专利名称：一种可溶性融合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种可溶性融合蛋白，具体地讲它是人Notch配体Delta-likel即 hDLLl的一种新型可溶性截短体蛋白，它由硫氧还蛋白即TRX及与TRX蛋白C 末端相融合的重组hDLLl蛋白组成。
技术背景Notch信号途径广泛存在于多种生物体内，且进化上高度保守，在胚胎发育、 血细胞发育及肿瘤形成等多种病理生理过程中发挥重要作用。 '现己在哺乳动物中发现了4种Notch同源分子，Notch 1~4， 5种Notch配 体，分别是Jaggedl、 2和Delta-likel、 3、 4。这些配体都是I型跨膜蛋白，N端 有一个结合Notch受体必需的DSL基序，其由含6个半胱氨酸，3个甘氨酸的 45个氨基酸组成；配体胞外区还含有数量不等的EGF样重复区；胞浆区很短， 只有70-215个氨基酸残基，其保守性差。其中，hDLLl属于果蝇delta配体在人 的同源物，由723个氨基酸组成，其胞外段中有l个DSL基序和8个EGF样 重复区(Freddy Radtke等,EMBO reports, 2005,6:1120-1125; Sabine Pfister等，J. Mol, Biol" 2003, 333(2): 229-35; J.M. Ascano等，J. Biol.Chem" 2003,278: 8771-8779)。Notch信号途径的活化主要采用三步蛋白水解模式(Martin Baron, Semin Cell.Dev.Bio-1. ,2003,14 (2):113-9)。全长Notch分子是新合成的胞内非活化分子， 在分泌运输中，首先被高尔基体内Furin样蛋白酶酶切，酶切位点位于临近Notch 跨膜区的胞外段SI ，酶切形成ECN(Extracellular Notch Subunit)和NTM(Notch transmembrane subunit)，通过一种Ca^依赖的非共价键结合而形成分子内异二聚 体，转运至细胞膜成为成熟的Notch受体。当配体与受体结合后，NTM上的S2 位点暴露，通过ADAM金属蛋白酶家族TACE或Kuz酶切，Notch受体释放ECN， 粘连在细胞膜上的成为NEXT(Notch Extracellular Truncation)或Notch-intro TM。 第三步酶切发生在跨膜区，由Y分泌酶复合物催化，在位点S3， S4酶切释放胞 内段NICD(IntracellularDomainofNotch)和N0 。 Sl酶切是组成性的，配体与受 体结合触发S2、 S3酶切从而激活Notch信号途径。Notch受体和配体都属于EGF样超家族分子，EGF样重复区的功能可能有 两方面，其一介导与邻近细胞表面分子的相互作用，其二介导同一细胞表面分子 侧向的相互作用(M. Balzar等,Mol. Cell. Biol" 2001,21:2570-2580)。如Notch 1的 第11-12个EGF样重复区与配体DSL结构域相互作用激活Notch信号途径(I. Rebay等，Cell, 1991:67687-699)。但对配体的EGF样重复区的功能研究发现，配 体从N末端到DSL结构域的片段足以激活Notch信号途径(Fitzgemld K等， Development,1995,121:4275; Henderson ST.等，Mol. Biol. Cell"1997,8:1751; Annette丄.Parks等,Genetics,2006,174:1947- 1961)。目前体外研究Notch信号对细胞增殖、分化和凋亡的作用多采用Notch配体 刺激。Notch配体表达系统分真核表达系统和原核表达系统。真核表达绝大多数 是哺乳动物细胞系，如CHO， COS7等，表达配体的整个胞外区与人IgG的Fc融合蛋白，可以以亲和层析一步纯化，但由于哺乳动物细胞表达系统成本高、难 操作、表达水平低，产量受限制。而原核表达系统，易操作，成本低，表达水平 高，但目前难以表达整个胞外区，而表达的截短体多以包涵体形式存在，这使纯 化过程复杂化。因此有必要在提高产量、降低成本的同时简化纯化步骤。发明内容本发明的目的是提供了一种可溶性融合蛋白，它实现了在原核表达系统中的 可溶性表达，并且它具有生物学活性；此可溶性hDLLl截短体融合蛋白提供体 外研究Notch信号是对细胞增殖、分化和凋亡的影响重要手段。本发明的技术方案是，提供一种可溶性融合蛋白，其特征是它由硫氧还蛋 白即TRX及与TRX蛋白C末端相融合的重组人Ddta-likel艮卩hDLLl蛋白组成。所述的重组hDLLl蛋白是hDLLl第127-224氨基酸截短体，它包含DSL结构域和部分N-Terminus结构域。所述的hDLLl重组蛋白包括N04的氨基酸序列，并由N03核酸序列编码； N03核酸序列编码为251 AAGTGTGCAA CCCTGGCTGG AAAGGGCCCT ACTGCACAGA GCCG;N04氨基酸序列为1 lhtd驴ddla tenperlisr latqrhltvg eewsqdlhss grtdlkysyr 51 fvcdehyyge gcsvfcrprd dafghftcge rgekvcnpgw kgpyctep 。所述的融合蛋白的C末端为His标记。所述的融合蛋白包括N02的氨基酸序列，并由NOl核酸序列编码； NOl核酸序列编码为N02氨基酸序列为1msdkiihltd dsfdtdvlka dgailvdfwa ewcgpckmia pildeiadey 51 qgkltvakln idqnpgtapk ygirgiptll lfkngevaat kvgalskgql 101 kefldanlag sgsghmhhhh hhssglvprg sgmketaaak ferqhmdspd 151 lgtddddkam adigslhtds pddlatenpe rlisrlatqr hltvgeewsq 201 dlhssgrtdl kysyrfvcde hyygegcsvf crprddafgh ftcgergekv 251 cnpgwkgpyc tepnsssvdk laaalehhhh hh。所述的融合蛋白在大肠杆菌BL21中用低温诱导方法实现可溶性表达。本发明的特点是截取hDLLl的功能区即DSL结构域和部分N-Terminus结构域，并将其与TRX蛋白C末端进行融合，使用低温诱导的方法在大肠杆菌BL21中实现可溶性表达。在融合蛋白的C末端为His标记以利于纯化。
下面结合实施例附图对本发明做进一步说明。图1是本发明融合蛋白的模式图。图2是本发明构建表达载体质粒图。图3是琼脂糖电泳显示PCR扩增目的基因。图4是限制性内切酶BamHI、 EcoRI酶切鉴定图。图5是SDS-PAGE分析IPTG诱导融合蛋白的表达。图6是SDS-PAGE分析融合蛋白的可溶性电泳图。图7是SDS-PAGE分析融合蛋白的纯化电泳图。图8是融合蛋白免疫印迹检测结果。图9是融合蛋白激活萤光素酶报告基因。图IO是融合蛋白激活萤光素酶报告基因的剂量依赖效应。图11是Y-secretase inhibitor抑制融合蛋白激活萤光素酶报告基因。图12是琼脂糖电泳显示PCR扩增目的基因。图13是SDS-PAGE分析GST融合蛋白的表达。 图14是GST-127-224融合蛋白的可溶性分析。图15是SDS-PAGE分析TRX-26-224融合蛋白的表达。
具体实施方式
以下通过附图结合实施例对本发明做详尽的说明。图1是本发明融合蛋白的模式图；hDLLl-ext是hDLLl的胞外区， TRX-127-224是融合蛋白，TRX代表硫氧还蛋白。图2、图3、图4是本发明构建表达载体？￡丁32&-127-224。 图2是本发明构建表达载体质粒图。图3是琼脂糖电泳显示PCR扩增目的基因，1道是marker DL2000， 2道是扩增目的基因127-224。图4是限制性内切酶BamHI、 EcoRI酶切鉴定图，1道是marker DL2000， 2 道是pMD18T-127-224酶切结果，3道是pET32a-127-224酶切结果。图5、图6是融合蛋白的可溶性表达。图5是SDS-PAGE分析IPTG诱导融合蛋白的表达，1道是蛋白marker (由 上到下分别是97.4KD， 66.2 KD， 43.0 KD， 31.0 KD， 20.1 KD)， 2道是pET32a 未诱导组，3道是pET32a诱导组，4道是pET32a-127-224诱导组，5道是 pET32a-127-224未诱导组。图6是SDS-PAGE分析融合蛋白的可溶性，1道是蛋白marker, 2道是pET32a 上清，3道是pET32a沉淀，4道是pET32a-127-224上清，5道是pET32a-127-224 沉淀。图7、图8是融合蛋白的纯化及免疫印迹检测。图7是SDS-PAGE分析融合蛋白的纯化，1道是蛋白marker, 2道是pET32a-127-224上清，3道是250mM咪唑第一次洗脱液，4道250mM咪唑第二次洗脱液，5道为穿过液，6道为40mM咪唑洗涤液。图8是融合蛋白免疫印迹检测结果， 一抗是抗末端His抗体(Invitrogen)。图9、图IO、图ll是萤光素酶报告基因检测融合蛋白活性。图9是融合蛋白激活萤光素酶报告基因。图IO是融合蛋白激活萤光素酶报告基因的剂量依赖效应。图11是Y-secretase inhibitor抑制融合蛋白激活萤光素酶报告基因。 图12、 13、 14、 15是其它融合蛋白的表达分析。图12是琼脂糖电泳显示PCR扩增目的基因，1道是扩增目的基因127-224， 2道是扩增目的基因26-224， 3道是marker DL2000。图13是SDS-PAGE分析GST融合蛋白的表达，1、 2、 3道为IPTG诱导的 GST-26-224全菌，4、 5、 6道为GST-127-224, 7道为GST, 8道为未诱导全菌， 9道是蛋白marker 。图14是GST-127-224融合蛋白的可溶性分析，1、 3、 5道为超声裂解沉淀， 2、 4、 6为超声裂解上清，7道是未诱导菌超声裂解的上清。图15是SDS-PAGE分析TRX-26-224融合蛋白的表达，1道IPTG诱导的 TRX-26-224全菌，2道未诱导全菌，3道为IPTG诱导的对照TRX全菌，4道为 蛋白marker o1、构建表达载体。以人脑cDNA文库为模板， 5 ，-CGGGATCCCTCCAC AC AGATTCTCCTG陽3' (上游引物)、5 ，-CGGAATTCGGCTCTGTGCAGTAG-3 ，(下游引物)(引物为上海基康公司合成)聚合酶链反应扩增编码hDLLl的第 127-224氨基酸的多核苷酸序列(见图3)，条件为94。C30S， 57XM0S， 72。C30S， 45个循环，1 %琼脂糖电泳回收后与pMD18-T载体16°C以T4连接酶连接2小时，热休克转化大肠杆菌XLIO，扩增提取质粒，以BamH I和EcoR I切下回收目的 片段，亚克隆至表达载体pET32a(+)，构建pET32a-127-224,限制性酶切(见图 4)、上海基康公司测序鉴定。2、 诱导表达融合蛋白(见图5)。表达载体以热休克法转化大肠杆菌BL21， 涂布含100u g/ml氨节青霉素LB平板，37'C培养12小时后挑取单克隆接种到 含100ug/ml氨苄青霉素LB液体培养基，200rpm， 37'C培养12h，以1%转接 到新鲜LB(+)培养基中，200rpm， 37。C培养3h后，加入终浓度0. 5-1. OmM的 IPTG， 200rpm， 28-30。C培养24h。3、 获得可溶性上清(见图6)。离心收集细菌，200pl/ml培养基PBS重悬细 菌，超声裂菌，加入终浓度l%Triton-X100，混匀，4。C静置30分钟，4'C离心 收集上清。4、 纯化融合蛋白(见图7， 8)。以镍离子螯合柱(Invitrogen ProBond ) — 步纯化上清。其中结合液含20mM咪唑，洗涤液含40mM咪唑，洗脱液含250mM 咪唑。其余步骤按ProBondTM纯化手册操作。纯化的融合蛋白以抗末端His抗体(Invitrogen)免疫印迹检测，按标准免疫印迹步骤操作。5、 蛋白活性测定。以萤光素酶报告基因实验检测融合蛋白的活性。报告基 因pGa9816启动子区有RBP-J识别位点，因此Notch信号能激活萤光素酶的表 达。本实验是将纯化的融合蛋白加入培养基，检测能否激活报告基因。转染前一 天接种HeLa细胞2x 105于24孔板，转染当天90%铺满。以脂质体2000 (Invitrogen) 转染。实验A (见图9)分为三组，阳性对照组转染pGa9816 500ng， pEF-BOS-RAMIC 50ng，phRL 25ng，pEF-BOS 225ng;另两组转染pGa9816 500ng， phRL 25ng， pEF-BOS 275ng，转染5h后分别加入5 P g纯化蛋白TRX和融合蛋 白TRX-127-224, 48h后检测荧光强度。实验B(见图IO)分为五组，转染pGa9816 775ng， phRL25ng，转染5h后分别加入4u g纯化蛋白TRX， 0.5吗、l吗、2吗、 4吗融合蛋白TRX-127-224， 48h后检测荧光强度。实验C(见图ll)分为五组， 转染前一天接种HeLa细胞2xl05于24孔板，其中三组分别加入Y-secretase inhibitor, 50nmol， 75pmol， lOOpmol，转染当天转染pGa9816 775ng， phRL25ng， 转染5h后在Y-secretase inhibitor处理过三组及另一组中加入5ug融合蛋白 TRX-127-224，余下一组加入5 y g纯化蛋白TRX， 48h后检测荧光强度。6、 其它融合蛋白的表达。同上述条件扩增26-224，上游引物 5'-CGGGATCCGAACTGAAGCTGCAGGAGT-3'、下游引物5'-CGGAATTCGGCTCTGTGCAGTAG-3，(引物为上海基康公司合成) (见图12)，构建表达载体pGEX4Tl-127-224， pGEX4T1-26-224， pET32a-26-224 (方案同上)。诱导融合蛋白的表达(方案同上)。12MSDS-PAGE分析融合蛋白 的表达情况。由图13可见3小时、5小时、24小时(30°C) GST-127-224表达 (4、5、6道)，而GST-26-226未见表达(1 、2、3道)。图14分析表达的GST-127-224 的可溶性，1、 3、 5道为诱导3小时、5小时、24小时G(TC)的超声裂菌沉淀， 2、 4、 6道是对应的上清，7道是未诱导菌的上清，可见GST-127-224在表达在 包涵体中。图15显示诱导pET32a-26-224的表达，诱导的(l道)与未诱导(2 道)的无明显区别，未见TRX-26-224的表达。由此可见可溶性融合蛋白不仅与 截取的范围，有关，还与所融合的蛋白密切相关，当截取26-224片段时不能很 好地表达，而GST融合的蛋白可溶性差，只有与TRX融合才有较好的可溶性。 由以上可制得本发明这种可溶性融合蛋白，它由硫氧还蛋白即TRX及与TRX 蛋白C末端相融合的重组人Delta-likel即hDLLl蛋白组成。所述的重组hDLLl蛋白是hDLLl第127-224氨基酸截短体，它包含DSL结构域和部分N-Terminus 结构域。所述hDLU重组蛋白包括N04的氨基酸序列，并由N03核酸序列编 码；上海基康公司测序N03核酸序列编码为151由所测N03核酸序列编码推导出N04氨基酸序列为 lhtdspddla tenperlisr latqrhltvg eewsqdlhss grtdlkysyr fvcdehyyge gcsvfcrprd dafghftcge rgekvcnpgw kgpyctep。所述融合蛋白的C末端为His标记。所述融合蛋白包括N02的氨基酸序列，并由NOl核酸序列编码； 上海基康公司测序NOl核酸序列编码为801由NOl核酸序列编码推导出N02氨基酸序列为 1msdkiihltd dsfdtdvlka dgailvdfwa ewcgpckmia pildeiadey 51 qgkltvakln idqnpgtapk ygirgiptll lfkngevaat kvgalskgql 101 kefldanlag sgsghmhhhh hhssglvprg sgmketaaak ferqhmdspd 151 lgtddddkam adigslhtds pddlatenpe rlisrlatqr hltvgeewsq 201 dlhssgrtdl kysyrfvcde hyygegcsvf crprddafgh ftcgergekv 251 cnpgwkgpyc tepnsssvdk laaalehhhh hh。所述融合蛋白在大肠杆菌BL21中用低温诱导方法实现可溶性表达-
权利要求
1、一种可溶性融合蛋白，其特征是它由硫氧还蛋白即TRX及与TRX蛋白C末端相融合的重组人Delta-like1即hDLL1蛋白组成。
2、 根据权利要求1所述的一种可溶性融合蛋白，其特征是:所述的重组hDLLl 蛋白是hDLLl第127-224氨基酸截短体，它包含DSL结构域和部分N-Terminus 结构域。
3、 根据权利要求1所述的一种可溶性融合蛋白，其特征是:所述的重组hDLLl 蛋白包括N04的氨基酸序列，并由N03核酸序列编码；N03核酸序列编码为151 101 151 201251 AAGTGTGCAA CCCTGGCTGG AAAGGGCCCT ACTGCACAGA GCCG;N04氨基酸序列为 1 lhtdspddla tenperlisr latqrhltvg eewsqdlhss grtdlkysyr 51fvcdehyyge gcsvfcrprd dafghftcge rgekvcnpgw kgpyctep 。
4、 根据权利要求l所述的可溶性融合蛋白，其特征是所述的融合蛋白的C末端为His标记。
5、 根据权利要求l所述的可溶性融合蛋白，其特征是所述的融合蛋白包括N02的氨基酸序列，并由NOl核酸序列编码；NOl核酸序列编码为801N02氨基酸序列为 msdkiihltd dsfdtdvlka dgailvdfwa ewcgpckmia pildeiadey 51 qgkltvakln idqnpgtapk ygirgiptll lfkngevaat kvgalskgql 101 kefldanlag sgsghmhhhh hhssglvprg sgmketaaak ferqhmdspd 151 lgtddddkam adigslhtds pddlatenpe rlisrlatqr hltvgeewsq 201 dlhssgrtdl kysyrfVcde hyygegcsvf crprddafgh ftcgergekv 251 cnpgwkgpyc tepnsssvdk laaalehhhh hh。
6、根据权利要求1所述的一种可溶性融合蛋白，其特征是:在大肠杆菌BL21中用低温诱导方法实现可溶性表达。所述的融合蛋白
全文摘要
本发明涉及一种可溶性融合蛋白，具体地讲它是人Notch配体Delta-like1即hDLL1的一种新型可溶性截短体蛋白，其特征是它由硫氧还蛋白即TRX及与TRX蛋白C末端相融合的重组人Delta-like1即hDLL1蛋白组成。它实现了在原核表达系统中的可溶性表达，并且它具有生物学活性；此可溶性hDLL1截短体融合蛋白提供体外研究Notch信号是对细胞增殖、分化和凋亡的影响重要手段。
文档编号C07K19/00GK101225112SQ20071018858
公开日2008年7月23日 申请日期2007年12月12日 优先权日2007年12月12日
发明者飞 何, 骅 韩 申请人:中国人民解放军第四军医大学