针对ccr5的抗体及其应用的制作方法

专利名称：：针对ccr5的抗体及其应用的制作方法针对CCR5的抗体及其应用本发明涉及针对CCR5的抗体，生产它们的方法，包含所述抗体的药物组合物，及其应用。在过去数年间，已经出现了关于HIV-l利用特异性机制进入靶细胞的越来越多的理解。这推动了开发攻击该过程中的离散步骤的药物的尝试。最近已经批准了靶向进入的首个药物用于临床应用(enfuvirtide,T20;Lazzarin,A.，等，N.Engl.J.Med(新英格兰药物杂志).348(2003)2186-2195)。Enfbvirtide是在趋化因子受体结合后的阶段阻断融合的肽药物。HIV-1感染由在病毒包膜糖蛋白(Env)和包括CD4加趋化因子受体的细胞受体复合物之间的相互作用所启动(Pierson,T.C.和Doms,R.W.,Immuno.Lett(免疫通讯).85(2003)113-118;Kilby，J,M.禾口Eron,J丄,N.Engl.J.Med(新英格兰药物杂志).348(2003)2228-2238)。Env具有两个亚基表面糖蛋白gp120，其与细胞CD4受体相互作用并且其与病毒跨膜亚基gp41非共价的缔合。Gp41将gp120锚定到病毒膜上并且还为融合负责。gp120与细胞上的CD4的结合引发构象变化，所述构象变化暴露或产生这样的结合位点，其使gpl20能够与细胞表面趋化因子受体，即"辅助受体"相互作用。趋化因子受体是7个跨膜G-蛋白偶联受体(7TMGPCRs),其在正常情况下响应于趋化因子，炎症和其它功能传递信号，所述趋化因子是具有趋化性的小的细胞因子。临床应用中的大部分的药物针对其它的7TMGPCRs，并且这样耙向这些分子以阻断病毒进入是过去的药物开发程序的最成功类型的延伸。HIV-1分离株需要CD4和辅助受体进入并且感染细胞。人CC趋化因子受体CCR5是巨噬细胞-向性(R5)株的辅助受体并且在HIV-1的性传递中具有关键作用(Berger,E.A.,AIDS11(Suppl.A)(1997)3-16;Bieniasz,RD.和Cullen，B.R.,FrontiersinBioscience(生物科学的前沿)3(1998)d44-d58;Littman,D.R.,Cell(细胞)93(1998)677-680)。人CCR5(也称为"CCR5")由大部分HIV-1原代分离物使用并且对于建立和维持感染是关键的。此外，CCR5功能对于人类健康不是必要的。突变型CCR5等位基因，"CCR5△32"编码截短的无功能的蛋白(Samson，M.,等，Nature(自然)382(1996)722-725;Dean,M.,等，Science(科学)273(1996)1856-1862)。对于突变纯合的个体缺乏CCR5表达并且被强保护免于HIV-l感染。它们显示没有明显的表型结果并且对M向性HIV感染具有高度抗性，而杂合子个体表现延迟的疾病进展(Schwarz,M.K.和Wdls，T.N.,Nat,Rev.DrugDiscov.(自然药物发现综述)1(2002)347-358)。CCR5的缺乏不会带来明显的不利后果，这可能是因为CCR5是作为a趋化因子MIP-loc,MIP-lJ3，和RANTES的受体的高丰度趋化因子网络的部分，ot-趋化因子MIP-la、MIP-lfi、和RANTES共享很多重叠的功能，并且其大部分具有备选的受体(Rossi,D.和Zlotnik，A.,Annu.Rev.Immunol.(免疫学每年综述)18(2000)217-242)。将CCR5鉴定为HIV-1共同受体是基于其配体MIP-la，MIP-1J3和RANTES阻断R5而不是R5X4或X4分离物的感染的能力(Cocchi,F"等，Science(科学)270(1995)1811-1815)。CCR5还是"成簇"趋化因子的受体，所述"成簇"趋化因子主要在炎性反应过程中产生，并且控制嗜中性粒细胞、巨噬细胞和T细胞亚型(T辅助Thl和Th2细胞)的募集。例如，Thl反应典型地是包括有效抗病毒和肿瘤的细胞介导的免疫的那些，而Th2反应被认为是过敏症中的关键因素。因此，这些趋化因子受体的抑制剂可以有效用作免疫调节剂。对于Thl反应，例如，在包括类风湿性关节炎的自体免疫中，消除过分活跃的反应，或者，对于Th2反应，减少哮喘发作或过敏反应，包括遗传性过敏性皮炎(参见，例如，Schols，D.,Curr.Top,Med.Chem.4(2004)883-893;Mueller,A.，禾nStrange,P.G.,国际生物化学和细胞生物学杂志(Int.J.Biochem.CellBiol,)36(2004)35-38;Kazmierski,W.M.，等，现代药物靶点感染病症(Curr.DrugTargetsInfect.Disord.)2(2002)265-278;Lehner,T.，免疫学趋势(TrendsImmunol.)23(2002)347-351)。针对CCR5的抗体是，例如，PRO140(Olson，W.C.,等，J.Virol.(病毒学杂志)73(1999)4145-4155),和2D7(Samson，M.，等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)272(1997)24934-24941)。其它的抗体在下列各项中提到WO2006/103100，US2004/0043033,US6,610,834,US2003/0228306,US2003/0195348,US2003/0166870,US2003/0166024,US2003/0165988，US2003/0152913,US2003/0100058,US2003/0099645,US2003/0049251,US2003/0044411,US2003/0003440，US6,528,625,US2002/0147147,US2002/0146415,US2002/0106374,US2002/0061834,US2002/0048786,US2001/0000241，EP1322332,EP1263791,EP1207202,EP1161456,EP1144006，WO2003/072766，WO2003/066830,WO2003/033666,WO2002/083172,WO02/22077,WO01/58916,WO01/58915,WO01/43779，WO01/42308。本发明的目的是提供针对CCR5的新的抗体，其主要用作针对AIDS的治疗剂。发明概述本发明包括与CCR5结合的抗体，其特征在于重链可变结构域包括下式的氨基酸序列Gln-Val-Gln-Leu-X01-X02-Ser-Gly-Pro-Gly-Leu-Val-X03-Pro-Ser-Gln-Ser-Leu-Ser-Ile-Thr-Cys-Thr-Val-Ser-Gly-Phe-Pro-Leu-Gly-Ala-Phe-Gly-Val-His-Trp-Val-Arg-Gln-Ser-Pro-Gly-Lys-Gly-X04-Glu-Trp-Leu-Gly-Val-Ile-Trp-Lys-Gly-Gly-Asn-Thr-Asp-Tyr-Asn-AIa-Aia-Phe-X05-Ser-Arg-Leu-Arg-Ile-Thr-Lys-Asp-Asn-Ser-Lys-Ser-Gln-Val-Phe-Phe-Arg-Met-Asn-Ser-Leu-Gln-Thr-Asp-Asp-Thr-Ala-X06-Tyr-Tyr-Cys-Ala-Lys-Val-Asn-Leu-AJa-Asp-AJa-Met-Asp-Tyr-Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-X07-Val-X08-Val-Ser-Ser，其中X01是Lys或Gln,X02是Gin或Glu,X03是Arg或Lys,X04是Leu或Pro,X05是Met或Lys，X06是lie或Thr,X07是Ser或Thr,X08是lie或Thr(SEQIDNO:l)。优选地，所述抗体特征在于所述抗体的轻链可变结构域包括下式的氨基酸序列Asp-Ile-GIn-Met-Thr-Gln-Ser-Pro-AJa-Ser-Leu-Ser-AJa-Ser-Val-G]y-Glu-Thr-Val-Thr-Ile-Thr-Cys-Arg-Aa-Ser-Gy-Asn-X10-His-Gy-Tyr-Leu-AJa-Trp-Xll-Gln-Gln-Lys-X12-Gly墨Lys-X13-Pro-X14-Leu-Leu-X15-Tyr-Asn-Thr-Lys-Thr-Leu-Ala-Glu-GIy-Val-Pro-Ser-Arg-Phe-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Thr-XlS-Phe-Xiy-XlS-Xl^IIe-X20-Ser-X21-Gln-Pro-Glu-Asp-Phe-X22-X23-Tyr-Tyr-Cys-Gln-His-His-Tyr-Asp-Leu-Pro-Arg-Thr-Phe-Gly-Gly-Gly-Thr-Lys-X24-Glu-le-Lys'射X10是Ile或Ala，XI1是Phe或Tyr,X12是Gln或Pro，X13是Ser或Ala，X14是Gln或Lys,X15是Val或Ile，X16是Gln或Asp,X17是Ser或Thr,X18是Leu或Ala,X19是Lys或Thr,X20是Asn或Ser,X21是Leu或Ala，X22是Gly或Ala,X23是Asn或Thr，X24是Leu或Val(SEQIDNO:2)。优选地，所述抗体的特征在于是人IgG4同种型的抗体或人IgGl同种型的抗体，所述IgGl同种型任选地在CH1和CH2之间的氨基酸位置216-240的铰链区修饰和/或在CH2和CH3之间的氨基酸位置327-331的第二结构域间区域进行修饰。本发明优选的实施方案是包括根据本发明的抗体的药物组合物。本发明优选的实施方案是根据本发明的抗体用于制备药物组合物的应用。本发明优选的实施方案是制备包括根据本发明的抗体的药物组合物的方法。本发明优选的实施方案是编码能够与第二多肽组装在一起的多肽的核酸，其中所述第二多肽包括选自SEQIDNO:2，5的多肽的组的多肽，并且其中所述多肽包括SEQIDNO:1，6,7或8的氨基酸序列。本发明优选的实施方案是治疗患有免疫抑制疾病的患者的方法，其特征在于向所述患者施用治疗有效量的根据本发明的抗体。根据本发明的抗体优选地特征在于所述抗体结合CCR5并且包括可变重链或轻链结构域，其选自可变结构域，所述结构域包括SEQIDNO:6,7,8的重链可变结构域，SEQIDNO:9,10的轻链可变结构域，或其CCR5结合片段。根据本发明的抗体优选地特征在于包含作为重链可变结构域的重链可变结构域，其选自SEQIDNO:6,7或8的重链可变结构域，或其CCR5结合片段，和特征在于包含作为轻链可变结构域的轻链可变结构域，其选自SEQIDNO:9或IO的轻链可变结构域，或其CCR5结合片段，其中所述重链可变结构域和所述轻链可变结构域彼此独立地选择。根据本发明的抗体优选地特征在于所述重链可变结构域包括选自由SEQIDNO:6,7,8的重链可变结构域氨基酸序列组成的组的氨基酸序列，更精确地所述抗体包括选自SEQIDNO:6,7或8的重链可变结构域，或其CCR5结合片段。根据本发明的抗体优选地特征在于轻链可变结构域包括选自由SEQIDNO:9,10的轻链可变结构域氨基酸序列组成的组的氨基酸序列，更精确地所述抗体包括选自SEQIDNO:9，或10的轻链可变结构域或其CCR5结合片段的氨基酸序列。根据本发明的抗体优选地特征在于恒定区(轻链和重链)是人起源的。这样的恒定区(链)是现有技术中公知的并例如由Kabat所描述(见，例如.Johnson,G.和Wu,T.T.,NucleicAcidsRes.(核酸研究)28(2000)214-218)。例如，有效的人重链恒定区包括独立选自由SEQIDNO:3,4组成的组的氨基酸序列。例如，有效的人轻链恒定区包括SEQIDNO:5的k轻链恒定区的氨基酸序列。进一步优选的是所述抗体是小鼠起源的并且包括根据Kabat的小鼠抗体的抗体可变序列构架(见例如，Johnson,G.和Wu，T.T.，NucleicAcidsRes.(核酸研究)28(2000)214-218)。所述抗体抑制人CCR5的一种或多种功能，如结合CCR5的配体，信号传导活性(例如，活化哺乳动物G蛋白，诱导快速和瞬时的细胞质游离(^2+浓度增加，和/或刺激细胞反应(例如刺激趋化性，胞吐作用或白细胞的炎性介质释放，整联蛋白激活))。所述抗体抑制RANTES,MIP-1a，MIP-13和/或HIV与人CCR5的结合并且抑制由人CCR5介导的功能，如白细胞运输，HIV进入细胞，T细胞激活，炎性介质释放和/或白细胞脱粒。根据本发明的抗体特异性结合人CCR5并且在测定中以4.0pg/ml或更低的IQo值抑制HIV与靶细胞的融合，所述测定包括使所述靶细胞在存在病毒的情况下与抗体接触，所述抗体浓度有效抑制病毒和所述细胞之间的膜融合。根据本发明的抗体特异性结合CCR5，并且以1.5pg/ml或更低，优选地0.3jug/ml或更低的ICso值抑制第一共表达CCR5和CD4多肽的细胞和第二表达HIVenv蛋白的细胞之间的膜融合。根据本发明的抗体特异性结合CCR5，并且在测定中以1.5pg/ml或更低的IC5Q值抑制靶细胞的细胞反应的剌激，优选地抑制迁移，所述测定包括使所述靶细胞与抗体在存在RANTES,MIP-1a,禾Q/或MIP-1P的情况下接触。根据本发明的抗体优选地在多达100pg/ml的抗体浓度在结合测定中不抑制趋化因子与CCR1,CCR2,CCR3，CCR4,CCR6，禾口CXCR4的结合。根据本发明的抗体优选地在多达50)ig/ml的抗体浓度不刺激在表达CCR5和Ga16的CHO细胞中检测的细胞内Ca^增加。根据本发明的抗体优选地是人同种型IgGl,IgG2，IgG3,或IgG4，其中优选IgGl或IgG4。根据本发明的抗体优选地是IgG4同种型。根据本发明的抗体优选地是IgGl同种型。根据本发明的抗体优选地是具有突变S228P的lgG4同种型。根据本发明的抗体，即，重链和轻链恒定区是在CH1和Ch2之同約氨基酸位置216-240的铰链区修饰的，优选地在CH1和CH2之间约氨基酸位置220-240的铰链区修饰的IgGl或IgG4同种型的重链和轻链恒定区(Angal，S.，等，Mol.Immunol.(分子免疫学)30(1993)105-108),和/或在CH2和CH3之间的约氨基酸位置327-331的第二结构域间区域修饰的IgGl或IgG4同种型的重链和轻链恒定区(根据Kabat编号，见例如Johnson，G.和Wu,T.T.,NucleicAcidsRes.(核酸研究)28(2000)214-218)。所述修饰减少或避免效应子功能(ADCC和/或CDC)。IgG类别的转换可以通过所述抗体的重链恒定区和轻链恒定结构域与来自需要类别的抗体如IgGl突变体或IgG4的那些进行交换而进行。所述方法在现有技术中是公知的。根据本发明的抗体优选地特征在于人亚类IgGl，在L234中包含至少一个突变(在氨基酸位置234的亮氨酸)，L235,D270，N297，E318，K320，K322,P331，和/或P329(根据EU索引编号)。优选地，所述抗体是包括突变L234A(丙氨酸取代在氨基酸位置234处的亮氨酸)和L235A的人IgGl同种型的抗体。根据本发明的抗体优选地特征在于是在位置S228包含突变的人IgG4同种型的抗体。因此，本发明在一方面涉及抗体，特征在于所述抗体结合CCR5，包含来自人起源的Fc部分，并且不结合人补体因子Clq和/或激活补体因子C3。优选地，所述抗体显示与人FcY受体的减少的结合或不与其结合。本发明还包括根据本发明的编码抗体链，可变结构域或其CDR的核酸分子。编码的多肽能够与各个其它的抗体链组装在一起以得到根据本发明的针对CCR5的抗体分子。本发明还提供包含根据本发明的所述核酸并能够在原核或真核宿主细胞中表达所述核酸的表达载体，以及包含所述载体用于重组生产所述抗体的宿主细胞。本发明还包括包含根据本发明的载体的原核或真核宿主细胞。本发明还包括生产根据本发明的重组人或人源化抗体的方法，其特征在于在原核或真核宿主细胞中表达根据本发明的核酸并且从所述细胞或细胞培养物上清中回收所述抗体。本发明还包括可由所述重组方法获得的抗体。根据本发明的抗体显示对于需要CCR5靶向治疗的患者的益处。根据本发明的抗体具有新的和创造性的性质，其导致对于患有所述疾病的患者的益处，尤其是对于患有免疫抑制的患者，尤其是对于患有HIV感染的患者的益处。本发明还提供治疗患有免疫抑制的患者，尤其是患有HIV感染的患者的方法，所述方法包括向诊断患有所述疾病(并且因此需要所述治疗)的患者施用有效量的根据本发明的与CCR5结合的抗体。所述抗体优选地在药物组合物中施用。本发明还包括根据本发明的抗体作为药物用于治疗免疫抑制疾病，优选地用于治疗HIV感染，用于治疗患有免疫抑制的患者，以及用于制备根据本发明的药物组合物的应用。此外，本发明包括制备根据本发明的药物组合物的方法。本发明还包括药物组合物，其包含药物有效量的根据本发明的抗体，以及任选地用于配制药用目的的抗体的缓冲液和/或佐剂。本发明还提供在药用载体中包含所述抗体的药物组合物。在一个实施方案中，所述药物组合物可以包含在生产的制品或试剂盒中。因此，本发明的一个方面是根据本发明的抗体用作药物。本发明的另一个方面是根据本发明的抗体用于治疗免疫抑制疾病。另外一方面是根据本发明的抗体用于制备治疗免疫抑制疾病的药物的应用。发明详述术语"抗体"包括各种形式的抗体结构，其包括但不限于完整的抗体，和抗体片段。根据本发明的抗体优选地是人源化的抗体，嵌合抗体，或另外遗传改造的抗体，只要保留了根据本发明的特征性性质。"抗体片段"包括全长抗体的一部分，优选的是抗体的可变结构域，或至少是它的抗原结合位点。抗体片段的实例包括双抗(diabodies)，单链抗体分子，免疫毒素和形成自抗体片段的多特异性抗体。scFv抗体例如描述在Huston,J.S.,MethodsinEnzymol(酶学方法).203(1991)46-88中。此外，抗体片段包括具有VH结构域特征的单链多肽，即能够与VL结构域在一起组装成功能性抗原结合位点，或具有结合于CCR5的VL结构域的特征，即能够与VH结构域一起组装成功能性抗原结合位点，由此提供抑制与靶细胞的膜融合或HIV融合的性质。术语"单克隆抗体"或"单克隆抗体组合物"用于本文时指单氨基酸组成的抗体分子的制备物。术语"嵌合抗体"指包括来自小鼠的可变结构域，即结合区和来自不同的来源或物种的恒定区的至少一部分的单克隆抗体，其通常由重组DNA技术制备。包括小鼠可变结构域和人恒定区的嵌合抗体是特别优选的。所述小鼠/人嵌合抗体是表达的免疫球蛋白基因的产物，其包括编码小鼠免疫球蛋白可变结构域的DNA片段和编码人免疫球蛋白恒定区的DNA片段。本发明涵盖的其他形式的"嵌合抗体"是其中类别或亚类已经被从原始抗体的类别或亚类修饰或转变的那些。所述"嵌合"抗体也称为"类别转换抗体"。生产嵌合抗体的方法包括本领域公知的常规重组DNA和基因转染技术。见例如Morrison,S丄.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)81(1984)6851-6855;美国专利号.5,202,238和5,204,244。术语"人源化抗体"指与母体免疫球蛋白相比，其中构架和/或"互补决定区(CDR)"已经被修饰以包括不同物种的免疫球蛋白的CDR的抗体。在优选的实施方案中，小鼠CDR被移植到人抗体的构架区以制备"人源化抗体"。见例如Riechmann,L.,等，Nature(自然)332(1988)323-327;和Neuberger,M.S.,等，自然314(1985)268-270。特别优选的CDRs对应于那些代表性序列，其识别上述关于嵌合和双功能性抗体的抗原。术语"与CCR5结合"用于本文时，意味着在基于细胞的体外ELISA测定中抗体与CCR5的结合(CCR5表达细脱例如转化的CHO细胞，L1.2细胞)。如果在100ng/ml的抗体浓度，抗体导致5或更多的S/N(信号/噪声)，优选地10或更多的S/N(信号/噪声)比率则发现结合。术语"七跨膜趋化因子分子结构"用于本文时指当其位于细胞膜双层时，CCR5显示的天然结构(见，例如，Oppermann,M.，Cell.Sig.(细胞信号)16(2004)1201-1210)。如其它G蛋白偶联受体(例如，G蛋白-偶联受体lb)，CCR5由细胞外N端结构域，跨膜结构域和细胞质C端结构域组成。跨膜结构域由通过三个细胞质和三个细胞外片段连接的七个疏水跨膜片段组成。根据本发明的抗体在其七跨膜趋化因子分子结构中与CCR5结合。术语"表位"意指能够特异性结合抗体的蛋白决定子。表位通常由分子的化学活性表面基团组成，诸如氨基酸或糖侧链，并且通常表位具有特异性的三维结构特征，以及特异性的电荷特征。构象和非构象的表位的区分在于存在变性溶剂的条件下，失去与前者的结合而不是与后者的结合。优选地，本发明所述的抗体特异性结合天然的而不是变性的CCR5。术语"膜融合"指在共表达CCR5和CD4多肽的第一细胞与表达HIVerw蛋白的第二细胞之间的融合。膜融合通过萤光素酶报告基因测定来确定。术语"抑制HIV与耙细胞的融合"指在测定中测量的抑制HIV与靶细胞的融合，所述测定包括使靶细胞在存在所述病毒的情况下与抗体接触，所述抗体的浓度有效抑制病毒和所述细胞之间的膜融合，和测量萤光素酶报道基因活性。"可变结构域"((轻链)(VO的可变结构域，重链(VH)的可变结构域)用于本文时指直接涉及抗体与抗原结合的轻链和重链结构域对的每一个。可变轻链结构域和可变重链结构域具有相同的一般结构并且每个结构域包括四个构架区(FR)，其序列是广泛保守的，通过三个"高变区"(或互补决定区，CDRs)连接。所述构架区采取P-折叠构象并且CDRs可以形成连接|3-折叠结构的环。每条链中的CDRs通过构架区保持它们的三维结构并且与来自其它的链CDRs形成抗原结合位点。所述抗体的重链和轻链CDR3区在根据本发明的抗体的结合特异性/亲和性中具有特别重要的作用并且因此提供本发明的另外的目的。根据本发明的抗体优选地特征在于所述抗体包括重链可变结构域和轻链可变结构域，其选自由下列各项组成的组合的组中a)由SEQIDNO:6的氨基酸序列定义的重链可变结构域和由SEQIDNO:9的氨基酸序列定义的轻链可变结构域；、)由SEQIDNO:6的氨基酸序列定义的重链可变结构域以及由SEQIDNO:10的氨基酸序列定义的轻链可变结构域；c)由SEQIDNO:7的氨基酸序列定义的重链可变结构域和由SEQIDNO:9的氨基酸序列定义的轻链可变结构域；d)由SEQIDNO:7的氨基酸序列定义的重链可变结构域和由SEQIDNO:10的氨基酸序列定义的轻链可变结构域；e)由SEQIDNO:8的氨基酸序列定义的重链可变结构域和由SEQIDNO:9的氨基酸序列定义的轻链可变结构域；f)由SEQIDNO:8的氨基酸序列定义的重链可变结构域和由SEQIDNO:10的氨基酸序列定义的轻链可变结构域。术语"抗体的抗原结合部分"当用于本文时指对抗原结合负责的抗体的氨基酸残基。抗体的抗原结合部分包括来自"互补决定区"或"CDRs"的氨基酸残基。"构架"或"FR"区是除了本文定义的高变区残基的那些可变结构域区。因此，抗体的轻链和重链可变结构域从N端到C端包括结构域FR1，CDR1，FR2,CDR2,FR3，CDR3，禾BFR4。特别地，重链的CDR3是对抗原结合贡献最大的区域并且限定抗体的性质。CDR和FR区按照Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(免疫目的蛋白质的序列)，第5版，公共健康服务(PublicHealthService),美国全国卫生研究所(NationalInstitutesofHealth),Bethesda，MD，公开号91-3242(1991)的标准定义和/或来自"高变环"的那些残基确定。术语"核酸"或"核酸分子"用于本文时，倾向于包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但是优选地是双链DNA。当在本申请中应用时，术语"氨基酸"表示天然存在的羧基oc-氨基酸，其包括丙氨酸(三字母密码ala，单字母密码A),精氨酸(arg，R),天冬酰胺(asn,N),天冬氨酸(asp，D),半胱氨酸(cys，C)，谷氨酰胺(gln,Q),谷氨酸(glu,E),甘氨酸(gly,G)，组氨酸(his，H),异亮氨酸(ile,I),亮氨酸(leu,L)，赖氨酸(lys，K)，甲硫氨酸(met,M)，苯丙氨酸(phe，F),脯氨酸(pro，P)，丝氨酸(ser,S)，苏氨酸(thr,T)，色氨酸(trp，W),酪氨酸(tyr,Y)，和缬氨酸(val,V)。当将核酸置于与另一个核酸的功能关系中时，所述核酸是"可操作性地连接"。例如，前序列或分泌前导序列的DNA与多肽的DNA可操作性地连接，如果其作为参与多肽分泌的前蛋白表达的话；启动子或增强子与编码序列可操作性地连接如果其影响所述序列的转录的话；或核糖体结合位点与编码序列可操作性地连接如果其定位有利于翻译的话。一般而言，"可操作性地连接"指连接的DNA序列是共线性的，并且在分泌fP导序列的情况中，是连续的并且在阅读框中。然而，增强子不必是连续的。连接通过在适合的限制性位点的连接反应实现。如果所述位点不存在，根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。用于本文时，表述"细胞"，"细胞系"和"细胞培养物"交替使用并且所有这样的定义包括子代。因此，短语"转化子"和"转化细胞"包括原代目标细胞和来自其不管经过多少次转移的培养物。还要理解所有的子代不可能在DNA内容物上精确地相等，这是因为故意或无意的突变。包括筛选的与原始转化的细胞具有相同的功能或生物活性的变体子代。抗体的"Fc部分"不直接涉及抗体与抗原的结合，但是显示不同的效应子功能。根据它们重链的恒定区的氨基酸序列，抗体或免疫球蛋白被分成数类IgA，IgD,IgE,IgG和IgM，并且这些中的一些可以被进一步分成亚类(同种型)，例如IgG分成IgGl,IgG2，IgG3，和lgG4，IgA分成IgAl和lgA2。根据重链恒定区，免疫球蛋白的不同种类分别被称为aSey和p。根据本发明的抗体优选地是IgG类型的。用于本文时，术语"衍生自人起源的Fc部分"指亚类IgG4的人抗体的Fc部分或亚类IgGl，IgG2，或IgG3的人抗体的Fc部分，包括其突变形式。优选地，亚类IgGl,IgG2,或IgG3的人抗体的Fc部分以这样的方式修饰，其使如下面定义的减少或无Fcy受体(FcyR，S卩Fc7RIIIa)结合和/或减少或无Clq结合可以关于无修饰的Fc部分检测。"抗体的Fc部分"是熟练的技术人员公知的术语，并且是依据抗体的木瓜蛋白酶分解而定义的。本发明所述的抗体包含来源于人源的Fc部分作为Fc部分和优选地人恒定区的所有其他部分。优选地，Fc部分是人Fc部分并且尤其优选来自人lgG4亚类或来自人IgGl亚类的Fc部分，或来自人IgGl亚类的突变的Fc部分。最优选的是在SEQIDNO:3,SEQIDNO:4，具有突变L234A和L235A的SEQIDNO:3，具有突变S228P的SEQIDNO:4中显示的Fc部分和重链恒定区。尽管IgG4表现出减少的Fcy受体(FcyRIIIa)结合，但是其他IgG亚类的抗体表现出强结合。然而，Pro238，Asp265,Asp270，Asn297(无Fc碳水化合物)，Pro329,Leu234,Leu235,Gly236,Gly237,Ile253,Ser254,Lys288,Thr307，Gln311，Asn434,和His435是这样的残基，即，如果改变，其也提供减少的Fc受体结合(Shields,R丄.，等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)276(2001)6591-6604;Lund,J.,等，FASEBJ.(FASEB杂志)9(1995)115-119;Morgan,A.,等，Immunology(免疫学)86(1995)319-324;EP0307434)。优选地，本发明所述的抗体是关于IgG4亚类或IgGl或IgG2亚类的Fey受体结合，具有S228，L234,L235,和/或D265的突变，和/或含有PVA236突变。优选的是突变S228P，L234A，L235A,L235E，禾口/或PVA236(PVA236意指IgGl氨基酸位置233-236的氨基酸序列ELLG(以单字母氨基酸密码表示或者IgG4的EFLG由PVA替代)。特别优选的是IgG4的突变S228P，和IgGl的L234A，L235A。抗体的Fc部分直接参与ADCC(抗体-依赖性细胞介导的细胞毒性)和CDC(补体-依赖性细胞毒性)。补体激活(CDC)通过补体因子Clq与大部分IgG抗体亚类的Fc部分结合而起始。Clq与抗体的结合由在所谓的结合位点的定义的蛋白-蛋白相互作用而引起。这样的Fc部分结合位点是本领域现有技术中己知的，并且例如由Lukas,T丄，等，J.Immunol.(免疫学杂志)127(1981)2555-2560;Brunhouse,R.,和Cebra,J丄,Mol.Immunol.(分子免疫学)16(1979)卯7-917;Burton,D.R.,等，Nature(自然)288(1980)338-344;Thommesen,J.E.,等，Mol,Immunol.(分子免疫学)37(2000)995-1004;Idusogie,E.E.，等，J.Immunol.(免疫学杂志)164(2000)4178-4184;Hezareh,M.,等，J.Virol.(病毒学杂志)75(2001)12161-12168;Morgan,A"等，Immunology(免疫学)86(1995)319隱324;和EP0307434。这样的Fc部分结合位点特征在于，例如，氨基酸L234,L235，D270,N297,E318,K320,K322,P331，和P329(按照Kabat的EU索引编号)。亚类IgGl，IgG2，和IgG3的抗体通常表现出补体活化，包括Clq和C3结合，而IgG4不激活补体系统，并且不结合Clq和C3。艮卩，在其中需要ADCC和/或CDC的情况中，优选IgGl亚类的Fc部分，在其中需要减少的或无ADCC禾B/或CDC的情况中，优选IgG4亚类或修饰的/突变的IgGl亚类的Fc部分。在一个方面，本发明涉及结合CCR5并且显示减少的与FcY受体和/或补体因子Clq的结合或不与其结合的抗体。不结合Fc受体和/或补体因子Clq的抗-CCR5抗体不引发抗体-依赖性细胞的细胞毒性(八0<^)和/或补体依赖性细胞毒性0:0(:)，而显示减少的与Fc受体和/或补体因子Clq的结合的抗-CCR5抗体显示减少的ADCC和/或CDC。优选地，这种抗体特征在于，它结合CCR5，包含来源于人源的Fc部分，并且不结合Fc受体和/或补体因子Clq或显示减少的与其的结合。更优选地，这种抗体是人的、或人源的抗体、或T-细胞抗原消耗(depleted)的抗体。Clq结合可以按照Idusogie，E.E.,等，免疫学杂志(J.Immunol.)164(2000)4178-4184进行测量。如果在这样的测定中，在492-405nm处关于测试抗体的光学密度(OD)低于以8fxg/ml抗体浓度的未修饰的野生型抗体Fc部分的人Clq结合的值的15%，则发现不了"Clq结合"。在相同的条件下，减少的"Clq结合"是未修饰的野生型抗体Fc部分的人Clq结合的值的15%-30%范围内。ADCC可以作为在人NK细胞上所述抗体对于人FcyRIIIa的结合而进行测量。结合在20pg/ml抗体浓度处确定。"没有Fq受体结合"或"没有ADCC"意指与人IgGl相同的抗体(SEQIDNO:3)的结合相比，在20pg/ml的抗体浓度处的在人NK细胞上达到与人FcyRIIIa的结合的多达30%。"减少的Fcy受体结合"或"减少的ADCC"意指与人IgGl相同的抗体(SEQIDNO:3)的结合相比，在人NK细胞上达到与人FcyRIIIa的30%-多达60%的结合。本发明的另一个方面是结合CCR5并且还结合FcY受体和/或补体因子Clq的抗体。结合Fc受体和/或补体因子Clq的抗-CCR5抗体激发抗体依赖性的细胞的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖的细胞毒性(CDC)。优选地，该抗体特征在于其结合CCR5，包含来自人源的Fc部分，并且还结合Fc受体和/或补体因子Clq。更优选地，该抗体是人或人源化的抗体，或T细胞抗原消耗的抗体。Clq结合可以根据Idusogie,E.E.,等，J.Immunol.164(2000)4178-4184测量。ADCC可以作为抗体与人NK细胞上的人Fc7RIIIa结合进行测量。结合在20pg/ml的抗体浓度进行确定。另外，根据本发明的抗体包括这样的抗体，其具有不影响或不改变本发明所述的抗体的上述特征的"保守序列修饰"，核苷酸和氨基酸序列修饰(变体抗体)。修饰可以通过本领域已知的标准技术引入，诸如通过定向诱变和PCR介导的诱变引入。保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代的那些。具有相似侧链的氨基酸残基家族已经在本领域内得到了定义。这些家族包括具有下述氨基酸具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电荷极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有(3-分支的侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)，和具有芳香侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在人抗-CCR5抗体中预测的非必需氨基酸残基可以优选地由来自同一侧链家族的另一种氨基酸残基替代。因此，"变体"抗-CCR5抗体，在本发明中是指这样的分子，其在氨基酸序列上与"母体"抗-CCR5抗体的氨基酸序列不同在于在所述母体抗体的一个或多个可变区中达到10个、优选约2-约5个添加、删除、和/或取代。氨基酸取代可以通过基于分子建模的突变进行，如Riechmann，L.,等，Nature(自然)332(1988)323-327和Queen,C.,等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)86(1989)10029-10033所述。本发明另一个实施方案是生产不结合Fey受体和/或Clq或显示减少的与Fey受体和/或Cq结合的针对CCR5的抗体的方法，其特征在于对编码与CCR5结合的人IgGl类型抗体的重链的核酸的序列以这样的方式进行修饰，其使所述修饰的抗体不结合或显示减少的与Clq和/或Fcy受体的结合，将所述修饰的核酸和编码所述抗体的轻链的核酸插入表达载体，将所述载体插入真核宿主细胞，表达编码的蛋白并且从宿主细胞或上清液中回收。优选地，所述抗体通过"类别转换"，即Fc部分的改变或突变(例如从IgGl至l」IgG4，和/或IgGl/IgG4突变)修饰，优选地定义为IgGlvl(PVA-236;GLPSS331),IgGlv2(L234A;L235A),IgGlv3(S228P;L235E),IgGlx(S228P),IgG4vl(PVA-236)。GLPSS331意为突变E233P,L234V,L235A，SG236,A327G，A加S,P331S。关于序列的同一性或同源性在本文定义为在比对序列并在需要的情况下引入间隙以获得最大百分比序列同一性后，候选序列与母体序列相同的氨基酸残基的百分比。N端，C端或在抗体序列中的内部延伸，缺失或插入不会被理解为影响序列同一性或同源性。变体保留结合人CCR5的能力并且优选地具有优越于母体抗体的性质。例如，变体在治疗过程中可以具有减少的副作用。本文的"母体"抗体是由用于制备变体的氨基酸序列编码的抗体。优选地，母体抗体具有人构架区并且如果存在具有人抗体恒定区或人抗体恒定结构域。例如，母体抗体可以是人源化的或人抗体。根据本发明的抗体优选地通过重组方式进行生产。所述方法是现有技术中广泛公知的并且包括在原核和真核细胞中的蛋白质表达以及随后分离抗体多肽并且通常纯化到药用纯度。对于蛋白质表达，将编码轻链和重链或其片段的核酸通过标准方法插入表达载体。表达在适合的原核或真核宿主细胞中进行，所述细胞如CHO细胞，BHK细胞，？￡1^6细胞，NS0细胞，SP2/0细胞，HEK293细胞，COS细胞，酵母，或大肠杆菌(E.coli)细胞，并且将所述抗体从所述细胞中进行回收(从上清液或在细胞裂解后回收)。重组生产抗体是现有技术中公知的并且例如描述在Makrides，S.C.,ProteinExpr.Purif.17(1999)183-202;Geisse，S.，等，ProteinExpr.Purif.8(1996)271-282;Kaufman,R丄,Mol.Biotechnol(生物技术),16(2000)151-160;Werner,R,G.,Arzneimittelforschung-DrugRes.48(1998)870-880的综述文章中。抗体可以存在于完整的细胞，在细胞裂解物中或以部分纯化或完全纯化的形式存在。通过标准技术进行纯化以去除其它的细胞成分或其它的污染物，例如其它的细胞核酸或蛋白质，所述技术包括碱/SDS处理，CsCl显带法，柱层析，琼脂糖凝胶电泳，和其它本领域中已知的技术。见，Ausubel,R,等,(ed.)CurrentProtocolsinMolecularBiology(目前在分子生物学中的方法)，GreenePublishingandWileyInterscience，纽约(1987)。在NS0细胞中的表达由例如Barnes,L.M.,等，Cytotechnology32(2000)109-123;Barnes，L.M.，等，Biotech.Bioeng.(生物技术生物工程)73(2001)261-270描述。瞬时表达由例如Durocher，Y.,等，Nucl.Acids.Res.(核酸研究)30(2002)E9描述。克隆可变结构域由Orlandi,R.,等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)86(1989)3833-3837;Carter,P.,等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)89(1992)4285-4289;Norderhaug,L.,等，J.Immunol.Methods(酶学方法杂志)204(1997)77-87描述。优选的瞬时表达系统(HEK293)由Schlaeger,E,J.和Christensen，K.,在Cytotechnology30(1999)71-83中，和Schlaeger，E,J.，在J.Immunol.Methods(酶学方法杂志)194(1996)191-199中进行描述。单克隆抗体适合地通过常规免疫球蛋白纯化方法如例如蛋白质A-琼脂糖，羟基磷灰石层析，凝胶电泳，透析，或亲和层析从培养基中分离。使用常规方法，容易地分离并测序编码单克隆抗体的DNA和RNA。杂交瘤细胞可以作为这样的DNA和RNA的来源。一旦分离，可以将DNA插入表达载体中，其接着被转染到用别的方式不产生免疫球蛋白的宿主细胞中如HEK293细胞，CHO细胞,或骨髓瘤细胞中以在宿主细胞中获得重组单克隆抗体的合成。200780035346.3说明书第18/27页人CCR5抗体的氨基酸序列变体通过将适合的核苷酸变化引入到编码抗体的DNA或通过肽合成进行制备。然而，所述修饰可以仅在非常有限的范围内例如如上述的范围内进行。例如，所述修饰不改变上述抗体的特征如IgG同种型和表位结合，但是可以提高重组生产的产率，蛋白质稳定性或有利于纯化。还可以通常用丝氨酸取代不涉及维持抗-CCR5抗体的适合构象的任何半胱氨酸残基从而提高分子的氧化稳定性并防止异常的交联。相反地，可以将半胱氨酸键加入抗体中以提高其稳定性(特别是当所述抗体是抗体片段如Fv片段时)。另一种类型的抗体的氨基酸变体改变抗体的原始糖基化模式。"改变"意味着去除抗体中存在的一个或多个碳水化合物部分和/或加入在抗体中不存在的一个或多个糖基化位点。抗体的糖基化典型地是N连接的。术语"N-连接的"指将碳水化合物部分连接到天冬酰胺残基的侧链上。其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸的三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸是将碳水化合物部分酶连接到天冬酰胺侧链的识别序列。因此，这些三肽序列的任一在多肽中的存在产生潜在的糖基化位点。通过改变氨基酸序列方便地将糖基化位点加入抗体中从而使其包含一个或多个上述三肽序列(对于N-连接的糖基化位点)。编码抗-CCR5抗体的氨基酸序列变体的核酸分子通过多种本领域己知的方法进行制备。这些方法包括，但不限于，从天然来源分离(在天然存在氨基酸序列变体的情况下)或通过人源化的CCR5抗体的早期制备的变体或非变体形式的寡核苷酸介导(或位点定向)诱变，PCR诱变，和盒式诱变进行制备。另一种类型的共价修饰包括化学或酶促地将糖苷偶联到抗体上。这些方法有利之处在于它们不需要在宿主细胞中生产能够N或O-连接的糖基化的抗体。根据所用的偶联方法，所述糖可以连接于(a)精氨酸和/或组氨酸，(b)游离羧基，(c)游离巯基如半胱氨酸的那些，(d)游离羟基如丝氨酸，苏氨酸或羟脯氨酸的那些，(e)芳香族残基如苯丙氨酸，酪氨酸，或色氨酸的那些，或(f)谷氨酰胺的酰胺基团。这些方法描述在WO87/05330中，和描述在Aplin,J.D和Wriston,J.C.Jr.,CRCCrit.Rev.Biochem.10(1981)259-306中。去除在抗体上存在的任何碳水化合物部分可以化学或酶促地进行。化学去糖基化需要将抗体暴露于化合物三氟甲磺酸或等价的化合物。这种处理导致大多数或除了连接的糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)的所有的糖的裂解而保留了抗体的完整。化学去糖基化由Sojar，H.T.和Bahl，O.R，Arch.Biochem.Biophys(生物化学生物物理进展).259(1987)52-57;Edge，A.S.，等Anal.Biochem.118(1981)131-137描述。在抗体上的碳水化合物部分的酶促裂解可以通过使用多种内切糖苷酶和糖苷外切酶完成，如Thotakura,N.R.和Bahl，O.P,，Meth.Enzymol(酶学方法).138(1987)350-359所述。抗体的另一种类型的共价修饰包括将抗体连接于多种非蛋白质聚合物，例如聚乙二醇，聚丙二醇或聚氧化烯(polyoxyalkylenes)中的一种，连接方法见美国专利号4,640,835;4,496,689;4,301,144;4,670,417;4,791,192;4,179，337。根据本发明的重链和轻链可变结构域与启动子序列，翻译起始序列，恒定区序列，3'未翻译区序列，多腺苷酸化序列，和转录终止序列组合以形成表达载体构建体。所述重链和轻链表达构建体可以组合在单一载体中，共转染，系列转染或单独转染到宿主细胞中，接着将其融合以形成表达两链的单一宿主细胞。本发明还包括根据本发明的抗体用于体外诊断AIDS敏感性的应用，其优选地通过免疫测定确定在人血浆样品的可溶性CCR5(Tsimanis,T.,ImmunologyLetters(免疫通讯)96(2005)55-61)和根据本发明的抗体之间的结合进行。CCR5的表达与疾病进展相关并且可以用于鉴定AIDS敏感性的低或高风险个体。对于诊断目的，可以标记或不标记抗体或抗原结合片段。典型地，诊断测定需要检测由抗体或抗体片段与CCR5的结合导致的复合物的形成。在另一个方面，本发明提供组合物，例如药物组合物，其包含本发明的单克隆抗体或其抗原结合部分的一个或组合，以及与其一起配制的药用载体。当用于本文时，"药用载体"包括任何和所有的溶剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收/再吸收延迟剂等，它们是生理相容的。优选地，载体适于注射或输注。本发明的组合物可以通过本领域已知的多种方法施用。如本领域技术人员所理解，施用的路径和/或方式将取决于需要的结果而变化。药用载体包括无菌水性溶液或分散液以及用于制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。将这样的介质和试剂用于药物活性物质是本领域已知的。除了水之外，载体可以是，例如，等渗缓冲的盐溶液。不管所选择的施用途径，通过本领域技术人员已知的常规方法，将可以以适当的水合形式使用的和/或用在本发明的药物组合物中的本发明的化合物配制成药用剂型。在本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以不同，以获得这样的活性成分的量，所述量对具体的患者、组合物和施用模式有效地实现需要的治疗反应，而对患者无毒性(有效量)。选择的剂量水平将取决于许多药物代谢动力学因素，包括所用的本发明的具体组合物，或其酯，盐或酰胺的活性，施用的途径，施用的时间，所用的具体化合物的排泄率，与所用的具体组合物组合的其他药物、化合物和/或物质，被治疗的患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康和先前的医疗史以及医学领域公知的类似因素。本发明包括根据本发明的抗体用于治疗患有免疫抑制的患者的应用，所述免疫抑制如在患有免疫缺陷综合症如AIDS的患者中的免疫抑制，在经历放射治疗、化疗、对于自体免疫疾病的治疗或其它导致免疫抑制的药物治疗(例如皮质类固醇治疗)的患者中的免疫抑制，或本发明包括根据本发明的抗体用于治疗患有GvHD或HvGD(例如移植后)的患者的应用。本发明还包括治疗患有所述免疫抑制的患者的方法。本发明还提供制备药物组合物的方法，所述药物组合物包含有效量的根据本发明的抗体以及药用载体，以及根据本发明的抗体用于这样方法的应用。本发明还提供根据本发明的抗体用作药物。此外，还提供根据本发明的抗体用于治疗免疫抑制疾病。本发明还提供有效量的根据本发明的抗体优选地与药用载体在一起用于制备药剂的应用，所述药剂用于治疗患有免疫抑制的患者。本发明还提供有效量的根据本发明的抗体优选地与药用载体一起用于制备药剂的应用，所述药剂用于治疗患有由CCR5介导的炎性介质释放的患者。提供下述实施例和序列表以帮助理解本发明，其真正的范围在后附的权利要求中设定。应该理解，在不背离本发明的精神的条件下，可以在描述的方法中进行修改。序列描述SEQIDNO:1SEQIDNO:2SEQIDNO:3SEQIDNO:4SEQIDNO:5SEQIDNO:6SEQIDNO:7SEQIDNO:8SEQIDNO:9SEQIDNO:10式I，重链，可变结构域式II,轻链，可变结构域yl'重链恒定区重链恒定区k轻链恒定区重链可变结构域重链可变结构域重链可变结构域轻链可变结构域轻链可变结构域实施例1重组生产抗体用于表达根据本发明的抗体的载体己经如下构建。通过将重链可变结构域与人IgGl(SEQIDNO:3)恒定区连接在表达载体pSVgpt中构建重链表达载体。通过将轻链可变结构域与人K轻链恒定区(SEQIDNO:5)连接在表达载体pSVhyg中构建轻链表达载体。将包括前导信号肽、前导内含子和鼠免疫球蛋白启动子的5，侧翼序列，和包括剪接位点和内含子序列的3，侧翼序列使用载体VH-PCR1和VK-PCR1作为模板来引入。将重链和轻链表达载体共转染到NSO细胞(ECACC号85110503,无免疫球蛋白产生的小鼠骨髓瘤)中。通过关于人IgG进行ELISA筛选产生人抗体的转染的细胞克隆。实施例2构建突变体(变体)抗-CCR5抗体的表达质粒'使用QuickChangeTM位点定向诱变试剂盒(Stratagene)并如表1所述，通过表达质粒的位点定向诱变产生编码突变体抗-CCR5抗体重链和轻链的表达质粒。根据EU编号(Edelman,G.M.，等，Proc.Natl.Acad,Sci,USA(美国国家科学院学报)63(1969)78-85;Kabat，E.A.,等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(免疫目的蛋白质序歹U),第5版,NationalInstitutesofHealth(美国全国卫生研究所)，Bethesda,MD，公开号91-3242(1991))进行氨基酸编号。表l显示恒定链(Fc)的突变体表l:<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>突变的解释L234A意味着在Kabat氨基酸位置234的亮氨酸被改变为丙氨酸。实施例3细胞-细胞融合测定在第1天，将表达gpl60的HeLa细胞(2x104细胞/50|til/孔)接种在白色的96孔微量滴定平板中的补充了10%(v/v)FCS和2|ag/ml多西环素的DMEM培养基中。在第2天，将100)111上清液样品或抗体对照/孔加入到透明的96孔微量滴定平板中。然后，加入lOOpl含有8xl04CEM-NKr-Luc悬浮细胞的培养基，并且在37°C温育30分钟。将HeLa细胞培养基从96孔板吸出，加入来自200W抗体/CEM-NKr-Luc混合物的10(^1，并且在37°C温育过夜。在第3天，加入100pl/LBright-GloTM萤光素酶测定底物(1，4-二硫苏糖醇和连二亚硫酸钠(sodiumdithionite);普洛麦格公司(PromegaCorp.)，美国)，并且在RT温育最少15分钟后测量发光。材料将HeLa-R5-16细胞(在多西环素诱导时表达HIVgpl60的细胞系)培养在DMEM培养基中，该培养基包含营养成分和10°/。(v/v)FCS，具有400|ig/mlG418和200吗/ml潮霉素B。CEM.NKR-CCR5-Luc(目录号5198)是一种T-细胞系，可获自NIHAIDS研究及参考试剂系统McKesson生物服务公司(Research&ReferenceReagentProgramMcKessonBioServicescorporation)日尔曼敦,MD20874,美国)。细胞类型转染(电穿孔)CEM.NKR-CCR5(Cat.#4376)以在HIV-2LTR的转录控制下表达萤光素酶基因，并且在含有10%胎牛血清，4mM谷氨酰胺，青霉素/链霉素和0.8mg/mlgeneticinsulfate(G418)的RPMI1640中增殖。生长特征圆的淋巴样细胞，形态不是非常多变的。细胞以单个细胞悬浮生长，其可以形成小的簇。每周l:10分裂两次。特别的特征在HIV-2LTR反式激活后表达萤光素酶活性。适于用原代HIV分离物感染，用于中和和药物-敏感性测定(Spenlehauer，C.,等,Virology(病毒学)280(2001)292-300;Trkola,A.,等，J.Virol.(病毒学杂志)73(1999)8966-8974)。该细胞系通过NIHAIDS研究和参考试剂系统(ResearchandReferenceReagentProgram)，NIAID，NIH获自于JohnMoore禾口CatherineSpenlehauer博士。Bright-Gk)TM萤光素酶缓冲液(普洛麦格公司(PromegaCorp.)美国，部分号E2264B)Bright-GloTM，萤光素酶测定底物(普洛麦格公司.美国，部分号EE26B)。结果将结果显示在表2中。ICs。值介于46和399ng/ml之间。抗体的恒定区是突变的IgGl(IgGlv2)。表2:<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>用活病毒进行抗病毒测定使用Lymplwprep(NycomedPharmaAQOslo,挪烕)从通过密度梯度离心分离的暗黄覆盖层制备PBMCs。混合来自四个不同供体的细胞，用PHA刺激1天并随后在包含1%(w/v)青霉素/链霉素，1%GlutaMAX(Invitrogen公司，美国，目录号35050-038),1%丙酮酸钠,1%(w/v)非必需氨基酸和10%FBS的RPMI培养基中，在存在5U/mlIL-2(白介素-2)的情况下培养2天。将在50)il中的100，000PBMC(外周血单核细胞)加入100pi的抗体溶液(在补充的RPMI培养基中，系列稀释范围在0.006-17.5pg/ml之间)并用50^体积的250TCID50(中位值组织培养感染剂量)的NLBal(具有BaL(gpl20)的env的NL4.3株系(Adachi,A.,等，J.Virol.(病毒学杂志)59(1986)284-291))或备选地JRCSF(O'Brien,W.A.,等，Nature(自然)348(1990)69-73)感染。将混合物在C02培养箱中在37。C温育6天。收集上清液，随后用5U/mlIL-2补充的RPMI培养基稀释l:50。通过HIV-lp24ELISA(铂尔金-爱尔默，美国)进行p24的测量。接着，将样品中和并转移到微量培养板的孔中，所述孔用针对HIV-1p24的高特异性的小鼠单克隆抗体包被。固定的单克隆抗体捕获HIV-1p24。细胞培养样品不需要破裂并且直接加入单克隆抗体包被的微量培养板的孔中。将捕获的抗原与生物素化的针对HIV-1p24的多克隆抗体复合，随后与链霉抗生物素蛋白-HRP(辣根过氧化物酶)缀合物复合。通过与邻苯二胺-HCl(OPD)—起温育来检测得到的复合物，所述邻苯二胺-HCl(OPD)产生直接与捕获的HIV-1p24的量成比例的黄色。使用微量培养板阅读器读取每个微量培养板孔的吸光度，并且针对HIV-1p24抗原标准或标准曲线的吸光度进行校正。结果对于抑制HIV在人PBMC中的生长，确定包括重链(SEQIDNO:6，7,8)和轻链(SEQIDNO:9，IO)可变结构域的不同组合并且是IgGl同种型的抗画CCR5抗体的IC50值在2.27ng/ml到14.21ng/ml的范围内。对于这些组合，IC90值在9.77ng/ml到74.06ng/ml之间的范围内。对于包括突变的IgGl恒定区(IgGlv2)的抗-CCR5抗体，确定重链和轻链可变结构域的不同组合的IC50值在8.22ng/ml到43.11ng/ml的范围内，而确定IC90值在51.95ng/ml至U311.38ng/ml的范围内。实施例5CCR5细胞ELISA将重组表达CCR5的20,000个CHO细胞接种在每个96孔板中，并且在37。C温育过夜。随后吸出培养基并且加入40pl的新鲜培养基。加入10pl的在培养基中稀释的第一抗体并且在4。C温育两小时。吸出培养基，加入100的戊二醛(c=0.05%在磷酸盐缓冲液(PBS)中)并在室温温育10分钟。用200plPBS洗涤3次后，加入50pl的检测抗体(在ELISA封闭缓冲液中稀释1:1,000到l:2，000)并在室温温育2小时。加入50jil3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)并在7分钟后终止反应。在450nm(相对于620nm)测量光密度。第一抗体待检测的抗体第二(检测)抗体绵羊抗人IgG-Y特异性过氧化物酶缀合的抗体(结合位点Cat.#AP004)1:2,000(6|al/12ml)稀释在PBS10%封闭缓冲液中。培养基具有GlutaMAXTM,10%FCS,200吗/ml潮霉素(罗氏诊断(RocheDiagnostics)GmbH,德国)的HAM'sF-12或GIBCOELISA-封闭罗氏诊断(RocheDiagnostics)GmbH,德国，#1112589,10"K)(v/v)在水中的溶液，1:10稀释在PBS中TMB:罗氏诊断(RocheDiagnostics)GmbH,德国，#1432559,使用溶液结果CCR5细胞ELISA的结果显示人CCR5与1000ng/ml浓度的抗-CCR5抗体的结合在2.71-3.13(OD450/620)的范围内，所述抗-CCR5抗体包括重链(SEQIDNO:6，7,8)和轻链(SEQIDNO:9，10)可变结构域的不同组合。实施例6CCR5MAbs与NK细胞上FcyRIIIa结合的潜能为了确定本发明的抗体与天然杀伤(NK)细胞上的FcryRIIIa(CD16)的结合，分离外周血单核细胞(PBMCs)并将其与20pg/ml的抗体和对照抗体在存在或不存在20ng/ml的针对FcYRIIIa的封闭小鼠抗体(抗CD16,克隆3G8,RDI，Flanders,NJ)的情况下温育以证实通过FcYRIIIa的结合。作为阴性对照，使用人IgG2和IgG4(结合位点(TheBindingSite))，其不结合FcYRIIIa。包括人IgGl和IgG3(结合位点(TheBindingSite))作为FcYRIIIa结合的阳性对照。使用PE-标记的小鼠抗-人CD56(NK-细胞表面标记)抗体(BDBiosciencesPharmingen，圣地亚哥，USA)以及FITC-标记的山羊F(ab)2抗-人IgG(Fc)抗体(Protos免疫研究(ProtosImmunoresearch),伯林格姆,USA)通过FACS分析检测在NK细胞上的结合的抗体。在20pg/ml的抗体浓度确定最大结合(Bn^)。对照抗体(人IgG4)显示与人IgGl的100%B謹相比多达30。/。B腿。因此，，"无Fc7RIIIa结合或无ADCC"意为在20pig/ml的抗体浓度，与人IgGl相比多达30%的B,值。实施例7CCR5趋化性测定将L1.2hCCR5细胞培养在包含10%胎牛血清，lx青霉素/链霉素,1x谷氨酰胺，1x丙酮酸钠，1xP-巯基乙醇，和250ng/mlG418(都来自Iiwitrogen公司，美国)的RPMI1640中。正好在开始趋化性测定之前，将细胞离心沉淀并重新悬浮在趋化性缓冲液(包含0.1%BSA和10mMHEPES的Hank's平衡盐溶液HBSS(Invitrogen》中。将细胞以最终浓度5x1()S细胞/ml用于趋化性测定中。将CCR5配体人MIP1a,人MIP1P或人RANTES(R&D系统，美国)稀释在趋化性缓冲液中并以20nM的最终浓度使用。将测试抗体或适合的同种型对照抗体稀释在HBSS中。将趋化性测定设定在0.5pm孔径96-孔'ChemoTx⑧系统(Neuroprobe公司，美国)中。将每种抗体与CCR5配体之一混合并将30pl的该混合物置于ChemoTx⑧系统的底部孔中。将滤网置于底部孔的顶部。每种抗体与L1.2hCCR5细胞混合并将20pl的该混合物置于滤器上。接着，将板置于湿润的箱中并在37。C和5。/。C02温育3小时。温育后，将细胞从滤器刮去并且将板在台式离心机中以2,000rpm离心10分钟。然后移去滤器并使用CyQUANT⑧细胞增殖测定试剂盒(Invitrogen)和SpectraMAXGeminiXS板阅读器(分子装置(MolecularDevices),Wokingham,UK)，根据生产商的推荐检测移到底部孔的细胞的密度。使用Prism4(GraphPadInc.,USA)计算IC50值。对于重链可变结构域和轻链可变结构域与IgGl同种型恒定区的不同组合的人MIP-1a，人MIP-1P,和人RANTES的1(:5()值分别在0.80nM到0,91nM的范围内，0.72nM到1.08nM的范围内，和0.85nM到2.69nM的范围内。在突变的IgGl同种型(IgGlv2)的情况中，对于人MIP-la,人MIP-lP,人RANTES的ICso值分别在2.21nM到6.28nM，2.16nM到6.87nM，和3.59nM到5.03nM的范围内。权利要求1结合CCR5的抗体，其特征在于重链可变结构域包括SEQIDNO1的氨基酸序列Gln-Val-Gln-Leu-X01-X02-Ser-Gly-Pro-Gly-Leu-Val-X03-Pro-Ser-Gln-Ser-Leu-Ser-Ile-Thr-Cys-Thr-Val-Ser-Gly-Phe-Pro-Leu-Gly-Ala-Phe-Gly-Val-His-Trp-Val-Arg-Gln-Ser-Pro-Gly-Lys-Gly-X04-Glu-Trp-Leu-Gly-Val-Ile-Trp-Lys-Gly-Gly-Asn-Thr-Asp-Tyr-Asn-Ala-Ala-Phe-X05-Ser-Arg-Leu-Arg-Ile-Thr-Lys-Asp-Asn-Ser-Lys-Ser-Gln-Val-Phe-Phe-Arg-Met-Asn-Ser-Leu-Gln-Thr-Asp-Asp-Thr-Ala-X06-Tyr-Tyr-Cys-Ala-Lys-Val-Asn-Leu-Ala-Asp-Ala-Met-Asp-Tyr-Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-X07-Val-X08-Val-Ser-Ser，其中X01是Lys或Gln，X02是Gln或Glu，X03是Arg或Lys，X04是Leu或Pro，X05是Met或Lys，X06是Ile或Thr，X07是Ser或Thr，X08是Ile或Thr。2.根据权利要求1的结合CCR5的抗体，其特征在于轻链可变结构域包括SEQIDNO:2的氨基酸序列Asp隱lle-Glrt-Met-Thr-Gln.-Ser-Pro-Ala-Ser-Leu-Ser-Ala-Ser-Val-Gly-Glu-Thr-Val-Thr-Ile-Thr-Cys-Arg-AJa-Ser-Gly-Asn-XlO-His-ay-Tyr-Leu-AJa-Trp-Xll-Gin-Gln-Lys-X12-Gly-Lys-X13-Pro-Xl4-Leu-Leu-Xl5-Tyr-Asn-Thr-Lys-Thr-Leu-Ala-Glu-Gly-Val-Pro-Ser-Arg-Phe-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Thr-X16-Phe-X17-X18-X19-Ile-X20-Ser-X21-Gln-Pro-Glu-Asp-Phe-X22-X23-Tyr-Tyr-Cys-Gln-His-His-Tyr-Asp-Leu-Pro-Arg-Thr-Phe-Gy-Gly-Gly-Thr-Lys-X24-Glu-lle-Lys>其中X10是lie或Ala,XI1是Phe或Tyr,X12是Gin或Pro,X13是Ser或Ala,X14是Gin或Lys,X15是Val或Ile，X16是Gin或Asp,X17是Ser或Thr，XI8是Leu或Ala,XI9是Lys或Thr,X20是Asn或Ser,X21是Leu或Ala,X22是Gly或Ala,X23是Asn或Thr,X24是Leu或Val。3.根据前述权利要求任一项的结合CCR5的抗体，其特征在于所述抗体包括重链可变结构域，所述重链可变结构域选自SEQIDNO:6,7或8，或其CCR5-结合片段。4.根据前述权利要求任一项的结合CCR5的抗体，其特征在于所述抗体包括轻链可变结构域，所述轻链可变结构域选自SEQIDNO:9或10，或其CCR5-结合片段。5.根据权利要求3或4任一项的结合CCR5的抗体，其特征在于所述抗体包括重链可变结构域，所述重链可变结构域选自SEQIDNO:6，7或8，或其CCR5结合片段，并且特征在于包括轻链可变结构域，所述轻链可变结构域选自SEQIDNO:9或10，或其CCR5-结合片段，其中所述重链可变结构域和所述轻链可变结构域彼此独立地选择。6.根据前述权利要求任一项的结合CCR5的抗体，其特征在于所述抗体包括人源的恒定区。7.根据权利要求6的结合CCR5的抗体，其特征在于所述重链恒定区是在CH1和CH2之间的氨基酸位置216-240的铰链区修饰的人IgG4同种型或人IgGl同种型的重链恒定区和/或在CH2和CH3之间的在氨基酸位置327-331的第二结构域间区域修饰的人IgG4同种型或人IgGl同种型的重链恒定区。8.根据权利要求6的结合CCR5的抗体，其特征在于所述抗体包括SEQIDNO:3或4的重链恒定区并包括SEQIDNO:5的轻链恒定区。9.根据权利要求6-8任一项的结合CCR5的抗体，其特征在于所述抗体是人IgGl同种型的抗体，并包括突变L234A和L235A，或所述抗体是包括突变S228P的人IgG4同种型的抗体。10.药物组合物，其包括药物有效量的根据权利要求1或2的任一项的抗体。11.制备药物组合物的方法，所述药物组合物包括药物有效量的根据权利要求1或2的任一项的抗体。12.权利要求1或2的任一项的抗体用于制备药物组合物的应用。13.根据权利要求1或2任一项的抗体，用作药物。14.根据权利要求1或2任一项的抗体，用于治疗免疫抑制疾病。15.权利要求1或2的任一项的抗体用于制备治疗免疫抑制疾病的药物的应用。16.治疗患有免疫抑制疾病的患者的方法，其特征在于向所述患者施用治疗有效量的根据权利要求1或2的任一项的抗体。17.编码能够与第二多肽一起组装的多肽的核酸，其中所述第二多肽包括选自SEQIDNO:2,5的多肽的组的多肽，其中所述多肽包括SEQIDNO:1,6:7或8的氨基酸序列。18.编码结合CCR5的抗体的链的核酸，其特征在于所述编码的链能够与各个其它抗体链一起组装以形成根据权利要求1或2的任一项的结合CCR5的抗体分子。19.编码根据权利要求1或2任一项的结合CCR5的抗体的核酸。20.真核细胞，其包括根据权利要求19的核酸。21.生产根据权利要求1或2任一项的重组人或人源化抗体的方法，其特征在于根据权利要求19的核酸在原核或真核宿主细胞中表达并且所述重组抗体从所述细胞或细胞培养上清液中回收。全文摘要结合CCR5的抗体，其特征在于所述重链可变结构域包括SEQIDNO1的氨基酸序列，并且具有治疗免疫抑制疾病的有利性质。文档编号C07K16/28GK101516914SQ200780035346公开日2009年8月26日申请日期2007年9月25日优先权日2006年9月29日发明者约翰内斯·奥尔,莫妮卡·贝纳,迈克尔·布朗特申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司