专利名称：：与胰腺导管腺癌相关的新型抗原和抗体的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用于诊断和治疗人类癌症，特别是胰源癌症的新手段(means)。技术背景胰腺导管腺癌(PDA)是最常见的胰腺癌，而且，在美国和欧洲，胰腺导管腺癌是癌症死亡的第四诱因。确诊后大多数患者在12个月内死亡，存活5年的仅有2%。胰腺切除术仍然是PDA治疗和4匕疗的基础，^旦其^是供了边纟彖存活-文益(marginalsurvivalbenefit)(LahemD和JaffeeM，2005;KleefJetal"2006)。尽管手术和药物治疗(包括采用单克隆抗体、疫苗和化疗)已有所改进，但目前用于早期PDA诊断的标志物仍然极少且可信度较差。最常用于胰腺癌诊断的血清标志物是唾液酸化的Lewis血型抗原CA19-9,但其用途主要为了监测对治疗的反应而非PDA诊断。实际上，在患良性胰腺疾病(例如慢性胰腺炎或胆道阻塞)的患者血清中，该抗原也以较高浓度存在而提供假阳性，而且其不能应用于所有的患者，因为其在5-10%的人群中才艮本不表达(OkusakaTetal.,2006)。正是由于这些原因，人们正在评估用于PDAi貪断的可^^4戈性生物标志物(或生物标记，biomarker)，目的在于减少介入性才乘作如活组织才全查和组织病理学评估(BouvetM，2004;BrandR，2001;GogginsM,2005;LeungTetal"2005),以及用于评估候选药物(CohenS和MeropolN，2002;JimenoA和HidalgoM，2006)。最近已采用多种技术利用大规模的蛋白表达分析(基于RNA或蛋白水平)来鉴定候选的PDA生物标志物。特别;也，通过比寿交由双向凝月交电泳(或二维凝月交电泳，2-DE)所分辨的、由癌症患者的血清抗体所识别的、以及利用质i普法所鉴定的蛋白，已经应用蛋白质组学4支术来冲企测PDA患者的血清中"i秀发体液应答的抗原(GorgAetal.,2004;GrahamDetal.,2005)。文献中以不同的名称描述了用于蛋白质分离、选择和表征的方法的多种变型，如SERPA(KladeCetal.,2001)、PROTEOMEX(LichtenfelsRetal.,2003)、或SPEAR(U層inRetal"2003)。这些方法学共同的作用前提是，通过表征对抗癌症特异性表达的4元原的B细力包库(所谓的人类癌症免疫纟且)，应该能够确定在癌症免疫监视(immunosurveillance)和免疫编辑(immunoediting)中涉及的特异性把标，并理解导致细力包增殖和转移失控的一几制(DrakeCetal"2006;DunnGetal.，2004)。已表明免疫疗法是一种用于治疗膽i^癌的有用途径(LahemD和JaffeeM，2005)。事实上，已经才艮据其RNA水平的表达升高(WO04/55519)，或者血清样品和/或胰腺样品的大规模蛋白质组学分析(BhattacharyyaSetal"2004;CaoDetal"2005;CecconiDetal"2003;ChenRetal"2005;GronborgMetal.，2006;HondaKetal"2005;KoomenJetal"2005;RodriguezJetal"2005;ShenJetal"2004,RostyC和GogginsM,2005;SinhaPetal"1999;YuYetal"2005)而产生了一系列候选的PDA特异性蛋白。血清中用于PDA^珍断的^美选蛋白为纤维蛋白原y(Bloomstonmetal.,2006)、DEAD國Box蛋白48(XiaQetal.,2005)、MIC-1(KoopmannetJal"2004)、PTH相关蛋白(BouvetMetal.,2001)和4丐网织蛋白(HongSetal.，2004)。然而，仍然需要用于PDA早期检测以及将其与其他胰腺病症或癌症区分开的可靠的生物标志物。
发明内容本发明基于以下观察结果，即，与健康个体或患其他病症个体的血清相比，PDA患者的血清包含抗特异蛋白的抗体，而该特异蛋白在源于胰腺癌的细胞系中表达。在获自正常胰尿袈组织和PDA胰腺组织的提取物中，利用特异于这些蛋白的纯化抗体可确定这些蛋白的存在。本发明的一个主要目的是新型的、至少在3个4立点被z畴酸化的人类a-烯醇化酶(ENOA)的PDA相关同种型(亚型，isoform),并且这些位点已在a-烯醇化酶的新同种型中的一种中得到确定。本发明的另一个目的是结合这些ENOA磷酸化同种型并将它们与其他ENOA同种型区分开的抗体。所述抗体可以为任何恰当的形式，例如单克隆抗体(特别是人类单克隆抗体)和抗体片段。本发明中已限定为PDA相关的蛋白及结合它们的抗体(以及用于^:测它们的^f壬4可其他4争定方式)均可用于PDAi貪断的方法中，以及用来鉴定用于治疗PDA的药剂。具体地，在获自患者的生物学样品(如血清或活枱r组织)中基于抗体冲佥测PDA相关的ENOA磷酸化同种型可用于PDA诊断、评估疾病进展(progression)或评4古用于治疗PDA的药物疗凌丈的方法中。本发明的其他目的是用于PDA诊断、评估疾病进展、或评估用于治疗PDA的药物疗岁文的i式剂盒，该试剂盒包纟舌至少一种本发明所述的PDA相关蛋白和/或结合它们的抗体。下文的说明中还将提供本发明的其他目的，包括那些与胰腺癌i貪断和治疗中的特异性抗a-烯醇4匕酶抗体的限定和应用相关的目的。图1:SERPA法的示意图，SERPA法用于利用CF-PAC-1细胞(肿瘤细胞)和来自PDA(肿瘤)患者或对照(健康)供体的血清来表征PDA相关蛋白抗原和抗体。图2:(A)2-DE凝胶，利用来自CF-PAC-1细胞系的蛋白提取物而制备，作为用于^r测PDA相关蛋白表达的测定。细胞提:f又物中的蛋白根据其分子量和pl而在凝胶中分离并利用银染色而显现。指出了采用PDA血清而非对照血清的蛋白质印迹(Westernblot)中存在的斑点的位置(表I中列出了对应于每一个编号的特定蛋白的名称)。(B)柱状图，表示患有慢性胰腺炎(CP)或不同分期(11、III、IV)PDA的患者(每一组中患者总数以n表示)血清中包含识别所指出的PDA相关蛋白的抗体的百分比。表I中指出了对应于缩写的蛋白质全名。图3:人a-烯醇化酶(ENOA;SWISSPROTAcc.No.P06733;SEQIDNO:l)与人y烯醇化酶(ENOGSWISSPROTAcc.No.P09104;SEQIDNO:2)蛋白序列的比对(两种蛋白质中相同的氨基酸用":"表示，而那些仅保守的氨基酸则用"."表示)。在2-DE凝胶斑点中已通过质谱法鉴定且用来将ENOA同种型分配到这些斑点的肽序列用下划线表示。图4:人a-烯醇化酶(ENOA)蛋白序列中的磷酸化位点(加并且、有下划线)的位置，其通过不同的算法来预测和/或通过实-验来鉴定(蛋白序列下面的小写字母；参见图注)。在ENOA中已鉴定为在ENOA同种型3中发生磷酸化的肽用实线框出。ENOA同种型3中鉴定为未磷酸化的肽用虚线框出。图5:(A)通过不同方式检测6种a-烯醇化酶同种型(ENOAl、2、3、4、5、6)。ENOA1/2、和3的4立置用白色箭头表示。(B)冲企测正常胰腺组织或PDA患者胰腺组织的蛋白提取物中的6种a-烯醇化酶同种型(1、2、3、4、5、6),其已转移至月莫上，随后用抗-ENOA作为第一抗体通过蛋白质印迹法进行检测。ENOA1/2同种型的位置用白色箭头表示。作为凝胶上样以及转移至膜上的蛋白量的对照，用多克隆兔抗人肌动蛋白抗体(稀释度1:10000;SigmaChemicalCo.)对月莫进4亍4企测。图6:利用PDA患者血清作为第一抗体，通过2-DE凝胶和蛋白质印迹法检测CF-PAC-1细胞提取物中的6种a-烯醇化酶同种型(斑点l、2、3、4、5、6),该血清已用或未用重组人a-烯醇化酶进行预吸附(十rENOA或-rENOA)。可替代地，利用PDA患者血清池(pool)作为第一抗体进行蛋白质印迹法前，用磷酸酶(+人PPASE)乂t该力莫进^亍予贞处理。具体实施例方式生物化学和蛋白质组学4支术的联合应用可鉴定并评估与疾病有关的生物学才羊品中存在的特有蛋白(individualproteins)。本发明中，这种类型的分冲斤最初旨在用于癌症(PDA),并利用两种来源的疾病相关分子源自人胰腺导管腺癌(PDA)的细胞系(CF-PAC-1)和获自一大组PDA患者的血清，其可能包含与PDA肿瘤形成和/或进展相关的抗体。通过这些血清的蛋白质印迹分析在CF-PAC-1提取物中才全测到的免疫活性蛋白i普与利用不同对照群体(健康个体、非PDA肿瘤患者、慢性胰腺炎患者)的血清所获得的蛋白谱进行比较，以确定CF-PAC-1蛋白质组中候选的PDA相关抗体和相关抗原(图1)。已经发现，具有已清楚了解的生物学活性的有限数量的蛋白(包括代谢酶和细胞骨架蛋白)的抗体选4奪性地存在于PDA患者的血清中，表明这些蛋白是PDA相关的，且可在PDA患者而非健康个体或非PDA癌症患者中诱发体内抗体应答。本发明中已确定为PDA相关的蛋白和抗体(以及用于4企测它们的任何其他特定方式)，均可用于PDA诊断的方法中，并可用来鉴定用于治疗PDA的药剂。已经采用用于蛋白分离和分析的2-DE和质譜4支术确定了一組PDA相关的人类蛋白(包括a-烯醇化酶、磷酸丙糖异构酶、视黄醛脱氬酶-1、葡萄糖-6-磷酸盐-l-脱氢酶、延伸因子Tu和异柠檬酸盐脱氢酶、I型角蛋白细胞骨架IO、Cofilin1;图2B和表I)为用于PDA血清中特异性存在的抗体的抗原。此外，针对这些抗原的纯化抗体确^人了它们的差异表达，并/人而确i^了用于4企测它们的4壬4可基于蛋白质的方式(包括血清、完全或部分純化的抗体、多克隆抗体制备物、和肽)用于PDA早期^诊断并用于评估患者体内这种癌症的进展的有岁丈性。因而这些蛋白均可单独或组合^f吏用，用作PDA早期i貪断以及用于评估患者体内这种癌症进展的生物标志物。在这些生物标志物中，ENOA1/2(a-烯醇化酶同种型1和同种型2)和COF1(Cofilin1)，如利用2-DE和蛋白质印迹法鉴定的，看来是最可靠的PDA相关蛋白抗原。如在实施例中所示出的，结合这些PDA相关抗原的抗体可用于上文列出的范围。因此，包括检测生物学样品(如血清、活检组织(biopsies),或细胞/组织蛋白#是取物)中这些抗原和/或抗体的方法可实现PDA早期诊断以及对患者体内PDA进展的评估。除了在下文所述的一种情形中，对PDA相关抗原的表征不能推广至对PDA相关蛋白的任何翻译后^f多饰的定义。婆t据表明，任何特异性结合给定抗原的全部同种型所共有的表位(如表I使用的纯化抗体，右列)或包含PDA相关的翻译后修饰的一种或多种同种型所^又有的表位(如PDA患者血清中存在的以及在PDA进展过禾呈中;f企测到的抗体；参见图2B)的抗体或肽，均可用于确定PDA-^断和进展。考虑到人们对提供用于治疗PDA的新型治疗化合物的兴趣，包括"险测生物学样品中PDA相关抗原和抗体(以及它们的结合特性)的方法还可用来评估用于治疗PDA的4美选药物。该方式适用于一些分析中，其中可比较PDA相关蛋白和/或抗体的存在，如在ENOA同种型(ENOA1/2)的实例中所示出的。在暴露于候选化合物之后而发生的这些特性的改变，可利用实施例和文献中所描迷的生物化学和蛋白质组学技术而确认，其可表明导致PDA肺瘤形成和转移的生物学途径。例如，通过4企测患者或动物模型的血清中抗PDA相关抗原的第一抗体的消失、以及利用抗原特异性抗体在细胞提取物中通过蛋白质印迹法检测斑点数目的减少而确认化合物的PDA特异性活性是可能的。候选化合物可针对任何可能的PDA治疗性革巴标，包括那些在本发明中确定为PDA相关蛋白的靶标(如COF1或ENOA1/2)。例如，这些化合物的形式可为结合它们的抗体(大体上或仅特定的同种型)，或为通过调节^f奮饰它们的酶的活性而改变其表达或翻i奪后修饰的小分子。而且，已经发现结合人a-烯醇化酶的抗体(如鼠单克隆抗体)抑制胰腺源转化细胞系(呈现(presenting)6种a烯醇化酶同种型(即包括ENOA1/2,如利用PDA患者血清在蛋白质印迹法中4企测到的))的体外生长和增殖。在非胰腺源转化细胞系(呈现这6种a烯醇化酶同种型)中也^见察到了这种对体外生长和增殖的抑制效应，^E对于仅呈现3种非;岸酸化同种型的非胰&i源转化细胞系则未》见察到该效应(实施例3;图5B;表IV)，表明利用抗-ENOA抗体治疗PDA的可能性。随后可利用细胞系或动物才莫型在任何用于胰腺细胞的增殖分析中评估这些可能的治疗特性，并已力口以^^测来证实不同化合物如肽、肽类似物和影响信号转导的小分子的效应(BakerCetal.,2002;BauerTetal.，2005;B腿sCetal"2000;LeeLetal.,2002;LevitzkiA和MishaniE,2006;QinYetal.,1995;YezhelyevMetal.，200+Rubio-ViqueiraBetal.,2006)。此外，已经^L实了联用4十对不同分子耙标的化合物从而更加有效地治疗胰腺癌的可能性。例如，联合给予化疗药物和特异于细胞膜受体的激酶抑制剂可抑制实验性人胰A泉癌的生长并显著延长动物才莫型的存活期(YokoiNetal.,2005)。可^^4戈地，已有文献描述，如果将两种或更多种针对病毒或人类乾^标的抗体结合于药物组合物中，则不仅由于加合作用(additiveeffect)而且由于协同效应而可使所得的组合物表现出改善的治疗和/或诊断有效性(LogtenbergT，2007)。包含抗PDA相关蛋白(如ENOA1/2)的抗体的药物组合物可纟合予人类用于治疗和i貪断目的。因此，用于PDA治疗或i貪断的方法可包括给予包含抗PDA相关蛋白(如ENOA1/2)的抗体的药物组合物。所述组合物可包括常用的药物赋形剂，且可以单剂量或多剂量和/或利用适合的装置通过不同的途径月几内、l争月永内、皮下、局部、经粘膜、以不可生物降解/可生物降解的基质材料、或利用颗粒药物递送系统而纟合予。特別的，该组合物应该可有效纟合予至膽J^或任^可其他存在PDA相关蛋白的组织。药物组合物应该为患者l是供治疗或预防有效量的化合物，允许该化合物可在足够长的时间内发挥其活性。期望的效果是通过控制PDA生长和增殖，并通过减少至少部分PDA临床表现而改善PDA患者的病况。例如，才艮据给药途径以及个体状况不同，该组合物应该以约0.005至约50mg/kg体重的有效量给予。当组合物具有诊断性用途时，则该化合物应该利用通常在临床和研究实-验室中所建立的用于4企测生物才羊品中的病毒的4支术力口以检测(例如，ELISA或其他血清学分析)，或者当体内给予患者时，则至少在给予后l、2、5、10、24或更多个小时进行检测。PDA相关蛋白和/或抗体的检测可利用本发明的PDA相关蛋白和/或抗体在已建立的用于诊断PDA的已知方法和步骤之后实施或者与其联合实施。PDA治疗和/或"i貪断的临床开发(clinicaldevelopment)和应用，应该基于抗体药^动力学和药效动力学的特4i(LoboEetal.,2004)、临床前详口临床安全凄史才居(datapreclinicalandclinicalsafety)(TabriziM和RiskosL,2007)，并遵守关于人类治疗和体内i貪断性应用的单克隆抗体的生产和质量4空制的国际^见定(HarrisRetal.2004)。用于患者PDAi，断的试剂盒可包4舌一种或多种上文限定的如本发明中所限定的。这些试剂盒可包括未标记/标记的抗原、抗体或在与这些抗原相互作用后#1改性(modified)的底物(例如，已鉴定为具有酶活性的那些)。在对PDA的体液应答的耙标中，人们特别感兴趣的是发现新型的a-烯醇化酶的磷酸化同种型可由PDA血清识别。人oc-烯醇化酶(ENOA)的该新型同种型在至少三个位置发生磷酸化，而且已经鉴定了全部七个^粦酸化位点(图4)。这个发现的重要性通过利用获自PDA患者的血清或在获自PDA患者的胰腺组织中特异性检测到两种高度石粦酸化的ENOA同种型(ENOA1/2)而^寻到i正实(图2B、图5和图6;表I和表II)。PDA患者呈J见有(present)可特异性结合本发明所述高度磷酸化ENOA同种型的抗体。实施例表明，即使ENOA序列中的若干个位置可以发生磷酸化，但在细胞系和PDA组织中，苏氨酸、丝氨酸和酪氨酸残基的豸青确组合实际上发生^岸酸化，且可通过PDA患者产生的人类抗体而冲全观'J。净争另U^;,苏氛酸55、赂氛酸57、酷氛酸200、酷氛酸236、苏氨酸237、酪氨酸257和丝氨酸419的磷S臾化存在于ENOA同种型3中，3口ENOA1/2,其表i见出可经石粦酸酶处理而改变的蛋白石粦酸化语。蛋白磷酸化的类似改变可应用于诊断PDA以及利用获自患者的生物学样品而评估疾病进展。在完整ENOA1/2同种型的替换中，产生呈现(present)相同的ENOA1/2磷酸化残基(如图4中所鉴定的那些(参见加框的序歹'J))的ENOA源性单肽、包括其的蛋白质序列或文库及它们的组合也是有用的。用于产生并利用这些石岸酸化蛋白和肽的方法在文献中有所披露(ConradsTetal.，2002;US5763164;WO97/30097)。a-烯醇化酶同种型(特别是ENOA1/2)中翻译后修饰的数目和步文应可进一步通过已^^支术(KalumeDetal.,2003;MachidaKetal.，2003;MannMetal.，2002;RushJetal.，2005;MolinaHetal"2007;SchmelzleK和WhiteF，2006;WuJetal.，2005)在PDA相关的和对照样品中加以证实。其他已知的ENOA磷酸化和/或》务饰(表in)可存在于ENOA1/2中，且与这些同种型的#元原性和生物学活性以及其利用同种型特异性抗体进行^^测相关。与疾病特定分期/分型相关的翻i奪后Y多饰可通过几种方法进^"才全测，包括直接蛋白分析或抗体区分具有特定j务饰的同种型，如其他蛋白所示(EdbergDetal.,2005;MandellJ,2003)。抗体，尤其是单克隆抗体，通过其与利用2-DE和蛋白质印迹法在非PDA/PDA蛋白提取物中差异表达的蛋白同种型的结合而得以确定，可应用于治疗在2-DE和蛋白质印迹法中具有类似i普的癌症。因此，结合a-烯醇化酶(大体上；或特別地，特定的磷酸化同种型)的抗体可应用于制备用于PDA治疗的药物组合物以及用于PDA患者或表现出类似的a烯醇化酶表达语(即，表达本发明所述的在至少3个位置发生磷酸化的新型人a-烯醇化酶同种型)的癌症患者的治疗性处理方法中。抗体可用于癌症(如PDA)的4企测或治疗，所述癌症特征在于患者血清中存在》粦酸化a-烯醇化酶同种型。这些抗体可通过利用用于鉴定、表征和产生诊断性或治疗性抗体的任何已知技术而产生(JainMetal.,2007;LafflyE和SodoyerR，2005)。该抗体可以以用于功能性抗体的任何蛋白形式而产生，如完整抗体(或完全抗体，fullantibody)(如单克隆抗体，特别是人或人源4b单克隆抗体)、抗体片段、抗原结合蛋白以及其他基于基因工程抗体的融合蛋白和肽，它们在文献中以不同命名得到描述，如Scfv(单链片段可变区)、Fab(可变区重/轻链异源二聚体)、双价抗体(或双体，diabody)、分离的重《连或轻链、肽体(或多聚肽体，peptabody)或双特异性抗体。本发明的抗体可通过结合(conjugate)(利用化学接头(或化学连4妾体，chemicallinker)或聚合体)或融合于治疗性、稳、定性、标记性、或诊断性试剂而加以改善。这些试剂的实例是可被结合的可4企测性标记分子(例如》文射性同位素、荧光化合物、毒素、金属原子、化学发光化合物、生物发光化合物、生物素、酶底物或酶)。ENOA特异性活性还可以通过与另一种治疗性蛋白如可在it断性或治疗性应用中改变代谢和/或稳定性的蛋白或聚合物融合而得到增强。文献中提供了用于选才奪和设计蛋白成分、配体和恰当接头的方式以及用于构建、纯化、才企测和应用融合蛋白的方法和策略(Nilssonetal.,1997;"ApplicationsOfChimericGenesAndHybridProteins"MethodsEnzymol.Vol.326-328,AcademicPress,2000;WO01/77137),且通常可在临床和科研实验室中采用。例如，融合蛋白可包含由商品化抗体识别的序列(包括标签，如多组氨酸、FLAG、c-Myc或HA标签)，其可促进该融合蛋白的体内和/或体外鉴定或者其纯化。其他蛋白序列可通过直接荧光分析(如绿色荧光蛋白)，或通过特异性底物或酶(例如应用蛋白水解位点)而容易地鉴定。识别PDA特异性蛋白序列(如ENOA1/2)的抗体，或源自这种抗体的任何其他蛋白序列，均可利用这种用于转化恰当宿主细胞的栽体而表达为重组蛋白，所述宿主细月包可以是原冲亥或真核宿主细胞且应该可实现所需重组蛋白的分泌。用于产生这种蛋白的方法包括培养宿主细胞，其在适于蛋白表达的条件下用包含其编码序列的表达载体而转化，并乂人宿主细胞培养物中回收蛋白。在原核或真核宿主细胞内表达的载体在关于如何克隆和产生重组蛋白的书籍和综述中有所描述，包括由OxfordUniv.Press出版的系列丛书《APracticalApproach》中的题目("DNACloning2:ExpressionSystems",1995;"DNACloning4:MammalianSystems",1996;"ProteinExpression",1999;"ProteinPurificationTechniques",2001)。其他蛋白序列可结合所需抗体形式(Scfv、FAb、抗体片段、完全人抗体等)、或结合一个或多个内部氨基酸的插入、取代或去除而力口入。这些才支术也可以用于进一步的结构和功能表;f正以及蛋白质(一般而言)、特别是抗体的治疗特性的优化(KimSetal.,2005)。接下来，本发明将借助下列实施例进行阐述，其不应理解为以任何方式限制本发明。实施例实施例1:在CP-PAC-1细胞系的蛋白质组中检测PDA相关的体液抗原才才#牛&方法在得到患者和健康供体的知情同意和临床研究机构伦理委员会批准后，从静脉血分离血清样品。使用前，将样品储存于-80°C。从70位PDA患者(31位男性，39位女性；年龄范围32-86岁；年龄平均值士标准差67±11)获得血清，并按照通用的分类(FariaSetal.,2004)和UICC(国际抗癌联合会)分类分组为如下不同的临床分期II期17人(未转移，中度分化)、III期17人(未转移，低分化)，以及IV期36人(远端转移，未分化)。将这些血清的反应性与无癌症或自身免疫疾病史的用估文对照的40个健康个体(14位男性，26位女性；年龄范围57-77岁；年龄平均值士标准差70±7)的血清反应性进行比较。此外，将这些血清的反应性与30位非PDA癌症患者(9位肝细胞癌患者，12位乳腺癌患者、8位结肠癌患者和1位卵巢癌患者；ll位男性，19位女性；年龄范围44-79岁；年龄平均值士标准差66±10)和15位慢性胰腺炎患者(9位男性，6位女性；年龄范围49-76岁；年龄平均^直士标准差59±8)的血清反应性进4亍比專交。提供血清的不同组的患者的年龄和性别分布，经非配对双尾学生氏14全-弓全(unpaired2-tailedStudent'st-test)^H古，未表J见出统i十学显著性差异。仅在慢性胰腺炎的组中，这两组的年龄(而非性别)分布显著不同，因为该疾病通常发生于比PDA较年轻的年龄(平均约44岁)。细應系和细應炎取教的刺备收集源于月夷&，导管&泉癌(SchoumacherRetal"1990)的CF画PAC-1细胞系(ECACCRef.no.91112501)的细胞(107)，并用Hank's平4lf盐;容液(SigmaChemicalCo.，St.Louis,MO,USA)洗涤。将该细胞团(或细胞沉淀，pellet)冷冻-干燥过夜并储存于-80°C。将该细胞团重悬浮于200(al再水合緩沖液[5M尿素、2M硫脲、4%w/vCHAPS(SigmaChemicalCo.)、2%v/vIPG緩沖液3-10NL(GEHealthcareBio-Sciences，Uppsala,Sweden)、80mMDTT(SigmaChemicalCo.)]和痕量溴酚蓝(SigmaChemicalCo.)中。通过Bradford分析测定蛋白质浓度(Bio-Rad实验室)。双向凝y^^泳("2-D五J将100吗来自CF-PAC-1细胞系的蛋白提取物通过凝胶中再水合(ge/rehydration)上冲羊于7cmIPG月交条(strip)上(pH3-10NL),用于分析和制备型凝月交。在IPGphorIEFunitsystem(GEHealthcareBio-Sciences)上实施等电聚焦(IEF),电压梯度达5000V,共16000Vh。SDS-PAGE运行前，将IPG胶条用Tris/HCl緩沖液(50mM;pH8.8)、尿素(6M)、甘油(30%v/v)、SDS(2%w/v)和DTT(2%w/v)的溶液平衡15分钟，随后在含石典乙酰胺(2.5%w/v)和溴酚蓝(而非DTT)的相同緩冲液中再平衡5分钟。为了进行双向电泳，利用NovexX-CellIITMMini-cellsystem(Invitrogen),4吏7cm的月交条(strip)以恒定200V在小NuPAGENovex4-12%Bis-TrisZoom预制凝胶(Invitrogen,才各罗宁才艮(Groningen),荷兰)上进4亍电泳(run)，并利用NovexX-CellIITMBlotModule(Invitrogen)转移至HybondECL硝'基纤维素膜(GEHealthcareBio-Sciences)上或者经名艮染用于质i普分才斤(ShevchenkoAetal.，1996)。利用GEHealthcareBio-Sciences4是供的pH梯度图，/人蛋白斑点在2-DE凝胶上的位置估计蛋白斑点的p/值。通过与已知分子量的SeeBluePlus2预染标准(Invitrogen)的迁移比较，计算蛋白质的分子量。用"ImageScanner"(GEHealthcareBio-Sciences)获取2-DE凝月交图象并用"ImageMasterLabscanVer3.00"4欠4牛(GEHealthcareBio-Sciences)记录为TIFF才各式。蛋白l伊遊^^f用封闭緩冲液(由含5%脱脂奶粉的TBS组成)将膜在4。C卯孚育15小时，然后用血清(工作稀释度1:200,用含0.05。/。Tween20和5%脱脂奶粉的TBS稀释)孵育4小时。洗涤后，将膜用结合辣根过氧化物酶(HRP)的兔抗人免疫球蛋白G(IgG)抗体(SantaCruzBiotechnology)以1:1000的稀释度在室温下孵育90分4中。可^l代地，对于利用纯化的第一抗体的蛋白质印迹分析，从2-DE凝胶印迹而来的硝基纤维素膜(nitrocellulosemembranes)用1:1000稀释的抗体于25。C聘育1小时进行检测，所述第一抗体为小鼠源的[例如单克隆抗体抗烯醇化酶19/128(MoscatoSetal.，2000中表征的克隆19/12的亚克隆)、抗-磷酸丙糖异构酶1(AbnovaCorporation)、4元陽角蛋白10(ChemiconInternational)、才元-延4申因子tu(AbnovaCorporation)]或兔源的[例如多克隆抗体抗-乙醛脱氢酶1(ChemiconInternational)、抗-葡萄冲唐-6-石粦酸盐1-脱氢酶(Bethyllaboratories)、才元-异4宁4蒙酸盐脱氢酶(BiogenecisLtd)和4元-cofilin1(CellSignaling)]。随后，按照生产商的说明书，将膜用结合HRP的4争异性第二羊抗体，抗小鼠IgG或抗兔IgG(SantaCruzBiotechnoly)孵育1小时。胰腺组织的蛋白质印迹分析利用共30-50mg新鲜冰冻组织实施，该组织在400^裂解緩沖液(包含50mMTRIS/HC1pH7.4、150mMNaCl、1%NP40、1%TritonX-100、lmMDTT、10jil/ml抑制性混合物、1mMPMSF(均购自SigmaChemicalCo.)和10pl/ml核酸酶混合物(GEHealthcareBio-Sciences))中于;水上进4亍匀质化处理(T18basicUltraTurrax)。用超声4义(ultrasoundsonicator)(HielscherUP200S，3x40秒，振幅40%，周期(cycle)0.5)进行超声降解(sonication)后，将该混合物离心(4。C,13000rpm/min，30分钟)。上清中包含20吗蛋白提取物并用Bradford分析(Bio-RadLaboratories)进4亍测定，在小NuPAGENovex4-12%Bis-Tris(双[三(羟甲基)]氨基甲烷)预制凝胶(pre-castgel)(Invitrogen)上进行电泳，并如上所述转移至硝基纤维素膜上。免疫检测利用ECL(增强化学发光，GEHealthcareBio-Sciences)实施,随后在hyperfilm(GEHealthcareBio-Sciences)上进4亍方丈射自显影。用"ImageScanner"(GEHealthcareBio-Sciences)获取已显影的膜的图4象，并用"ImageMasterLabscanVer3.00"软件(GEHealthcareBio-Sciences)i己录为TIFF才各式并用ImageMaster2DEliteversion3.1软件(GEHealthcareBio-Sciences)进行分析。为了进行MS分析，将感兴趣的斑点从制备型2-DE凝胶上切割下来，并利用基质辅助的激光解吸电离/飞行时间(MALDI-TOF)进行分析，必要时，利用电喷雾电离(ESI)进行分析。用25mM碳酸氢铵和50%乙腈的溶液将蛋白脱色过夜，随后用胰蛋白酶(Promega,Madison,WI，USA)进行凝胶中消化，如前所述(HellmanUetal.，1995)。为了进行MALDI-TOFMS,将每一种肽混合物0.5pl置于目标盘(targetdisk)中并4吏其风干。随后，将0.5(il基质溶液(1%w/va-氰基-4-羟基肉桂酸/30。/o乙腈，0.1%TFA)应用于干燥才羊品，并^f吏其再次干燥。利用BmkerReflexIIIMALDI-TOF质谱仪获得质谱。蛋白消化物的MSi普的判读(interpretation)矛J用MS画Fit專欠4牛(http:〃prospector.ucsf.edu;ChamradDetal.,2004)通过"肽质量指紋(peptidemassfingerprinting)，，(PMF)而进行。为了实施MS/MS实验，将胰蛋白酶肽混合物脱盐并在ZipTipds仪(Millipore)中浓缩。用60%甲醇加1%曱酸洗脱后，将4.5pi胰蛋白酶肽混合物吸入涂有金的硅硼毛细管(gold-coatedborosilicatecapillaryXProxeonBiosystems)并在安装有纟内ESI源、(纟内电喷雾离子源，nanoESIsource)的LCQThermo(ThermoFinnigan)离子阱质谱仪中分析。将毛细管电压设为46V,喷雾电压设为1.8kV。收集来自全扫描质谱的最稳定信号，并通过低能石並撞-誇导解离(CID)进行碎裂，标准化碰撞能量范围为22-24%。某些蛋白还利用装配有ESI离子源的LCQDECAXPPlus离子阱质i普4义(ThermoFinnigan)通过LC-MS/MS来鉴定。利用Surveyor(自动采才羊器和泵)4义(ThermoFinnigan),以10jal注射体积、200(il/min流速，在C18柱Luna,150x2.0mm(Phenomenex)上进行层析分离，其后为MS分析4义。为了进行所有MS/MS数据分析，采用Bioworks3.0(ThermoFinnigan)库欠件，并利用FASTA寿欠件(http:〃www.ebi.ac.uk/fasta33/:JohnsonRetal.,2005)一等戶斤4寻序歹'J与EBI数据库中存在的人蛋白序列进行比较。影,为、浙所有的统计均利用GraphPadPrism软件进行计算。数据以均值士SEM(均值的标准误差)示出。利用非配对双尾f检验估计PDA和正常胰腺组织中不同蛋白表达的显著性。双侧P值0.05可认为具有统计学显著性。结果CF-PAC-1细胞系的蛋白质组，常用作用于PDA相关蛋白表达和细胞增殖的才莫型(BouvetMetal.，2001;SzepeshaziKeta1.，2005),其用来利用PDA患者的血清作为第一4元体的来源而鉴定与PDA相关的蛋白和抗体的存在。来自该细胞系的蛋白提取物利用2-DE进行分析，通过银染色确定代表性的双向图谱。该途径可将该提取物中所包含的蛋白分离为根据其在2-DE凝胶中的密度和位置而分类的"斑点"，且由此可大致确定蛋白质的量、分子量和pl。将2-DE凝胶转移至膜上，以通过蛋白质印迹法利用一组来自PDA患者或非PDA患者(包括^建康个体、患其他癌症的患者以及患慢性胰腺炎的患者)的血清进行分析。不同的斑点图谱之间(以及2-DE凝胶的银染图像与相对应的蛋白质印迹图像之间)的比较，可实现PDA相关斑点的鉴定，该PDA相关斑点可例如通过蛋白片,殳的质谱分析进一步表征，而该蛋白片l殳利用以受控方式消化蛋白的酶从这些斑点中^是取(图1)。利用这种途径，筛选出10个斑点并将其进一步表征为可利用来自PDA患者的血清抗体而唯一识别(图2A)。该分析限于人IgG抗体，因为已采用的第二抗体特异于这种同型(isotype)。将该10个斑点从制备型凝月交切割下来，并通过MALDI-TOFMS进行分析以鉴定其对应于哪种人类蛋白。利用该途径，将9种不同蛋白鉴定为PDA相关抗原。两对斑点对应于相同蛋白的同种型，一个斑点包含属于两种不同蛋白质但不能利用2-DE完全分离的序列。在利用对照血清而实施的蛋白质印迹法中，所有这些斑点均不存在或几乎4全测不到。结合这些斑点中的一种或多种蛋白的第一抗体可在显著比例的获自PDA患者的血清中鉴别出(表I)。在这些PDA相关抗原性蛋白中，可^^艮据生物学活性的类型(其在文献中已指出)区分为两类蛋白。第一组蛋白包括代谢酶a-烯醇化酶(存在于两个斑点中，每一个斑点对应于一个特定的同种型)、；粦酸丙并唐异构酶(存在于两个斑点中，每一个斑点对应于一个特定的同种型)、视黄醛脱氢酶-1、葡萄糖-6-磷酸盐-l-脱氩酶、延伸因子Tu、和异柠檬酸盐脱氢酶。第二组蛋白中的大多数被表征为细月包骨架蛋白I型角蛋白细月包骨架lO和Cofilinl。除了利用CF-PAC-1细月包和人血清得到的结果，将从Y建康和PDA个体中获得的胰腺提取物利用抗这些蛋白的纯化抗体(而非人血清)作为第一抗体在蛋白质印迹法中进4亍比4交。该分析可实现蛋白总量(而非限制于一种同种型)的定量，但其表明在获自PDA患者的活检组织的胰腺组织中这些蛋白均有不同程度的过表达(表1)。这些蛋白(以及PDA血清中针对其的特异性抗体的存在)的诊断价值通过区分对应于PDA血清中每一种蛋白的斑点是否存在而进一步评估，PDA血清获自根据疾病分期而分组的患者，并采用患慢性胰腺炎患者的血清作为对照。蛋白质印迹分析表明，针对不同蛋白的自身抗体的存在及其量在不同PDA分期的患者中并非均一分布(图2B)。在对照血清中，针对大多数蛋白的自身抗体均不存在，而在II期PDA患者中，除了ENOAl/2是明显例外，对大多数蛋白而言，PDA血清包含其的频率略微升高(低于25%)。自身抗体生成谱中，这些频率在大多数晚期得到了证实，其中，鉴于III期和IV期PDA中其频率持续增加，因此针对a-烯醇化酶同种型的自身抗体同样是人们最感兴趣的。结论一种基于血清学的方法，其结合人胰腺肿瘤细胞系(CF-PAC-1)的2-DE表达谱和蛋白质印迹分析(利用PDA患者血清中的人IgG作为第一抗体)，可鉴定有限数量的人蛋白及其同种型，而PDA患者针对这些蛋白和同种型产生特异性体液应答。除了仅有的一个例夕卜(AL1A1),这些蛋白的表达在PDA活组织才金查中均上调。此外，针对这些PDA相关蛋白的抗体的产生，至少对某些抗原而言，看来在疾病B免期显著增加。这些结果证实了血清学方法在鉴定早期PDA诊断的可能标志物(在本情形中，大多数位于细胞内)方面的适用性。免疫系统对细胞内蛋白发生反应的机制尚不清楚，但可能依赖于肿瘤形成的独特环境，其能够改变肿瘤细胞中细胞内酶的定位。Cofilinl(COFl)，作为一种在4曼入伪足(invadopodium)的形成中所涉及的月几动蛋白解聚酶，在月几动蛋白重塑、迁移和癌症中发挥作用(YamaguchiHetal.,2005),且可能是胂瘤细胞应答趋向性或生长因子剌i敫的方向'f生(directionality)所必需的(MouneimneGetal.，2004)。之前曾观察到COF1的过表达与PDA动物才莫型相关(CecconiDetal.,2003;SinhaPetal.,1999)。a-烯醇化酶是一种高度保守的代谢酶，具有多种特性且可在不同玉不境中4企观'J至'J(Pancholi^V,2001;PiastMetal.，2005;TerrierBetal.，2007)。其在细力包表面上作为纤；容酶原受体而表达(Lopez-AlemanyRetal.，2003)并可由B纟田胞识另'J,可能用作一种B细胞激活剂(BabuJetal.，2002)。在胰腺腺癌中已经检测到两种同种型，但未描述其在翻i斧后Y务饰方面的分子特征(ShenJetal.,2004)。4十对a-烯醇化酶的自身抗体已经在多个不同的生物学和疾病才莫型中得到鉴定，如癌症相关的一见网月莫病(AdamusGetal.，1998;AdamusGetal.，1996)、非小纟田胞肺癌(non-smalllungcancer)和其4也非月夷&泉的癌症(WO07/072219;US20070172487:HePetal.,2007)、胆;十'性肝石更4匕(AkisawaNetal.，1997)、月S病(FujiiAetal.,2005)和自身免疫病(BallotEetal"2003;Bogda應Detal.，2004;GitlitsVetal.,2001),其中a-烯醇化酶作为一种同种型或多种同种型而存在(但还没有ENOA磷酸化同种型特异性表达的证据)。人们已经利用p蓝菌体展示(ArzaBetal.,1997;KempEetal.，2002)或肽(AdamusGetal"1998;SatoNetal"2000;WalterMetal"1995;FujiiAetal.，2005)研究了a-烯醇化酶及a-烯醇化酶特异性抗体或自身抗体的特4正。本发明的结果证实，鉴于PDA患者血清中抗该蛋白的两种特定同种型(ENOA1/2)的自身抗体的出现频率和特异性生成，特定的a-烯醇化酶同种型及用于4企测它们的抗体可作为一种用于PDAi貪断特别有用的工具(表I和图2B)。所述抗体可特异于全部或多凄史同种型共有的表位(如实-睑中采用的纯化抗体)或将PDA相关同种型与其他同种型区分的表位(如那些在PDA血清中存在的抗体)。此夕卜，PDA从II期至IV期进展的特征在于抗ENOA1/2自身抗体生成的极显著增加，表明与肺瘤大小和生长能力直接关联。对这些同种型的更加详细的分析不^f义对于确定自身抗体对PDA诊断的预测价值非常重要，而且对于更加深入理解将其与PDA及与抗该癌症的可能治疗方法联系的分子才几制非常重要。实施例2:分析CF-PAC-1细胞中由自身抗体险测的a-烯醇化酶同种型才才泮十&方法MS为、浙将斑点从制备型2-DE凝胶上切割下来并通过基质辅助的激光解吸电离/飞行时间(MALDI-TOF)进行分析。蛋白用含0.025mol/L碳酸氢铵和50%乙腈的溶液脱色过夜，随后用胰蛋白酶(Promega,Madison,WI)进4亍凝月交中消化，如前所述(HellmanUetal.,1995)。为了进行MALDI-TOFMS,将每一种肽混合物0.5pl置于目标盘中，并使其风干。随后，将0.5基质溶液(1%w/va-氰基-4-羟基肉桂酸/30%乙腈，0.1%TFA)应用于干燥样品，并再次使其干燥。利用BrukerReflexIIIMALDI-TOF谱仪(Bremen,Germany)获得谱图。蛋白消化物的MS谱的判读利用MS-Fit软件通过"肽质量指紋"(PMF)来进行。碌凝化为、浙人a-烯醇化酶蛋白序列的分析利用下列可在因特网上使用的软件而实施NetPhos[http:〃www.cbs.dtu.dk/services/;(BlomNetal.,1999)]、NetPhosK[http:〃www.cbs.dtu.dk/services/;(BlomNetal"2004)]、dbPTM[http:〃dbPTM.mbc.nctu.edu.tw/;(LeeTetal.,2006)]、PPSP[http:〃bioinformatics.lcd-ustc.org/PPSP/;(XueYetal.,2006)]和GPSI"http:〃bioinformatics.lcd-ustc.org/gps.—web/predict.php;(XueYetal.,2005)]。^口前戶斤述(YamagataAetal.,2002),采用XPPase(NewEnglandBiolabslnc.)实施磷酸酶处理，并做了如下改良。将团状(pelleted)CF-PAC-1细胞(30xl()6)重悬浮于1ml裂解緩冲液(1%w/vNP40、1%w/vSDS、50mMTrispH7.6和150mMNaCl蛋白酶抑制剂混合物)中达15小时。用去离子水将裂解物(120相当于2mg蛋白)调至终体积1240pl，然后力口入20(il的20mMMnCl2溶液和201^1的XPPase緩冲液。添加完成后，轻轻地将溶液混匀。将该混合物分为几等份，其中每一等份中加入600单位的XPPase。混匀后，将这些等^f分于30°C孵育15小时。蛋白经丙酮和氯仿沉淀并用于2-DE分析(参见实施例1)。基于染料检测磷蛋白是在2-DE凝胶中利用ProQ磷蛋白荧光染Ruby染色(Bio-Rad)而实施的，如生产商说明书和文献中所述(WuJetal.,2005)。简言之，在2-DE之后，通过首先在50%甲醇/10%醋酸中固定凝胶30分钟而实施Pro-Q染色。随后用双蒸水洗涤凝月交，并对其进4亍Pro-QDiamond石岸蛋白染色4小时。在用SyproRuby荧光染料染色(过夜)前，通过用含20%乙腈的50mM醋酸钠，pH4.0连续洗涤而进4亍脱色。来々活#会逸织的腐#秉纽织^五iV04/^7神型表这的为、^f将从健康个体或PDA患者(II期)活检组织获得的胰腺组织在400pi裂解緩沖液(包含5mol/L尿素、2mol/L硫脲、4%w/vCHAPS、2%v/vIPG緩冲液非线性pH3-10、0.08mol/L二石危苏糖醇(DTT)、10[Al/mL核酸酶混合物和痕量溴酚蓝)中在;水上进4亍匀质4匕(Tl8basicUltraTurrax，IKA)。用超声4义(ultrasoundsonicator)(HielscherUP200S,3x40s,振幅40%,周期0.5，HielscherUltrasonicsGmbH)进4亍超声降解(sonication)后，将该混合物离心(4°C,13000rpm，30分钟)，其中蛋白溶液包含于上清中。蛋白浓度用Bradford分析进行测定。如实施例1中所述，将30lag蛋白4是取物在小NuPAGENovex4-12%Bis-Tris预制凝月交上电泳，转移至硝基纤维素膜、用抗a-烯醇化酶单克隆抗体19/128(MoscatoSetal.，2000)于4°C温育过4艾，并在蛋白质印迹中显王见。4:成重纽鈕凌^y力记的"V04—￡^04;。从已用编码融合于组氨酸标签的人ENOA(仅缺少最开始9个氨基酸)序列的质粒进行转染的大肠杆菌细胞中纯化重组蛋白。简言之，通过离心从1升培养物中收集细菌细胞，并将细胞团重悬浮于20ml添加了溶菌酶(100昭/ml)和0.7%十二烷基肌氨酸钠的非变性结合緩冲液(NBB，20mM磷酸钠和500mM氯化钠，pH7.8)中。将该悬浮液于4°C緩')"曼摇动15分钟。于水上通过10次40秒的高强度脉冲对细胞裂解物进行超声裂解。将该裂解物以10000rpm于4°C离心5分钟，以沉淀(pellet)不溶性成分，将其重悬浮于10ml富含蛋白酶抑制剂的胍盐裂解緩冲液(6M盐酸胍、20mM磷酸钠、500mM氯化钠，pH7.8)中，在室温下10分钟。将该裂解物加至已平4紆的柱(Ni-NTA琼月旨并唐柱，Invitrogen)中通过轻柔摇晃在4°C经30分钟而结合于树脂。树脂用NBB洗涤两次，随后用非变性洗涤緩冲液(NWB;NBB,pH6.0)洗涤两次。洗脱利用10ml咪唑洗脱缓冲液(350mMpH6)来实施，生成重组组氨酸标记的ENOA(rENOA)。将洗脱出的成分在无菌水中透析(dialyse),然后将其冻干并重悬浮于无菌无致热源的杜尔贝科磷酸盐緩冲溶液(DPBS,Sigma)中。将各等份储存于-20。C。在鲎变形细胞溶解须寸定(LimulusAmebocyteLysateassay(Pyrogent;BioWhittaker))中，内毒素水平低于0.03EU/ml。^/席,悉者A清和蛋^l伊迹法为V^CF-iMC-/哞^7W24这如前所述，将CF-PAC-12-DE凝月交电转移至HybondECL硝基纤维素膜(GEHealthcare)上。用含5%脱脂奶粉的TBS封闭1小时后，在不同条件下用ENOA1/2+患者的三份血清池(用TBS1:100#希释)孵育印迹。在一系列实验中，孵育该膜之前，首先于4。C将血清池(poolofsera)在震荡器上与20吗/ml的重组a-烯醇化酶(rENOA)—起孵育15小时。在另外一系列实验中，首先将膜用2ml含600单位XPPase的PBS、40|il20mM的MnCl2溶液和40(il入PPase緩冲液于30。C孵育15小时。再将月莫封闭1小时、用TTBS洗涤3次(15分钟)并用混合血清(稀释度1:100)孵育。如实施例1中所述，血清中抗体与ENOA同种型的结合利用标记的抗人抗体在蛋白质印迹法中显现。作为所固定的ENOA量的对照，膜用鼠单克隆抗体抗烯醇化酶19/128进行再次检测(参见实施例1)。结果在证实PDA患者血清中的抗体特异性检测到两种人a-烯醇化酶的同种型后，我们利用不同方法表征这些同种型(以及CF-PAC-1细胞中存在的该蛋白的任何其他同种型)的特征。比较利用抗a-烯醇化酶的纯化抗体或不同PDA患者的血清所获得的蛋白质印迹、2-DE凝胶的银染色以及质谱分析，表明2-DE凝月交中还存在另夕卜4个斑点(对应于与PDA不相关的其他a-烯醇化酶同种型)，具有相似分子量但实验性pi值低于ENOA1/2(表II)。这些证据是利用CF-PAC-l或MiaPaCa-2细胞提取物在2-DE凝胶分析中获得的。从这些斑点获得的肽与ENOA片段相同(且明显不同于高度相似的人Y-烯醇化酶；图3),i正实了蛋白质印迹"i正据，即这些斑点应该只于应于ENOA同种型，其中仅ENOA1/2是PDA相关的。翻译后修饰是通常将一种同种型与其他同种型相区别的特征。初步分析似乎排除了糖基化(鉴于分子量的改变有限)，而暗示了磷酸化修饰(鉴于pl下降)。人a-烯醇化酶的序列包含几个酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基，它们是可被不同激酶磷酸化的可能靶标。这种假设通过在2-DE分离之前将蛋白掮j又物暴露于广泛有效的石粦酸酶来》见察采用石粦酸化依赖性抗体所检测的斑点强度是否发生变化而力^以检测，如关于其他蛋白的文献中所示出的(KumarYetal.，2004)。实际上，对应于多数酸性同种型(其为PDA相关的ENOA1/2和ENOA同种型3;表II)的ENOA斑点的强度在磷酸酶预处理的CF-PAC-l细胞提取物中明显下降。此夕卜，ENOA同种型3(比ENOA1/2丰度更高)的质谱分析表明，该同种型中残基55、57、200、236、237、257、和419发生了磷酸化(图4)。之前关于a-烯醇化酶体内或体外磷酸化的报道(CooperJeta.，1984;EigenbrodtEetal"1983^MarcusKetal.，2000;RushJetal"2005;StasykTetal"2005;MolinaHetal"2007)大体上均未指出至少三个特定残基可同时发生磷酸化，尤其是，ENOA同种型中的残基55、57、200、236、237、257、#口419发J见可发生石粦酸4匕。jt匕夕卜，ENOA同种型3中磷酸化残基的组合很难利用对ENOA蛋白序列基于软件的分析而加以预测，因为其中存在大量的候选磷酸化位点(图4)。不能排除ENOA同种型3可能具有在质谱分析阶段未检测到的其他磷酸化位点，〗旦ENOA1/2应该含有翻i奪后^f务饰的残基(根据pi值及采用磷酸酶得到的结果，极可能也发生了磷酸化)，这些翻译后#~饰的残基将其与ENOA同种型3相区分。很明显，多于一种的从ENOA3同种型获得的肽未表现出这种酸化位点。例如，文献中特异性鉴定为在已建立的白血病T细胞系中发生磷酸化的酪氨酸44(RushJetal.,2005)在ENOA同种型3中则未发现磷酸化。类似地，如在ENOA同种型3中(图4)，已鉴定残基57与残基63共同磷酸化(MolinaHetal.,2007),而不是与残基55共同》粦酸化。通过将蛋白质印迹法中获得的图像与利用染料染色2-DE凝胶中总蛋白"艮染或SyproRuby)或特异于石粦蛋白(Pro-QDiamond)的染料染色得到的图像进行比较而进一步分析利用PDA血清和ENOA特异性抗体检测到的ENOA同种型中的磷酸化。该分析证实在CF-PAC-1细胞中仅ENOA1/2和3发生了磷酸化(图5A;表II)。还通过蛋白质印迹法才企测了获自经手术治疗的PDA患者(II期；n=7)的组织和正常胰腺组织(n=l)中的ENOA表达，所采用的抗烯醇化酶抗体结合在PDA患者血清中检测到的全部六种同种型共有的特定表4立。在7例PDA活枱riEL织中，有6例中4全测到了全部六种ENOA同种型。相比之下，在正常胰腺中仅四种同种型(ENOA3、4、5和6)可清晰才企测到(图5B)。因ot匕，可以4,断出不仅PDA患者产生抗ENOA1/2的抗体，而且这些同种型在PDA胰腺组织中显著过表达。采用CF-PAC-1细胞提取物在2-DE和蛋白质印迹中进一步研究PDA患者血清抗石粦S臾4匕ENOA的反应性，以了解该反应性是否特异性针对它们的磷酸化表位。因为PDA患者血清对全部6种同种型均发生反应，因此其可能包含对磷酸化或非磷酸化表位均发生反应的抗体。在第一系列实验中，血清用不含磷酸化残基的重组人ENOA提前孵育，以观察暴露于ENOA抗原是否改变血清识别参照胰腺细胞系中ENOA同种型的能力。实际上，2-DE蛋白质印迹分析表明，非磷酸化ENOA仅显著降低了对同种型3、4、5和6的反应性，而未影响对ENOA1/2同种型的反应性。这种迹象在另一系列实验中进一步得到了证实，其中膜用磷酸酶(XPPase)提前孵育，以确定患者血清中是否包含对磷酸化的ENOA1/2同种型发生特异性反应的抗体。如果不存在XPPase,该血清则识别全部ENOA同种型，其中XPPase处理显著降低了血清对ENOA1/2的反应性(图6)。在经过处理或未经处理的月莫中，抗ENOAmAb同才羊4企测到了全部同种型(数据未示出)，这些数据证明，PDA患者血清中的抗体与^寿酸化的ENOA1/2同种型发生了特异性反应。结论利用不同的蛋白质组学方法，已经鉴定了多种ENOA同种型以及针对这些同种型的抗体(AdamusGetal.，1998;AdamusGetal.，1996;AkisawaNetal.,1997;BallotEetal"2003;BrybomMetal"2005;LubecGetal.，2003;O，DwyerDetal"2002)。然而，这些才PL道未明确证实磷酸化状态和位置与PDA进展中抗特定同种型的自身抗体的产生之间的相关性。其他文章报道了例如采用患者血清在2-DE凝胶的蛋白质印迹中所才全测到的与4争歹木细月包处理(BatyJetal.,2005;BottalicoLetal.,1993;KanamotoTetal.，2002)或疾病(ByrjalsenIetal.,1999;ClauserKetal"1995;NakanishiTetal"2006;TanakaYetal.,2006;US20070172487)相关的a-烯醇化酶斑点的强度和/或数量的变化，表明其可能是由于诸如磷酸化的翻译后修饰。其他才艮道中，还指出了在通过2-DE凝胶分析的PDA样品中，人a-烯醇化酶是几种过表达的蛋白之一，并在mRNA和免疫细胞化学水平得到了确认，但未;H到那些可表征与PDA相关的a-烯醇化酶的同种型的特异性磷酸化(WO04/55548;ShenJetal"2004;NakanishiTetal"2006;MikuriyaKetal"2007)。在a-烯醇化酶中检测到的大量翻译后修饰(表III)中，较早的文献表明在体内和体外均已4企测到磷酸化(CooperJetal.,1984;CoussensPetal"1985;EigenbrodtEetal"1983;GoldenAetal"1986)。最近，已经利用2D凝胶、商品化小鼠抗磷酸酪氨酸的抗体(clone4G10,cod.05-321;Biomol)和质i普在人血小板中(MarcusKetal.,2000);险测到了a-烯醇化酶的两种磷酸化同种型。利用2D-凝胶、》文射性标记和质谱在TGF(31处理的细胞(MCF-7细胞系)(StasykTetal.，2005)中或者在MIAPaCa细胞(一种胰&良癌细胞系)中冲企测到了a-蹄醇化酶的一种磷酸化变异体(variant),其中烯醇化酶磷酸化随着用黄酮类处理而降^氐(LeeLetal.，2002)。此夕卜，双石粦酸化位点位于酪氨酸残基(44和286;RushJetal.,2005)或酪氨酸与丝氨酸残基(57和63;MolinaHetal"2007)。然而，这些文献均未将PDA与已在至少三个位点发生》粦酸化的a-烯醇化酶同种型的额外石粦酸化、以及与结合其的抗体关联起来。实施例3:结合a-烯醇化酶的抗体对表达a-烯醇化酶磷酸化同种型的转化细胞系的生长和增殖的影响材泮+&方法f勿應屑增遂^为V,采用完全细胞培养基(含10%胎牛血清的RPMI-1640)通过在96孔孩丈孔一反(microplate)中4妄种2-10xl03细月包/孔而实施指定细月包系的体外细胞增殖分析，含有或不含抗a-烯醇化酶的单克隆抗体72/1(MoscatoSetal.,2000)或小鼠IgG1同型对照单克隆抗体(R&DSystems)用估文阴性对照。44或68小时后，每个孑L中力口入20|il曱基四p坐(methyltetrazolium)溶液(MTT;5mg/ml),于37°C再孑咅养4小时。弃去培养基，用DMSO溶解细胞。培养板通过分光光度计在540纳米下读数。结果如通过2-DE和蛋白质印迹法测定的，抗a-烯醇化酶的抗体对呈现不同a-烯醇化酶表达语的细胞系生长的影响是通过测定MTT的掺入(incorporation)而枱r测的，MTT是一种可4参入存活细月包内的化合物，与活性细胞生长、代谢和增殖有关。利用基于MTT的比色测定，在表达全部六种同种型的转化细胞系中均得到了细胞增殖的显著抑制，与其是胰腺来源还是非胰腺来源无关。利用IgG1同型(isotype-matched)只于照单克隆抗体或不表达所述三种磷酸化ENOA同种型的细胞系，该影响则极低(表IV)。因此，抗a-烯醇化酶的抗体能够抑制(至少部分地)具有特定(x-蹄醇化酶^粦酸化"i普的细月包系生长和增殖，a-烯醇化酶可在PDA相关生物学样品中检出(如血清或来自活检的组织)。结论即便人们通常认为ot-烯醇化酶是一种纟田胞质蛋白(cytoplasmaticprotein)，其4乃纟《可净皮表达为一种纟田月包表面上的生净勿学活性蛋白(ArzaBetal"1997;BergmanAetal.,1997;MoscatoSetal"2000;Lopez-AlemanyRetal.，2003)以及一种可溶性因子(BabuJetal.，2002;DemirAetal"2005)。体外数据表明，只要转化细胞系表达a-烯醇化酶的磷酸化同种型，该转化细胞系的生长就会由于抗体结合于在胞外空间中表达的a-烯醇化酶同种型(作为一种细月包表面受体和/或作为一种可溶性蛋白)中所存在的表位而减慢。因此，特异性结合呈现a-烯醇化酶磷酸化同种型的细胞的单克隆抗体，可抑制转化细胞系的增殖。控制细胞增殖的这种一几制看来不^f又存在于PDA中，还存在于其他表现出该分子特4正的癌症形式中，且可^L'除当的单克隆抗体作为^^标，用于癌症相关的治疗性应用，例如制备用于PDA治疗的药剂以及用于i貪断和治疗PDA患者的方法。<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>ND:不确定a通过银染和蛋白质印迹法在2-DE凝胶中检测为PDA特异性(见图IB中相应斑点编号的4立置)b用特异于每一种蛋白的抗体实施蛋白质印迹法。反应性线(reactiveline)的强度表示为任意单位的标准化线强度(normalizedlineintensity)(三次实验的均值士SEM)c采用配对双尾t检验估计所选蛋白标准化线强度的统计学显著性d这些蛋白共定4立(colocalize)于同一个斑点中<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>表IV:体外增殖分析的结果<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>参考文献AdamusGetal.(1998).JAutoimm叫11,671-7.Ad则usGctal.(19%).Clin.ImmunolImmunopathol，78，120-9.Aki幼waNetal.，(！的7).JH邻ato1,26,845-51.ArzaBetal.,(1997).Tli鹏bHa函st,78,1097-〗03.Avr細Dctal"《2004).Proteomics,4，2397-407.BabuJSetal.,(2002).ClinImmunol,104，293-304.BakerCHetid,(2002).CancerRes,62，1996-2003.BalkrtEctal.(2003),ClinChc叫49，634-43,BatyJWctal.(2005).BiochcmJ,389，785-95.BauerTW改al.(2005).CancerRes,65,7775-81.BlwrtadwryyaSetd.(2004),Neoptesia，6,674-86.BergmanActal.,(1997).FEBSLett,417,17-20.BlomNetal.(1999),JMolBiol,294,1351-62.BlomNetal.(2004).Proteomics,4，163349.Bl細幽Metal.(2006).CancerRcs,66,2592-9.BogdanosDPetal.(2004).JAutoimmuneDis,1,4.BottalicoLAetal.(1993).ArteriosclcrThromb,13,264-75.BouvctM(2004),AnnSurgOncol,Ii,637-8,Bo歸tMetal.(200).JClinEndocrinolMeteb,X6,310-6.BrandR.(2001).CancerJ，7，2X7-97.B,CJctal..(2000).CancerRcs,60,2926-35.BrybornMctal.(2005).RcspirRcs、6，，18.ButtcrfieldDAetal.(2006).NeurobiolDis,22,223-32,ByrjalsmIetal.(1999).MolHumReprod,5,748-56.CaoDctai,(2005).ModPathol，18，752-61.CasoniFctal.(2005).JBiolCherry280,16295-304.CastegnaAetal.(2002).JNeurochcr^82，1524-32.CccconiDctal.(2003).Electrophoresis,24,4291-303.ChamradDetal"(2004).Proteomics,4:619-28.ChenRetal.(2005),MolCe!lProteomics,4，523-33,Cla隨Kctal.(1995).ProcNatlAcadSciUSA,92,5072-6.CohenSandMeropolN(2002).IntJGastrointestCancer,32，91-106.ConradsTctal,(2002).BiochemBiophysRcsComm叫290，885-90,CooperJetai.(1984).JBiolChem，259，7835-41.Coi,ssensPctal.(1985).MolCdlBbl,5,2753-63.DemirAetal.,(2005)CeltTissueRes,322，299-311.DraieCetal,(2006).AdvJ讓加ol，卯，51-81,Du纖Getal.(2004),Immunity,2i,137-48,EdbergDetal,(2005》,JBio!Chem，280',1-73.EigenbrodtEctal.(簡).EmboJ，2，1565-70.FariaSetal.(2004),SeminRoentgenol,39，397-41FischerDetal.,(,).JImmunol.125:463-5.Fuj"Act(2005).J.Neuroinim.162:130-6.GitliteVMetal,(2001),』InvestigMed,49，138-45,GogginsM(2005).JClinOncoL23，4524-31,GotoAetal"(,)PracNatlAcadSciUSA,83，852-6.GorgAet(2004).Proteomics,4,3665-85.GrahamDRetal.(2005).〗Physiol，563，1-9.G,旨gMctd.(2006).MolCellProteomks，5,157-7i.HarrisRetal.(2004).DrugDevelopmentResearch.61,137-154.HePetaL,(2007).CancerSci,诉12344240.HcllmanUctal.(簡).AnalBiochetn，224,451-5.Ho油Kcta.(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