使用铜氧还蛋白和富含CpG的DNA治疗癌症的组合物和方法

专利名称：使用铜氧还蛋白和富含CpG的DNA治疗癌症的组合物和方法
技术领域：
本发明涉及含有来自铜绿假单胞菌CPsewfifomowos aerag/wosa)的富含 CpG的DNA、并任选地含有铜氧还蛋白的组合物。本发明包括铜绿假单胞 菌特有的CpGDNA，所述DNA可用于治疗患者、尤其是患病的患者、特 别是患有癌症的患者，也可用于预防癌症。这些组合物任选地处于药学上 可接受的载体中，且任选地包含铜氧还蛋白。本发明进一步涉及邻近癌细 胞表达蛋白质的方法。这些方法可以用来在患病的患者、特别是患癌症的 患者中邻近癌细胞表达治疗性或者诊断性蛋白质；用来预防癌症；和诊断 患者的癌症。本方法使用来自铜绿假单胞菌的天青蛋白基因作为铜绿假单 胞菌或者异源细胞中的天青蛋白或者异源蛋白质的表达系统。
背景技术：
虽然在癌症治疗中，DNA接种疫苗和基因治疗中使用活的细菌具有重 要的地位，但是另一途径是可以使用例如脂多糖、肽聚糖、以至裸DNA这 样的细菌产物。Vassaux等，J.Pathol.208:290-298(2006)。早在1984年，己 经表明来自牛分枝杆菌BCG (A^co^cfen'wm 6ov/力的DNA具有抗癌特性。 实际上，Tokunaga等描述了从BCG中分离纯化的DNA，其在小鼠中表现 出显著的肿瘤退化，并在人体皮肤恶性肿瘤中表现出显著的退化反应。Tokunaga等，Japan J, Infect. Dis.52:1-11(1999)。
BCG DNA中导致肿瘤退化的免疫刺激活性是由于富含未甲基化CpG 二核苷酸的一段DNA序列的存在。与哺乳动物DNA相比，细菌DNA中 未甲基化的CpG序列要常见哺乳动物20倍，通过Toll样受体(TLR)9识别 特异性未甲基化CpG序列(基序)的存在。在细菌性CpG DNA基序和TLR9 之间交互作用活化了单核细胞和树状细胞产生白介素-12，这反过来活化T-辅助细胞l。与CpGDNA不同，细菌性的脂多糖通过TLR4识别，而相应 的脂蛋白则通过TLR2识别。Modlin， Nature, 408:659-660(2000); Krieg， Nature Med.9:83-835(2003)。由于难以纯化富含未甲基化CpG序列的细菌性 DNA供人类临床试验，8至30个碱基并包含一个或多个CpG基序的合成 寡脱氧核苷酸(ODN)，已经在病毒性、细菌性和寄生感染的免疫治疗，以及 基础细胞癌或者黑素瘤患者的限制性I期人类临床试验中使用，取得令人鼓 舞的结果。Krieg，出处同上。
与细菌性CpG基序不同，哺乳动物细胞DNA包含CpG序列，其中胞 嘧啶残基高度甲基化。例如，约6-8。/。的人DNA胞嘧啶残基被认为是由DNA 转甲基酶甲基化的，DNA转甲基酶的水平在人肿瘤中比在正常细胞中高一 些。大量人基因启动子区具备CpG岛，其超甲基化，导致下游基因沉默。 这种下游基因的外遗传沉默，特别是在肿瘤抑制基因中，如pl6Ink4a、 BRCAl或者hMLHl，引发肿瘤形成并且其中具体DNA-脱甲基剂的开发可 用于抗肿瘤药。Herman和Bayln， New Eng. J. Med. 349:2042-2054(2003); Femberg和Tycko. Nature Rev. Cancer 4:143-153 (2004)。几种乳腺癌细胞系 的转录概括分析己经证明在原发肿瘤和细胞系中存在高度甲基化的CpG 岛，但在癌症患者的正常乳房上皮或匹配淋巴细胞的DNA中不存在。用 DNA甲基化抑制剂5-氮胞苷治疗乳腺癌细胞系，导致癌细胞的生长抑制， 证明了启动子CpG岛甲基化作用在肿瘤生长中的重要性。Wang等， Oncogene 24:2705-2714(2005)。
对于患者、特别是患有病症、特别是癌症的患者而言需要新的治疗， 以及需要癌症的预防性治疗。这样的疗治疗可以是新的治疗方法，或者在 以前记述的治疗方法上的改变或者改善。这样的癌症治疗应该能够减缓哺 乳动物患者的肿瘤生长，和/或减少哺乳动物患者的肿瘤尺寸。同时需要的 是将治疗分子递送至患者癌细胞的方法，以及诊断肿瘤在患者体内的存在和位置的方法。 发明概述
本发明涉及包含来自铜绿假单胞菌的富含CpG的DNA多核苷酸的组 合物。特别地，本组合物可以包含来自铜绿假单胞菌的富含CpG的DNA， 和任选地一种铜氧还蛋白肽，例如来自铜绿假单胞菌的天青蛋白，和/或天 青蛋白的50-77残基区(p28)。本发明进一步涉及使用本发明的组合物治疗 患者，特别是患病、尤其是癌症的哺乳动物患者，以及预防癌症。本发明 进一步涉及与癌细胞接触后表达蛋白质的细胞和方法，和施用所述细胞以 诊断和治疗癌症的方法。
在本发明的一方面， 一种分离的核酸分子，包含多核苷酸序列，其选 自(a)选自SEQ ID NOS:26-62的序歹U，和(b)与选自SEQ ID NOS:26-62的序 列具有至少90%相同性的序列。在具体实施方式
中，多核苷酸是SEQ ID NO:26。分离的核酸序列可以在药学可接受载体中。该药物组合物也可包含 至少一种铜氧还蛋白肽。在一些实施方式中，药物组合物被配制用于静脉 内、皮下、或局部施用。在一些实施方式中，药物组合物中的铜氧还蛋白 肽可以来自选自以下的生物体铜绿假单胞菌(尸wwcfowo"as aen^'"osa)、 粪产碱菌(ia/^"es加cafe)、 氧化木糖无色杆菌(Jc/zra附ofefl"er :c^oso:aWa")、支气管败血性博德特氏菌(5orcfete〃a 6rawc/^ep"ca)、甲基单 胞菌(Afe^y/o附o"oy 5/ .)、脑膜炎奈瑟球菌(7Ve&ser/a附e"/wgzYzVfo)、淋病奈瑟 球菌C/Ve/5^en'a go"cvr/^a)、荧光假单胞菌(i^ewfifowo"asy7womscms)、绿针假 单胞菌CPsewcfo附o"as c/7/orara/ /2/s)、 苛养木杆菌(^^/e//(3々5t/d/osa)禾口畐U溶血 性弧菌(附n'o戸ra^ewo/"/cw"。在一些实施方式中，药物组合物中的铜氧 还蛋白肽可以是这样的蛋白质的部分或全部，所述蛋白质选自天青蛋白、 假天青蛋白、质体蓝素、铁硫菌蓝蛋白、Laz、绿丝菌蓝色铜蛋白、漆树蓝 蛋白或黄瓜碱性蛋白。药物组合物还可以包含选自SEQ ID NOS:l-25的肽 的部分或全部。
本发明也包括方法。根据本发明的任何方法可用于治疗患病的患者。 在根据本发明的方法的一些实施方式中，患者患有癌症。
根据本发明治疗的癌症可以非限制性地包括黑素瘤、乳腺癌、胰腺癌、 恶性胶质瘤、星形细胞瘤、肺癌、结直肠癌、头颈癌、膀胱癌、前列腺癌、皮肤癌、和宫颈癌。
给药途径可以非限制性地包括静脉内注射、肌肉注射、皮下注射、吸 入、局部给药、透皮贴剂、栓剂、玻璃体注射和口服。
在一个实施方式中，所述方法包括一种治疗患者的方法，其包括对所 述患者施用分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含选自以下的多核苷
酸序列(a)选自SEQ ID NOS:26-62的序列和(b)与选自SEQ ID NOS:26-62 的序列具有至少90%相同性的序列，其中所述分离的核酸分子处于药学可 接受的载体中，以及共同施用铜氧还蛋白肽。
在另一个根据本发明的方法的实施方式中，所述方法包括向患者施用 药物组合物，其含有药学可接受载体、至少一种铜氧还蛋白肽和分离的核 酸分子，所述分离的核酸分子包含选自以下的多核苷酸序列(a)选自SEQ ID NOS:26-62的序列和(b)与选自SEQ ID NOS:26-62的序列具有至少90% 相同性的序列。
在另一个根据本发明的方法的实施方式中，所述药物组合物通过选自
下列方式施用静脉内注射、肌肉注射、皮下注射、吸入、局部给药、透
皮贴剂、栓剂、玻璃体注射和口服。
在另一个根据本发明的方法的实施方式中，所述方法包括对所述患者
施用分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含选自以下的多核苷酸序列
(a)选自SEQ ID NOS:26-62的序列和(b)与选自SEQ ID NOS:26-62的序列具 有至少90%相同性的序列，其中所述分离的核酸分子处于药学可接受的载 体中，以及共同施用铜氧还蛋白肽，并且进一步共同施用额外的预防性或 治疗性药物。
本发明也包括细胞。在一个实施方式中，所述细胞含有来自铜绿假单 胞菌的异源天青蛋白基因，其中所述细胞经与癌细胞接触后表达天青蛋白。 在另一个实施方式中，异源天青蛋白基因中的天青蛋白编码序列已经用靶 蛋白编码序列替换，其中所述细胞经与癌细胞接触后表达所述靶蛋白。在 另一个实施方式中，所述细胞是铜绿假单胞菌细胞，其中基因组中的天青 蛋白编码序列已经用靶蛋白编码序列替换，并且其经与癌细胞接触后表达 所述耙蛋白。在另一个实施方式中，异源天青蛋白基因中的天青蛋白编码 序列已经用靶蛋白编码序列替换，并且其中所述细胞经与癌细胞接触后表 达所述靶蛋白，所述靶蛋白选自预防性蛋白质、治疗性蛋白质、细胞毒性蛋白质和诊断蛋白质。
本发明也包括记载在前述段落中的细胞的使用方法。在这些实施方式 的一些中，所述方法包括通过施用一个或多个所述细胞类型来治疗患者。 本发明也包括利用前述段落所述的细胞类型来诊断判断患者癌症的方法。 在一个实施方式中，所述方法包括施用细胞，所述细胞具有来自铜绿假单 胞菌的异源天青蛋白基因，其中所述细胞经与癌细胞接触后表达天青蛋白 并且其中该异源基因中的天青蛋白编码序列已经用靶蛋白编码序列替换， 其中所述细胞经与癌细胞接触后表达所述靶蛋白，并且其中所述靶蛋白是 诊断蛋白质。在其他的实施方式中，靶蛋白选自预防性蛋白质、治疗性 蛋白质、细胞毒性蛋白质、和诊断蛋白质。在另外的实施方式中，药物组 合物可以通过选自下列的方式施用静脉内注射、肌内注射、皮下注射、 吸入、局部给药、透皮贴剂、栓剂、玻璃体注射和口服。此外，采用这些 方法，患者可以患有病状和/或癌症。通过以下附图和具体实施方式
的详细 描述，本发明的这些及其它方面、优势、和特点将变得明显。
序列简述
SEQIDNO: 1.来自铜绿假单胞菌的天青蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 2. p28的氨基酸序列，铜绿假单胞菌天青蛋白残基50-77。
SEQ ID NO: 3.层理席藻(尸/zorm^Mm /am/wwww)质体蓝素的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 4.氧化亚铁硫杆菌(77zz'o6ac/〃MS /e/roo;d^ww)铁硫菌蓝蛋 白的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 5.裂环无色杆菌04c/zramo^cter cyc/oc/asfe力假天青蛋白 的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 6.粪产碱菌天青蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 7.氧化木糖无色杆菌反硝化亚种I G4c/2ramo6acfer
x少/osoja'fibm1邵.fife"z7ny c<ms I)天青蛋白的氮基酸序歹lj。
SEQ ID NO: 8.支气管败血性博得特氏菌天青蛋白的氨基酸序列。 SEQ ID NO: 9.甲基单胞菌J种(M"/^/omo"w平J)天青蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 10.脑膜炎奈瑟球菌Z2491天青蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO: 11.荧光假单胞菌天青蛋白的氨基酸序列。 SEQIDNO: 12.绿针假单胞菌天青蛋白的氨基酸序列。 SEQIDNO: 13.苛养木杆菌9a5c天青蛋白的氨基酸序列。 SEQIDNO: 14.黄瓜(Cwcmw/s sa"vw)漆树蓝蛋白的氨基酸序列。 SEQ ID NO: 15.橙色绿曲菌(C72/o厂q/7ejow m/rawriflcw)的绿丝菌蓝色铜
蛋白A的氨基酸序列。
SEQIDNO: 16.橙色绿曲菌的绿丝菌蓝色铜蛋白B的氨基酸序列。 SEQIDNO: 17.来自黄瓜的黄瓜碱性蛋白的氨基酸序列。 SEQIDNQ: 18.淋病奈瑟球菌F62的Laz的氨基酸序列。 SEQIDNO: 19.副溶血性弧菌的天青蛋白的氨基酸序列。 SEQ ID NO: 20.橙色绿曲菌的绿丝菌蓝色铜蛋白B的氨基酸57至89
的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 21，百日咳博德特氏菌(Borafefe〃a peWi^s/力天青蛋白的氨
基酸51-77的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 22.脑膜炎奈瑟球菌Laz的氨基酸89-115的氨基酸序列。 SEQ ID NO: 23. 丁香假单胞菌CPsew^wowas s,/"gae)天青蛋白的氨基
酸51-77的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 24.副溶血性弧菌天青蛋白的氨基酸52-78的氨基酸序列。 SEQ ID NO: 25.支气管败血性博德特菌天青蛋白的氨基酸51-77的氨
基酸序列。
SEQIDNOS:26.在15 kb条带中的多核苷酸的DNA序列，该多核苷 酸释放自铜绿假单胞菌，其编码类似于奈瑟球菌属(A^^en'a)Laz的多肽。
SEQ ID NOS: 27-62.在15kb条带中的多核苷酸的DNA序列，该多核 苷酸释放自铜绿假单胞菌。
附图简述


图1.图1描绘了在癌细胞的存在下，通过铜绿假单胞菌菌株8821和 8822的天青蛋白分泌。图IA.，两株铜绿假单胞菌菌株(8822， 8S21)在癌 细胞存在(MCF-7)或不存在(对照)的情况下生长，并且使用抗天青蛋白抗体， 通过蛋白质印迹法，检查天青蛋白在细胞外部分中的分泌。图a:通过测量 600 nm下的浊度而获得的铜绿假单胞菌细胞的生长。正方形和菱形分别代表在癌细胞存在和不存在的情况下天青蛋白的分泌水平。o分钟时，癌细胞
存在和不存在之间的浊度差异是由于癌细胞的添加。图b:通过测量蛋白质 印迹分布图上的信号强度，图解表示天青蛋白的分泌水平。正方形和菱形 分别代表在癌细胞存在和不存在的情况下天青蛋白的分泌水平。图c:蛋白 质印迹法。添加癌细胞后，在0、 15、 30和60分钟制备细胞外部分，然后 进行SDS-PAGE，接下来进行蛋白质印迹法。箭头显示天青蛋白的位置。 图1B.定量蛋白质印迹法。蛋白质印迹分布图上的信号强度随着标准天青 蛋白(O到20 ng)的增加而线性增加。图1C铜绿假单胞菌菌株8821和8822 中天青蛋白的产生。对在指数生长期从这些细胞(8821， 8822)获得的细胞内 部分进行SDS-PAGE，随后使用抗天青蛋白抗体进行蛋白质印迹法。标准 天青蛋白在左侧泳道显示。图ID.通过蛋白质印迹法，在MCF-7细胞提取 物(l OO叫蛋白质)中天青蛋白的缺乏性检测。
图2.图2描绘了在癌细胞存在下，铜绿假单胞菌细胞裂解的缺乏。图 2A.用含有lacZ基因的质粒pQF47转化的菌株8822细胞在癌细胞存在 (MCF-7)或者不存在(对照)的情况下生长，且对细胞外和细胞内部分进行 SDS-PAGE，然后使用抗LacZ抗体进行蛋白质印迹法。样品制备如图1进 行。标准LacZ被示于左泳道。星号表示亲代菌株8822细胞(无pQF47质粒) 的细胞内部分，其与癌细胞一起温育60min。图2B.对用pQF47转化的菌 株8822细胞的细胞外部分进行SDS-PAGE，之后使用抗-天青蛋白抗体进行 蛋白质印迹法。图2C.用pQF47转化的菌株8822细胞中LacZ的功能性表 达。
图3.图3描绘了天青蛋白(而不是细胞色素0551)从大肠杆菌(￡. Co")的 壁膜间隙分泌，从而以非能量依赖性方式应答人乳腺癌MCF-7细胞的存在。 样品制备如图l进行。星号(0*)表示恰在与癌细胞温育之前的细胞内部分。
天青蛋白和细胞色素C55, (Cyt C55,)的位置由箭头显示。图3A，来自大肠杆
菌JM109的天青蛋白分泌；图3B，来自大肠杆菌JCB7120的细胞色素c^ 分泌；图3C，当铜绿假单胞菌8822与0、 50或250 mM CCCP预温育1小 时时，来自这些细胞的天青蛋白分泌。图3D，当大肠杆菌JM109在暴露或 不暴露于MCF-7乳腺癌细胞之前与浓度250 的CCCP预温育1小时时， 来自这些细胞的天青蛋白分泌。图3E， CCCP对铜绿假单胞菌8822(左图) 和大肠杆菌JM109 (右图)的生长的影响。所示浓度下的CCCP在指数生长期的早期至中期加入，并且以600 nm下的光密度追踪生长速率60分钟。
图4.图4描绘了铜绿假单胞菌8822菌株分泌染色体外DNA进入培养 基。图4A，铜绿假单胞菌8822菌株分泌15kb的染色体外DNA片段。通 过核蛋白部分的异丙醇沉淀、之后进行经Qiager^柱(Qiagen， Inc., Valencia CA)的DNA纯化，纯化该DNA。图4B，在不同时间点的染色体外DNA 分泌。DNA早在第5分钟就分泌，并且分泌在第15、 30和60分钟分别得 到加强。在MCF-7人乳腺癌细胞存在下，在所有时间点DNA均有效分泌。 图4C，在MCF-7癌细胞存在下，铜绿假单胞菌菌株8822分泌天青蛋白和 15 kb DNA片段进入培养基滤液。菌株8822在MCF-7癌细胞存在下生长， 并且细胞外部分的天青蛋白和染色体外DNA的分泌通过使用抗天青蛋白 抗体的蛋白质印迹法和使用PA克隆的引物和该沉淀DNA作为模板的PCR 加以检测。天青蛋白和DNA的分泌是时间依赖性的。图4D，分泌的DNA 富含CpG。使该DNA经受由EcoRI、 HindIII、 Mspl和Pvul酶进行的限制 性内切核酸酶消化。Mspl和Pvul (已知切割富含CpG的DNA)产生成片DNA 条带，其表明DNA中高比例CG序列的存在。
图5.图5描绘了在释放的富含CpG的DNA中高度富含C和G区段 的DNA序列和氨基酸翻译。图5A，该DNA区段与数据库中的任何其他序 列没有同源性，并且看起来不是开放阅读框的一部分。图5B，存在于富含 CpG的释放的DNA(8822)中的推定天青蛋白基因和来自铜绿假单胞菌 PAOl和淋病奈瑟球菌(NG)和脑膜炎奈瑟球菌(NM)的相应序列的比较氨基 酸序列同源性。
图6.图6描绘通过染色体外富含CpG的铜绿假单胞菌DNA诱导 NF-kB。图6A， NFkB诱导是TLR9依赖性的，并且需要染色体外富含CpG 的DNA。 HEK293细胞用TLR9表达质粒转染，而且NF-kB启动子诱导型 SEAP (分泌型胚性碱性磷酸酶)报告质粒(Invitrogen， Inc. Carlsbad， CA)用不 同浓度的富含CpG的15kbDNA处理。在转染细胞的上清液中测量NF-kB 活化后的SEAP表达。使用HEK-Blue TM SEAP报道分析试剂盒(Invitrogen， Inc. Carlsbad， CA)定量评价SEAP水平。用富含CpG的DNA对HEK293 细胞的刺激致使NF-kB诱导，以剂量依赖性方式产生SEAP活性。图6B， 不同的癌细胞系表达宽范围的Toll样受体(TLR)。 TLR的表达通过定量 RT-PCR分析。数据被标准化成亲环蛋白B的表达。图6C，富含CpG的DNA处理对MCF-7乳腺癌细胞的细胞增殖的影响。细胞用不同浓度的15 kb 富含CpG的DNA(0.5、 1、 3和5pg)处理12和24h，并测定细胞存活率。 如以前所述(Yamada等，2002)，进行MTT分析来测量活细胞的程度，从而 说明细胞毒性(细胞死亡百分数)。为了计算细胞毒性百分数，未处理的活细 胞的值为100%，其用于测定用2.5吗小牛胸腺DNA和不同浓度的富含CpG 的DNA处理的活细胞数。
图7.图7是与癌细胞接触后从铜绿假单胞菌的富含CpG的DNA序列 的表。
发明详述 定义
除非具体描述为"单个细胞"，否则本文中的术语"细胞"包括单数或复数 的该术语。
术语"多肽"、"肽"、和"蛋白质"在本文中可以互换使用，其指的是氨基 酸残基的聚合物。该术语适用于这样的氨基酸聚合物，其中一个或多个氨 基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物。该术语也适用于天 然存在的氨基酸聚合物。术语"多肽"、"肽"、和"蛋白质"也包含修饰，包括 但不限于糖基化、脂质连接、硫酸化、谷氨酸残基的Y羧化、羟基化和ADP 核糖基化。可以理解，多肽并非都是完全线性的。例如，由于泛素化的结 果，多肽可以是分支的，并且它们可以是环形的(有或没有分支)， 一般都是 翻译后事件的结果，包括天然加工事件和不会天然发生的人工处理带来的 事件。通过非翻译的天然过程以及完全通过合成方法都可以合成环形的、 分支的和分支环形的多肽。
术语"多核苷酸"、"寡核苷酸"、"寡聚物(oligo)"和"DNA"在本文中可互 换地使用，是指核酸残基的聚合体。
术语"药理学活性"在本文中的含义是指药物或者其他化学物质对生物 学系统的作用。化学物质的作用可能是有益的(治疗学的)或者有害的(毒性 的)。纯化学物质或者混合物可能是源自天然的(植物，动物，或者矿物的) 或者可能是合成的化合物。
术语"病理性病变"，在本文中包括不同于正常的解剖的和生理的偏差， 其构成了对活体动物或其中一部分的正常状态的损害，中断或修饰了躯体功能的性能，并且是一种对各种因素(例如营养不良、工业危害或气候)、对 特殊感染原(例如蠕虫、寄生原虫、细菌或病毒)、对生物体的先天缺陷(例 如遗传学异常)或这些因素的组合的应答。
术语"病症"，在本文中包括不同于正常的解剖的和生理的偏差，其构成 了对活体动物或其中一部分的正常状态的损害，中断或修饰了躯体功能的 性能。
术语"患病"，在本文中包括目前表现出病理性病变的症状、具有甚至没 有可观察到的症状的病理性病变、处于病理性病变的恢复期以及己经从病 理性病变中康复。
术语"治疗"，在本文中包括阻止、减慢、终止或逆转与所治疗的病变相 关的病变或症状的进展或严重度。因此，在适当的情况下，术语"治疗"包括 医疗性的、治疗性的、和/或预防性的施用。治疗也包括预防或减轻患病(例 如癌症)的发展。
术语"抑制细胞生长"在本文中表示减慢或停止细胞分裂和/或细胞扩 增。该术语也包括抑制细胞发育或增加细胞死亡。
"治疗有效量"，是能有效地阻止、减慢、终止或逆转所治疗对象的特殊 病变的现有症状的发展或部分或完全消除所述症状的量。确定治疗有效量 是在本领域人员的能力范围之内。
在本文中使用的术语"基本上纯的"，当用于修饰本发明的蛋白质或其它 细胞产物时，指的是，例如，从培养基或细胞内容物分离的蛋白质形式为 基本没有或基本上未掺杂其它蛋白质和/或其它化合物。术语"基本上纯的"
指的是一种因子的量是分离部分干重的至少约75%，或至少"75%基本上纯 的"。更具体而言，术语"基本上纯的"指的是一种化合物是分离部分干重的 至少约85%，或至少"85%基本上纯的"。最具体而言，术语"基本上纯的" 指的是一种化合物是分离部分干重的至少约95%，或至少"95%基本上纯 的"。术语"基本上纯的"也可用于修饰本发明的人工合成的蛋白质或化合物， 其中，例如合成的蛋白质从合成反应的试剂和副产物分离。
在本文中使用的术语"药物级"，当指本发明的肽或化合物时，是基本上 或主要从组分分离的肽或化合物，该组分通常伴随在自然状态发现的物质， 包括合成试剂和副产物，以及基本上或主要从可能损坏其药用的成分分离。 例如，"药物级"肽可以与任何致癌物分离。在一些情况下，"药物级"，可以用意于施用的方法进行修饰，例如"静脉药物级"，从而指定肽或化合物基本 上或主要从任何可能使组合物不适于给患者静脉施用的物质分离。例如"静
脉药物级"肽可以从去污剂(例如SDS)以及抗菌剂(例如叠氮化物)分离。
术语"分离的"、"纯化的"或"生物学纯的"指的是物质基本上或主要没有 通常伴随以其天然状态发现的物质的组分。因此，根据本发明的分离的肽 优选不含有通常与它们的原位环境相关的物质。多核苷酸或多肽的"分离的" 区域指的是所述区域不包括所述区域来源的多核苷酸或多肽的整个序列。 "分离的"核酸、蛋白质或其各自片段基本上从其体内环境移出，从而可以由 技术人员进行操作，例如但不限于核苷酸测序、限制酶切消化、定点诱变、 亚克隆到用于核酸片段的表达载体中以及获得基本上纯的量的蛋白质或蛋 白质片段。
在本文中相对于肽使用术语"变体"，指的是与野生型多肽相比，具有替 换、缺失或插入的氨基酸的氨基酸序列变体。变体可以是野生型肽的截短 体。"缺失"指的是从所述多肽内部去除一个或多个氨基酸，而"截短体" 则是从所述多肽的一端或两端去除一个或多个氨基酸。因此，变体肽可以 通过操作编码所述多肽的基因而制得。变体可以通过改变多肽的基本组成 或特征但不改变至少其某些基本功能而制得。例如天青蛋白的"变体"可以是 突变的天青蛋白，其保持天青蛋白抑制癌前期哺乳动物细胞发展的能力。 在某些情况下，变体肽是用非天然氨基酸(例如s-(3，5-二硝基苯甲酰)-Lys残 基)合成的。Ghadiri & Femholz， J. Am. Chem. Soc， 112: 9633-9635(1990)。 在某些实施方式中，与野生型肽或其部分相比，变体中被替换、缺失或插 入的氨基酸不超过20个。在某些实施方式中，与野生型肽或其部分相比， 变体中被替换、缺失或插入的氨基酸不超过15个。在某些实施方式中，与 野生型肽或其部分相比，变体中被替换、缺失或插入的氨基酸不超过10个。 在某些实施方式中，与野生型肽相比，变体中被替换、缺失或插入的氨基 酸不超过6个。在某些实施方式中，与野生型肽或其部分相比，变体中被 替换、缺失或插入的氨基酸不超过5个。在某些实施方式中，与野生型肽 或其部分相比，变体中被替换、缺失或插入的氨基酸不超过3个。
如本文中使用的，术语"氨基酸"指的是含有任何天然存在或非天然存在 或人工合成的氨基酸残基的氨基酸部分，也就是任何包含至少一个羧基和 通过一个、二个、三个或更多碳原子、 一般为一个(a)碳原子直接连接的至少一个氨基的部分。
当涉及到肽时，术语"衍生物"在本文中指的是源自对象肽的肽。衍生作 用包括化学修饰肽，使得肽仍然保留一些其基本活性。例如，天青蛋白的"衍 生物"可以是保留其抑制哺乳动物血管发生的能力的化学修饰的天青蛋白。 感兴趣的化学修饰包括但不限于肽的酰胺化、乙酰化、硫酸化、聚乙二醇
(PEG)修饰、磷酸化或糖基化。另外，衍生肽可以是多肽或其片段与化合物 的融合，所述化合物是例如但不限于另一种肽、药物分子或其他治疗剂或 药剂或可检测探针。
术语"核苷酸序列相同性百分比(％)"被定义为当两个序列被比对日寸，多 核苷酸中与候选序列中的核苷酸相同的核苷酸的百分比。为了确定出核苷 酸相同性％，比对序列，如果必要，则引入缺口，以便获得最大的序列相 同性％。确定相同性百分比的核苷酸序列比对方法是本领域人员公知的。 常常使用可公用的计算机软件例如BLAST、 BLAST2、 ALIGN2或 Megalign(DNASTAR)软件比对核苷酸序列。在一个具体的实施方式中，使 用Blastn(来自国立生物技术信息中心，BethesdaMD)，其使用低复杂性滤 器的缺省参数，预期10和字长11。
术语"宿主细胞"包括一个独立细胞或者细胞培养物，其可以是或者已经 是一个任何重组载体或者本发明的分离的多核苷酸的接受者。宿主细胞包 括单个宿主细胞的后代，而且由于先天的，随机的，或者有准备的突变和/ 或改变，后代可以不必是完全与初始亲代细胞相同(在形态学上或者总DNA 完整性上)。宿主细胞包括在体内或体外用本发明的重组载体或多核苷酸转 染或感染的细胞。其中包含本发明的重组载体的宿主细胞是"重组宿主细 胞"。
术语"转化"是可以与"遗传修饰"互换使用，是指在引入新DNA(即，所 述细胞的外源DNA)持久的或者瞬时的遗传变化。遗传变化("修饰")可以是 通过将新的DNA整合到宿主细胞的基因组中，或者通过瞬时或稳定地保持 新DNA作为游离元件而实现。
当比对氨基酸序列时，给定氨基酸序列A与或相对于给定氨基酸序列 B的氨基酸序列相同性X(其或者可以表达为给定氨基酸序列A具有或包括 与或相对于给定氨基酸序列B的特定的氨基酸序列相同性)可以被计算为
氨基酸序列相同性％=乂 / Y*100其中
X是通过对A和B的序列比对程序或算法的比对被积分为相同的匹配 的氨基酸残基的数目；而
Y是B中氨基酸残基的总数。
如果氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的序列不相等，那么A与B 的氨基酸序列相同性^将不等于B与A的氨基酸序列相同性％。当比较较 长的序列与较短的序列时，较短的序列将是"B"序列。例如，当比较截短形 式的肽与相应的野生型多肽时，截短形式的肽将是"B"序列。
当比对核苷酸序列时，给定核苷酸序列A与或相对于给定核苷酸序列 B的核苷酸序列相同性％(其或者可以表达为给定核苷酸序列A具有或包括 与或相对于给定核苷酸序列B的特定的核苷酸序列相同性)可以被计算为
核苷酸序列相同性％=乂 / Y*100
其中
X是通过对A和B的序列比对程序或算法的比对被积分为相同的匹配 的核苷酸残基的数目；而
Y是B中核苷酸残基的总数。
如果核苷酸序列A的长度与核苷酸序列B的序列不相等，那么A与B 的核苷酸序列相同性％将不等于B与A的核苷酸序列相同性％。当比较较 长的序列与较短的序列时，较短的序列将是"B"序列。例如，当比较多核苷 酸的一个区域与相应的全长度多核苷酸时，多核苷酸的一个区域将是"B"序 列。
概述
本发明提供包括分离的多核苷酸在内的组合物，其包含来自铜绿假单 胞菌中的富含CpG的DNA。本发明也提供包括富含CpG的DNA在内的药 学组合物，其来自铜绿假单胞菌，和任选的至少一种铜氧还蛋白肽，该药 物成分可以有利地用于治疗患者，特别是患病的患者，尤其是癌症，或者 可以用于预防癌症。本发明还提供治疗患者的方法，特别是患病的患者， 尤其是癌症，或者可以用于预防癌症，包括施用来自铜绿假单胞菌，任选 与铜氧还蛋白肽结合的富含CpG的DNA。本发明同时提供当使用来自铜绿 假单胞菌的天青蛋白基因和癌细胞接触，导致表达具体蛋白质的细胞。细胞可能用在治疗患者，特别是患病的患者，尤其是癌症，或者是预防癌症， 或者是诊断患者的癌症的方法中。
关于本发明的第一方面，先前已知铜绿假单胞菌加工的氧化还原蛋白、
铜氧还蛋白天青蛋白，选择性地进入J774细胞并诱导凋亡，而不进入正常 细胞。Zaborina等人，Microbiology 146: 2521-2530(2000)。天青蛋白同样 可以选择性地进入并杀灭人黑素瘤UISO-Mel-2或人乳腺癌MCF-7细胞。 Yamada等人，PNAS99: 14098-14103(2002); Punj等人，Oncogene 23: 2367-2378(2004)。来自铜绿假单胞菌的天青蛋白优先进入J774鼠网状细胞 肉瘤细胞，与肿瘤抑制蛋白p53形成复合体并将其稳定，提高p53的胞内 浓度，并诱导细胞凋亡。Yamada等人，Infection and Immunity 70: 7054-7062(2002)。对天青蛋白分子的各种结构域进行详细研究显示50-77 位氨基酸(p28)(SEQIDNO: 2)代表对内在化和随后的细胞凋亡活动重要的蛋 白转导域(PTD)。 Yamada等人，Cell. Microbial. 7: 1418-31， (2005)。
现在己知铜绿假单胞菌也释放特有的DNA序列进入细胞外培养基，在 某种意义上，癌细胞的存在加强了这一释放。参见实施例5。 DNA和癌细 胞接触5分钟就从铜绿假单胞菌中释放，表明释放的DNA是源于染色体外 的。参见实施例6。使用限制性内切酶消化释放的DNA，表明DNA富含 G+C核苷酸，并且由此是"富含CpG的DNA"。参见实施例7。在DNA序 列中发现，释放DNA之一是序列SEQIDNO:26，它富含CpG并且与源自 奈瑟氏菌/"z的天青蛋白基因的核苷酸序列95%相同。参见实施例8。最后， 现在已经知道，如同证明的它具有在TLR9-相关方法中激活NF-kB的能力 那样，这种铜绿假单胞菌富含CpG的DNA制剂具有抗肿瘤性。参见实施 例9。
预测铜绿假单胞菌的富含CpG的DNA可以和铜氧还蛋白一起给药治 疗患者，特别是患病，尤其是癌症的患者，或者用于预防癌症。特别地， 预计释放自铜绿假单胞菌的多核苷酸带有非常类似于奈瑟氏laz基因的序 列，SEQIDNO:26，可以与铜氧还蛋白，例如铜绿假单胞菌的天青蛋白， 和/或天青蛋白的50-77位残基区域(p28)联合给药，以提高单独使用铜氧还 蛋白治疗癌症、AIDS、疟疾、不当的血管生成或者有发展成癌症的危险的 患者的有效性。尽管本治疗方法的功能不限于任意一种方式，预料释放自 铜绿假单胞菌的富含CpG的DNA将减少患者的免疫系统侵袭联合给药铜氧还蛋白肽的水平。可以预料，铜绿假单胞菌逐渐成为一种哺乳动物种的 寄生生物，而且哺乳动物种上的肿瘤生长压制铜绿假单胞菌的生长。进一 步，人们认为，暴露于癌细胞时，铜绿假单胞菌积极地分泌天青蛋白作为 抗癌的武器。因为天青蛋白可以是寄主免疫系统抗体形成的靶点，可以预
测铜绿假单胞菌菌株8822也能通过在暴露于癌细胞时释放，变成富含CpG 的DNA，从而可以用作一个假靶点，以转移免疫系统对目标天青蛋白的注 意力。因为富含CpG的DNA被认为是保护任选地联合给药的铜氧还原蛋 白，它能有效提高与铜氧还蛋白给药相关的任何治疗方法的效果，无论是 否治疗疾病或者患病。进一步预测，富含CpG的DNA可以通过保护任何 联合给药的化合物免受免疫系统靶向。
关于本发明的第二个方面，先前已经知道铜绿假单胞菌的天青蛋白是 外周胞质的蛋白质，于生长阶段的晚期分泌在生长培养基中。Zaborina等 Microbiology 146:2521-2530(2000)。其细胞外释放取决于在高细胞密度下的 细胞密度感受，并受到GacA或者两个小的RNA产物RsmY和RsmZ的调 节。Kay等，J. Bacterid. 188:6026-6033(2006)。
现在知道人类癌细胞的存在会引起铜绿假单胞菌释放天青蛋白进入细 胞外介质。在癌细胞系MCF-7和Mel-2存在下，在暴露于所述癌细胞20-30 min内，铜绿假单胞菌释放天青蛋白进入介质，但是在没有癌细胞的情况下， 没有观察到分泌。参见实施例1。此外，天青蛋白的释放不是因为细胞裂解， 需要真正存在癌细胞，而不是来自癌细胞的扩散性因子。参见实施例2。此 外，现在知道癌细胞也将导致具有铜绿假单胞菌天青蛋白基因的大肠杆菌 释放天青蛋白，参见实施例3。最后，从铜绿假单胞菌或者大肠杆菌释放天 青蛋白不需要能量，参见实施例4。
今天，牛分支杆菌(M ^W"的活细胞广泛应用于治疗表浅膀胱癌，并 且在可能的抗癌治疗中使用减毒细菌受到普遍注意。Chakrabarty， J. Bacterial. 185:2683-2686(2003， Minton ， Nature Rev. Microbiol. 1:237-243 (2003); Dang等，Cancer Biol.Therap， 3:326-33(2004): Vassaux等，Pathol. 208:290-298(2006)。预计当与癌细胞接触时，铜绿假单胞菌的天青蛋白基因 可被用于铜绿假单胞菌或者另一种细胞中，例如，大肠杆菌，来表达天青 蛋白或者异源蛋白质。表达天青蛋白或异源蛋白质的具有天青蛋白基因的 细胞可以通过递送表达的蛋白质到癌细胞的位置，或者提供一种癌的位置可以由蛋白质的表达而诊断的方式，来治疗癌症。 本发明的组合物
本发明提供了分离的多核苷酸，其从铜绿假单胞菌中释放，并可用于 治疗患者，特别是患病的，尤其是癌症患者。在一些实施方式中，分离的
多核苷酸是富含CpG的DNA。在一些实施方式中，分离的多核苷酸是在与 癌细胞接触后从铜绿假单胞菌中释放，并按照实施例5中提供的程序制备 的。在其他的实施方式中，分离的富含CpG的DNA可以包含一种或多种 具有SEQIDNOS: 26-62的序列的分离的多核苷酸。在具体实施方式
中， 分离的富含CpG的DNA包含具有SEQ ID NO:26中的序列的分离的多核苷 酸。在其他的具体实施方式
中，富含CpG的DNA由具有SEQIDNOS:26-62 中的序列的分离的多核苷酸组成。
本发明提供组合物，其包含来自铜绿假单胞菌的分离的富含CpG的 DNA，任选地包含至少一种分离的铜氧还蛋白肽。在一些实施方式中，这 些组合物也包含一种药学上可接受的载体。在具体实施方式
中，组合物被 设计为一种特别的给药方式，例如，但不限于，口服、腹膜内或者静脉内 给药。这样的组合物可以在水中被水合，或者可能是经干燥的(例如通过冷 冻干燥)，随后用于水合。这样的组合物可以是在除了水之外的溶剂中，例 如，但是不限于，乙醇。
富含CpG的DNA可以是稳定的DNA形式。在一种实施方式中，DNA 可以是通过用20。/。(Wv)叔丁醇中的氯化钙处理，浓縮DNA而稳定的，使其 形成小的(约50nm)环，以及大的(约300nm)棒状体和球体，即DNA的浓縮 粒子。浓縮粒子具有一个负电表面电荷，显示钙的亚化学计量浓度。更特 别地，在一种实施方式中，在约0.1ng/ml到约lmg/mL的浓度下纯化的去 离子化DNA，可以溶于叔丁醇水溶液中，其浓度是从约17%到约25%(v/v)。 然后，由约0.2mM到约2mM浓度的Ca+2、 Mg^或者Zn"组成的适当二阶 阳离子可以加入到叔丁醇共溶剂溶液中浓縮DNA。在一种实施方式中， DNA主链的阴离子磷酸盐和二价阳离子的化学计量比在(阴离子/阳离子)约 0.1和约1.0之间，最优选约0.3的比率。然后，可使溶液平衡约45分钟， 达到热力学平衡縮合。棒状、环状和球状DNA颗粒是约20到约500nm的 粒度范围。含有浓縮DNA的溶液因此可以转入下游过程单元操作，诸如，无限制，经由0.2211111过滤器进行无菌过滤、喷雾干燥或者冷冻干燥。
然后，无菌过滤的浓縮DNA可以经冷冻干燥或者喷雾千燥处理而获得 稳定的药物剂型。在冷冻干燥之前DNA可以与填充剂，例如蔗糖、甘露醇、 海藻糖、乳糖或者其他常见填充剂结合在一起。由于叔丁醇的升华性质， 叔丁醇溶液冷冻，形成单相，其易于冷冻干燥。在干燥的冷冻块中，DNA 环和棒保持完整无损。重构后，该冻干块可以迅速溶解，并且DNA完全溶 解成非浓縮的天然质粒DNA备用于进行配制，其中仅剩下原始过程中微量 的阳离子和任何添加的填充剂。在该过程的这一阶段基本上不含叔丁醇。
处理DNA的可选方法是使用喷雾干燥。喷雾干燥可包括三个基本单元 过程液体雾化、气体-小滴混合、和液滴干燥。雾化通过三种雾化装置之 一完成高压喷嘴、双流体喷嘴、和高速离心盘。用这些喷雾器，稀溶液 可以分散成小至约2pm的液滴。最大的液滴尺寸很少超过约500拜(35目)。 因为产生了大的总干燥表面和小的小滴尺寸，喷雾干燥器中的实际干燥时 间一般是至多约30秒。
喷雾干燥的主要优点之一是产生球状粒子，这是用任何其他干燥方法 通常不能获得的。取决于材料、送料条件和干燥条件，球状粒子可以是实 心的或者空心的。由于向液滴的高热传递速率，粒子中心的液体蒸发，导 致外壳扩张，形成空心球。
干燥DNA粒子可以以DNA粉末状态使用，准备用于重构入水合溶液， 用于肠胃外施用，包括但不限于静脉内、肌内和腹膜内施用。重构的DNA 也可以进行皮下和眼内给药。重构的DNA还可以气溶胶方式给药，并可以 直接以干燥微粒形式，通过气溶胶或者其他吸入给药方式以粉末递送。配 料用的粉末DNA组合物基本上不含用于改变其结构的溶剂。
分离的多核苷酸可以与在与癌细胞接触后释放自铜绿假单胞菌的DNA 中发1L的一个或多个DNA序列类似但不相同。在一个实施方式中，分离的 多核苷酸可与SEQ ID NOS:26-62的一个或多个具有约80%以上的核苷酸序 列相同性。在另一个实施方式中，分离的多核苷酸可与SEQIDNOS:26-62 的一个或多个具有约90%以上的核苷酸序列相同性。在另一个实施方式中， 分离的多核苷酸可与SEQ ID NOS:26-62的一个或多个具有约95%以上的核 苷酸序列相同性。
本发明的组合物可以进一步包括铜氧还蛋白肽，其具有抗肿瘤活性或者其他使人感兴趣的药理活性。铜氧还蛋白肽可以是铜氧还蛋白、其变体、
衍生物、或者结构等价物，例如记载于美国专利申请号10/047， 710， 2002 年1月15日申请(现在美国专利号7， 084， 105)，和美国专利申请号10〃20， 603， 2003年11月11日申请，美国专利申请号11/244， 105， 2005年10 月6日申请，美国专利申请号11/488， 695， 2006年7月19日申请；美国 专利申请号11/436， 592， 2006年5月19日申请;美国专利申请号11/488， 693， 2006年7月19日申请，美国专利申请号11/436， 590， 2006年5月 19日申请；美国专利申请号11/436， 591， 2006年5月19日申请；美国临 时专利申请号60/843， 388， 2006年9月11日申请；和美国临时专利申请 号60/844， 358， 2006年9月14日申请，其每一个通过引用并入本文。在具体实施方式
中，铜氧还蛋白肽可以具有铜氧还蛋白的至少一种药理活性。 使人感兴趣的具体药理活性包括(l)进入哺乳动物癌细胞，(2)不进入非癌 性哺乳动物细胞，(3)进入癌前期哺乳动物细胞，(4)杀死哺乳动物癌细胞， (5)杀死癌前期哺乳动物细胞，(6)抑制哺乳动物癌细胞的生长，(7)抑制HIV-I 感染，(8)抑制疟疾感染的红血细胞的寄生虫血症，(9)干扰肝配蛋白(ephrin) 信号传导系统，(10)抑制血管生成和(11)抑制癌前期损害的发展。
铜氧还蛋白肽可以是全长的野生型铜氧还蛋白，或者在哺乳动物细胞、 组织和/或动物中显示出一种或多种药理活性的铜氧还蛋白变体、衍生物或 者结构等价物。在一些实施方式中，铜氧还蛋白肽是分离的；在一些实施 方式中，铜氧还蛋白肽是基本上纯的或药物级的。在其他的实施方式中， 铜氧还蛋白处于组合物中，该组合物包含所述肽或者基本上由所述肽组成。 在另一个具体实施方式
中，铜氧还蛋白肽不能提高哺乳动物、更具体是人 的免疫反应。在一些实施方式中，铜氧还蛋白肽小于全长铜氧还蛋白，并 保留铜氧还蛋白的一些药理学特性。
由于铜氧还蛋白之间高度的结构同源性，考虑到铜氧还蛋白肽将具有 和P28(SEQIDNO:2)相同的药理学活性。在一些实施方式中，铜氧还蛋白 肽为但不限于天青蛋白、假天青蛋白、质体蓝素、铁硫菌蓝蛋白、绿丝菌 蓝色铜蛋白或Laz。在尤其特定的实施方式中，所述天青蛋白来自铜绿假单 胞菌、粪产碱菌、氧化木糖无色杆菌反硝化亚种I、支气管败血性博德特氏 菌、甲基单胞菌、脑膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌、荧光假单胞菌、绿针 假单胞菌、苛养木杆菌或副溶血性弧菌。在非常特定的实施方式中，所述天青蛋白来自铜绿假单胞菌。在其它特定的实施方式中，铜氧还蛋白肽包
含氨基酸序列，其为SEQIDNO: 1、 3-19。
铜氧还蛋白肽可以是氨基酸序列变体，其与野生型铜氧还蛋白相比具 有取代的、缺失的或插入的氨基酸。铜氧还蛋白肽可以是野生型铜氧还蛋 白的截短形式。在一些实施方式中，铜氧还蛋白肽包括铜氧还蛋白的区域， 其小于全长野生型多肽。在一些实施方式中，铜氧还蛋白肽包括超过约10 个残基、超过约15个残基或超过约20个残基的截短形式的铜氧还蛋白。 在一些实施方式中，铜氧还蛋白肽包括不超过约100个残基、不超过约50 个残基、不超过约40个残基、不超过约30个残基、或不超过约20个残基 的截短形式的铜氧还蛋白。在一些实施方式中，铜氧还蛋白与铜氧还蛋白 肽，更特别是SEQIDNO: 1-19，具有至少约70%氨基酸序列相同性、至 少约80%氨基酸序列相同性、至少约90%氨基酸序列相同性、至少约95 %氨基酸序列相同性、或至少约99%氨基酸序列相同性。
在特定的实施方式中，所述铜氧还蛋白肽包含铜绿假单胞菌天青蛋白 残基50-77、天青蛋白残基50-67、或天青蛋白残基36-88。在其它实施方式 中，所述铜氧还蛋白肽由铜绿假单胞菌天青蛋白残基50-77、天青蛋白残基 50-67或天青蛋白残基36-88组成。在其它特定的实施方式中，所述铜氧还 蛋白肽由除天青蛋白之外的铜氧还蛋白的等价残基组成。也考虑可以设计 其它铜氧还蛋白肽，其具有和天青蛋白残基50-77、天青蛋白残基50-67或 天青蛋白残基36-88相似的活性。为了达到此目的，采用BLAST、 BLAST2、 ALIGN2或Megalign(DNASTAR)将目标铜氧还蛋白氨基酸序列与铜绿假单 胞菌天青蛋白序列进行比对，相关残基位于铜绿假单胞菌天青蛋白氨基酸 序列上，并且在目标铜氧还蛋白序列上发现等价残基，从而设计等价铜氧 还蛋白肽。
在本发明的一个实施方式中，铜氧还蛋白肽至少包含橙色绿曲菌的绿 丝菌蓝色铜蛋白B的57-89位氨基酸(SEQ ID NO: 20)。在本发明的另一实 施方式中，铜氧还蛋白肽至少包含百日咳博德特氏菌天青蛋白的51-77位氨 基酸(SEQIDNO: 21)。在本发明的另一实施方式中，铜氧还蛋白肽至少包 含丁香假单胞菌天青蛋白的51-77位氨基酸(SEQIDNO: 23)。在本发明的 另一实施方式中，铜氧还蛋白肽至少包含脑膜炎奈瑟球菌Laz的89-U5位 氨基酸(SEQIDNO: 22)。在本发明的另一实施方式中，铜氧还蛋白肽至少包含副溶血性弧菌天青蛋白的52-78位氨基酸(SEQIDNO: 24)。在本发明 的另一实施方式中，铜氧还蛋白肽至少包含支气管败血性博德特氏菌天青 蛋白的51-77位氨基酸(SEQDNO: 25)。
铜氧还蛋白肽也包含使用合成而不是天然存在的氨基酸制备的肽。例 如，非天然存在的氨基酸可以整合到铜氧还蛋白肽中，从而延长或优化所 述组合物在血流中的半衰期。所述变体包括但不限于D，L-肽(非对映异构 体)(例如Futaki等人，J.Biol. Chem. 276(8): 5836-40(2001); Papo等人， Cancer Res. 64(16): 5779-86(2004); Miller等人，Biochem. Pharmacol. 36(1): 169-76， (1987)、含有稀有氨基酸的肽(例如Lee等人，J. Pept, Res. 63(2): 69-84(2004))、含烯烃的非天然氨基酸继以烃锁环(hydrocarbon stapling)(例如 Sehafhieister等，J.Am.Chem.Soc.l22:5891-5892(2000); Walenski等，Science 305: 1466-1470(2004))，以及包括e-(3，5-二硝基苯甲酰基)-赖氨酸残基的肽。
在其他实施方式中，铜氧还蛋白肽是铜氧还蛋白的衍生物。铜氧还蛋 白的衍生物是所述肽的化学修饰形式，使得肽仍然保留一些其基本活性。 例如，天青蛋白的"衍生物"可以是化学修饰的天青蛋白，其保留了其杀死哺 乳动物癌细胞、组织或动物的能力。感兴趣的化学修饰包括但不限于，肽 的烃锁环、酰胺化、乙酰化、硫酸化、聚乙二醇(PEG)修饰、磷酸化和糖基 化。另外，铜氧还蛋白肽可以是铜氧还蛋白肽与化合物的融合体，所述化 合物例如但不限于另一种肽、药物分子或其他治疗性或药物用试剂或可检 测探针。感兴趣的衍生物包括通过其可以延长或优化本发明的肽和组合物 在血流中的半衰期的化学修饰，例如通过一些本领域人员公知的方法，包 括但不限于环化肽(Circularized peptide)(例如Monk等，BioDrugs 19(4): 261-78， (2005); DeFreest等，J. Pept. Res. 63(5): 409-19(2004))、 N-和C-末端修饰(例如，Labrie等，Clin. Invest. Med. 13(5): 275-8， (1990))、和 含烯烃的非天然氨基酸继以烃锁环(例如Schafineister等，J. Am. Chem . Soc . 122 : 5891-5892(2000) ; Walenski等，Science 3051466-1470(2004))。
此外，铜氧还蛋白肽可以是铜氧还蛋白肽与运送物的融合体，所述运 送物例如化合物，包括但不限制于，另一种肽、药物分子、或者其他治疗 剂或者药剂、或者可检测探针。在一个实施方式中，递送可检测物质，例 如，荧光物质，诸如绿色荧光蛋白；发光物质；酶，例如卩-半乳糖苷酶；或者放射性标记或生物素化蛋白，以赋予细胞可检测表型。类似地，用可 检测物质(例如荧光物质)标记的微粒或者纳米颗粒可以被递送。适当纳米颗
粒的一个例子在2002年5月7日授权的美国专利6,383,500中找到，该专 利通过引用明确并入本文。许多这类可检测物质是本领域普通技术人员已 知的。
在一些实施方式中，运送化合物是可检测物质，其适用于X线计算机 体层摄影术、磁共振成像、超声成像或者放射性核素闪烁显像。在这些实 施方式中，为了诊断的目的，向患者施用运送化合物。造影剂作为运送化 合物施用，以便加强X线CT、 MRI和超声获得的图像。经由铜氧还蛋白进 入结构域靶向肿瘤组织的放射性核素运送化合物的施用可用于放射性核素 闪烁显像。在一些实施方式中，铜氧还蛋白进入结构域可以在具有或者没 有运送化合物的情况下容纳放射性核素。在其他的实施方式中，运送化合 物是Y射线或正电子发射同位素、磁共振成象造影剂、X射线造影剂、或 者超声造影剂。
适合用作运送化合物的超声造影剂包括，但不限制于，生物相容性气 体微气泡、液体载体、和表面活性微球，其更进一步包括任选的在寻靶部 分和微气泡之间的连接部分，Ln。在本文中，术语液体载体是指水溶液， 而术语表面活性剂是指在溶液中减少界面张力的任何两亲物质。能够形成 表面活性微球的适当的表面活性剂的列表公布在EP0727225A2，其通过引 用明确并入本文。术语表面活性剂微球包括纳米球、脂质体、小囊泡等等。 生物相容性气体可以是空气、或者碳氟化合物，诸如C3-C5全氟烷，其提供 在产生回声方面的差异，因此在超声成像影像中提供对比。任选地经由连 接基，气体被包封或容纳在微球中，该微球附着有铜氧还蛋白进入结构域。 所述附着可以是共价的、离子的或者通过范德华力。这类造影剂的具体实 例包括脂质包封的全氟碳化合物，其具有大量肿瘤新生血管受体结合肽、 多肽或者肽模拟物。
适合用作运送化合物的X射线造影剂包括，但不限制于， 一种或多种 X射线吸收或"重"原子，其具有原子序数20或更大，进一步在铜氧还蛋 白进入结构域和X射线吸收原子之间包括任选的连接部分，Ln。在X射线 造影剂中经常使用的重原子是碘。近来，已经公布了由金属螯合物组成的X 射线造影剂(例如，美国专利号5，417,959)和由大量金属离子组成的多螯合物(例如，美国专利号5，679，810)。更近以来，已经公开了用作X射线造影 剂的多核族络合物(multinuclear clustercomplex)(例如美国专利号5,804,161 、 PCT WO91/14460和PCT W092/17215)。
适用用作运送化合物的MRI造影剂包括但不限于一种或多种顺磁金属 离子，进一步在铜氧还蛋白进入结构域和顺磁金属离子之间包括任选的连 接部分，Ln。顺磁金属离子以金属配合物或金属氧化物颗粒的形式存在。 美国专利5,412,148和5,760,191描述了用于MRI造影剂的顺磁金属离子的 螯合剂实例。美国专利5,801,228、美国专利5,567,411和美国专利5,281,704 描述了可用于络合一种以上在MRI造影剂中使用的顺磁金属离子的多螯合 剂的例子。美国专利5,520,904记载了由用作MRI造影剂的顺磁金属离子组 成的微粒组合物。
另一个实施方式中，递送运送化合物以杀死或者延迟细胞诸如癌细胞 中的细胞周期发展。上述的癌细胞可以是，例如，骨肉瘤细胞，肺癌细胞， 结肠癌细胞，淋巴瘤细胞，白血病细胞，软组织肉瘤细胞或者乳腺癌，肝 癌，膀胱癌或者前列腺癌的细胞。例如，运送化合物可以是细胞周期控制 蛋白质，诸如p53; —种依赖细胞周期蛋白的激酶抑制剂，诸如p16， p21 或者p27; —种自杀性蛋白质，诸如胸苷激酶或者硝基还原酶； 一种细胞活 素或者其他的免疫调制蛋白质，诸如白介素l，白介素2或者粒细胞巨噬细 胞集落刺激因子(GM-CSF);或者一种毒素，诸如铜绿假单胞菌外毒素A。 在其他的实施方式中，递送以上所述各类化合物之一的生物活性片段。
在又一个实施方式中，运送化合物是一种核酸，其编码以上所述类别 化合物之一。在又一个实施方式中，运送化合物是一种药物，用于治疗癌 症。上述药物包括，例如，5-氟尿嘧啶，干扰素a;氨甲喋呤；三苯氧胺；和 长春新碱。以上所述例子仅仅是提供例子说明，许多其他上述化合物是本 领域技术人员所熟知的。
适合于治疗癌症的运送化合物包括，但不限制于，垸基化剂，诸如氮 芥，烷基磺酸酯，亚硝基脲、氮丙啶和三氮烯；抗代谢物，诸如叶酸拮抗 剂，嘌呤类似物，和嘧啶类似物；抗生素，诸如蒽环类抗生素，博来霉素, 丝裂霉素，更生霉素和普卡霉素；酶，诸如左旋天冬醯胺；法呢基-蛋白质 转移酶抑制剂；5-a-还原酶抑制剂；17p-羟甾醇脱氢酶3型抑制剂；激素类 药剂，诸如糖皮质激素，雌激素/抗雌激素，雄激素/抗雄激素，黄体酮，和促黄体激素释放激素拮抗剂，醋酸奥曲肽；微管分裂剂，诸如，海鞘素或 者他们的类似物和衍生物；微管稳定剂，诸如紫杉烷，例如，紫杉醇(泰克
索TM)，多烯紫杉醇(泰索帝TM)和他们的类似物，以及埃博霉素，例如埃博 霉素A-F和它们的类似物；植物来源的产品，诸如长春花属生物碱，表鬼 臼毒素，紫杉烷和局部异构酶抑制剂；异戊二烯基蛋白质转移酶抑制剂； 和混合剂，诸如羟基脲，丙卡巴肼，米托坦，六甲嘧胺、铂配位复合物例 如顺氯氨铂和卡波铂；以及其他用作抗癌的药剂和细胞毒剂诸如生物效应 调节剂，生长因子；免疫调制剂和单克隆抗体。
这些类别的抗癌剂和细胞毒剂的代表性实例包括但不限于，盐酸氮芥， 环磷酰胺，苯丁酸氮芥，美法仑，异环磷酰胺，白消安，卡莫司汀，洛莫 司汀，司莫司汀，链脲霉素，硫替派，氮烯唑胺，氨甲喋呤，2-氨基嘌呤-6-硫醇，巯基嘌呤，氟达拉滨，喷司他丁，克拉曲宾，阿糖胞苷，氟尿嘧啶， 多柔比星盐酸盐，柔红霉素，伊达比星，争光霉素硫酸盐，丝裂霉素C， 方夂线菌素D， safracin， saframycin， quinocarcin， discodermolide，长春新碱， 长春花碱，酒石酸长春瑞滨，鬼臼亚乙苷，鬼臼亚乙苷磷酸盐，表鬼臼毒 噻吩糖苷，紫杉醇，三苯氧胺，雌氮芥，雌氮芥磷酸钠，氟他米特，布舍 瑞林，亮丙瑞林，蝶啶，diynese，左旋咪唑，aflacon，干扰素、白介素、 阿地白介素、非格司汀、沙莫司亭、利妥昔单抗、BCG，维甲酸，盐酸依 立替康、倍他米松，盐酸吉西他滨、六甲蜜胺和拓泊替康和它们的任何类 似物或者衍生物。
这些类型的优选成员包括，但不限于，紫杉醇、顺铂、卡波铂、多柔 比星、洋红霉素、柔红霉素、氨喋呤、氨甲喋呤、甲氨喋呤、丝裂霉素C、 海鞘素743，或紫菜霉素(pofiromydn)、 5-氟尿嘧啶、6-颈基嘌呤、吉西他 滨、胞嘧啶阿拉伯糖苷、鬼臼霉素或鬼臼霉素衍生物，例如鬼臼亚乙苷、 鬼臼亚乙苷磷酸盐或替尼泊甙、美法仑、长春碱、长春新碱、异长春碱、 去乙酰长春酰胺和环氧长春碱。
用作运送化合物的抗癌剂及其他细胞毒剂的例子包括以下内容如在 德国专利号4138042.8 ; WO97/19086 ， W098/22461 ， W098/25929 , W098/38192, WO99/01124, WO99/02224, W099/02514, WO99/03848, WO99/07692, WO99/27890, W099/28324, W099/43653, WO99/54330, W099/54318, W099/54319 , W099/65913.W099/67252,W099/67253和WO00O0485中发现的埃博霉素衍生物；W099/24416(参见美国专利号 6,040，321)中发现的细胞周期蛋白相关激酶抑制剂，和在WO97/30992和 WO98/54906中发现的异戊二烯基-蛋白质转移酶抑制剂；和诸如在美国专 利号6,011,029中一般记载和特别记载的药物(可以和任何NHR调节剂(包 括，但不限于，本发明的那些调节剂)，诸如AR调节剂，ER调节剂，LHRH 调节剂，或者与外科手术，特别是癌症的治疗一起采用的美国专利的化合 物)。
以上所述其它治疗药剂，当作为运送化合物和本发明的化合物应用时， 可以例如在医生办公参考(Physicians， Desk Reference, PDR)中指出的那些数 量使用，或者以如本领域技术人员确定的量使用。
在另一个实施方式中，铜氧还蛋白肽是铜氧还蛋白的结构等价物。测 定铜氧还蛋白和其他蛋白质之间显著的结构同源性的研究实例包括Toth 等，(Developmental Cell 1:82-92 (2001》。特别地，使用VAST算法测定铜 氧还蛋白和结构等价物之间显著的结构同源性。Gibrat等，Curr Opin Struct Biol 6:377-385(1996); Madej等，Proteins 23:356-3690 (1995)。在特定的实 施方式中，VAST p值从铜氧还蛋白到铜氧还蛋白肽的结构对比是小于约 10—3，小于约l(T5，或者小于约10—7。在其他的实施方式中，使用DALI算 法测定铜氧还蛋白和铜氧还蛋白肽之间显著的结构同源性。Holm&Sander, J.MoI.Biol.233:123-138 (1993)。在特殊实施方式中，成对结构对比的DALI Z分值是至少约3.5，至少约7.0，或者至少约10.0。
考虑到铜氧还蛋白肽可以是超过一种铜氧还蛋白的变体、衍生物和/ 或结构等价物。例如，所述铜氧还蛋白肽可以是经过PEG化的天青蛋白的 截短体，因此使其既是变体又是衍生物。在一个实施方式中，使用含有烯 烃携带链的a,ot-双取代非天然氨基酸，然后进行通过钌催化烯烃复分解的全 烃"锁环"(all-hydrocarbon "staple"),合成所述铜氧还蛋白肽。Scharmeister 等人，J.Am. Chem. Soc， 122: 5891-5892(2000); Walensky等人，Science 305: 1466-1470(2004)。此外，为天青蛋白的结构等价物的肽可以与其它肽 融合，因此可形成既是结构等价物又是衍生物的肽。所述实例只是示例性 的，并不限制于本发明。铜氧还蛋白肽可以结合铜或不结合铜。
在一些实施方式中，铜氧还蛋白肽具有铜绿假单胞菌天青蛋白、特别 是p28的一些功能特性。在一特定的实施方式中，铜氧还蛋白肽可以抑制哺乳动物细胞、组织或动物、特别是但不限于HUVEC的血管发生。铜氧 还蛋白肽可具有抑制哺乳动物癌细胞、特别是但不限于黑素瘤、乳腺癌、 胰腺癌、恶性胶质瘤、星形细胞瘤或肺癌细胞生长的能力。铜氧还蛋白肽 可具有抑制癌前期哺乳动物细胞发展的能力。与等价的非癌细胞相比，铜 氧还蛋白肽可具有进入哺乳动物癌细胞、特别是但不限于黑素瘤、乳腺癌、 胰腺癌、恶性胶质瘤、星形细胞瘤或肺癌细胞的能力。抑制血管发生或癌 细胞生长为所述活性的任何减少或增加率变小，与对照治疗相比其具有统 计学显著性。进入细胞是以任何速度进入细胞，与进入等价正常细胞的速 度相比在统计学上是显著的。
在一些实施方式中，铜氧还蛋白肽是衍生自，但不限于，天青蛋白， 假天青蛋白，质体蓝素，铁硫菌蓝蛋白，绿丝菌蓝色铜蛋白，漆树蓝蛋白， 黄瓜碱性蛋白或者Laz。在特别具体的实施方式中，天青蛋白衍生自铜绿假 单胞菌、粪产碱菌、氧化木糖无色杆菌反硝化亚种I、支气管败血性博德特 氏菌、甲基单胞菌、脑膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌、荧光假单胞菌、绿 针假单胞菌、苛养木杆菌、J^WMWi或副溶血性弧菌。在非常特定的 实施方式中，所述天青蛋白来自铜绿假单胞菌。在其他具体实施方式
中， 铜氧还蛋白肽包括SEQIDNO:l-25的氨基酸序列。
在一些实施方式中，铜氧还蛋白肽具有一些铜绿假单胞菌天青蛋白， 特别是p28的药理学活性。在一个具体实施方式
中，铜氧还蛋白肽能够抑 制肿瘤的发展，减少肿瘤的生长或者杀死哺乳动物的细胞、组织或动物中 的肿瘤细胞。在一些实施方式中，哺乳动物的肿瘤是，但不限制于，由黑 素瘤、乳腺癌、胰腺癌、恶性胶质瘤、星形细胞瘤、肺癌、结直肠癌、头 颈癌、膀胱癌、前列腺癌、皮肤癌和宫颈癌细胞组成。抑制肿瘤发展是任 何的降低、或者縮小其增长率、肿瘤的发展率，相比于控制治疗，统计学 上有显著意义。
本发明的细胞
本发明提供在与癌细胞接触后表达目的蛋白质的细胞。本发明一方面 使用于此公开的铜绿假单胞菌中的天青蛋白基因，通过与癌细胞接触可以 诱导。在一个实施方式中，本发明的细胞来自铜绿假单胞菌，在该细胞的 基因组中具有一个拷贝的铜绿假单胞菌天青蛋白基因，该基因中天青蛋白编码序列用靶蛋白的编码序列替代，并且该基因在接触癌细胞时表达耙蛋 白。在另一个实施方式中，细胞可以是一种除了铜绿假单胞菌之外的种， 在其基因组中具有一个拷贝的铜绿假单胞菌天青蛋白基因，该基因中天青 蛋白编码序列用靶蛋白的编码序列替代，并且该基因在接触癌细胞时表达
靶蛋白。实施例3提供了这种实施方式的一个实例。在另一实施方式中， 细胞可以是一种除了铜绿假单胞菌之外的种，在其基因组中具有一个拷贝 的铜绿假单胞菌天青蛋白基因，该基因中天青蛋白编码序列用靶蛋白的编 码序列替代，并且该基因在接触癌细胞时表达耙蛋白。
目的靶蛋白质包括治疗蛋白质、细胞毒蛋白质和诊断蛋白质,和任何其 他在癌细胞附近产生有益的蛋白质。目的治疗蛋白质的实例包括在本文提 供的铜氧还蛋白肽。制备这样的细胞的方法是本领域技术人员公知的，并 且可获得指导手册，包括Sambrook等，Mo/ecw/w C/o"/"g:^ I"6orato^v Mawwfl/ (Cold Spring Harbor Laboratory Press ， Cold Spring Harbor ， Mass.(2001))。但是，以下提供非限制性细胞制剂和转化治疗方法。
宿主细胞制备方法示范要转化的宿主细胞可以培养在任何有助于生 长的培养基中。这样的培养基的实例包括但不限于Luria肉汤，Luria肉汁 加入20 mM MgCl2、 0.001%硫胺和0.2%葡萄糖；含有0.001% PPG(如下处 方)的SOB培养基；和15/10培养基(如下处方)。其他的适当的培养基是易 于被本领域技术人员认识到的。
用于培养细胞的培养温度可以从约1(TC到约42'C变化。在一个实施方 式中，温度范围从约12'C到约37'C。在另一个实施方式中，温度范围从约 15。C到约32"C，并且在另一个实施方式中，从约20。C到约25。C。在一个具 体实施方式中，细胞可以在约23t:培养。
本领域的普通技术人员会懂得，生长条件和培养龄期可以影响低温贮 藏的细胞的生存能力和转化率。在摇瓶培养中培养的细胞比固定肉汤培养 物通常更耐受冻干的压力。而且，培养基的寿命也影响培养基对冻干生存 的能力。通常，如果考虑到上述冻干的话，晚对数生长期或者早稳定生长 中收获的细胞显示出最强的耐冻干能力。
因此，当考虑到冻干时，细胞优选在摇瓶中培养，虽然可以使用其他 的培育方法，包括发酵器。可以使用任意大小和类型的摇瓶。在一个实施 方式中，可以使用带挡板的2.8L摇瓶进行该加工过程。培养时间根据使用条件(温度，介质，通气性等等)和细胞类型而变化。在摇瓶中通气也将根据
所用的每分钟转数(rpm)而变化，每分钟转数较高，导致通气性较高。在一 些实施方式中，尽管本领域的普通技术人员能确定其他的优选范围，但是 摇瓶一般以100-500rpm、 200-400rpm和200-300rpm摇动。细胞一般培养一 段时间，足够达到550nm，约0.1到约2.0的光密度(OD)。在一个实施方式 中，OD的范围从约0.1到约1.0。在另一个实施方式中，OD的范围从约0.3 到约0.S。在另一个实施方式中，OD的范围从约0.5到约0.8。在另一个实 施方式中，OD的范围从约0.5到约0.7。在另一个实施方式中，OD的范围 从约0.6到约0.8。并且，在另一个实施方式中，OD的范围从约0.66到约 0.75。
细胞达到所需的OD后，聚集细胞以便更进一步处理。如果所需的OD 没有达到或者超出，细胞重新接种并且重复生长过程直到获得足够光密度 的培养基。
采集细胞后(通过无限制，离心，过滤，等)，它们可以任选地冷却(例 如，0。到4i:， 5分钟到2小时)。细胞采集可以通过离心细胞完成，以获得 细胞颗粒。收集也可以通过浓缩细胞完成，然后离心浓縮培养基，得到细 胞沉淀。浓縮细胞的方法包括，但不限制于，使培养基脱水、过滤或者将 培养物进行大小排阻层析，例如使用CentrtconTM株(Amicon Corp.Lexington, Mass) 0
采集细胞后，细胞可以再悬浮于全能缓冲液(competence buffer)中。全 能缓冲液是任意的让细胞能够吸收和建立外源DNA的溶液。全能缓冲液的 非限制性例子包括，50mMCaCl2， 10 mM Tris/HCl(Maniatis.T.等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第二版.，Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)); 0.1MMOPS(pH6.5)， 50mMCaCl2， 10mMRbCl2， 23%V/VDMSO; CCMB80 缓冲液(10mM乙酸钾pH7.0， 80mM CaCl2-H20， 20mM MnCl24H20， 10mM MgCl26H20， 0.1N HC1调节pH为6.4的10%甘油)；TFB缓冲液(Liu等， Biotechniques 8(1): 23-25(1990));和Q1776缓冲液(Maniatis， T.等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual第二版.，Cold Spring Harbor, N.Y(1989))。其 他适宜的缓冲液公开于Tang等，Nucl. Acids Res.22(14):2857 -2858(1994); Chung等，Proc.Natl.Acad Sci. U,S.A.86:2172-2175(1989); M.Dagert和 S.D.Ehrlich， Gene 6:23-28(1974); Kushner， S.R.，遗传工程(H.W.Boyer和S.Nicosia，等)pp. 17-23， Elsevier/North Holland, Amsterdam (1978); Mandel 和Higa， J.Mol.Biol.53:159-162 (1970); Jessee的美国专利号4， 981， 797; 和Hanahan， D.， J. Mol. Biol. 166:557 -580 (1983)，通过引用的方式将其并 入本文中。
在全能缓冲液中悬浮细胞培育足够长的时间，培育在足以使所述细胞 对DNA摄入有感受性的温度下进行。在一个实施方式中，细胞在低温(O到 4'C)下培养约0到约3小时。在另一个实施方式中，细胞在低温(O到4'C) 下培养约5分钟到约1小时。在另一个实施方式中，细胞在低温(O到4°C.) 下培养约5分钟到约30分钟。
使细胞处于感受态后，可以向细胞悬浮液中直接添加冷冻保护剂。在 一个实施方式中，可以采集细胞然后再悬浮在冷冻保护剂中。冷冻保护剂 的浓度改变取决于细胞类型，使用的缓冲液，冷冻保护剂的种类以及其他 因素。无需过多试验，本领域普通技术人员可以确定最佳条件。使用时， 通过降低冰点，冷冻保护剂提供了冷冻处理期间细胞的保护，让细胞外的 溶液转变的效果最小化，渗透细胞以防止溶质浓度的影响，和/或改变最适 宜冷却速率到下限值(F.P, Simione ， Journal of Parenteral Science & Technology 46 (6):226-232(1992))。当然，冷冻保护剂不能是对细胞有毒的。
任何的冷冻保护剂和及其组合可能是并且如同将要显示的那样，类型 和用量取决于细胞类型和使用条件。可用于本发明的冷冻保护剂包括，但 不局限于碳水化合物和碳水化合物衍生物，例如海藻糖，蔗糖，乳糖，麦 芽糖，甘露醇，半乳糖，核糖，果糖，木糖，甘露糖，右旋糖，葡萄糖和 山梨醇，以及聚合物，诸如聚乙烯胺，聚乙烯吡咯垸酮(PVP)，蔗聚糖等等。 其他可一同被用在本发明中的冷冻保护剂，诸如阿拉伯胶，白蛋白，明胶， 和糖醇，本领域技术人员容易认识到。
细胞与冷冻保护剂混合后，细胞悬液可以等分入容器中，用于冻干和 存储，诸如冷的冷冻管，例如NUNC管(GibcoBRL， Gaithersburg， Cat. No. 366656),或者小玻璃管(Wheaton， Millville， NJ.)。在冻干前，在一个实施 方式中，细胞可以在约-20'C至约-180。C下冷冻。在另一个实施方式中，细 胞可以在约-8(TC到约-18(TC下冷冻。在一个具体实施方式
中，细胞可以在 约-8(TC冷冻。
从-80'C到约-18(TC冷冻样品的方法是本领域熟知的。这些包括将装有细胞的小管在-80。C冷冻机中贮藏整夜(约16小时)，或者将装有细胞的小管 浸在干冰，或一个低温浴锅中，诸如干冰乙醇，或在一个盛有液氮的浴器 中。上述的其他系统公开于The Chemist's Companion:A Handbook of Practical Data, Techniques, 和References, Gordon, A.丄，等，John Wiley 和Sons， NY 1972)，通过引用的方式将其并入本文中。
如果需要，细胞可以通过本领域公知的技术冻干。冻干是一个在真空， 低于零度(如-40。到-50'C)下，通过升华从冷冻的细胞除掉冰和/或湿气的过 程。任何与"干燥"制备有关的残余水份通过逐步提高温度，引起蒸发而移除。 因此，冻干包含将冷冻细胞置于真空条件下，以便从上述的细胞(在本文中 也称为基本上干的细胞)中基本上除去湿气和/或冰。基本上干的细胞可以在 不同的温度下存储(室温到约-18(TC，和在一些实施方式中，从约4'C到约 -80°C，从约-20。C到约-8(TC，在一个具体实施方式
中，约-20。C)。
细胞冻干处理的一个非限制例子包含步骤(a)将含有冰冻细胞的容器放 入冷冻干燥器，该冷冻干燥器的温度为约-40。到约-5(TC; (b)将细胞抽真空； 和(c)基本上干燥细胞。在一个实施方式中，真空是小于约100pm，细胞通 过下列方式干燥(i)真空室的温度保持在约-45'C约2小时；和(ii)以约O.l。 到约l.CTC/小时的速率，提高真空室的温度从约-45X:到约l(TC(在一种实施 方式中，约0.5°到约0.8""C/小时，和在一个具体实施方式
中，约0.6°到约0.8°C/ 小时)。那么，在不同温度下所述细胞容器可以密封和存储更长时间。
当存储于-2(TC时，通过所述方法制备的感受态细胞中活宿主细胞的计 数应保留大于约&107约lxl(^个细胞/ml，存储时间为从约0天到约450 天的任一时间段。细胞可能保持最低每微克的DNA(T/昭)约1><105个转化体 的转化率，优选最低每微克的DNA(T/ng)约lxl()S个转化体。适宜的ie藏温 度从约室温到约-18(TC变化。在一个实施方式中，贮存温度范围从约4"C到 约-8(TC。在另一个实施方式中，贮存温度范围从约-2(TC.到约-8(TC。在另 一个具体实施方式
中，贮存温度范围从约-2(TC。贮藏期或时间范围可以从 约0天到约45天，从约0天到约90天，从约0天到约150天，从约240 天到约365天，或者从约365天约450天，虽然较长的存储时间可能使用 于约-2(TC和更低的温度。用这一方法制备的感受态宿主细胞可以在-2(TC下 存储最少一年，基本保持其转化率。
示例性宿主细胞转化方法。本领域普通技术人员懂得，为了转化宿主细胞，通常细胞可以和目的DNA分子混合，在足够将细胞用上述DNA分 子转化的条件下培养。可以使用任何DNA分子(例如，载体，质粒，噬菌 粒，表达载体等等)。优选在有全能缓冲液条件下混合目的DNA分子和细 胞。可在向感受态宿主细胞加入DNA分子之前加入缓冲液，或者同时向感 受态宿主细胞加入DNA分子和全能缓冲液。虽然优选将感受态宿主细胞与 DNA分子和缓冲液混合，可以使用能够再水合和混合细胞与目的DNA分 子的任何溶液。上述的溶液包括水，盐水，或任何适宜的缓冲液。
提供以下更详细的非限制性实施例。将约25-200^1细胞解冻，保持在 冰上。细胞不应放在玻璃管内，因为玻璃会吸附目的DNA。 DNA可以轻轻 移液至细胞混合物中，保持DNA的体积少于约5%的细胞体积。以目的DNA 培养细胞约5到约30分钟。下一步，细胞在约42匸下培养约30秒，然后 在冰上培养约2分钟。在这一步，可以加入约4体积的SOC介质，但是这 一添加不会威胁到成功转化。然后在振荡器上，37'C下，培养细胞约30分 钟到约1小时。按照这样培养，如果需要的话，可以将约100-300^1的细胞 /DNA混合物在以适当抗生素制备的平板上展幵。
一旦以目的DNA分子转化了细胞，转化后的细胞就在有助生长的培养 基上培养。典型地，上述有助生长的培养基也将包含一种抗生素，可以帮 助转化细胞的选择。也就是说，待转化的DNA分子可以包含一种选择性标 记(例如一种抗生素抗性基因)，当相应的抗菌素用于培养基时，允许选择转 化细胞。然而该过程的这些方面不是必需的。
根据本发明，当转化的宿主细胞(和浓縮的DNA)用作一种治疗时，尤 其有用的给药方法可以包括而不限于由导管和药物泵送系统局部输送，由 直接局部注射或通过使用聚合物输送。在一个实施方式中，可以使用"控制 给药系统"，其包括使用一个直接和局部给药系统。控制给药系统可以是储 存或泵送系统，诸如而不限于渗透泵或灌流泵。灌流泵是可植入的，可以 是但不限于可编程泵、固定速度泵，等等。导管可以可操作地连接到所述 泵上，装配输送本发明的细胞到对象的靶组织区域。其他记载在说明书中 的其余部分的输送方法也是适合的。
使用方法
技术领域：
本发明提供了治疗患者的方法，特别是患病的患者，尤其是癌症，和 预防患者的癌症，包括将铜绿假单胞菌的富含CpG的DNA和至少一种铜氧还蛋白肽向上述患者联合给药。这样的治疗可以由给与至少一种本发明
的分离的富含CpG的多核苷酸而进行。可以用本发明的组合物预防或治疗 的癌症包括，但不限于，黑素瘤、乳腺癌、胰腺癌、恶性胶质瘤、星形细 胞瘤、肺癌、结直肠癌、头颈癌、膀胱癌、前列腺癌、皮肤癌和宫颈癌。 在其他的实施方式中，患者患有AIDS、疟疾、血管生成不当，或者是比普 通人高危发展为癌症。在一些实施方式中，患者可以是人类。在其他的实 施方式中，患者不是人类。
所述组合物包含至少一种来自铜绿假单胞菌的富含CpG的DNA和至 少一种铜氧还蛋白肽，可以经由本领域技术人员公知的许多路径和给药方 案给患者施用。在具体的实施方式中，来自铜绿假单胞菌的富含CpG的 DNA和铜氧还蛋白肽进行静脉内、肌内、皮下、局部、口服或吸入施用。 所述组合物可以经由任何输送多核苷酸和多肽给患者的方式给患者施用。 在一些实施方式中，患者患有癌症，而所述组合物以输送多核苷酸和多肽 到肿瘤的位置的方式加以施用。在具体实施方式
中，来自铜绿假单胞菌的 富含CpG的DNA和铜氧还蛋白肽是静脉内施用。
在一些实施方式中，发明的方法包括给患者施用至少一种组合物，其 包含一个单位剂量的铜氧还蛋白肽和一个单位剂量的来自铜绿假单胞菌的
富含CpG的DNA。
在其他的实施方式中，所述方法可以包括向患者以任一顺序共同施用 一个单位剂量的至少一种包含铜氧还蛋白肽的组合物和一个单位剂量的至 少一种包含来自铜绿假单胞菌的富含CpG的DNA的组合物，大致同时施 用，或在另一种施用后大致一段给定的时间内施用，例如，另一种药物施 用后约一分钟到约60分钟，或者另一种药物施用后约1小时到约12小时。
在其他的实施方式中，所述方法可以包括向患者以任一顺序共同施用 一个单位剂量的至少一种包含铜氧还蛋白肽的组合物， 一个单位剂量的至 少一种包含来自铜绿假单胞菌的富含CpG的DNA的组合物，和一个单位 剂量的包含另一种预防性或治疗性药物的组合物，大致同时给药，或者在 其它药物施用后大致一段给定的时间内施用，例如，另一种药物施用后约l 分钟到约60分钟，或另一种药物施用后约1小时到约12小时。另外的治 疗性药物可以是一种或多种通常用于治疗患者所患病症或者治疗副作用的 药物。这类治疗性药物包括，但不限于，用于治疗癌症，AIDS，疟疾，血管发生不当，炎性肠病，病毒疾病，心血管疾病，外周血管疾病，中枢神 经系统疾病，中枢神经系统的退化和阿尔茨海默氏病以及用于预防癌症。
这类治疗性药物的例子记载于10/047， 710， 2002年1月15日申请(现在 美国专利号7， 084， 105)，和美国专利申请号10/720， 603， 2003年11月 11日申请，美国专利申请号11/244， 105， 2005年10月6日申请，美国专 利申请号11/488， 695， 2006年7月19日申请；美国专利申请号11/436， 592， 2006年5月19日申请；美国专利申请号11/488， 693， 2006年7月 19曰申请，美国专利申请号11/436， 590， 2006年5月19日申请；美国专 利申请号11/436，591，2006年5月19日申请；美国临时专利申请号60/843， 388， 2006年9月11日申请；和美国临时专利申请号60/844， 358， 2006 年9月14日申请，其每一个通过引用并入本文。更进一步地，感兴趣的治 疗性药物可以发现于 Thomson Physician's Desk Reference (Thomson Healthcare, Stamford CT. 2006)及其它本领域普通技术人员熟知的那些参考 文献。
用于治疗癌症的药物包括但不局于盐酸氮芥，环磷酰胺，苯丁酸氮芥， 美法仑，异环磷酰胺，白消安，卡莫司汀，洛莫司汀，司莫司汀，链脲霉 素，硫替派，氮烯唑胺，氨甲喋呤，2-氨基嘌呤-6-硫醇，巯基嘌呤，氟达 拉滨，喷司他丁，克拉曲宾，阿糖胞苷，氟尿嘧啶，多柔比星盐酸盐，柔 红霉素，伊达比星，争光霉素硫酸盐，丝裂霉素C，放线菌素D， safracin， saframycin， quinocarcin， discodermolide， 长春新碱，长春花碱，酒石酸长 春瑞滨，鬼臼亚乙苷，鬼臼亚乙苷磷酸盐，表鬼臼毒噻吩糖苷，紫杉醇， 三苯氧胺，雌氮芥，雌氮芥磷酸钠，氟他米特，布舍瑞林，亮丙瑞林，蝶 啶，diynese，左旋咪唑，aflacon，干扰素、白介素、阿地白介素、非格司 汀、沙莫司亭、利妥昔单抗、BCG，维甲酸，盐酸依立替康、倍他米松， 盐酸吉西他滨、六甲蜜胺和拓泊替康和它们的任何类似物或者衍生物。
这些类型的优选成员包括，但不限于，紫杉醇、顺铂、卡波铂、多柔 比星、洋红霉素、柔红霉素、氨喋呤、氨甲喋呤、甲氨喋呤、丝裂霉素C、 海鞘素743，或紫菜霉素、5-氟尿嘧啶、6-巯嘌呤、吉西他滨、胞嘧啶阿拉 伯糖苷、鬼臼霉素或鬼臼霉素衍生物，例如鬼臼亚乙苷、鬼臼亚乙苷磷酸 盐或替尼泊甙、美法仑、长春碱、长春新碱、异长春碱、去乙酰长春酰胺 和环氧长春碱。用于治疗癌症的药物包括以下内容如在德国专利号4138042.8; WO97/19086, W098/22461, W098/25929, W098/38192, WO99/01124, WO99/02224, WO99/02514, WO99/03848, WO99/07692, WO99/27890, W099/28324, W099/43653, WO99/54330, W099/54318, W099/54319, W099/65913, W099/67252, W099/67253和WO00/00485中发现的埃博霉 素衍生物；W099/24416(参见美国专利号6,040，321)中发现的细胞周期蛋白 相关激酶抑制剂，和在WO97/30992和WO98/54906中发现的异戊二烯基-蛋白质转移酶抑制剂；和诸如在美国专利号6,011,029中一般记载和特别记 载的药物(可以和任何NHR调节剂(包括，但不限于，本发明的那些调节剂)， 诸如AR调节剂，ER调节剂，LHRH调节剂，或者与外科手术，特别是癌 症的治疗一起采用的美国专利的化合物)。
用于治疗HIV感染的药物包括但不限于逆转录酶抑制剂AZT(齐多夫 定[Retrovir])、 ddC(扎西他滨[Hivid]、双脱氧肌苷)、d4T(司他夫定[Zerit])、 和3TC(拉米夫定[Epivir]);非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTIS):地拉夫定 (Rescriptor)和奈韦拉平(Viramune);蛋白酶抑制剂利托那韦(Norvir)、洛匹 那韦和利托那韦组合(Kaletra)、沙奎那韦(Invirase)、硫酸印地那韦(Crixivan)、 安泼那韦(Agenerase)和那非那韦(Viracept)。目前，称为高效抗逆转录病毒 疗法(HAART)的若干药物联合被用于治疗HIV患者。
用于治疗疟疾的药物包括但不限于，氯胍，氯丙胍，甲氧苄啶，甲氟 喹，本芴醇，阿托伐醌，乙胺嘧啶-磺胺多辛，乙胺嘧啶-氨苯砜，卤泛群， 奎宁，奎尼丁，氨酚喹，阿莫吡喹，磺胺药，青蒿素，阿替夫林，蒿甲醚， 青蒿琥酯，伯氨喹啉，咯萘啶，氯胍，氯喹，甲氟喹，乙胺嘧啶-磺胺多辛， 乙胺嘧啶-氨苯砜，卤泛群，奎宁，氯胍，氯喹，甲氟喹，1，16-十六亚甲基 双(N-甲基吡咯烷)二溴化物和及其组合。
用于治疗炎性肠病的药物包括但不限于氨基水杨酸盐，如柳氮磺吡啶 (Azulfidine )、奥沙拉嗪(Dipentum⑧)、美沙拉嗪(Asaco1⑧、Pentasa )、和 巴柳氮(Colazal⑧)；糖皮质激素，例如泼尼松、Medrol⑧(美卓乐)、甲基泼尼 松龙、氢化可的松、布地奈德(Entocort EC);免疫调节剂，例如硫唑嘌呤 (Imuran )、 6-巯基嘌呤(6-MP， Purinethol⑧)和环孢菌素A(Sandimmune 、 Neoral );抗生素例如甲硝唑(Flagyl⑧)和环丙沙星(Cipro⑧)；生物治疗剂， 例如英夫利昔单抗(Remicade⑧)、以及其它治疗，例如他克莫司(FK506)和吗逆转录酶抑制剂AZT(齐多夫 定[Retrovir ])、 ddC(扎西他滨[Hivid ]、双脱氧肌苷)、d4T(司他夫定 [Zerit ])、和3TC(拉米夫定[Epivir刷)；非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTIS): 地拉夫定(Rescriptor⑧)和奈韦拉平(Viramune⑧)；蛋白酶抑制剂利托那韦 (Norvir )、洛匹那韦和利托那韦组合(Kaletra⑧)、沙奎那韦(Invirase⑧)、硫 酸印地那韦(Crixivan⑧)、安泼那韦(Agenerase⑧)和那非那韦(Viracept⑧)。用于治疗病毒疾病的药物包括但不限于阿昔洛韦、水痘带状疱疹免疫 球蛋白(VZIG⑧)、PEG干扰素、利巴韦林、阿昔洛韦(Zovirax⑧)、伐昔洛韦 (Valtrex⑧)、泛昔洛韦(Famvir⑧)、金刚垸胺、金刚烷乙胺、扎那米韦、奥赛米韦和(X-干扰素。用于治疗心血管病的药物包括但不限于抗凝剂、抗血小板药、溶栓剂、 肾上腺能神经阻断剂、肾上腺能神经激动剂、a/卩-肾上腺能神经阻断剂、血 管紧张肽转变酶(ACE)抑制剂、血管紧张肽转变酶(ACE)抑制剂和钙离子通 道阻断剂、血管紧张肽转变酶(ACE)抑制剂和利尿剂、血管紧张素H受体拮 抗剂、钙通道阻断剂、利尿剂(包括碳酸酐酶抑制剂、髓袢利尿剂、保钾利 尿剂、噻嗪类和相关利尿剂)、血管扩张剂和血管升压药等。用于治疗外周血管病的药物包括但不限于乙酮可可碱(Trental(巡能 泰)⑧)、口服甲基黄嘌呤衍生物、和西洛他唑(Pletal⑧)；m型磷酸二酯酶抑 制剂；抗血小板/抗血栓治疗如阿司匹林；抗凝剂如肝素和warfarin⑧(华法 林)(Coumadin );降胆固醇药物如烟酸、他汀类、贝特类、1opid⑧片剂(吉 非贝齐；Parke-Davis)、 tricor片剂(非诺贝特；Abbott)、胆酸多价螯合剂、 colestid(降胆宁)⑧片剂(微粒化的盐酸降胆宁；Pharmacia和Upjohn)、 welchol⑧片剂(盐酸考来维纶；Sankyo);钙通道阻断剂；维生素和食品添加 物如叶酸、B-6、 B-12、 L-精氨酸和①-3脂肪酸和HMG-COA还原酶抑制 剂如advicor⑧片剂(烟碱酸/洛伐它丁； Kos); altocor⑧延长释放片剂(洛伐他 汀；Andryx labs); lescol⑧胶囊(氟伐他汀钠；Novartis & Reliant); lipitor 片剂(阿托伐他汀；Parke-Davis和Pfizer); mevacor⑧片剂(洛伐他汀Merck); pravachol⑧药片(普伐他汀钠；Bristol-Myers Squibb)、pravigard PAC片剂(缓 冲阿司匹林和普伐他汀钠；Bristol-Myers Squibb); zocor⑧片剂(辛伐他汀； Merck);烟酸类药物如advico漲片剂(烟碱酸/洛伐他汀；Kos (也作为HMG-COA还原酶抑制剂列出))；niaspan⑧(碱酸；Kos);和其它药物，如 zetia⑧片齐!j(依泽替米贝；Merck / Schering Plough)。用于治疗中枢神经系统疾病的药物包括但不限于精神治疗药物例如各 种苯二氮卓类制剂和组合、抗焦虑药、抗抑郁药(包括单胺氧化酶抑制剂 (MAOI)、选择性5-羟色胺再吸收抑制剂(SSRI)、三环类抗抑郁药)、抗躁狂 剂、抗惊恐剂、抗紧张剂、精神兴奋剂、和强迫性障碍治疗药物；偏头痛 制剂如P肾上腺能神经阻断剂、甲异辛烯胺和5-羟色胺受体抑制剂、以及 其他偏头痛制剂包括depakote⑧片剂中的活性成分(双丙戊酸钠；Abbott)、 和excedrin⑧偏头痛片剂中的活性成分(醋氨酚；BMS Products);镇静剂和 安眠药；抗惊厥剂；和pimozide⑧。用于治疗帕金森病的药物包括但不限于 抗胆碱能药物、儿茶酚-O-甲基转移酶抑制剂、多巴胺药物和单胺氧化酶 (MAO)抑制剂。用于治疗中枢神经系统(CNS)退行性疾病的药物包括以下药物用于治 疗多发性硬化的药物包括但不限于avonex⑧中的活性成分(干扰素-pia， Biogen Neurology);用于皮下注射的Betaseron⑧(干扰素-pib的修饰形式 Berlex);用于注射的Copaxone (醋酸格拉默；Teva Neuroscience); depo-medrol⑧可注射悬浮剂(醋酸甲基泼尼松龙；Pharmacia & Upjohn); Novantrone 注射用浓縮剂(以盐酸米托蒽醌提供的米托蒽醌；Serono); Orapred⑧口服液(泼尼松龙磷酸钠口服液；Ascent);和Rebif⑧注射液(干扰 素-(31a; Pfizer & Serono)。用于治疗亨廷顿病的药物包括但不限于安神剂如 氯硝西泮(Klonopin );抗精神病药如氟哌啶醇(Haldol )和氯氮平 (Clozaril );氟西汀(Prozac⑧、Sarafem )、舍曲林(Zoloft⑧)、去甲替林 (Aventyl 、 Pamelor )。和锂剂(Eskalith⑧，Lithobid )。用于治疗阿尔茨海默病的药物包括但不限于aricept⑧片剂(盐酸多奈培 齐；Eisai或Pfizer); exelon⑧胶囊(利斯的明(酒石酸氢盐形式)；Novartis); exelon⑧口服溶液(酒石酸利斯的明Novartis); reminyl 口服液(氢溴酸加兰 他敏；Janssen)或reminyl 片剂(氢溴酸加兰他敏；Janssen)。目的化学预防药物包括，但不限于，它莫西芬，芳香酶抑制剂诸如来 曲唑和阿那曲唑(Arimidex⑧)，类视黄醇诸如N-[4-羟苯基]维甲酰胺(HPR， 芬维A胺)，非甾体类抗炎药(NSAID)诸如阿斯匹林和舒林酸，塞来考昔 (COX2抑制剂)，二氟甲基鸟氨酸(DFMO)，熊去氧胆酸，3-羟基-3-甲基戊，EKI-785(EGFR抑制剂)，贝伐单抗(VEGF-受 体的抗体)，西妥昔单抗(EGFR的抗体)，视黄醇诸如维生素A， p-胡萝卜素， 13-顺式视黄酸，异维甲酸和棕榈酸视黄酯，a-生育酚，干扰素，溶瘤细胞 性腺病毒dl1520 (ONYX -015)，吉非替尼，依曲替酯，非那雄胺，鹏画3-甲醇，白藜芦醇，绿原酸，雷洛昔芬，和奥替普拉。本发明的方法进一步包括施用本发明的细胞的方法。这样的方法包括 治疗患者、尤其是患有病症、尤其是癌症的患者的方法，和用于诊断患者 癌症的方法。在一些实施方式中，通过施用当与癌细胞接触后表达天青蛋 白的细胞，或者与癌细胞接触后表达治疗性或细胞毒性靶蛋白的细胞，可 以治疗患有癌症的患者。在其他的实施方式中，患者患有癌症，例如，但 不限于，黑素瘤、乳腺癌、胰腺癌、恶性胶质瘤、星形细胞瘤、肺癌、结 直肠癌、头颈癌、膀胱癌、前列腺癌、皮肤癌、和宫颈癌。在其他的实施 方式中，所述方法如下诊断患者癌症施用与癌细胞接触后表达诊断蛋白 质的细胞，然后在血流中或者在其表达位置处检测所述诊断蛋白质。本发明的细胞可以经任何适当的方式给患者施用，包括但不限制于， 静脉内注射，肌内注射，皮下注射，吸入，局部施用，栓剂，玻璃体注射 和口服。在一个具体的实施方式中，细胞进行静脉内施用。包含富含CpG的DNA或细胞的药物组合物包含本发明的铜绿假单胞菌的富含CpG的DNA或细胞的药物组合物 可以用任何适当的常规方法制备，例如通过常规混合、溶解、粒化、糖衣 制备、乳化、包囊化、包埋或冻干方法。基本上纯的或药物级的本发明的 铜绿假单胞菌的富含CpG的DNA或细胞可以容易地与本领域公知的药物 可接受载体组合在一起。这些载体使得制品可以被配制成片剂、丸剂、锭 剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂、悬浮液等。合适的载体或赋形剂也 可以包括，例如填料和纤维素制品。其他的赋形剂可以包括，例如调味剂、 着色剂、防粘剂、增稠剂和其他可接受的添加剂、佐剂或粘合剂。在一些 实施方式中，药物制剂基本上没有防腐剂。在其他的实施方式中，药物制 剂可包含至少一禾中防腐齐U。在Ansel等，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Lippencott Williams & Wilkins, Baltimore MD(1999》 中可以找到关于药物剂形的 一般性方法。包含本发明的铜绿假单胞菌的富含CpG的DNA或细胞的药物组合物 可以用许多方式施用，包括通过注射(如，皮内、皮下、肌肉内、腹膜内等)， 通过吸入、通过局部施用、通过栓剂、通过使用透皮贴剂或通过口服。在 Ansd等(同上)中可以找到关于药物递送系统的一般信息。在一些实施方式 中，包含本发明的铜绿假单胞菌的富含CpG的DNA或细胞的组合物可以 被配制并直接用于皮下和静脉内注射等的注射液。具体地说，可注射制剂 可以有利地用来治疗适合于化学预防治疗的患者。任选地在与诸如聚丙二 醇或类似包衣剂的保护剂混合后，包含本发明的铜绿假单胞菌的富含CpG 的DNA或细胞的组合物也可以进行口服。当通过注射施用时，本发明的铜绿假单胞菌的富含CpG的DNA或细 胞可以配制成水溶液，特别地配制成生理学相容性缓冲液，例如Hanks液、 Ringer液或生理盐水缓冲液。所述溶液可以包含配制剂，例如悬浮剂、稳 定剂和/或分散剂。可选地，本发明的铜绿假单胞菌的富含CpG的DNA 或细胞可以是粉末形式，用于在使用前用合适载体例如灭菌无热原水进行 构建。在一些实施方式中，药物组合物不包含佐剂或任何其他被加入用于 增强所述多核苷酸所剌激的免疫反应的物质。在一些实施方式中，药物组 合物包含抑制针对所述多核苷酸的免疫反应的物质。当通过静脉内液进行施用时，用于施用本发明的铜绿假单胞菌的富含 CpG的DNA或细胞的静脉内液可以由类晶体或胶体组成。本文所用的类晶 体是无机盐或其他水溶性分子的水溶液。本文所用的胶体包含更大的不溶 性分子例如明胶。静脉内液可以是无菌的。可以被用于静脉内施用的类晶体液包括但不限于生理盐水(浓度0.9% 的氯化钠溶液)、乳酸盐林格液或林格液、和5%葡萄糖水溶液(有时也称作 D5W)，如表1所示。表1.常见类晶体溶液的组成溶液其他名称[Na+][cr〗[葡萄糖]D5W5%葡萄糖002522/3 & 1/33.3%葡萄糖/ 0.3%生理盐水5151168半生理盐水0.45% NaCl77770生理盐水0.9% NaCl1541540乳酸盐林格液林格溶液1301090*乳酸盐林格液还含有28 mmol/L乳酸盐、4 mmol/L K+和3 mmol/L Ca2+。当通过吸入施用时，利用合适的推进剂例如二氯二氟甲垸、三氯氟甲 烷、二氧化碳或其他合适的气体，可以通过加压包装或加压喷雾器，以气 雾剂形式输送本发明的铜绿假单胞菌的富含CpG的DNA或细胞。对于加 压气雾剂而言，通过提供计量输送的阀，可以确定出剂量单位。可以配制 用于吸入器或吹入器的由明胶制成的胶囊和药筒，其含有多核苷酸和合适 的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。当通过局部给药时，可以将本发明的铜绿假单胞菌的富含CpG的DNA 或细胞配制成溶液、凝胶、软膏、乳膏、凝胶剂、悬浮液等，如本领域所 公知。在一些实施方式中，经透皮贴剂的方式进行施用。当通过栓剂(例如 直肠或阴道栓剂)进行施用时，本发明的铜绿假单胞菌的富含CpG的DNA 或细胞也可以配制成含有常规栓剂基质的组合物。当口服施用时，通过混合本发明的铜绿假单胞菌的富含CpG的DNA 或细胞和本领域公知的药学上可接受载体，可以容易地配制本发明的铜绿 假单胞菌的富含CpG的DNA或细胞。可以采用固体载体例如甘露醇、乳 糖、硬脂酸镁等；合适的载体使得本发明的铜绿假单胞菌的富含CpG的 DNA或细胞可以被配制成片剂、丸剂、锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆剂、 膏剂、悬浮液等，用于待治疗对象的口服摄入。对于口服固体制剂例如粉 末、胶囊和片剂，合适的赋形剂包括填充剂例如糖类、纤维素制品、造粒 剂和粘合剂。其它常规载体，如本领域公知的，也包括多价载体，例如细菌荚膜多 糖、葡聚糖，或被基因工程化的载体。此外，包括铜绿假单胞菌的富含CpG的DNA的持续释放制剂允许富含CpG的DNA在延长的时间期间内释放， 这样在无持续释放制剂的情况下，铜绿假单胞菌的富含CpG的DNA将在 没有引起或增强治疗效应之前被对象系统清除，和/或被例如蛋白酶和简单 水解所降解。在各种实施方式中，所述药物组合物包含载体和赋形剂(包括但不限于 缓冲剂、碳水化合物、甘露醇、蛋白质、多肽或氨基酸例如甘氨酸、抗氧 化剂、抑菌剂、螯合剂、悬浮剂、增稠剂和/或防腐剂)、水、油、盐水溶液、 葡萄糖水溶液和甘油溶液、接近生理条件所需的其他药学上可接受的辅助 物质例如缓冲剂、渗涨度调节剂、润湿剂等。可以认识到，虽然可以采用 本领域普通技术人员已知的任何合适的载体来施用本发明的组合物，但是 载体的类型将根据施用模式而有所不同。利用公知的技术也可以将化合物 包封在脂质体内。生物可降解微球也可以被采用作本发明的药物组合物的 载体。例如在美国专利号4,897,268、 5,075,109、 5,928,647、 5,811,128、 5,820,883; 5，853，763; 5，814，344和5,942,252中描述了合适的生物可降解微 球。包含富含CpG的DNA的药物组合物可以通过常规的公知灭菌技术灭 菌进行灭菌或者可以进行无菌过滤。所形成的水溶液可以被包装以直接使 用，或者被冻干，该冻干制剂在施用之前与无菌溶液组合。富含CpG的DNA或细胞的施用本发明的铜绿假单胞菌的富含CpG的DNA或细胞可以配制成药物组 合物，并经由任何合适路径施用，例如，通过口服、含服、吸入、舌下、 直肠、阴道、经尿道、鼻、局部、经皮，即经皮或肠外(包括静脉内、肌肉 内、皮下和冠状动脉内)和玻璃体施用。其药物制剂可以任何有效实现预定 目标的量施用。更具体地说，所述组合物以预防或治疗有效量施用。在具 体的实施方式中，预防或治疗有效量通常是从约0.01-20mg/天/kg体重。包含本发明的铜绿假单胞菌的富含CpG的DNA或细胞的复合物可用 于治疗病症、特别是癌症，以及预防癌症，可以单独或者结合其他活性药 剂进行。当然，适当的剂量是依赖于，例如，所使用的本发明的铜绿假单 胞菌的富含CpG的DNA或细胞的复合物、宿主、给药模式和病症的性质 和严重程度而有所不同。但是， 一般来说，认为约0.01-20mg/Kg体重的日剂量将在人体中获得满意的结果。标明的人日剂量范围是从约0.7mg到约 1400 mg本发明的铜绿假单胞菌的富含CpG的DNA或细胞的复合物，其方 便地施用，例如每日施用、每周施用、每月施用和/或连续施用。每日施用 可以是从每日1次到12次的分开施用。可选地，施用可以是每隔一天、每 隔两天、每隔三天、每隔四天、每隔五天、每周，并且类似地以日增量达 到31天或更长来进行。可选地，使用贴剂、静脉内施用等，施用可以是连 续的。由主治医师根据患者情况决定确切的制剂、给药路径和剂量。可以个 别调整剂量和间隔，以提供足以保持预防或治疗效果的铜绿假单胞菌的富 含CpG的DNA和铜氧还蛋白肽的血浆水平。通常在与药物载体混合的情 况下进行施用，所述药物载体根据计划施用途径和标准药学实践加以选择。 在本发明的细胞的情况下，剂量和间隔可以个别调整，从而在癌细胞位置 提供足够保持预防或治疗效果或诊断性存在的耙蛋白或天青蛋白水平。包含富含CpG的DNA或细胞的试剂盒在一个方面，本发明提供了在包装或容器中含有一种或多种以下项目 的试剂盒:(l)包含铜绿假单胞菌的富含CpG的DNA的药物组合物;(2)包 含至少一种铜氧还蛋白肽的药物组合物；(3)另外的预防或治疗药物；和(4)将生物活性组合物给患者施用的装置，例如注射器、喷雾器等。在另一个方面，本发明提供了在包装或容器中包含一种或多种以下项 目的服法或试剂盒(l)本发明的细胞；和(2)向患者施用所述细胞的装置。当提供试剂盒时，如果适合，组合物的不同组分可以被包装在分开的 容器内，并在使用前即刻将其混合。这种分开包装组分可以容许长时间储 存而不失去活性组分的功能。试剂盒中包含的试剂可在任何种类的容器中提供，要求不同组分的使 用期得到保持并不被容器的材料所吸收或改变。例如，密封的玻璃安瓿可含有冻干的富含CpG的DNA，或在中性、不反应性气体例如氮气下包装的 缓冲液。安瓿可由合适的材料构成，例如玻璃、有机聚合物如聚碳酸醋、 聚苯乙烯等、陶瓷、金属或通常用于保存相似试剂的任何其它材料。其它 合适容器的实例包括简易瓶，其由与安瓿相似的物质制造而来，和封套 ((envelopes),其可包含金属箔衬里的内部，例如铝和合金。其它的容器包括试管、管形瓶、烧瓶、瓶、注射器等等。容器可具有无菌存取口，例如 有塞子的瓶子，该塞子可用皮下注射针头刺穿。其它容器可具有两室，两 室被容易去除的膜分开，去除所述膜后允许组分混合。可去除膜可为玻璃、 塑料、橡胶等。试剂盒也可以提供说明材料。说明书可以被打印在纸或其它载体上，或者可以提供电子可读介质如软盘、CD-ROM、 DVD-ROM、压縮盘(Zip disc)、录像带、录音带、闪存盘等。详细的说明书可以不与试剂盒以物理 形式在一起；取而代之的是，用户可以被引导到试剂盒的制造商或经销商 指定的互联网站点，或者通过电子邮件来提供。通过参照下面的具体实施例，可以获得对本发明的更完整的理解。描 述实施例只是为了举例说明的目的，并不旨在限制本发明的范围。当情况 提示或使得这样更便利时，形式的变化和等同替换也被考虑在内。尽管本 文使用具体术语，但这些术语只是描述意义的，而不是限制的目的。，如 上文所述的对本发明的修饰和变化可以在不脱离本发明的精神和范围的情 况下进行实施例实施例1.在MCF-7细胞存在下，铜绿假单胞菌释放的天青蛋白进入 介培养基来自铜绿假单胞菌的天青蛋白是一种周质蛋白质，但已知其在生长晚 期在生长培养基中分泌。Zaborina等，Microbiology 146:2521-2530 (2000)。 它的细胞外释放取决于高细胞密度下的细胞密度感受并由GacA或者两个 小RNA产物(RsmY和RsmZ)调节。Kay等，J. Bacteriol. 188:6026-6033 (2006)。进行实验，以确定当与癌细胞接触后，铜绿假单胞菌是否释放天青 蛋白进入细胞外培养基。如以前由Darzins等(J. Bacteriol. 161:249-257 (1985))所述，使用来自囊 性纤维化患者的铜绿假单胞菌的黏液型分离菌株8821和其自发产生的非黏 液型(非藻酸盐分泌)衍生物8822。当在补充组氨酸的葡萄糖基本培养基中 生长时，菌株8822在生长约4小时后，在中间指数生长期时，于生长培养 基中分泌天青蛋白。在生长约2小时的滞后期或极早对数期，在生长培养 基中观察不到天青蛋白。黏液型菌株8821甚至在晚对数期或早稳定期都乏天青蛋白分泌。已知由于外泌多糖藻酸盐的大量分泌，黏液型菌株缺乏细胞外蛋白质分泌。Ohman和Chakrabarty, Infect. Immun. 37:662-669 (1982); Woods等，J, Infect. Dis. 163:143-149 (1991)。向8821和8822细胞(660 nm下的光密度为约0.3)中添加1.6xl0"到 4xl()S个人乳腺癌细胞系MCF-7的细胞，生长几个小时，并在离心分离细 胞和经由0.22pm膜滤器过滤生长培养基之后，使用抗天青蛋白抗体，通过 蛋白质印迹法测量细胞外生长培养基中的天青蛋白水平。Punj等，Oncogene 23:2367-2378(2004)。使用无MC-7细胞但有等价量的生长培养基的对照。添加MCF-7细胞到黏液型菌株8821或非黏液型菌株8822，对假单胞 菌属细胞的生长速率具有极小的影响(图1A， a)。然而，最令人感兴趣的是， 暴露于MCF-7细胞在20分钟内引起显著量的天青蛋白分泌到细胞外生长 培养基(图IA)，如由蛋白质印迹法所测定(图1A， c)，但只从菌株8822分 泌。在已知缺乏细胞外蛋白质分泌的黏液型菌株8821中，在MCF-7细胞 不存在的情况下可达一小时或几小时都没有观察到天青蛋白分泌(图1A， b 和c)。使用标准曲线进行通过蛋白质印迹法的天青蛋白的分泌量化(图1B)。 采用另一种人癌细胞系黑素瘤Md-2，获得类似的结果(数据未显示)。在 MCF-7和Mel-2的情况下，在暴露于所述癌细胞20到30分钟之内观察到 天青蛋白分泌，但在不存在癌细胞的情况下没有分泌，这强烈显示，菌株 8822能够感测人癌细胞的存在，并开始分泌天青蛋白以应答它们的存在。即使延迟到40mm左右，在存在MCF-10A细胞下，观察到类似分泌， 所述MCF-10A细胞是无限增殖化正常乳腺上皮细胞。天青蛋白分泌的程度 也取决于癌细胞的浓度当lxl0Vml 8822细胞暴露于2xl06/ml癌细胞 (L4nM天青蛋白)时，比当暴露于1.6xl0Vml MCF-7细胞(< 0.1 nM天青蛋 白)或8xl(/个细胞/ml (0.7nM天青蛋白)时，在生长培养基中观察到高得多 的天青蛋白水平，显示出天青蛋白分泌对于MCF-7细胞暴露的剂量依赖性。为保证黏液型菌株8821不缺乏天青蛋白产生，通过制备细胞裂解物， 和使用固定量(5(Vg)的溶胞产物蛋白、通过SDS-PAGE分离天青蛋白，还 测量了菌株8821和8822中的细胞内天青蛋白水平(图1C)。虽然仅从非黏 液型细胞观察到分泌，但是菌株8821和8822都显示出存在细胞内(周质) 天青蛋白。在不存在(对照)或存在MCF-7细胞的情况下，菌株8822的细胞 内和细胞外部分的天青蛋白通过标准曲线(图1B)进行量化，表明约6到8%的细胞内天青蛋白是在60分钟的温育期间释放到外部培养基。实施例2. MCF-7细胞诱导天青蛋白在无细胞裂解的情况下从铜绿假单 胞菌释放为了确定添加癌细胞是否可诱导铜绿假单胞菌的溶解，从而在生长培 养基中释放天青蛋白及其它蛋白质，将宽宿主范围的质粒pQF47引入菌株 8822，该质粒具有编码P-半乳糖苷酶的功能性lacZ基因。然后，在60分钟 期间内，在MCF-7细胞存在或不存在的情况下，评价在生长培养基中天青 蛋白和P-半乳糖苷斷LacZ)的释放。在60分钟温育期间，在MCF-7细胞不存在(对照)或存在的情况下，都 没有可测量的LacZ释放进入细胞外生长培养基(图2A)。细胞裂解物的检测 表明，在不存在或存在癌细胞的情况下都存在细胞内LacZ(图2A)，这显示 出非常少的细胞溶解，因此几乎没有细胞内LacZ释放进入外部生长培养基。然而，检测生长培养基中天青蛋白的存在，清楚地表明，尽管分泌天 青蛋白并从而在MCF-7细胞存在下被检测到，但在其不存在时极少的天青 蛋白被检测到(图2B)，这清楚地证明MCF-7细胞诱导而不是LacZ在天青 蛋白从细胞分泌中起作用。在单独的菌株8822和具有pQF47质粒的菌株 8822 (8822/pQF47)中细胞内LacZ的评价证明，如所预料，尽管铜绿假单胞 菌菌株8822缺乏功能性lacZ基因，从而不产生LacZ蛋白质，但8822/pQF47 产生大量的细胞内LacZ(图2C)。外部培养基中天青蛋白的存在不是由于裂 解所致，这也得到通常缺乏蛋白质分泌的黏液型菌株8821也缺乏天青蛋白 分泌这一事实的确认(图1A):细胞的溶解将会在其生长培养基中释放天青 蛋白。^^縮过滤的MCF-7细胞生长培养基用于确定铜绿假单胞菌菌株8822 是否应答于癌细胞的任何可扩散代谢物。在这类条件下，没有观测到天青 蛋白的分泌，证明天青蛋白的分泌是接触依赖性的，但不依赖于能量。这 样的分泌方式将暴露于癌细胞的天青蛋白分泌与其它的蛋白质分泌方式区 分开。Kostakioti等，J. Bacteriol. 187: 187: 4306-4314 (2005); Thanassi等， Mol, Membr. Biol. 22:63-72 (2005)。实施例3. MCF-7细胞特异性诱导天青蛋白从大肠杆菌释放天青蛋白是一种铜绿假单胞菌中的周质蛋白质。当铜绿假单胞菌天青 蛋白基因在大肠杆菌JM109中表达时，在周质中发现所得到的天青蛋白， 并从大肠杆菌细胞的周质部分将其纯化。Goto等，Mol. Microbiol. 47:549-559 (2003)。铜绿假单胞菌的另一种周质蛋白质是细胞色素c551，其 在体外电子转移期间和天青蛋白组成一对，并且其也可以从在厌氧条件下 生长的大肠杆菌细胞JCB7120细胞的周质部分中纯化。出处同上。研究在MCF-7细胞不存在或存在的情况下天青蛋白和细胞色素c551从 铜绿假单胞菌和大肠杆菌菌株的分泌。这些研究确定暴露于MCF-7乳腺癌 细胞是否允许细菌外膜破裂以释放任何周质蛋白质或者在天青蛋白的分泌 中是否具有特异性。进一步，这些研究确定天青蛋白的分泌是否是铜绿假 单胞菌特异性的，或者是否可以从其他的细菌诸如大肠杆菌中产生。在有氧生长的限定条件下，铜绿假单胞菌8822中的细胞内或细胞外细 胞色素c^的水平太低，以致于通过蛋白质印迹法检测不到。然而，在超表 达所述蛋白质的大肠杆菌细胞的提取物中，明显检测到天青蛋白和细胞色 素(图3, A和B，时间0*)。与铜绿假单胞菌相似，将含有铜绿假单胞菌azu 基因的大肠杆菌细胞暴露于MCF7-细胞，引起天青蛋白大量分泌至外部培 养基，但只在癌细胞存在的情况下分泌(图3A)。然而，令人感兴趣的是， 当含有周质细胞色素c551的大肠杆菌细胞暴露于MCF-7细胞时，在外部生长培养基中检测到极少量的细胞色素C5"图3B)，这表明，即使当明显检测到细胞内细胞色素c551时，暴露于MCF-7细胞也是特异性地诱导天青蛋白 而不是细胞色素c551从大肠杆菌分泌天(图3B)。实施例4.天青蛋白从铜绿假单胞菌或大肠杆菌中的分泌是非能量依赖性的为了确定铜绿假单胞菌8822或大肠杆菌JM109的天青蛋白分泌是否需 要能量，在protonophore羰基氰化氯苯腙(CCCP)的存在下，在两个不同浓 度(对于铜绿假单胞菌8822用50和250^M;对于大肠杆菌JM109用250pM)， 于暴露MCF-7癌细胞之前培养细菌。CCCP是一种氧化磷酸化的解偶联剂， 并且抑制在所用浓度下的细菌生长(图3E;左图，铜绿假单胞菌8822;右 图，大肠杆菌JM109)。然而，CCCP几乎不影响铜绿假单胞菌8822 (图3C或者大肠杆菌JM109 (图3D)的天青蛋白分泌，这表明天青蛋白分泌是非能 量依赖性的。实施例5. MCF-7细胞诱导15 kb DNA从铜绿假单胞菌释放已知，细菌DNA使用IV型分泌系统在接合期间被释放或转移，以应 答细胞需求。Cascales和Christie, Nature Rev. Microbiol. 1:137-149 (2003)。 在这样的系统中，蛋白质和DNA的直接转移可以在从靶宿主细胞中胞浆发 生以及从供体细菌的周质发生。但是，宿主细胞的存在或者对宿主细胞接 触的依赖性不是必需的，原因在于在不存在任何宿主细胞的情况下蛋白质 或染色体DNA通过IV型系统分泌迸入生长培养基也已经得到证明。Bums， Curr. Opin. Microbiol. 2:25-29， 1999 ; Hamilton等，Mol. Microbiol. 55:1704-1721(2005)。在铜绿假单胞菌中，已知释放的DNA在囊性纤维化 患者的肺部感染期间或在生物膜形成期间有助于促炎过程。Ddgado等， Infect. Immun. 74: 2975-2984 (2006); Whitchurch等，Science 295: 1487 (2002)。然而，尚未报道任何具体富含CpG的染色体外DNA的释放。在观察铜绿假单胞菌菌株8822是否可能不但释放天青蛋白而且释放基 因组DNA进入其生长培养基的努力中，在其中不存在MCF-7细胞暴露下 观察到极少天青蛋白的条件下生长1或2小时期间，检测菌株8822的生长 培养基。为了检测任何核蛋白复合物的存在，向生长培养基中添加3体积 的正-异丙醇，再于-80'C下培养l小时。核蛋白沉淀被离心出，重悬于双蒸 馏水中，并在用双蒸馏水洗脱前，通过Qiagen DNA制备试剂盒(Qiagen. Inc.Valencia, CA)。尽管在0小时(实验开始)时未检测到DNA，但在MCF-7 细胞不存在或存在的情况下，在1和2小时下都检测到约15 kb大小的特异 DNA条带(图4A)。存在癌细胞时，DNA的量较高，这表示在天青蛋白的情况下释放增加， 但是与天青蛋白相反，DNA甚至可以在癌细胞不存在的情况下被检测到， 大概是因为使用了 PicoGreen (Invitrogen， Inc， Carlsbad, CA)和PCR反 应，检测灵敏度高得多。有趣的是，没有观察到其它显著DNA条带，并且 该条带在重复实验条件下高度可再现，表明它不是染色体DNA消化的随机 产物。实施例6.释放条带(releaseprofile)表明15 kb DNA是染色体外的 铜绿假单胞菌中携带毒力相关基因的基因组岛是熟知的。Kiewitz等， Microbiology 146: 2365-2373 (2000); He等，Proc. Natl. Acad. Sci. 101:2530-2535 (2004); Klockgether等，J. Bacteriol. 186:518-534 (2004); Kulasekara等，J. Bacteriol. 188:4037-4050(2006)。赋予在生物异源物质污染 的环境中的选择性生长优势的生物可降解基因簇也被称作假单胞菌中的可 动遗传因子，其通常与噬菌体基因有关，vanderMeer等，Arch. Microbiol. 175:79-85 (2001)。单个基因组岛，PAGI-1 ，其具有G+C含量为63.7%和54.9% 的至少两个不同DNA区段，其中含有参与可能的活性氧去毒的基因，已经 被证明存在于大量铜绿假单胞菌的铜绿假单胞菌的临床分离群中。Liang 等，J. Bacteriol. 185:843-853(2001)。与天青蛋白分泌相似，DNA片段释放的动力学表明其早在5分钟内就 在细胞外存在(图4B)，甚至当MCF-7细胞不存在时也是如此。在这类条件 下没有观察到其它DNA条带。经暴露于MCF-7细胞，在不存在任何其它 染色体外DNA下释放，天青蛋白和15 kb DNA片段的动力学研究显示出类 似的释放时程(图4C)，这表明该DNA是染色体外元件，其可能作为水平地 获得的基因组岛而环出染色体。实施例7.从铜绿假单胞菌中释放的15 kb DNA是富含CpG的DNA 为了检验释放的DNA的性质，DNA被施以限制性内切核酸酶消化。 令人感兴趣的是，只有已知在G和C残基之间切割的MSP-1和Pvul诱导 该DNA的大范围消化，这表明该DNA富含G+C (图4D)。当对这些限制 性酶的部分消化片段或机械剪切片段进行测序并将这些序列的多源性与数 据库中的那些比较时，几种在铜绿假单胞菌PAO基因组中存在和不存在的 DNA序列被发现(图7)，并且是SEQIDNOS: 26-62，这表明所释放的DNA 来自菌株8822的基因组岛。通过常规分离方法没有分离获得质粒DNA。 存在于富含CpG的DNA中的令人感兴趣的序列是一段胞嘧啶序列(图5A)， 并且其中有许多CpG 二核苷酸序列。实施例8. 15 kb富含CpG的DNA条带包含与天青蛋白相似的序列 目前一种令人感兴趣的序列是天青蛋白基因序列，但类似于奈瑟球菌 属的天青蛋白基因并且与它具有95°/。的核苷酸序列相同性。氨基酸序列比较示于图5B。因为奈瑟球菌属天青蛋白基因在5-末端具有额外的DNA序 列，其编码天青蛋白N末端的39个氨基酸的R8表位，所以富含CpG的 释放DNA被用做模板，并且H.8和天青蛋白基因序列以及来自称为/"z的 奈瑟球菌属H.S-天青蛋白基因的全基因都被使用。Hong等，Cell Cycle 5:1633-1641 (2006)。所有的三种片段都可以用PCR扩增，表明在富含CpG 的DNA中存在奈瑟球菌属/"z基因的两种成分。实施例9.释放的富含CpG的DNA活化TLR9介导的NF-kB，并具有抗肿瘤特性已经有报道，CpG脱氧寡核苷酸具有抗肿瘤特性。Krieg， Nature Med. 9:831-835(2003); Krieg， Curr. Oncol. Rep. 6:88-95 (2004)。为了确定从铜绿 假单胞菌菌株8822释放的15kb富含CpG的DNA是否具有与CpG合成寡 脱氧核苷酸(ODN)类似的性质，检测该DNA以TLR9依赖性的方式活化 NF-kB的能力。用TLR9-表达质粒转染TLR9缺陷的HEK293细胞。 Kandimalla等，Proc. Natl Acad Sci USA 102:6925-6930 (2005)。然后，使用 在NF-kB诱导型ELAM1复合启动子的调控下表达SEAP (分泌型胚性碱性 磷酸酶)的pNIFty质粒。使用SEAP报道基因分析试剂盒(Invitrogen. Inc.， Carlsbad. CA)，测量转染的HEK293细胞的上清液中NF-kB活化后的SEAP 表达。SEAP报道基因分析如Schindler和Baichwal (Mol. Cell Biol. 14:5820-5831 (1994))所述进行。在TLR9-缺陷的HEK293细胞中存在极少的NF-kB-启动子诱导型 SEAP表达(图6A)。可是，在表达TLR9的HEK293细胞中，随着富含CpG 的15kbDNA的量增加，SEAP活性增加，这表明只有在TLR9-充足的细胞 (TLR-9 proficient cell)中，该DNA才可以活化NF-kB启动子(图6A)。为了确定TLR9-依赖性NF-kB的活化是否引起肿瘤细胞死亡，在一系 列癌细胞中测量TLR9的表达。基本上，全部癌细胞系、前列腺癌DU145、 乳腺癌MCF-7以及肺癌H23和A549都表达TLR9及其它Toll样受体，如 TLR4 (图6B)。当富含CpG的DNA与浓度增加的肺癌细胞A549温育12 和24小时，细胞死亡增加，尽管有限，这表明富含CpG的DNA具有低的 抗肿瘤活性(图6C)。实施例10，功效研究。在六个月期间内进行双盲、安慰剂对照研究。总共选择80位年龄45-60 岁的癌症患者来进行该研究。患者的初期招募将通过医生推荐。成功通过 预筛选的患者将通过电话联系，并被邀请参加筛选/指导会。有希望的对象 将被提供本研究和参与要求的口头和书面说明。在筛选/指导会上将从每位 参与者获得书面通知同意书，以及获得医疗记录表并由项目肿瘤医生审阅。 表示同意的参与者将分配给一个研究ID号。在筛选会期间，将汇总以下信 息人口统计数据姓名，住址，电话号码，主要医生和肿瘤医生，出生 日期，民族，种族，职业和完成教育年数。医疗史目前和过去的医疗情况，包括癌症状态的评价，用药和补脉， 住院治疗，外科手术，过敏，抽烟，喝酒和非法药品使用。基本体检身高，体重，血压，脉搏读数，以及胸部、心脏、肺部和腹部检查。血样阴性妊娠试验和正常肝功能试验(ALT， AST)和血红蛋白。这80个患者分成2个分开的组，每组40个患者。第一组将施用一个 剂型，其包含SEQIDN0 26和药学可接受载体， 一日一次。第二组将施用 一个剂型的安慰剂对照， 一日一次。治疗期间，每3天监测体重和肿瘤体 积(包括肿瘤进展、淤滞、消退和增生)。以下肿瘤体积类别将用于评分进展相比于开始治疗时，在面积上肿瘤生长超过40%;淤滞整个疗程期 间，肿瘤不从原始面积波动超过40%;消退肿瘤从原始面积消退40%以上；增生治疗期间出现新的肿瘤。体重。在接受SEQIDNO:26和药学可接受载体的患者和接受安慰剂的患者之间将具有明显的体重差异。当考虑了身高和性别时,那些接受SEQIDNO:26和药学可接受载体的患者平均而言重于那些接受安慰剂的患者。肿瘤体积。在治疗开始时，两个组的肿瘤尺寸将相当，且彼此没有显 著差异。平均来说，安慰剂患者的肿瘤体积将以变化的速率增加。接受SEQ ID NO:26和药学可接受载体的患者与安慰剂治疗的患者相比，将显示出肿 瘤大小的减幅生长。肿瘤进展。发展的肿瘤百分数将如上所述计算。接受SEQIDNO:26和 药学可接受载体的患者在研究过程期间将显示出比接受安慰剂的患者更少的肿瘤进展。
肿瘤淤滞(tumorstasis)。保持淤滞的肿瘤百分数将如上所述计算。接受 SEQ IDNO:26和药学可接受载体的患者比起接受安慰剂的患者将显示出相 比于肿瘤生长更多的肿瘤淤滞。
肿瘤消退。退化的肿瘤百分数如上所述计算。接受SEQIDNO:26和药 学可接受载体的患者将显示出比接受安慰剂的患者更多的肿瘤消退。
肿瘤增生。增生的肿瘤的百分数如上所述计算。接受SEQ ID N026和 药学可接受载体的患者将显示出比接受安慰剂的患者较少的肿瘤增生。
尽管已经参考附图对本发明的说明性实施方式在本文中进行了描述， 但是可以理解，本发明不局限于那些精确的实施方式，并且本领域技术人 员可以在其基础上实现各种其它变化和修改而不脱离本发明的精神和范 围，并且旨在主张所有这些改变和修改都落入本发明的范围之内。
权利要求
1.一种分离的核酸分子，其包含选自如下一组的多核苷酸序列(a)选自SEQ ID NOS26-62的序列，和(b)与选自SEQ ID NOS26-62的序列具有至少90％的相同性的序列。
2. 如权利要求1的分离的核酸，其中所述核苷酸序列是SEQIDNO :26。
3. —种药物组合物，其包含药学上可接受的载体中的权利要求1的 分离的核酸序列。
4. 如权利要求3的药物组合物，其还包含至少一种铜氧还蛋白肽。
5. 如权利要求3的药物组合物，其中所述药物组合物配制成用于静 脉内给药。
6. 如权利要求3的药物组合物，其中所述药物组合物配制成用于皮 下给药。
7. 如权利要求3的药物组合物，其中所述药物组合物配制成用于局 部给药。
8. 如权利要求4的药物组合物，其中所述铜氧还蛋白肽来自选自如下一组的生物体铜绿假单胞菌(P化WfifowO"OS flerag/"OM)、粪产碱菌(^(/cfl//ge"es_/^ecafe)、氧化木糖无色杆菌(Jc/2ra附o6crcfer jqy/cwo;aV/a")、支气 管败血性博德特氏菌(Bo^fete〃a 6ra"c/^e; "ca)、甲基单胞菌(Mef/^/owo"os 、 脑膜炎奈瑟球菌(A^5化r/a附e"/"g衍6fc)、 淋病奈瑟球菌(7VW^n.a go"o^r/zefl)、 荧光假单胞菌(尸sei/cfowo"as y7womscms)、 绿针假单胞菌 (i^ewcfo;wo"as c/j/orarap/^)、苛养木杆菌(J^/e〃a ^wrtVZ/osa)禾口畐U溶血性弧菌
9. 如权利要求4的药物组合物，其中所述铜氧还蛋白肽是选自如下一组的蛋白质的部分或全部天青蛋白、假天青蛋白、质体蓝素、铁硫菌 蓝蛋白、Laz、绿丝菌蓝色铜蛋白(auracyanin)、漆树蓝蛋白或黄瓜碱性蛋白。
10. 如权利要求4的药物组合物，其中所述铜氧还蛋白肽包含选自 SEQIDNOS:l-25的肽的部分或全部。
11. 一种治疗患者的方法，所述方法包括给所述患者施用权利要求3 的药物组合物，并共同施用铜氧还蛋白肽。
12. 如权利要求ll的方法，其中所述患者患有病症。
13. 如权利要求12的方法，其中所述患者患有癌症。
14. 一种治疗患者的方法，所述方法包括给所述患者施用权利要求4 的药物组合物。
15. 如权利要求14的方法，其中所述患者患有病症。
16. 如权利要求15的方法，其中所述患者患有癌症。
17. 如权利要求11的方法，其中所述药物组合物通过选自如下一组 的方式施用静脉内注射、肌内注射、皮下注射、吸入、局部施用、透皮 贴剂、栓剂、玻璃体注射和口服。
18. 如权利要求17的方法，其中施用的方式是通过静脉内注射。
19. 权利要求11的方法，所述方法进一步包括共同施用额外的预防 性或治疗性药物。
20. —种细胞，其具有来自铜绿假单胞菌的天青蛋白的异源基因，其 中所述细胞在与癌细胞接触后表达所述天青蛋白。
21. 如权利要求20的细胞，其中天青蛋白异源基因中天青蛋白编码 序列由靶蛋白编码序列替换，其中所述细胞在与癌细胞接触后表达所述耙 蛋白。
22. —种铜绿假单胞菌细胞，在其基因组中天青蛋白编码序列由耙蛋 白编码序列替换，所述细胞在与癌细胞接触后表达所述靶蛋白。
23. 如权利要求21的细胞，其中所述靶蛋白选自如下一组预防性 蛋白质、治疗性蛋白质、细胞毒性蛋白质和诊断性蛋白质。
24. —种治疗患者的方法，所述方法包括施用权利要求20-23的细胞。
25. 如权利要求24的方法，其中所述患者患有病症。
26. 如权利要求25的方法，其中所述患者患有癌症。
27. 如权利要求26的方法，其中所述癌症选自黑素瘤、乳腺癌、 胰腺癌、恶性胶质瘤、星形细胞瘤、肺癌、结直肠癌、头颈癌、膀胱癌、 前列腺癌、皮肤癌和宫颈癌。
28. —种诊断患者癌症的方法，所述方法包括施用权利要求21的细 胞，其中所述细胞表达诊断性靶蛋白。
29. 如权利要求24的方法，其中所述药物组合物通过选自如下一组 的方式施用静脉内注射、肌内注射、皮下注射、吸入、局部施用、透皮贴剂、栓剂、玻璃体注射和口服。
30. 如权利要求29的方法，其中施用的方式是通过静脉内注射。
31. 如权利要求22的细胞，其中所述靶蛋白选自如下一组预防性 蛋白质、治疗性蛋白质、细胞毒性蛋白质和诊断性蛋白质。
32. 如权利要求28的方法，其中所述药物组合物通过选自如下一组 的方式施用静脉内注射、肌内注射、皮下注射、吸入、局部施用、透皮 贴剂、栓剂、玻璃体注射和口服。
全文摘要
本发明涉及含有来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的富含CpG的DNA、并任选地含有铜氧还蛋白的组合物。本发明包括铜绿假单胞菌特有的CpG DNA，所述DNA可用于治疗患者、尤其是患病的患者、特别是患有癌症的患者，也可用于预防癌症。这些组合物任选地处于药学上可接受的载体中，且任选地包含铜氧还蛋白。本发明进一步涉及邻近癌细胞表达蛋白质的方法。这些方法可以用来在患病的患者、特别是患癌症的患者中邻近癌细胞表达治疗性或者诊断性蛋白质；用来预防癌症；和诊断患者的癌症。本方法使用来自铜绿假单胞菌的天青蛋白基因作为铜绿假单胞菌或者异源细胞中的天青蛋白或者异源蛋白质的表达系统。
文档编号C07K2/00GK101600728SQ200780050577
公开日2009年12月9日 申请日期2007年12月4日 优先权日2006年12月4日
发明者A·查克拉博蒂, T·达斯古普塔 申请人:伊利诺斯大学理事会