 3.5)(H-3)， 6.39(1H， s)(H-5a)， 3.26 (1H， dd， J=12,0,5.5)(H-11)， 2.71 (1H， t， J=12.0)(H-11)， 3.94(1H， dd， J=12.0， 5.5) (H画lla)， 2.02 (IH， m)(H-12)， 1,60(1H， m)(H-12)， 1.72 (IH， m)(H-13)， 0.93 (3H， d, J=7.0) (H-14)， 1.01 (3H， d, J=7.0) (H-15)， 2.05 (3H， s)(H-18)，2.65(3H， s) (H-20)
化合物(m)结构如下
实施例3对LXR的激动活性
本活性测定是利用GAL4-LXR的转录激活的测定方法
测定原理该机理利用了LXR的结构中共有的两个主要结构域配体结合 结构域(LBD)和DNA结合结构域(DBD)功能的独立性特点，以及酵母细胞转录 因子GAL4具有核受体的相似结构，将LXR的配体结合结构域(LBD)与酵母细 胞转录因子GAL4的DNA结合结构域(DBD)融合表达成嵌合蛋白，与含有GAL4 特异的反应元件的报道质粒共转染，通过测定报告基因的表达从而评价LXR配 体的活性。依据该原理构建表达质粒和报告质粒将从肝组织中PCR扩增的 LXR-LBD片断，通过双酶切连接到表达载体pBIND，构建成pBIND-LXR-LBD 表达质粒；将GAL4的相应元件插入到pGL3的启动子SV40上游构建成 p5GAL-luc报告质粒。
测定方法将L02细胞以3xl()S个/mL细胞数接种细胞于96孔板，24h后， 将培养液换成含10%胎牛血清的无双抗的PRMI 1640培养基，用lipofectamine2000将重组质粒的报告质粒p5GAL-luc和pGAL4 -LXR-LBD嵌合表达质粒共 转染入细胞中。6h加入不同浓度的药物诱导，DMSO作为空白对照。给药24h 后，Victor2 1420 Multilabel Counter,利用Luciferase Assay System检测细胞中荧 光素酶的活性。将该化合物从2mg/ml的始浓度进行3倍的系列梯度稀释，在96 孔板转染培养的细胞中加l^il样品，24h培养结束后检测对荧光素酶的诱导活性。 药物的荧光素酶的活性值与空白DMSO孔的荧光素酶活性值的比值为转录激活 活性。利用T0901317 (购自晶美生物工程有限公司)作为阳性对照。
根据本方法测定本发明的三个化合物对LXR具有较好的转录激活活性，能 较大幅度地上调荧光素酶的表达，结果见表l。
表l化合物对LXR的转录激活活性测定结果
EC5。最大上调活性(％)
化合物(I)5.6 (ig/ml416±70
化合物(II)6.8 |ug/ml329 ±43
化合物(111)8.2 jig/ml298±61
本发明化合物的生物活性特性证明，本化合物可以预防或治疗脂代谢和糖 代谢紊乱导致的糖尿病、高血脂、高胆固醇、高血压、动脉粥样硬化、冠心病、 肥胖症和代谢综合症等多种疾病。
1权利要求
1、下式(I)、(II)或(III)的化合物及其可药用盐或溶剂化物
2、 一种制备权利要求1任一化合物的方法，包括培养产生所述化合物的微生 物，之后对发酵液进行分离和纯化。
3、 根据权利要求2的方法，其中的微生物为曲霉(A/^g/〃^ sp. )CGMCCNo. 2037。
4、 一种药物组合物，含有权利要求l任一化合物作为活性成份和可药用载体。
5、 权利要求1任一化合物在制备预防或治疗LXR介导的疾病的药物中的用途。
6、 权利要求l任一化合物在制备预防或治疗心血管疾病、炎症、肥胖症、糖尿 病或代谢综合症的药物中的用途。
7、 根据权利要求6所述的用途，其中的心血管疾病为高血压、高血脂、高胆固 醇、动脉粥样硬化或冠心病。
全文摘要
本发明涉及一类作为LXR受体激动剂的新化合物及含有该类化合物或其可药用盐的药物组合物，还涉及制备这些化合物的方法及其药用组合物。本发明公开了该类化合物作为药理活性物质的用途，特别是在治疗高血压、高血脂、高胆固醇、动脉粥样硬化和冠心病等心血管疾病以及在炎症、肥胖症、糖尿病和代谢综合症等方面的用途。
文档编号C07D491/14GK101456863SQ20071018539
公开日2009年6月17日 申请日期2007年12月14日 优先权日2007年12月14日
发明者丁彦博, 晓 任, 单越琦, 可爱兵, 崔晓兰, 华 张, 张雪莲, 岩 徐, 林 曹, 朱京童, 李业英, 洁 林, 英 石, 栋 穆, 范玉玲, 蔡超静, 贺建功, 路新华, 郑智慧, 瑛 马 申请人:华北制药集团新药研究开发有限责任公司