N-末端xa27信号锚及其在融合蛋白定位中的应用的制作方法

专利名称：：N-末端xa27信号锚及其在融合蛋白定位中的应用的制作方法N-末端XA27信号锚及其在融合蛋白定位中的应用
背景技术：
：本发明涉及功能性信号锚，其使融合蛋白定位于植物维管元件(vascularelements)的质外体。所述信号锚可用于工程化分泌性蛋白至植物细胞的细胞壁和/或质外体。所述信号锚也可用于在生物反应器中的转基因植物细胞中生产分泌性蛋白。本文援引加入用以阐述本发明的背景的出版物及其它材料以及特别是对实施本发明提供额外细节的案例，为方便起见在下文中以作者和日期进行引用并按作者字母顺序列于所附参考文献目录中。植物维管系统的木质部和韧皮部是在植物中转运水和溶质的主要导管(Carmy，1986；KimandGuerinot，2007)。木质部和韧皮部是多种植物病原体如细菌、真菌和昆虫的靶。许多取食韧皮部的昆虫如蚜虫和飞虱在世界范围内是高度破坏性的农业害虫(Backusetal2004，Moranetal，2001)。这些害虫主要在茎上取食及在韧皮部筛分子中吮吸，因此导致作物的直接取食性损伤(例如虱烧现象(hopperburn))(Moranetal，2001)。这些害虫还传播导致另外损伤的病毒疾病(Nodaetal，1991)。尽管喷洒毒性化学制品是用于害虫控制的常用方法，但是其费力、昂贵，此外其不利于环境，因此需要使用其它安全和经济的害虫控制的替代方法。具有杀虫属性的许多源于植物或者细菌的毒素蛋白可获得并用于转基因作物(CarliniandGrossi-de-Sa,2002,Chattopadhyayetal.,2004)自从可表达单修饰苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)毒素(Bt)的第一代玉米和棉花商业发布以来，对具有昆虫抗性转基因作物的采用逐年增多(Christouetal.，2006)。这些毒素蛋白对不同类昆虫的作用是有差别的，并且大多数源于植物的毒素和Bt对于蚜虫和飞虱的毒性还是未知或者无作用的(CarliniandGrossi-de-Sa,2002)这部分地是由于这两种昆虫是取食韧皮部的昆虫，而所述毒素蛋白局限于植物细胞的细胞质。类似地，当转基因植物细胞用作天然生物反应器时，工程化的蛋白需要分泌至植物培养基中(JamesandLee，2001)。在任一情况中均应考虑到工程化的蛋白向植物细胞的质外体的有效分泌。植物确实能有成本效益地以农业规模生产重组蛋白，同时消除产物受内毒素或者人病原体污染的风险(FischerandEmans,2000；Giddingsetal.,2000；Maetal.，2003；Twymanetal.，2003)。植物悬浮细胞可作为宿主细胞用于产生异种蛋白。使用转基因植物细胞的主要优势是由于植物培养基便宜且简单。由植物细胞产生的哺乳动物蛋白被发现可正确地糖基化及分泌至培养基中(JamesandLee,2001)0植物疾病抗性(R)基因赋予针对具有关联(cognate)无毒(avr)基因的病原体的品种特异性抗性(Flor，1971)。R蛋白据推测是作为识别激发子(elicitor)的受体复合物的一部分而起作用，所述激发子直接或者间接地由病原体中的关联avr基因编码，并随后引发防御应答(Hammond-KosackandJones,1997；Martinetal.，2003)。近年来，已经在许多R-Avr系统中进行了广泛的分子和遗传学分析。大多数的R蛋白可主要基于其有限数目的结构基序的组合而被分成五类，而几个其它的R蛋白具有新颖的结构或者以非品种特异性方式赋予针对植物病原体的抗性(DanglandJones,2001；Martinetal.,2003)R蛋白功能的一个令人感兴趣的方面是其定位性。已经在各种细胞部位发现R蛋白。可获得的信息提示R蛋白通常与病原体效应物共定位，清楚表明这两种成分的空间互相依赖性(Martinetal.，2003)。R与Avr蛋白的直接物理性相互作用已经在多个R-Avr对中被证明(Jiaetal.，2000；Kimetal.，2002；LeisterandKatagiri，2000；Scofieldetal.,1996；Tangetal.，1996)。病毒效应物出现在植物细胞内部，针对病毒的所有已知R蛋白的预测的结构表明它们也是在细胞内的(Burch-Smithetal，2007)。识别胞外番茄叶霉病菌(Cladosporiumfulvum)Avr蛋白的番茄Cf蛋白(LaugeandDeWit,1998)定位于质膜(RivasandThomas,2005)0导向真菌病原体的R蛋白也可以在细胞内，因为真菌Avr蛋白被输送至植物细胞中并在其内部起作用(Jiaetal.，2000)。除了XA21，所有导向细菌的R蛋白推测均是细胞内的。这一推测基于以下事实，即大多数细菌Avr基因产物是效应物蛋白，其通过细菌III型分泌系统(TTSS)被分泌进宿主细胞中(Heetal.，2004)。事实上，许多R蛋白不携带可供识别的亚细胞靶向特征(signature)并且其定位需要通过实验确定。例如，拟南芥RPMl和RPS2与细胞膜相关，尽管它们不具有任何规范的膜靶向结构域(AxtellandStaskawicz,2003；Boyesetal.，1998)。这种亚细胞定位分别与其相应的Avr激发子AvrRpml和AvrRpt2的膜定位一致(AxtellandStaskawicz,2003；Nimchuketal.,2000)除了质膜之外，拟南芥RRSl-R及其关联Avr蛋白PopP2共定位于核，并且RRSl-R的核定位依赖于PopP2的存在(Deslandesetal.，2003)。近来发现烟草N和大麦MLAlO定位于细胞质和核，且任一R蛋白的核滞留对于下游信号转导和防御都是不可或缺的(Burch-Smithetal.,2007；Shenetal.,2007)在这三种情况中，基于所述R蛋白被关联Avr蛋白激活，也可能发生该R蛋白在信号转导期间的易位(Burch-Smithetal.,2007；Deslandesetal.,2003；Shenetal.,2007)水稻XA21是跨膜受体激酶，推测其可通过其胞外LRR部分来识别定位于水稻细胞质外体的激发子(Songetal.，1995)。相应于Xa21的AvrXa21分子还未经鉴定，尽管看起来其可能是通过II型分泌系统分泌至质外体的硫酸化蛋白并且参与细胞密度感受(quorumsensing)(Leeetal.，2006)。所述质外体是植物细胞原生质体外基质，由质膜外表面至细胞壁的所有区室组成(Dietz,1997)。所述质外体对于植物所有与其环境的沟通非常重要，并且在病原体攻击时的信号转导和防御中起重要作用(Dietz，1997；Huckelhoven,2007)0位于质外体中或者与细胞壁相关的许多胞外酶和蛋白参与防御信号转导或者具有抗微生物功能(EdreVa，2005；Huckelhoven,2007)。例如，所述质外体含有多个低分子量和蛋白抗氧化剂，其控制活性氧类(ROS)的水平(Noctoretal.，2002；PignocchiandFoyer2003)。在大麦与B.graminis的相容和不相容相互作用期间抗坏血酸盐和谷胱甘肽的质外体水平和氧化还原状况发生改变，多个胞外抗氧化酶活性也在B.graminis攻击时增加(Noctoretal.，2002；Vanackeretal.，1998，2000)。在水稻与黄单胞菌水稻致病变种(X.oryzaepv.oryzae)的相互作用、特别是不相容相互作用期间也检测到胞外空间中过氧化物酶活性增加以及木质部维管中阳离子过氧化物酶聚集(Hilaireetal.,2001；Reimersetal.，1992.Youngetal.，1995).分泌至细胞壁的另一组蛋白是致病相关(PR)蛋白。所述I3R蛋白包括PR-I、壳多糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶、硫素、渗透蛋白、防卫素，并且其中一些仅是小肽(EdreVa，2005；Huckelhoven,2007)0在抗性或者系统获得性抗性(SAR)表达植物以及从转基因抗性植物4中诱导的这些I3R蛋白质呈现出高抗微生物活性(EdreVa，2005)。大多数所述I3R蛋白也由许多环境和发育刺激所诱导(Edreva，2005)。由黄单胞菌水稻致病变种(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)引起的水稻细菌性枯萎病是在水稻中最具破坏性的细菌性疾病之一(Mew1987)。我们先前报道了抗性基因Xa27从水稻中的分离(Guetal.，2005)。与其它克隆的R基因不同，Xa27_介导的对于细菌性枯萎病的抗性特异性是由其启动子而不是由其基因产物决定。Xa27-依赖性抗性与通过携带avrXa27的不相容病原体对R基因的特异性诱导相关。Xa27编码区在水稻PRl启动子控制下的异位表达导致对于不相容和相容菌株的非特异性抗性。所述Xa27蛋白(XA27)与任何先前鉴别出的R-基因产物无序列相似性。需要鉴定可用于使融合蛋白定位于植物或者植物细胞内特定位置的元件。发明概述本发明涉及功能性信号锚，其使融合蛋白定位于植物维管元件的质外体。所述信号锚可用于工程化分泌性蛋白或者其它蛋白至植物细胞的细胞壁和/或质外体。所述信号锚也可用于在生物反应器中的转基因植物中生产分泌性蛋白。一方面，本发明提供了核酸分子，该核酸分子包含编码信号锚的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述信号锚是具有SEQIDN0:2所示序列的XA27信号锚。在另一个实施方案中，编码XA27信号锚的核苷酸序列具有SEQIDNO:1所示序列。在再一个实施方案中，所述核苷酸序列是掺入了遗传密码简并性的序列。在另一个实施方案中，所述核苷酸序列是已经被修饰为含有植物偏好密码子的序列。在一个实施方案中，所述信号锚是XA27信号锚的变体。在另一个实施方案中，所述变体是具有氨基酸取代的XA27信号锚。因此，本发明的所述基因和核苷酸序列包括天然发生的序列以及突变形式。同样，本发明的所述蛋白涵盖了天然发生的蛋白及其变化和修饰形式。这种变体将仍具有所希望的活性，即信号锚活性。第二方面，本发明提供了含有信号锚编码核苷酸序列的盒(cassette)。在一个实施方案中，提供了盒，其具有多个限制酶切位点用于插入感兴趣蛋白的编码序列使其与信号锚编码序列相连接以产生包含信号锚和感兴趣蛋白的融合蛋白的编码序列。在另一个实施方案中，提供了盒，其包含在适当读框中与感兴趣蛋白的编码序列融合的信号锚编码序列以产生融合蛋白的编码序列。这个融合蛋白的编码序列在本文有时被称作融合基因。在再一个实施方案中，盒也可包括调节区，其与信号锚编码核苷酸序列的5’端和/或与所述限制酶切位点的3’端可操纵连接，并因而与所插入的感兴趣蛋白的编码序列的3’端连接。含有所有这些元件的盒在本文也被称作表达盒。在一个实施方案中，表达盒在表达盒构建体中可另外含有5’前导序列。在另一个实施方案中，表达盒可另外含有选择性标记基因。第三方面，本发明提供了转化的植物、植物细胞、植物组织及其种子。在一个实施方案中，可以用常规方式使所述转化的细胞生长为植物。在另一个实施方案中，可以继而生长这些植物，并用相同的转化株系或者不同株系授粉，以及鉴定具有所希望的表型特性的组成性表达的所得杂交体。在再一个实施方案中，将转化的植物细胞培养生长以产生作为融合蛋白的感兴趣的蛋白，并将其纯化和处理以获得感兴趣的蛋白。附图简述图1示出从SignalP3.0服务器中对XA27的signalP-HMM预测的输出。推定的信号锚预测含有N-末端带正电荷的η-区(残基1-37)，随后是疏水性h-区(Emanuelssonetal.，2007)。将XA27的全长氨基酸(aa)序列提交给SignalP3.0服务器(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)以预测真核生物信号肽或者信号锚。神经网络(neuralnetworks)和隐马尔科夫模型(hiddenMarkovmodel)的方法被用于预测。选择标准输出形式。图2a和2b示出转基因品系中转基因的表达。图2a通过RNA凝胶印迹分析GFP标记品系中转基因的表达。泳道1、6和10，Pu^GFP:!1^的品系8(L8)；泳道2、5和9，Nipponbare；泳道3和4，未接种细菌(UI，泳道3)以及在接种黄单胞菌水稻致病变种菌株PX099A3天后(3DAI)(泳道4)的PXa27-Xa27_GFP:Txa27的品系22(L22)；泳道7，PubiXa27-GFPTnos的品系9(L9)；泳道8，PubiXa27G_GFPTnos的品系18(L18)；泳道11，PubiINST-GFP:Tnos的品系12(L12)；泳道12，Pubi:N57G_GFP:TNos的品系5(L5)；泳道13，PubiINSTK-GFP:Tnos的品系3(L3)；泳道14，Pubi:N37_GFP:TN。s的品系2(L2)。GFP基因(GFP)的探针被用于凝胶印迹杂交。水稻泛素基因2(Ubi)的表达被用作加样对照。细菌性枯萎病的疾病表型在每条泳道下示出。BB，细菌性枯萎病；R，抗性；S，易感。图2b通过western印迹分析在Pxa27:Xa27-FLAG:Txa27的转基因品系中检测XA27-FLAG蛋白。泳道1，Nipponbare；泳道2-7，在用黄单胞菌水稻致病变种菌株PX099A接种3天后Pxa27:Xa27-FLAG:Txa27的独立转基因品系。蛋白分子量标准(AmershamBiosciences,RPN755)的大小以千道尔顿(kDa)示出。示出XA27-FLAG位置。图3a_3i示出Xa27在维管元件中被黄单胞菌水稻致病变种诱导。GFP荧光在绿色通道中示出(图3a、3d和3g)。传输通道由相差通道2(Ph2)获得(图3b、3e和3h)。两个通道的图像合并示出(图3c、3f和3i)。m，叶肉；p，韧皮部；px，原生木质部；x，木质部；xv，木质部维管。Bar=20μm。图3a_3c在用黄单胞菌水稻致病变种菌株PX099A接种3天后Nipponbare的叶横截面。图3d_3f未接种的Pxa27:Xa27_GFP:Txa27的L22叶横截面。图3g-3i用PX099A接种3天后Pxa27:Xa27-GFP:Txa27的L22的叶横截面。图4a_4i示出使用透射电子显微镜对Xa27_FLAG的免疫金定位。Pxa27:Xa27-Flag:Txa27的品系18(L18)接种PX099A，并在接种3天后进行免疫金电子显微术。使用免疫前血清作为对照(图4a和4b)或者抗-FLAG单克隆抗体(图4c_4i)来检测XA27-FLAG蛋白。然后用10-nm(图4a_4g)或者15-nm(图4h和4i)金缀合山羊抗小鼠IgG抗体来标记免疫反应。金颗粒用箭头示出。B，细菌；CW，细胞壁；FM，纤维状材料；N，细胞核；P，凹陷(pit)；PC，薄壁细胞；VW，维管壁；XV，木质部维管。图4a凹陷区的木质部维管。Bar=Ium0图4b图4a中示出的方形区的高倍放大。Bar=OJym15图3c:木质部维管，凹陷和薄壁细胞。ΒειΓ=2μπι。图4d图4c中示出的方形区的高倍放大。Bar=OJym15图4e高倍放大的木质部维管。Bar=0.2μm。图4f木质部维管和薄壁细胞。Bar=2μm。图4g图4f中示出的方形区域中薄壁细胞细胞核的高倍放大。Bar=0.2μm。图4h韧皮部区域中的薄壁细胞。Bar=2ym。图4i图4h中示出的方形区域中细胞壁的高倍放大。Bar=0.2μm0图5a_51示出异位品系(ectopicline)的根细胞中Xa27_GFP蛋白的定位。图5a-5c无质壁分离的PimGFPTnos的品系8(L8)。图5d_5f在质壁分离后PimGFPTnos的L8。图5g-5i无质壁分离的Pubi:Xa27-GFP:TN。s的品系9(L9)。图5j_51质壁分离后6Pubi=XaZT-GFP:!^的品系9(L9)。细胞壁用箭头示出。Bar=10μm。图6a_6x示出XA27中信号锚的鉴别和鉴定。图6a_6f:N_末端57个氨基酸信号锚足以使N57-GFP定位于细胞壁。N57-GFP示出与图5g_51中XA27-GFP相似的定位。图6a_6c无质壁分离的Pubi:N57-GFP:TN。s的品系12(L12)；图6d_6f质壁分离后Pm:N57-GFP:Tn。s的L12。图6g-61无h-区的XA27信号锚不能使N37-GFP定位于细胞壁。图6g_6i无质壁分离的Pm:N37-GFP:Tn。s的品系2(L2)；图6j_61质壁分离后Pubi:N37_GFP:TN。s的L2。图6m-6r:XA27信号锚中三联精氨酸残基用三联甘氨酸残基取代不能使N57G-GFP定位于细胞壁。图6m-6o无质壁分离的Puh=NSTG-GFP:!^的品系5(L5)；图6p_6r质壁分离后Pffl3iINSTG-GFP:Tnos的品系5(L5)。图6s_6x:XA27信号锚中三联精氨酸残基用三联赖氨酸残基取代不能使N57K-GFP定位于细胞壁。图6s-6u无质壁分离的Pubi:N57K_GFP:TN。s的品系3(L3)；图6v-6x质壁分离后Puh=NSTK-GFP:!^的L3。关于XA27信号锚的突变以及融合基因的构建见实施例1。细胞壁用箭头示出。Bar=10ym。图7a_7h示出XA27定位于质外体是疾病抗性所需的。图7a_7f:XA27信号锚中三联精氨酸用三联甘氨酸取代不能使XA27G-GFP定位于Pubi:Xa27G-GFP:TN。s的品系18(L18)中根的细胞壁。图7a-7c无质壁分离的Puw=XaZTG-GFP:TN。S的L18；图7d_7f在质壁分离后Puh=XUTG-GFP:TN。S的L18。用箭头指示细胞壁。Bar=IOym15图7g在接种黄单胞菌水稻致病变种菌株PX099A之后3天，Pxa27Xa27GTxa27和TN8的转基因品系中转基因的表达。Nipponbare，未转化的对照；TN8，Xa27转基因植物(Guetal，2005)；T_2、T_6、T-8和T-13是携有Pxa27:Xa27G:Txa27基因的独立转基因品系。图7h转基因Pxa27:Xa27G:Txa27品系对于PX099A的疾病评估。细菌性枯萎病的病斑长度是具有标准偏差的16个接种叶片的平均值。发明详述本发明涉及功能性信号锚，其使融合蛋白定位于植物维管元件的质外体。更具体地，XA27含有具有三联精氨酸基序的N-末端信号锚以定位于维管元件的质外体。所述信号锚可用于工程化分泌性蛋白至植物细胞的细胞壁和/或质外体。所述信号锚也可用于在生物反应器中的转基因植物中生产分泌性蛋白。水稻基因Xa27赋予针对黄单胞菌水稻致病变种的抗性，这种细菌是水稻细菌性枯萎病的致病因素。然而，对推断的Xa27蛋白(XA27)的结构分析除了预测在XA27N-末端区域的推定的信号锚之外，对该蛋白质作用模式仅提供了很少的或者未提供线索。已经发现XA27依赖于信号锚来定位于维管元件的质外体而且这种定位对于细菌性枯萎病的抗性是不可或缺的。最初功能性XA27-GFP蛋白被诱导并在维管元件中聚集，特别是在非活(non-live)木质部维管，此处细菌性枯萎病病原体在宿主中繁殖。通过对功能性XA27-FLAG蛋白进行免疫金电子显微镜研究以及XA27-GFP在质壁分离后定位于异位品系根细胞的细胞壁进一步验证XA27定位于维管元件的质外体。XA27的57个氨基酸信号锚足以使融合的GFP定位于细胞壁。信号锚中h-区和三联精氨酸残基是GFP融合蛋白定位于细胞壁所需的。用赖氨酸残基取代信号锚中三联精氨酸残基不能恢复所述定位。最后，XA27或者XA27-GFP从细胞壁和质外体的离位(delocalization)则消除了其针对黄单胞菌水稻致病变种的抗性功能。因此，XA27依赖于N末端信号锚来通过非典型分泌途径而定位于维管元件的质外体，从而提供针对黄单胞菌水稻致病变种的非特异性抗性。对于XA27的N末端信号锚的此功能的发现使得可以在生物反应器中在转基因植物或者转基因植物细胞中进行蛋白质工程化。对于指定的核酸而言，“编码”或者“被编码的”是指包含用于翻译为指定蛋白的信息。编码蛋白质的核酸在核酸的翻译区内可包含非翻译序列(例如内含子)，或者可以缺少这种插入的非翻译序列(例如在cDNA中)。编码蛋白的信息由使用密码子而指定。典型地，由使用“通用”遗传密码的核酸来编码氨基酸序列。然而，可以使用通用密码的变体，比如存在于一些植物线粒体中的、当在其中表达核酸时可能使用的变体。当制备或者通过合成来改变核酸时，可利用要表达核酸的目的宿主的已知密码子偏好性。例如，尽管本发明的核酸序列可以在单子叶和双子叶植物物种中表达，但是仍可以修饰序列以虑及单子叶植物或者双子叶植物具体的密码子偏好性和GC含量偏好性，因为这些偏好性已被示出是不同的(Murrayetal.，1989)。因此，特定植物物种的特定氨基酸的偏好密码子可以得自所述特定植物物种的已知基因序列。如本文所用的“全长序列”，对于指定的多核苷酸或者其编码的蛋白质而言，是指具有指定蛋白的天然的(非合成的)、内源的、生物学活性形式的完整氨基酸序列。确定序列是否是全长的方法为本领域熟知，包括例如Northern或者Western印迹、引物延伸、Sl保护以及核糖核酸酶保护。见例如PlantMolecularBiology:ALaboratoryManual,Clark,Ed.，Springer-Verlag，Berlin(1997)所述。对比已知全长同源(直系同源和/或旁系同源)序列也可以用于鉴定本发明的全长序列。此外，典型存在于mRNA的5’和3’非翻译区的共有序列有助于对全长多核苷酸的鉴定。例如，共有序列ANNNNAUGG，其中带下划线的密码子代表N-末端甲硫氨酸，有助于确定所述多核苷酸是否具有完整的5’末端。在3’末端的共有序列如多腺苷酸化序列有助于确定所述多核苷酸是否具有完整的3’末端。如本文所用的“异源的”，对于核酸而言是指源自外源物种的核酸，或者如果来自相同物种，则是通过有意的人为干预而在组成和/或基因组基因座上对其天然形式进行了实质上的修饰的核酸。例如，与异源核苷酸序列可操纵地连接的启动子可以来自与所述核苷酸序列的来源不同的物种，或者如果来自相同物种，则该启动子与所述核苷酸序列并不是天然可操纵地连接的。异源蛋白质可来源于不同物种，或者如果来自相同物种，则通过有意的人为干预而对其原始形式进行了实质的修饰。“宿主细胞”是指含有载体且支持该载体复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌(E.coli)，或者真核细胞如酵母、昆虫、两栖动物或者哺乳动物细胞，不包括人细胞。优选宿主细胞是单子叶或者双子叶植物细胞。在将核酸插入细胞的背景下所用术语“导入”是指“转染”或者“转化”或者“转导”并包括将核酸掺入真核细胞或者原核细胞中，在此所述核酸可以被掺入该细胞的基因组中(例如染色体、质粒、质体或者线粒体DNA)，转变为自主复制子，或者瞬时表达(例如转染的mRNA)ο术语“分离的”是指如核酸或者蛋白质等材料，其(1)实质上或基本上没有在其天然存在的环境中通常与之伴随或者相互作用的成分。所述分离的材料任选包含在其天然环境中未发现的材料；或者(2)如果所述材料在其天然环境中，则该材料已经通过对组成成分进行有意的人为干预而被合成性地(非天然地)改变和/或在细胞中置于非天然在该环境中发现材料的位置(例如基因组或者亚细胞器)。为产生合成的材料而对所述材料的8改变，可以在其天然状态内进行或者从其天然状态中除去后进行。例如，如果通过在核酸所来源的细胞中进行人为干预改变天然发生的核酸或者将其由已经改变的DNA转录，则该天然发生的核酸成为分离的核酸。参见例如美国专利No.5，565，350和6，255，113所述。同样，如果将天然发生的核酸(例如启动子)通过非天然发生的方式导入对该核酸而言非天然的基因组基因座中，则其成为分离的。如本文所定义的“分离的”核酸也被称作“异源”核酸。如本文所用的“核酸”与“多核苷酸”可互换使用，包括单链或者双链形式的脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸聚合物，或者其嵌合体，以及除非特别限定，涵盖具有天然核苷酸基本性质的已知类似物，所述基本性质即其以与天然发生的核苷酸相似的方式与单链核酸杂交。多核苷酸可以是天然或者异源结构或者调节基因的全长序列或者亚序列。除非特别指出，则该术语包括指定序列以及其互补序列。因此，由于稳定性或者其它原因而具有修饰主链的DNA或者RNA在本文所指的范畴内属于“多核苷酸”。此外，包含不常见碱基如肌苷或者修饰碱基如三苯甲基化碱基(只列举两个例子)的DNA或者RNA在本文所指的范畴内属于多核苷酸。应意识到已经对DNA和RNA进行了大量修饰使其可以用于本领域技术人员已知的许多有用目的。如本文所用的术语“多核苷酸”包含此类通过化学、酶或者代谢修饰的形式的多核苷酸，以及病毒和细胞包括单细胞和复杂细胞等特有的化学形式的DNA和RNA。如本文所用，“可操纵连接”包括启动子与第二个序列之间的功能性连接，其中启动子序列起始及介导对应于第二个序列的DNA序列的转录。一般地，可操纵连接是指连接的核酸序列是连续的，并且在需要连接两个蛋白质编码区的情况下，其是连续的且在同一个阅读框内。如本文所用，术语“植物”包括完整的植物、植物器官(例如叶、茎、根等)、种子和植物细胞及其后代。如本文所用的植物细胞包括但不限于种子、悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、枝条、配子体、孢子体、花粉以及小孢子。可用于本发明方法中的植物类别包括单子叶植物和双子叶植物。术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文是可互换用于指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于氨基酸聚合物，其中一或多个氨基酸残基是相应天然发生的氨基酸的人工化学类似物，以及适用于天然发生的氨基酸聚合物。天然发生的氨基酸的这种类似物的基本性质是当其掺入蛋白中时，该蛋白特异性地与相同但是全部由天然发生的氨基酸组成的蛋白所引发的抗体反应。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”也包括修饰物，包括但不限于糖基化、脂质附着、硫酸化、谷氨酸残基的Y-羧基化、羟基化和ADP-核糖基化。本发明进一步虑及本发明中蛋白的含甲硫氨酸和不含甲硫氨酸的氨基末端变体的应用。如本文所用，“启动子”是指位于转录始点上游的DNA区域并且其参与RNA聚合酶及其它蛋白质的识别和结合以起始转录。“植物启动子”是在植物细胞中能起始转录的启动子，无论其是否源自植物细胞。作为范例的植物启动子包括但不限于得自植物、植物病毒和细菌的那些，其包含在植物细胞如土壤杆菌(Agrobacterium)或者根瘤菌(Rhizobium)中表达的基因。在发育控制下的启动子的例子包括优先在某些组织如叶、根或者种子中起始转录的启动子。这种启动子被称作“组织优选的”。只在某些组织中起始转录的启动子被称作“组织特异的”。“细胞类型”特异性启动子主要驱动在一或多种器官中的某些细胞类型中的表达，例如根或者叶中的维管细胞。“可诱导的”或者“可阻抑的”启动子是在环境控制下的启动子。可通过可诱导启动子影响转录的环境条件的例子包括厌氧条件或者光的存在。组织特异性、组织优选、细胞类型特异性以及可诱导启动子组成“非组成型”启动子类别。“组成型”启动子是在大多数环境条件下具活性的启动子。如本文所用，“重组”是指通过导入异源核酸而修饰的细胞或载体，或者所述细胞源于如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的该细胞内未以相同形式发现的基因，或者由于有意的人为干预而表达天然基因，否则该天然基因会异常表达、低表达或者根本不表达的。如本文所用的术语“重组”不涵盖细胞或者载体通过天然发生的事件(例如自发突变、天然转化/转导/转位)所产生的改变，例如那些没有有意的人为干预而发生的改变。如本文所用，“重组表达盒”或者“表达构建体”是重组或者合成产生的核酸构建体，其具有一系列指定核酸元件，所述核酸元件允许特定核酸在宿主细胞中转录。所述表达盒可以被掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或者核酸片段中。典型地，表达载体的表达盒部分在其它序列之外还包含将被转录的序列和启动子。术语“残基”、“氨基酸残基”和“氨基酸”在本文是可互换地用于指掺入蛋白、多肽或者肽(统称“蛋白”)中的氨基酸。所述氨基酸可以是天然发生的氨基酸，并且除非特别指出，其可涵盖天然氨基酸的非天然类似物，该类似物可以通过与天然发生的氨基酸相似的方式起作用。术语“选择性杂交”是指核酸序列与指定的核酸靶序列在严格杂交条件下的杂交，该杂交的程度达到可检测地高于(例如超过背景至少2倍)其与非靶核酸序列的杂交，并且该杂交达到对非靶核酸的基本排除。选择性杂交序列彼此之间典型具有大约至少80%序列相同性、90%序列相同性、95%或者100%序列相同性(即互补)。术语“严格条件”或者“严格杂交条件”是指这样的条件，在此条件下探针将选择性地与其靶序列杂交，其程度达到可检测地高于与其它序列杂交(例如超过背景至少2倍)。严格条件是序列依赖性的，在不同情况下有所不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定出与探针100%互补的靶序列(同源探查)。或者，可以调整严格条件以允许序列中一些错配，从而检测较低程度的相似性(异源探查)。一般地，探针长度小于大约1000个核苷酸，任选长度小于500个核苷酸。典型地，严格条件是这样的条件，其中盐浓度低于大约1.5MNa+，典型地为大约0.01-1.OMNa+浓度(或者其它盐)，pH7.0-8.3，并且对于短探针(例如10_50个核苷酸)温度为至少大约30°C，对于长探针(例如超过50个核苷酸)温度为至少大约60°C。严格条件也可以通过加入去稳定剂如甲酰胺而实现。范例的低严格条件包括用缓冲液(30-35%甲酰胺，IMNaCl,1%SDS(十二烷基硫酸钠))在37°C杂交，以及在IX至2XSSC(20XSSC=3.0MNaCl/0.3M柠檬酸三钠)中在50_55°C洗涤。范例的中等严格条件包括在40-45%甲酰胺、IMNaClU%SDS中在37°C杂交，以及在0.5至IXSSC中在55-60°C洗涤。范例的高严格条件包括在50%甲酰胺、IMNaClU%SDS中在37°C杂交至少4小时，更优选直至12小时或者更长时间，以及最后在0.IXSSC中在60-65°C洗涤30分钟。特异性典型地是杂交后洗涤的函数，关键因素是离子强度和最终洗涤溶液的温度。对于DNA-DNA杂交体，Tm(热解链温度)可近似于MeinkothandWahl(1984)的等式10Tm=81.50C+16.6(logΜ)+0.41(%GC)-0.61(%form)-500/L；其中M是一价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中鸟苷与胞嘧啶核苷酸的百分比，％form是杂交溶液中甲酰胺的百分比，L是碱基对中杂交体长度。所述Tm是这样的温度(在指定离子浓度和pH下)，在此温度下50%的互补靶序列与完全匹配的探针杂交。每错配则Tm降低大约1°C;因此，可以调整Tm、杂交和/或洗涤条件而与具有所期望的相同性的序列杂交。例如，如果搜寻序列具有大于或等于90%相同性，则Tm可降低10°C。一般地，对于具体的序列及其补体在给定的离子浓度和pH下所选择的严格条件是低于Tm大约5°C。然而，极端严格条件可在比TJS1°C、2°C、3°C或者4°C的温度进行杂交和/或洗涤；中等严格条件可在比1低61、71、81、91或者10°C的温度进行杂交和/或洗涤；低严格条件可在比Tm低11°C、12°C、13°C、14°C、15°C或者20°C的温度进行杂交和/或洗涤。使用该等式、杂交和洗涤成分以及所期望的Tm，本领域技术人员将理解杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化是经固有描述的。如果所期望程度的错配导致低于45°c(水溶液)或32°C(甲酰胺溶液)的Tm，优选增加SSC浓度从而可以使用较高温度。核酸杂交白勺i羊尽指导见于Tijssen,LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes,PartI,Chapter2"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays“，Elsevier,NewYork(1993)以及Ausubeletal.,1992,CurrentProtocolsinMolecularBiology(JohnWiley&Sons，NewYork，包括定期更新)。如本文所用，“转基因植物”是指在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。一般地，所述异源多核苷酸被稳定地整合进基因组中，从而将所述多核苷酸传递给连续世代。所述异源多核苷酸可以被单独整合进基因组中或者作为重组表达盒的一部分。“转基因”在本文用于包括任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或者植物，其基因型已经由于异源核酸的存在而被改变，包括最初如此改变的那些转基因以及通过有性杂交或者无性繁殖而从初始转基因中产生的那些。如本文所用的术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或者通过天然发生的事件而产生的基因组(染色体或者染色体外)改变，所述天然发生的事件如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转位或者自发突变。“变体”意指基本相似的序列。对于核苷酸序列，保守变体包括由于遗传密码简并而编码本发明XA27信号锚多肽的氨基酸序列的那些序列。天然发生的等位基因变体例如是这些可以通过使用熟知的分子生物学技术来鉴定的，所述熟知的分子生物学技术如如下文所概述的聚合成酶链反应(PCR)以及杂交技术。变体核苷酸序列还包括合成性衍生的核苷酸序列的，例如通过使用位点定向诱变产生的那些，但是其仍编码本发明的信号锚多肽，即能够定位于植物细胞的细胞壁和质外体的信号锚。一般地，本发明特定核苷酸序列的变体与该特定核苷酸序列具有至少大约50%、60%、65%、70%，一般为至少大约75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或者更高的序列相同性，该相同性通过利用在美国专利No.7，205，453中描述的序列对比程序使用默认参数而确定。变体核苷酸序列和蛋白序列的特性在美国专利No.7，205，453中有描述。也见美国专利申请出版物No.2006/0218670所述。如本文所用，“载体”是指用于将本发明的多核苷酸导入宿主细胞中的核酸。载体经常是复制子。表达载体允许插入其中的核酸转录。根据本发明的一方面，提供了包含编码信号锚的核苷酸序列的核酸分子。在一个实施方案中，所述信号锚是具有SEQIDN0:2所示序列的XA27信号锚。在另一个实施方案中，编码XA27信号锚的核苷酸序列具有SEQIDNO:1所示序列。在再一个实施方案中，所述核苷酸序列是掺入遗传密码简并的序列。在另一个实施方案中，所述核苷酸序列是已经被修饰为含有植物偏好密码子的序列。在一个实施方案中，所述信号锚是XA27信号锚的变体。在另一个实施方案中，所述变体是具有氨基酸取代的XA27信号锚。不影响所感兴趣蛋白的生物活性的适当的氨基酸取代的指导为本领域熟知，可见于Dayhoffetal.(1978)的模型。可优选保守取代，如将一个氨基酸用具有相似性质的另一个替换。这种保守取代为本领域熟知。见美国专利No.7，205，453所述。然而，当在进行如此取代之前难以预测所述取代的确切作用时，本领域技术人员将会意识到可以通过常规筛选测定评估该作用。因此，本发明的基因和核苷酸序列包括天然发生的序列以及突变形式。同样，本发明的蛋白涵盖了天然发生的蛋白以及其变体和修饰形式。此类变体仍具有所期望的活性，即信号锚活性。根据本发明另一方面，提供了含有信号锚编码核苷酸序列的表达盒。这种表达盒可以具有多个限制酶切位点以用于插入感兴趣蛋白的编码序列使其与所述信号锚编码序列相连接，从而产生融合蛋白的编码序列，所述融合蛋白包含信号锚和感兴趣的蛋白。或者，所述盒包含在适当的阅读框中与感兴趣蛋白质编码序列融合的信号锚的编码序列，从而产生融合蛋白的编码序列。这种融合蛋白的编码序列在本文有时被称作融合基因。所述盒也可包含调节区，所述调节区与信号锚编码核苷酸序列的5’端和/或与限制酶切位点的3’端可操纵地连接，并因此与插入的感兴趣蛋白编码序列的3’端可操纵地连接。含有所有这些元件的盒在本文也被称作表达盒。所述表达盒在表达盒构建体中可另外含有5’前导序列。见美国专利No.7，205，453和美国专利申请出版物No.2006/0218670和2006/0248616所述。所述表达盒可另外含有选择性标记基因。见美国专利No.7，205，453和美国专利申请出版物No.2006/0218670和2006/0248616所述。在一个实施方案中，所述表达盒从5’-3’转录方向包含转录起始区(即启动子)，翻译起始区，编码信号锚的多核苷酸，编码感兴趣蛋白的多核苷酸，翻译终止区以及任选在宿主生物体中能起作用的转录终止区。所述调节区(即启动子，转录调节区及翻译终止区)和/或编码信号锚的多核苷酸对于宿主细胞或者对于彼此是天然的/类似的。或者，调节区和/或编码信号锚的多核苷酸可以与宿主细胞或者彼此之间是异源的。如本文所用，对于序列而言的“异源”是指源自外源物种的序列，或者如果来自相同物种则是通过有意的人为干预对其天然形式在组成和/或基因组基因座进行实质性修饰的序列。例如，与异源多核苷酸可操纵地连接的启动子来自与所述多核苷酸衍生的物种不同的物种，或者如果来自相同/类似物种，则其一或二者都由其原始形式和/或基因组基因座而进行了实质性修饰，或者所述启动子不是可操纵地连接的多核苷酸的天然启动子。见美国专利No.7，205，453和美国专利申请出版物No.2006/0218670和2006/0248616所述。所述终止区可以对于转录起始区是天然的，可以对于可操纵地连接的感兴趣DNA序列是天然的，或者可以源自另一来源。方便的终止区可得自根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)的Ti-质粒，如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。也见Guerineauetal.,1991；Proudfoot,1991；Sanfaconetal.,1991；Mogenetal.,1990；MunroeandJacobson,1990；Ballasetal.，1989；及Joshi，1987所述。也见美国专利No.7，205，453和美国专利申请出版物No.2006/0218670和2006/0248616所述。在适当情况下，可以优化所述编码序列以在所转化的植物中增加表达。也就是说，所述编码序列可以通过使用植物偏好密码子合成以提高表达。可利用本领域中合成植物优选基因的方法进行。见例如美国专利No.5，380，831和5，436，391以及Murrayetal.(1989)所述。也见美国专利No.7，205，453和美国专利申请出版物No.2006/0218670和2006/0248616所述。其它序列修饰已知可增强细胞宿主中基因表达。这些修饰包括消除编码假聚腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座子样重复序列以及其它此类经充分鉴别的可能不利于基因表达的序列。可以将所述序列的G-C含量调节至指定细胞宿主的平均水平，该平均水平通过参考在宿主细胞中表达的已知基因计算。在可能时，修饰所述序列以避免所预测出的发夹二级mRNA结构。一般见美国专利No.7，205，453和美国专利申请出版物No.2006/0218670和2006/0248616所述。在制备盒和表达盒时，可以操操作各个DNA片段，从而为所述DNA序列提供正确方向，以及适当地处于合适的阅读框内。为此，可以使用衔接头(adaptor)或者接头来连接DNA片段或者可以使用其它操作以提供方便的限制酶切位点，除去多余DNA，除去限制酶切位点等等。为此，可以使用体外诱变、引物修复、限制酶切、复性、重取代如转换或者颠换。一般可见美国专利No.7，205,453和美国专利申请出版物No.2006/0218670和2006/0248616所述。一般地，所述表达盒将包含选择性标记基因用于选择转化的细胞。选择性标记基因用于选择转化的细胞或者组织。通常，植物的选择性标记基因将编码抗生素抗性，合适的基因包括至少一组编码抗生素壮观霉素抗性的基因，编码链霉素抗性的链霉素磷酸转移酶(SPt)基因，编码卡那霉素或者遗传霉素抗性的新霉素磷酸转移酶(nptll)基因，编码潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶(hpt或者aphiv)基因，乙酰乳酸合酶(als)基因。或者，所述植物的选择性标记基因将编码除草剂抗性，如针对磺酰脲型除草剂、草铵膦(glufosinate)、草甘膦、铵、溴苯腈、咪唑啉酮类和2，4_二氯苯氧乙酸盐(2，4_D)的抗性，包括编码作用于抑制谷氨酰胺合酶作用的除草剂如草胺膦或者basta(例如bar基因)抗性的基因。一般见WO02/36782、美国专利No.7，205，453和美国专利申请出版物No.2006/0248616及其中所引用的参考文献所述。选择性标记基因的列表不是意图进行限制。任何选择性标记基因可用于本发明中。许多启动子可用于实施本发明。所述启动子可以基于所期望的结果而进行选择。也就是说，所述核酸可以与组成型的、组织优选的或者其它启动子组合来用于在感兴趣的宿主细胞中表达。此类组成型启动子包括例如Rsyn7的核心启动子(W099/48338及美国专利No.6，072，050)；核心CaMV35s启动子(Odelletal.，1985)；水稻肌动蛋白(McElroyetal.,1990)；之素(ChristensenandQuail,1989andChristensenetal.，1992)；pEMU(Lastetal.，1991)；MAS(Veltenetal.，1984)；ALS启动子(美国专利No.5，659，026)等等。其它组成型启动子包括例如在美国专利No.5，608，149,5,608，144、5，604，121,5,569，597,5,466，785,5,399，680,5,268，463和5，608，142中揭示的那些。在一些实施方案中，从可诱导启动子、特别是从病原体可诱导启动子表达所述融合基因可以是有益的。此类启动子包括来自致病相关蛋白(I3R蛋白)的那些启动子，其13在病原体感染后被诱导；例如I3R蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、壳多糖酶等。见例如Redolfi(1983),Uknesetal.(1992)及VanLoon(1985)所述。也见美国专利No.6，429，362和TO99/43819所述。在其它实施方案中，从包括在或邻近病原体感染部位局部表达的那些启动子的启动子表达所述融合基因可以是有益的。见例如Marineauetal.(1987)、MattonandBrisson(1989)、Somssischetal.(1986)、Somssischetal.(1988)以及YangandKlessig(1996)Μ$。iiiHChenetal.(1996)>ZhangandSingh(1994)>Wameretal.(1993),Siebertzetal.(1989)、美国专利No.5，750，386、Corderoetal.(1992)，及其中所引用的参考文献所述。在进一步的实施方案中，从创伤诱导型启动子表达融合基因可以是有益的。此类创伤诱导型启动子包括马铃薯蛋白酶抑制剂(PinII)基因(Ryan，1990；Duanetal.，1996)；wunl和wun2(美国专利No.5，428，148)；winl和win2(Stanfordetal.,1989)；系统素(McGurletal.,1992；WIPl(RohmeierandLehle,1993)；EckeIkampetal.，1993)；MPI基因(Corderoketal.，1994)等；所述文献援引加入本文。化学物调节的启动子可通过应用外源化学物调节剂来用于调控植物中的基因表达。根据目的，所述启动子可以是化学物诱导型启动子，其中化学物的应用诱导基因表达；或者化学物阻抑型启动子，其中化学物的应用阻抑基因表达。化学物诱导型启动子为本领域所熟知，并包括但不限于玉米In2-2启动子，其被苯磺酰胺除草剂安全剂所激活；玉米GST启动子，其被用作出萌前除草剂的疏水性亲电化合物所激活；以及烟草PR-Ia启动子，其被水杨酸激活。其它感兴趣的化学物调节的启动子包括类固醇应答性启动子(见例如糖皮质激素诱导型启动子，如Schenaetal.(1991)和McNellisetal.(1998)所述；以及四环素诱导型及四环素阻抑型启动子(见例如Gatzetal.(1991)和美国专利No.5，814，618及5，789，156所述)。根据本发明再一方面，另外提供了转化的植物、植物细胞、植物组织及其种子。嵌合或者转基因植物可以通过使用本身已知的技术从转化的外植体产生。所述转化/转染方法对于本发明不是决定性的；目前各种转化或者转染方法均可使用。随着较新的方法可用于转化农作物或者其它宿主细胞，可以直接应用这些方法。因此，已经开发了各种各样的方法用于将DNA序列插入宿主细胞的基因组中以获得所述序列的转录和/或翻译，从而引起该生物体中表型的改变。因此，任何提供有效转化/转染的方法均可以使用。转化方案以及将核苷酸序列导入植物中的方案可以根据作为转化靶向的植物或者植物细胞的类型即单子叶植物或者双子叶植物而改变。将核苷酸序列导入植物细胞中及随后插入植物基因组中的合适方法包括显微注射(Crosswayetal.，1986)、电穿孔(RiggsandBates,1986)、土壤杆菌介导的转化(美国专利No.5，563，055和5，981，840)、直接基因转移(Paszkowskietal.，1984)以及弹道粒子加速(见例如美国专利No.4，945，050；Tomesetal.,1995；McCabeetal.，1988)。也见Weisingetal.(1988)；Sanfordetal.(1987)(洋葱)；Christouetal.(1988)(大豆)；McCabeetal.(1988)(大豆)；FinerandMcMullen(1991)(大豆)；Singhetal.(1998)(大豆)；Dattaetal.(1990)(水稻)；Kleinetal.(1988)(玉米)；Kleinetal.(1988)(玉米)；美国专利No.5，240，855、5，322，783和5，324，646；Kleinetal.(1988)(玉米)；Frommetal.(1990)(玉米)；Hooykaas-VanSlogterenetal.(1984)；Bytebieretal.(1987)(☆禾斗，Liliaceae)；DeWetetal.(1985)(花粉)；Kaeppleretal.(1990)以及Ka印pieretal.(1992)(颈14须(whisker)-介导的转化)；D，Halluinetal.(1992)(电穿孔)；Lietal.(1993)和ChristouandFord(1995)(水稻)；Ishidaetal.(1996)(玉米，通过根癌土壤杆菌)。已经转化的细胞可以根据常规方式生长成植物。见例如McCormicketal.(1986)所述。然后生长这些植物，用相同转化株或者不同株授粉，所得杂交体具有经鉴定的所希望的表型特性的组成型表达。可以生长两个或更多世代以确保所希望的表型特性的组成型表达能稳定地保持和遗传，然后收获种子以确保所希望的表型特性的组成型表达。技术人员将意识到在重组表达盒被稳定整合入转基因植物中并被证实是可操纵的之后，其可以通过有性杂交而被导入其它植物中。根据要杂交的物种，可以使用任何标准育种技术。在营养体繁殖的农作物中，可以通过接取插枝或者组织培养技术来繁殖成熟的转基因植物以产生多个相同植物。选择所希望的转基因并获得新的变体以及进行用于商业用途的营养体繁殖。在种子繁殖的农作物中，成熟转基因植物可自我杂交来产生纯合的近交植物。所述近交植物产生含有新导入的异源核酸的种子。可以生长这些种子以产生将产生所选择表型的植物。得自再生植物的部分如花、种子、叶、分枝、果实等包括在本发明内，只要这些部分包含包含本发明分离的核酸的细胞。所述再生植物的后代和变体及突变体也包括在本发明范围内，只要这些部分包含导入的核酸序列。在一个实施方案中，本发明提供了对于所添加的异源核酸是纯合的转基因植物；即转基因植物含有两个添加的核酸序列，在染色体对的每条染色体上的相同基因座有一个基因。纯合转基因植物可以通过如下方式获得，即通过将含有单个添加的异源核酸的杂合转基因植物有性交配(自交)，使所产生的一些种子萌发并分析所得植物中本发明的多核苷酸表达相对于对照植物(即天然的非转基因植物)的改变。本发明也涵盖了与亲本植物的回交以及与非转基因植物的异型杂交。本发明可用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。感兴趣的植物的例子包括但不限于玉米(Zeamays)、芸苔属物种(例如油菜(B.napus)、芜菁(B.rapa)、芥菜(B.jimcea))，特别是可用作种子油来源的那些芸苔属物种，紫花苜蓿属(紫苜蓿(Medicagosativa))，7_K稻(Oryzasativa)，黑麦(Secalecereale),蜀黍属(两色蜀黍(Sorghumbicolor)、蜀黍(Sorghumvulgare)),粟(例如珍珠(Pennisetumglaucum),^(Panicummiliaceum),/J、(Setaraitalica),禾參-f·(Eleusinecoracana)，向日葵(Helianthusannuus)，红花(Carthamustinctorius)，小麦(Triticumaestivum)，大豆(Glycinemax)，烟草(Nicotianatabacum)，马铃薯(Solariumtuberosum)，花生(Arachishypogaea)，棉(海岛棉(Gossypiumbarbadense)，陆地棉(Gossypiumhirsutum)),番薯(Ipomoeabatatus),木薯(Manihotesculenta),咖啡(Coffeaspp·)，椰子(Cocosnucifera)，菠萝(Ananascomosus)，柑橘树(Citrusspp.),可可树属(Theobromacacao),茶(Camelliasinensis),香蕉(Musaspp·),鱼萼梨(Perseaamericana)，无花果(Ficuscasica)，番石槽(Psidiumguajava)，芒果(Mangiferaindica)，撤揽(Oleaeuropaea),木瓜(Caricapapaya)，腰果(Anacardiumoccidentale),澳洲坚果(Macadamiaintegrifolia),扁桃(Prunusamygdalus),舌甘菜(Betavulgaris),甘蔗(Saccharumspp.)，燕麦，大麦，蔬菜，观赏植物和针叶树。蔬菜包括番爺(Lycopersiconesculentum),莴苣(例如Lactucasaliva),菜豆(Phaseolusvulgaris)，禾马豆(Phaseoluslimensis)，豆|5豆(Lathyrusspp·)，以及香瓜属(Cucumis)成员如黄瓜(C.sativus)，舌甘瓜(C.cantalupensis)禾口香瓜(C.meld)。观赏植物包括杜鹃花(Rhododendronspp.)，绣球花(Macrophy1lahydrangea)，芙蓉(朱槿(Hibiscusrosasanensis)),玫瑰(Rosaspp.),郁金香(Tulipaspp.),7jC仙花(Narcissusspp.),(Petuniahybrida),(Dianthuscaryophyllus),一品红(Euphorbiapulchernima)和菊花。可用于实施本发明的针叶树包括例如松树，如火炬松(Pinustaeda)、湿地松(Pinuselliotii)、西黄松(Pinusponderosa)、小干松(Pinuscontorta)禾口福射松(Pinusradiata)；花旗松(Pseudotsugamenziesil)；力口拿大铁杉(Tsugacanadensis)；白云杉(Piceaglauca)；红杉(Sequoiasempervirens)；冷杉如银揪(太平洋银揪(Abiesamabilis))和香脂冷杉(Abiesbalsamea)；以及雪松如北美乔柏(Thujaplicata)及阿拉斯力口黄柏(黄扁柏(Chamaecyparisnootkatensis))。质外体是重组蛋白的短期原位聚集和贮存的极佳区室。已示出将重组免疫球蛋白靶向于所述质外体相对于其中重组免疫球蛋白靶向于胞质溶胶的植物显著增加蛋白质产量(ConradandFiedler,1998)。因此，在植物内膜系统中融合蛋白的合成与装配以及使用本发明信号锚的分泌可增强融合蛋白的聚集和回收。此外，将含有杀虫剂毒素蛋白的融合蛋白靶向于所述质外体可以产生对食用韧皮部昆虫有抗性的转基因植物。现有的原核和真核的表达系统中的生物化学、技术和经济学限制造成了对于开发新的用于生产重组蛋白的表达系统的实质兴趣。与微生物一样，植物细胞可以低成本地生长和维持，但是因为其是高等真核细胞，因此可实现在人细胞中所发生的许多翻译后修饰。植物细胞也是固有安全的，因为其既不具有人病原体也不产生内毒素。因此，植物是现有表达系统的最可能的替代物。随着植物转化技术的可用性及持续发展，大多数商业上重要的植物物种现在可以被遗传修饰以表达各种重组蛋白。转基因植物可用于低成本生产高品质的具生物活性的哺乳动物蛋白。见美国专利申请出版物No.2006/0248616所述。与在田间生长的植物不同，培养的植物细胞的性能不依赖于气候、土壤质量、季节、日长和天气。不存在污染真菌毒素、除草剂或者杀虫剂的危险以及具有较少的副产物(例如纤维、油、蜡、酚类化合物和偶生物(adventitiousagent))。也许植物细胞相对于整个植物最重要的优势是更简便的产物分离和纯化程序，特别是当产物被分泌进培养基中的时候。关于植物细胞生物反应器的描述，见美国专利申请出版物No.2006/0248616和2006/0218670。多个方法可用于在体外培养植物细胞，包括发根诱导(derivationofhairyroot)、枝形畸胎瘤(shootyteratomas)，固定化的细胞以及悬浮细胞培养物。悬浮细胞具有可以在大规模生物反应器中相对简单地培养的优势。悬浮细胞培养物已经从多个不同的植物物种中制备，包括拟南芥(Arabidopsisthaliana)、东北红豆杉(Taxuscuspidata)、长春花(Catharanthusroseus)及重要的种植作物(domesticcrops)如烟草、紫花苜蓿、水稻、番茄和大豆。通过将易碎的愈伤组织在摇瓶或者发酵罐中搅拌形成单细胞和小聚集体而制备植物悬浮细胞。愈伤组织是未分化的组织，其通过在含有适当的植物激素混合物的固体培养基上培养外植体以维持未分化状态而获得。使该细胞在含有相同激素的液体培养基中生长以促进快速生长和防止分化。16如果表达感兴趣的重组蛋白的转基因植物被用作愈伤组织的来源，则无需进行进一步的遗传操作(即无需在愈伤组织和/或悬浮物中选择转化的细胞)。或者，可通过与根癌土壤杆菌共栽培或者粒子轰击来用重组质粒转化野生型细胞悬浮物。适用于培养微生物细胞的原理也可适用于植物细胞，尽管细胞密度和生长速度较低。在植物细胞中摄氧率(及因此生物反应器应传递的输氧率)也相对较低。例如，Taticeketal.(1994)报道了在植物细胞培养物中的摄氧率(OUT)为1-3.5mmol·Γ1·h—1，与之相比在细菌培养物中为大约5-90mmol·Γ1·h—1。尽管存在这些不同，可以很容易地修改常规的发酵设备以便用于植物细胞，并且适用于微生物培养的许多发酵策略也适用于植物。所提供方法中的细胞也可以被固定化，这样使得可以获得持续和长期重组蛋白生产。所述重组蛋白和植物生物质的分离也变得更为方便。作为固定化方法，可以提及的有在藻酸盐或者琼脂珠中、在聚氨酯泡沫内固定或者也可在中空纤维内固定。所提供方法中的细胞也可以是根培养物。在体外在液态培养基中培育的根被称作“发根”，它们是由细菌发根土壤杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)转化的根。因此，有各种各样的方法可用于外源基因在植物中的重组表达。应理解本领域技术人员将能够使用本文提供的组合物和方法在任何植物中产生融合蛋白。与使用不同植物物种相关的挑战如用基因转化植物或者从植物中纯化该基因编码的蛋白可以通过使用本领域已知及本文提供的标准方法来克服。在转基因植物或者在培养的转基因植物细胞中产生的融合蛋白可以被分离或者纯化。如本文所用的术语“纯化的重组异源蛋白”意指重组的异源蛋白组合物，其与宿主细胞是可分离的，其中所述重组异源蛋白被纯化为任何相对于其天然可获得状态的程度，即在此情况中，相对于其在天然提取物中的纯度。纯化的重组异源蛋白因此也是指与其可以天然发生的环境中脱离的重组异源蛋白。一般地，“纯化的”是指已经经过分级分离而除去各种细胞成分的重组异源蛋白质组合物。适用于蛋白质纯化的各种技术将是本领域技术人员所熟知的。这些技术包括例如用硫酸铵、PEG、抗体等沉淀，或者热变性后离心；层析步骤如离子交换，凝胶过滤，反相，羟基磷灰石，凝集素亲和及其它亲和层析步骤；等电聚焦；凝胶电泳；以及这些及其它技术的组合。呈现出较低程度的相对纯化的方法在蛋白质产物的全部回收或者在维持所表达的蛋白的活性中可具有优势。失活产物在某些实施方案中也有用，如在抗体产生中。用于这种实施方案中的部分纯化的重组异源蛋白级分可以通过将细胞提取物经过一个或组合的多个上述步骤而获得。用改进的同等方式取代特某些步骤也被认为是有用的。例如，可以意识到的是利用HPLC设备进行的阳离子交换柱层析与利用低压层析系统的相同技术相比一般将导致更高倍数的纯化。因此，根据本发明，所述感兴趣的基因可以编码任何感兴趣的蛋白，该蛋白是被期望在生物反应器中的植物细胞中产生的。这种蛋白的例子是基于植物的生物药物产物，如抗生素和可食用疫苗(Fisheretal.，2004)。或者，感兴趣的基因可编码感兴趣的蛋白，该蛋白是被期望在维管元件的质外体中产生的。这种蛋白的例子是杀虫剂蛋白，如凝集素、核糖体抑制蛋白、arcelins、丝氨酸蛋白酶抑制剂，半胱氨酸(cyctein)蛋白酶抑制剂，α-淀粉酶抑制剂，修饰的贮存蛋白，刀豆毒素类似物(canatoxin-like)和尿素酶以及Bt毒素(CarlinimdGrossi-de_Sa，2002)。其它蛋白的例子包括下文所列出的那些。除非特别指出，则本发明的实施应用常规化学、分子生物学、微生物学、重组DNA、遗传学、免疫学、细胞生物学、细胞培养和转基因生物学的技术，这些技术为本领域所己知。见例如Maniatisetal.，1982，MolecularCloning(ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork)；Sambrooketal.，1989，MolecularCloning，2ndEd.(ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork)；SambrookandRussell，2001，MolecularCloning,3rdEd.(ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork)；Ausubeletal.，1992，CurrentProtocolsinMolecularBiology(JohnWiley&Sons，NewYork，包括定期更新)；Glover,DNACloning(IRLPress,Oxford,1985)；Gelvin，PlantMolecularBiologyManual(Springer，1989)；Jonesetal.,PlantMolecularBiOlogy:EssentialTechniques(JohnWiley&Sons，NewYork，1997)；Gelvin,PlantMolecularBiologyManual，2nded(包括附录4)(2000)；Clark，PlantMolecularBiology:ALaboratoryManual(Springer-Verlag，Berlin(1997))；Anand，TechniquesfortheAnalysisofComplexGenomes，(AcademicPress，NewYork，1992)；GuthrieandFink,GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology(AcademicPress,NewYork，1991)；HarlowandLane，1988，Antibodies，(ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork)；JakobyandPastan,1979；NucleicAcidHybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；TranscriptionAndTranslation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；CultureofAnimalCells(R.I.Freshney,AlanR.Liss,Inc.,1987)；ImmobilizedCellsAndEnzymes(IRLPress，1986)；B.Perbal,APracticalGuideToMolecularCloning(1984)；论文，MethodsInEnzymology(AcademicPress，Inc.，N.Y.)；GeneTransferVectorsForMammalianCells(J.H.MillerandM.P.Caloseds.，1987，ColdSpringHarborLaboratory)；MethodsInEnzymology,Vols.154andl55(Wuetal.eds.),ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecularBiology(MayerandWalker,eds.，AcademicPress，London，1987)；HandbookOfExperimentalImmunology,VolumesI-IV(D.M.WeirandC.C.Blackwell,eds.,1986)；Riott，EssentialImmunology,6thEdition，BlackwellScientificPublications，Oxford,1988；Hoganetal.，ManipulatingtheMouseEmbryo,(ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor,N.Y.,1986)；Westerfield,M.,Thezebrafishbook.Aguideforthelaboratoryuseofzebrafish(Daniorerio)，(4thEd.，Univ.ofOregonPress，Eugene，2000)所述。实施例本发明通过参考如下实施例而进行描述，所述实施例只是以举例说明的方式来提供，而并无以任何方式限制本发明之意。利用了本领域所熟知的标准技术或者下文具体描述的技术。实施例1实验程序构建体这项研究中所使用的构建体总结在表1中。构建体是基于PC1300或者pC1305.1的主链而制成的，通过DNA测序验证。Xa27-GFP融合基因是通过将GFP与XA27的C末端融合而产生的。Xa27编码区是从NA5.2(Guetal.，2005)扩增的，而GFP编码区是从pSSZ41(Kolesniketal.，2004)扩增的。将所述融合的PCR产物克隆进pC1305.1中产生pCXa27GFP。将来自pSSZ41的玉米泛素启动子的PstI片段插入pCXa27GFP中Xa27_GFP融合基因的5’产生pCUXa27GFP。含有部分Xa27_GFP融合基因的片段从pCUXa27GFP扩增并克隆进NA5.2的SacI位点以产生pC27Xa27GFP。Xa27_Flag融合基因通过PCR产生并克隆进NA5.2的SpeI和SacI位点中以产生pC27Xa27Flag。N57-GFP融合基因通过将XA27N末端区的57个氨基酸残基与GFP融合而产生。该融合基因用于置换pCUXa27GFP中的Xa27_GFP以产生pCUN57GFP。使用相似方法产生pCUN37GFP，其中XA27N末端区的37个氨基酸残基与GFP融合。将Xa27中的三联精氨酸残基(27-29)通过PCR突变为三联甘氨酸残基。该突变的Xa27基因用于置换NA5.2中的野生型Xa27以产生pC27Xa27G。该突变的Xa27基因也用于与GFP融合。这种Xa27G-GFP融合基因用于置换pCUXa27GFP中的Xa27_GFP以产生pCUXa27GGFP。相似方法用于产生构建体pCUN57GGFP和pCUN57KGFP，其中pCUN57GFP中N57-GFP融合基因中的三联精氨酸残基分别被突变为三联甘氨酸残基和三联赖氨酸残基。表1这项研究中使用的构建体aPubi,玉米泛素基因启动子；GFP，绿色荧光蛋白(GFP)基因(登记编号AAB92477)的编码区；Tnos,胭脂碱合酶基因(Nos)的终止子；Pxa27,Xa27启动子；Xa27-GFP,与XA27在C末端融合的GFP；Txa27,Xa27终止子；Xa27_Flag，与XA27在C末端融合的FLAG标记；N57-GFP，与XA27的N末端57氨基酸融合的GFP；N37-GFP,与XA27的N末端37氨基酸融合的GFP；N57G-GFP,与三联精氨酸(第27-29位)突变为三联甘氨酸的XA27的N末端57氨基酸残基融合的GFP；N57K-GFP,与三联精氨酸突变为三联赖氨酸的XA27的N末端57氨基酸融合的GFP；Xa27G-GFP,与三联精氨酸突变为三联甘氨酸的XA27融合的GFP；Xa27G,由三联甘氨酸置换三联精氨酸基序的XA27突变体。水稻转化根据先前描述的方法(YinandWang，2000)进行了水稻栽培种Nipponbare的土壤杆菌介导的转化。分子分析根据先前描述的标准程序(Sambrooketal,1989)进行了DNA和RNA凝胶印迹分析。如先前所述(Dellaportaetal.1983)从叶中分离水稻基因组DNA。大约2μgDNA用southern巾白勺*#r^cit。i^ffiRNeasyPlantMiniKit(Qiagen,Hi1den,Germany)根据厂商指导从水稻叶中分离总RNA。将大约20μg总RNA加样于每条泳道中用于RNA凝胶印迹分析。水稻泛素基因2(Ubi)的表达被用作RNA加样对照。使用RediprimeII随机引物标记系统(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ,USA)将DNA探针用[32P]_dCTP标记。使用来自转基因植物的20μg总蛋白质进行Western印迹，并在12%SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离，随后印迹在硝化纤维素膜上。使用FLAG-M2单克隆抗体(Sigma，StLouis,MO,USA)以及与辣根过氧化物酶偶联的二抗(Bio-Rad，Hercules,CA,USA)检测XA27-FLAG。细菌性枯萎病接种和疾病评分将黄单胞菌水稻致病变种菌株在PSA培养基(10g/L蛋白胨，10g/L蔗糖，lg/L谷氨酸，16g/L细菌琼脂，pH7.0)上在28°C培养2-3天。将细菌接种物悬浮于无菌水中达到在0D600为0.5的光密度。使用叶剪切(leaf-clipping)方法(Kauffrnanetal.，1973)进行细菌性枯萎病接种。根据先前描述的标准(Guetal.，2004)来对该疾病症状评分。GFP荧光和质壁分离使用ZEISSLSM510META倒置共聚焦显微镜(Zeiss，Jena，Germany)在488nm下用505-530nm的带通检测GFP荧光。同时通过相差2(Ph2)通道获取透射图像。使用10号手术刀人工切取接种或者未接种植物的叶横截面。为了诱导根细胞中的质壁分离，将具有根尖的大约Icm的根在10%(w/v)甘露醇溶液中温育1小时并置于相同溶液中进行观测。免疫金电子显微术根据Chyeetal.，(1999)先前描述的方法，略加修改来进行免疫金电子显微术。在接种后3天(DAI)将来自接种植物的长度为3mm的叶横截面切片在0.IM磷酸盐缓冲液中的0.5%戊二醛和2%多聚甲醛溶液中于真空下固定4小时。将样品用50mM磷酸盐缓冲液洗涤45分钟。在梯度乙醇系列中脱水后，将样品浸入LR白色树脂(EMS，Hatfield,PA19440,USA)中并包埋于明胶胶囊中。使用LeicaUltracut切片机将样品切成80nm切片并置于聚乙烯醇缩甲醛(Formvar)-包被的开槽网格(slottedgrids)中。使用抗-FLAG单克隆抗体(Sigma，StLouis,M0,USA)检测Xa27_FLAG蛋白，随后用与山羊抗小鼠IgG抗体(EMS)缀合的10或者15nm金标记。小鼠免疫前血清被用于在对照试验中代替抗-FLAG单克隆抗体。网格中的样品进一步用2%乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色。使用在120ky运行的透射电子显微镜(JE0LJEM-1230，JEOLTD,Tokyo196-8558，Japan)观测样品并且使用数码显微照像系统(GatanInc.，Pleasanton,CA94588，USA)照相。实施例2包含推定的N末端信号锚的XA27所述Xa27基因编码包含113个氨基酸的蛋白，然而对XA27的结构分析对于该蛋白的作用模式显示了很少或者完全没有线索(Guetal.，2005)。作为鉴别这种R蛋白质的生物化学功能的努力的一部分，我们研究了所述XA27蛋白的亚细胞定位。有趣地是，20SignalP-HMM(http//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)的预测显示XA27的N末端区域编码推定的信号锚(概率=0.790)(图1)。所述推定的信号锚在N末端具有一个37个氨基酸的η-区，包含带正电荷的残基，包括残基27-29位的三联精氨酸基序，其后是疏水性h-区(Emanuelssonetal，2007)。信号锚以与信号肽相同方式起始易位，但是不被信号肽酶裂解(vonHeijne,1988)。随着其余多肽链被穿膜易位，所得蛋白质通过所述疏水性区域保持锚定在膜上，并具有短的N末端胞质结构域(vonHeijne,1988)0实施例3在细菌性枯萎病感染期间XA27在维管元件中被诱导为了研究XA27的定位，我们在缺乏功能性Xa27的Nipponbare背景中产生了转基因Pxa27:Xa27-GFP:Txa27植物(表1)。Pxa27:Xa27-GFP:Txa27基因中的调节序列包括1.5_kbXa27启动子(Pxa27)和3.3-kb3，调节区(Txa27)，其克隆自用于互补研究中的Xa27基因组克隆(Guetal.2005)。产生了7个独立的转基因Pxa27:Xa27_GFP:Txa27品系，其在T。、T1,T2世代中赋予对不相容菌株PX099a的抗性(数据未示出)。RNA凝胶印迹分析表明所有所述7个品系在无细菌感染时均具有较弱的Pxa27:Xa27-GFP:Txa27基因的渗漏表达(leakingexpression)(数据未示出)。选取具有单拷贝转基因的Pxa27:Xa27_GFP:Txa27的品系22(L22)进行进一步分析。？&271327-6:1&27在1^22中的表达水平在其受到PX099A攻击后升高(图2a，泳道3和4)。在L22植物未接种的叶中，所述渗漏表达的XA27-GFP蛋白主要在叶肉细胞中被检测到(图3d-f)。然而，在PX099A接种后，大量XA27-GFP蛋白被诱导并聚集在维管元件，包括木质部维管、木质部、原生木质部和韧皮部(图3，g_i)，而叶肉细胞中的蛋白并未明显改变。在非转基因Nipponbare植物的叶中未检测到背景GFP荧光(图3a_c)。实施例4:XA27定位于维管元件的质外体在死亡的组织木质部和木质部维管中存在XA27-GFP蛋白表明XA27是分泌性蛋白而不是膜相关或者胞质蛋白。所述XA27蛋白可以从相邻的薄壁组织细胞中分泌至这些组织。为了验证这个设想，我们使用转基因？&271&27呼1叫:1&27植物(表1)进行了免疫金测定。产生了43个独立的转基因品系并且所有品系均示出对ΡΧ099Α&抗性。在这些抗性品系中所诱导的Xa27-FLAG蛋白首先通过使用抗-FLAG单克隆抗体的western印迹测试检测。在所检测的6个抗性品系中仅检测到分子量为大约13kDa的所述XA27-FLAG蛋白的一个均一条带(图2b)。然后所述XA27-FLAG蛋白的免疫定位通过使用来自用PX099A接种后3天(DAI)的品系18(L18)的叶横截面切片来进行。如金粒子所示，所述XA27-FLAG蛋白定位于在凹陷区域的木质部薄壁组织细胞的内部和外部(图4c和d)、木质部维管的管腔(图4e)以及也定位于韧皮部中薄壁组织细胞的二级细胞壁(图4h和i)。在所述木质部维管中，发现大部分XA27-FLAG蛋白定位于管腔内而不是与细菌或者维管壁结合(图4e)。在木质部管腔内，所述XA27-FLAG蛋白存在于纤维状材料中(图4d_f)(Hilaireetal.，2001；HorinoandKaku，1989)，其功能未知。在L18接种的的叶中并未在细胞核中(图4f和4g)或者木质部薄壁组织细胞的其它细胞器中检测到XA27-FLAG蛋白(数据未示出)。在对照试验中，当免疫前血清被用于免疫金测定时没有或者仅有背景水平的金粒子被标记到所述样品上(图4a和b)。实施例5:XA27定位于异位品系的根细胞壁为了进一步验证XA27定位于质外体，我们研究了所述XA27-GFP蛋白在异位品系的根细胞壁中的定位以通过质壁分离简便地鉴定出根细胞的细胞壁。产生了38个转基因Pubi:Xa27-GFP:Tnos品系，其携带受玉米泛素基因启动子控制的Xa27_GFP融合基因(表1)。在这些品系中，4个携带单一拷贝T-DNA插入的品系被选择用于进一步研究。这些品系示出Pxa27:Xa27-GFP:Txa27的高表达，并且对不相容菌株PX099A和相容菌株AX01947均有抗性(数据未示出)，表明这些异位品系中的XA27-GFP蛋白是具完全功能的并且其提供了与异位品系中野生型XA27蛋白类似的对于相容菌株的增强的抗性(Guetal.，2005)。对来自Pubi:Xa27-GFP:Tnos的品系9(L9)以及来自GFP对照Pubi.GFP:TNos的品系8(L8)(表1)的根尖进行了共聚焦显微术。L8的根细胞的GFP图像表明GFP蛋白定位于细胞质和核，因为在细胞之间观测到明显的无荧光区(图5a-c)。所述XA27-GFP蛋白也定位于细胞质(图5g_l)。然而，其也许不定位于细胞核，因为尽管清楚观测到细胞质GFP荧光，但是细胞核是间接地被GFP环所标记的(图5g和j)。此外，XA27-GFP蛋白似乎定位于细胞壁，因为在细胞之间未发现明显缺口(图5g-i)。这个观测结果通过质壁分离分析得到验证。在质壁分离时，质膜收缩并与细胞壁分离。在L8植物中，在质壁分离后皱缩的原生质体的细胞质之外并未发现GFP信号(图5d-f)。另一方面，所述L9植物中的XA27-GFP蛋白定位于细胞壁以及在质壁分离后皱缩的原生质体的细胞质(图5j-l)，这是XA27-GFP与GFP的亚细胞定位中的主要差别。XA27-GFP在细胞壁的定位不能得自L9中Pubi:Xa27-GFP:TN。s基因的异位表达，因为其表达在RNA和蛋白质水平(基于GFP荧光)上均与L8中PubiGFPTN。S基因的表达相当或者较低(图2a，泳道6和7；图5)。实施例6:XA27中信号锚的鉴别和鉴定为了进一步验证所述推定的信号锚存在并且是XA27定位于质外体和细胞壁以用于对黄单胞菌水稻致病变种的抗性所必需的，我们从XA27克隆了所推测的57个氨基酸的信号锚并通过截短或者突变产生了其衍生物。将所述推定的信号锚或者其衍生物与GFP融合并产生携带有在玉米泛素基因启动子控制下的融合基因的稳定转基因植物(表1)。在共聚焦显微镜下研究转基因品系的根细胞中融合蛋白的定位。所述Pubi:N57-GFP:TN。s基因携带与GFP的N末端融合的野生型推定的信号锚。从Pubi:N57-GFP:TN。s中获得了56个个体的转基因植物。所有所述转基因植物均示出高水平的转基因表达，但是无疾病抗性(数据未示出)。Pubi:N57-GFP:Tnos的品系12(L12)在RNA水平显示出与Pubi:GFP:TN。S的L8相当的转基因表达(图2a，泳道10和11)。与L9中XA27-GFP蛋白一样(图5j-Ι)，所述L12中N57-GFP蛋白在质壁分离之后除了细胞质之外还定位于细胞壁(图6d-f)，表明XA27的57个氨基酸的N末端区足以使N57-GFP融合蛋白锚定于细胞壁上。由于疏水性h-区是功能性信号锚必需的(vonHeijne，1988)，因此我们通过将所述h-区从信号锚截短并将剩余的37个氨基酸的N末端区域与GFP融合以构建Pubi:N37-GFP:TN。s(表1)从而来确定为蛋白质定位所需的XA27信号锚中的h-区。产生了66个独立的转基因Pubi:N37-GFP:TN。s品系，所有这些品系均易感PX099a。对来自Pubi:N37-GFP:Tnos的品系2(L2)根尖的细胞在有质壁分离和未有质壁分离下进行共聚焦显微术。图6g-61中的图像清楚示出N37-GFP融合蛋白不再能定位于细胞壁，表明所述h-区是功能性XA27信号锚所必需的。信号锚η-区中带正电荷的残基对于蛋白锚定是重要的(vonHeijne，1988)。XA27信号锚的η-区中的三联精氨酸基序在ΧΑ27及其来自水稻的平行进化同源物(paralog)之间是保守的(Guetal.，2005)。为了研究此三联精氨酸基序在XA27由细胞溶质至质外22体的易位中的作用，我们产生了两个信号锚突变体并将其与GFP融合。Pubi:N57G-GFP:TN。s基因通过将所述三联精氨酸残基改变为三联甘氨酸残基而携带突变的信号锚，而Pubi:N57K-GFP:TN。s基因包含用正电荷的三联赖氨酸取代三联精氨酸残基的突变。共聚焦显微术和质壁分离分析表明这两个融合蛋白N57G-GFP或者N57K-GFP均不定位于异位品系的根细胞壁(图6m-x)。此结果还提示所述三联精氨酸残基是XA27的易位所必需的，其不可由其它正电荷残基如赖氨酸所置换。在具有与GFP融合的XA27信号锚的截短的或者突变的衍生物的任一异位品系中，所述融合基因的表达与在PubiGFPTnos的L8或者PimN57-GFPTnos的L12中的相当(图2a，泳道10-14)。实施例7:XA27定位于质外体是疾病抗性所必需的尽管在细胞质中也检测到XA27-GFP和Xa27_FLAG蛋白，但是这些功能性蛋白质定位于质外体和细胞壁可能是负责XA27介导的针对黄单胞菌水稻致病变种的疾病抗性。为了验证这个假设，我们通过用三联甘氨酸残基置换三联精氨酸残基来突变XA27并产生含有突变的Xa27基因(PXa27.Xa27G:Txa27)或者其与GFP的融合基因(Pubi:Xa27G-GFP:TnJ的转基因植物(表1)。产生了45个转基因Pubi:Xa27G-GFP:TN。s品系，然而这些转基因品系在Ttl或者T1世代无一对PX099a具有抗性(数据未示出)。Pubi:Xa27G-GFP:Tnos的品系18(L18)被选择用于进一步分析。RNA凝胶印迹分析显示L18中Pubi:Xa27G-GFP:TN。s基因的表达与L8中的PubiGFPTnos或者L9中的PubiXa27-GFPTnos相当(图2a，泳道6_8)。然而，共聚焦显微术和质壁分离结果表明XA27G-GFP蛋白在异位品系中不能定位于根细胞的细胞壁(图7a_f)。相似地，XA27中三联精氨酸基序到三联甘氨酸残基的突变本身就消除了其疾病抗性功能，尽管突变的基因是由Xa27天然启动子所驱动的。RNA凝胶印迹分析表明尽管在接种PX099a之后所述突变的基因在转基因Pxa27:Xa27G:Txa27植物中的表达与TN8中野生型Xa27转基因的表达(Guetal.，2005)相当(图7g)，但是所述PXa27:Xa27G:TXa27植物对于细菌性枯萎病病原体是完全易感的(图7h)。我们已使用GFP标记、免疫金电子显微术、质壁分离以及诱变来确定了XA27的亚细胞定位。XA27-GFP在细胞壁和质外体的定位不能够得自所述融合蛋白的错误定位(mislocalization).不正确折叠的GFP蛋白已被报道为通过非经典途径分泌，但是它们是无荧光的(Tanudjietal.，2002)。更重要的是，所述XA27-GFP蛋白在提供针对细菌性枯萎病的抗性中起作用，这与所述融合蛋白在质外体和细胞壁的定位密切相关并且依赖于XA27的完整的N末端信号锚。信号锚的鉴定及XA27在维管元件的质外体的定位有利于对R蛋白的生物化学功能的进一步鉴别。黄单胞菌水稻致病变种是维管病原体，并典型性地通过在顶端叶和叶缘的排水孔而进入水稻叶(Nino-Liu，2006)。细菌在下面的通水组织的细胞间隙中增殖，然后通过木质部进入及传播至植物(Nino-Liu，2006)。我们还观测到当叶剪切方法被用于接种细菌时，细菌繁殖在原生木质部的管腔和筛管内发生(LifangWuandZhongchaoYin，未公开的数据)。与其它致病菌一样，黄单胞菌水稻致病变种不进入宿主细胞。而是当叶剪切方法被用于接种细菌时其与木质部的薄壁组织细胞和薄壁组织或者韧皮部的伴胞相互作用。事实上，发现所述XA27-GFP和XA27-FLAG蛋白在木质部维管周围的薄壁组织细胞、原生木质部的管腔和韧皮部的筛管中被诱导。在不相容相互作用中，在接种后3天内木质部维管中的细菌被丰富的纤维状材料所包围(Hilaireetal.，2001)(图4d_f)。所述纤维状材料源23于宿主，其功能未知(HorinoandKaku，1989)。可能是所述纤维状材料和XA27蛋白均主要通过木质部维管与薄壁组织细胞之间的凹陷分泌至木质部维管。所述被诱导的XA27蛋白主要分泌至木质部维管，这是细菌在其中繁殖的特殊质外体结构。在木质部维管内部，XA27-FLAG和XA27-GFP蛋白更频繁地被观测到是在木质部维管的管腔内的纤维状材料中，而不是附着于维管壁。在其它细胞中，如在韧皮部或者原生木质部的薄壁组织细胞以及异位品系的根细胞中，所述融合蛋白更频繁地被观测到定位于细胞壁。所述XA27蛋白具有类似于胞外ra蛋白的特性。与其它I3R蛋白一样，XA27本身未显示出抗性特异性。例如，所述R蛋白在水稻PRl启动子控制下的异位表达提供了对于包括Xa27相容菌株在内的多种黄单胞菌水稻致病变种菌株的广谱和非特异性抗性(Guetal.，2005)。在这项研究中，XA27-GFP蛋白在玉米泛素启动子控制下的组成型表达也赋予了针对黄单胞菌水稻致病变种菌株的非特异性抗性。大多数所述I3R蛋白是由许多环境和发育刺激激发的可诱导蛋白(EdreVa，2005)。XA27由来自不相容病原体的AvrXa27特异性诱导。与其它I3R蛋白对比，XA27的表达被更紧密地控制，并且R蛋白的组成型过表达导致应激表型，如细胞壁增厚(Guetal.，2005)，生长阻滞及过早衰老(未公开的数据)。最后，I3R蛋白的表达以及其它基于细胞壁的胞外防御很可能被病原体用于疾病发展的毒性因子所阻抑(Hauck，etal.，2003；Ottetal.，2006)。在AvrXa27_Xa27相互作用中，所述Xa27基因看起来配置了模拟启动子(抗性或者R启动子)，混淆了III型效应物AvrXa27，其中毒性功能仍未检测到，并且触发了Xa27基因表达。因此，更合适的描述是Xa27基因是R启动子驱动的防御基因。仍需要确定在维管元件的质外体中Xa27在生物化学水平是否施行任何信号转导或者抗微生物功能。II型膜蛋白通过其信号锚中的疏水性区域锚定在膜上(vonHeijnel988)。然而，所述功能性XA27-FLAG和XA27-GFP蛋白在自然状态是可溶的，因此可以是野生型XA27。这些蛋白质定位于水稻细胞的质外体和细胞质而不是锚定细胞质膜或者任何胞内膜系统。因此，尽管XA27具有信号锚，但是其易位至质外体可能不遵循典型的使蛋白质锚定于质膜的II型分泌途径。此外，XA27信号锚中的所述三联精氨酸残基不可以由任何其它碱性氨基酸残基置换。在双精氨酸易位(twin-argininetranslocation)(Tat)途径(MuIlerandKlosgen,2005；Robinsonandbolhuis,2004)的信号肽中也发现类似的精氨酸基序。所述Tat途径负责使折叠的蛋白质穿过细菌细胞质膜或者高等植物叶绿体的类囊体膜而输出。通过Tat途径转运的蛋白具有可裂解信号肽，该信号肽具有双精氨酸共有基序(Robinsonandbolhuis，2004)。所述类囊体Tat系统的几乎所有底物的Tat信号肽均含有三个不同的结构域由双精氨酸基序结尾的N-末端带电结构域，疏水性核心结构域及更具极性的C末端结构域，该C末端结构域的结尾是由类囊体信号肽酶指定裂解的共有基序(Ala-X-Ala)(Robinsonandbolhuis,2004)。尽管信号锚与Tat信号肽呈现一些共同特点，但是由TatP1.OServer(http//www.cbs.dtu.dk/services/TatP/)进行的Tat信号预测不能鉴定出XA27的N末端区域中的Tat信号序列(数据未示出)。此外，Tat信号肽在蛋白质易位后被裂解，一个例外是来自脱氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)的Rieske蛋白，其依赖于不可裂解的Tat信号序列锚定于细胞质膜(Bachmarmetal.，2006)。迄今为止，还未知但是仍在感兴趣地研究XA27蛋白是否以其折叠形式通过另一种Tat样分泌途径来易位至水稻细胞的质外体。24在描述本发明时(特别是下述权利要求时)，使用术语“一个”和“所述”及类似指代被解释为涵盖单数和复数，除非本文另外指明或者上下文清楚表明相反。术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”是开放术语(即是指“包括但非限于”)，除非另有说明。本文数值范围的引用仅仅是用于对落入该范围的每个单独数值的分别指代的简单方法，除非另有说明，并且每个单独数值并入本说明书中，就仿佛其分别在本文中所引用。例如，如果公开了范围10-15，则也公开11、12、13和14。本文描述的所有方法可以以任何适宜的次序进行，除非本文另有说明或上下文清楚表明相反。本文所提供的对任何和全部例子的使用或者范例语言(例如“如”)仅仅是为了更好说明本发明而非限制本发明的范围，除非另外声明。说明书中任何语言都不应被理解为表明任何未要求保护的、对实施本发明是必要的元ο应意识到本发明的方法和组合物可并入各种实施方案的形式中，本文仅公开了其中的几个。本发明的实施方案在本文描述，包括本发明人所知的实现本发明的最佳模式。在阅读前述说明书的基础上，这些实施方案的变化对本领域技术人员而言是很明显的。本发明人期望本领域技术人员适当地运用这些变化，本发明人试图以不同于本文具体描述的方式实施本发明。因此，本发明包括对所附权利要求书所详述的主题所进行的、适用法律所允许的所有修改及其等同。此外，除非特别指出或者上下文清楚表明相反，则上述元素所有可能变化的任意组合均涵盖在本发明范围内。参考文献Axtell,MJ.andStaskawicz,B.J.(2003).InitiationofRPS2-specifieddiseaseresistanceinArabidopsisiscoupledtotheAvrRpt2_directedeliminationofRIN4.Cell112:369-377.Bachmann,J.etal.(2006).TheRieskeproteinfromParacoccusdenitrificansisinsertedintothecytoplasmicmembranebythetwin-argininetranslocase.FEBSJ273:4817_4830.Backus,E.A.etal.(2004).Mechanismsofhopperbum:Anoverviewofinsecttaxonomy,behavior,andphysiology.AnnuRevEntomol50:125—151.Ballas,N.etal.(1989).Efficientfunctioningofplantpromotersandpoly(A)sitesinXenopusoocytes.NucleicAcidsRes17:7891-7903.Boyes,D.C.etal.(1998).TheArabidopsisthalianaRPMldiseaseresistancegeneproductisaperipheralplasmamembraneproteinthatisdegradedcoincidentwiththehypersensitiveresponse.ProcNatlAcadSciUSA9515849-15854.Burch-Smith,T.M.etal.(2007).AnovelrolefortheTIRdomaininassociationwithpathogen-derivedelicitors.PLoSBiol5:e68.Bytebier,B.etal.(1987).T-DNAOrganizationinTumorCulturesandTransgenicPlantsoftheMonocotyledonAsparagusofficinalis.ProcNatlAcadSciUSA84:5345-5349.Canny,M.J.(1986).Transportinlivingplants.Biorheology23:605—612.Carlini,CR.andGrossi—de—Sa,M.F.(2002).Planttoxicproteinswithinsecticidalproperties.Areviewontheirpotentialitiesasbioinsecticides.Toxicon40:1515-1539.Chattopadhyay,A.etal.(2004).Bacterialinsecticidaltoxins.CritRevMicrobiol30:33_54.Chen,W.etal.(1996).ThepromoterofaH202-inducib1e,ArabidopsisglutathioneS—transferasegenecontainscloselylinkedOBF—andOBPl-bindingsites.PlantJ10:955_966.Christensen，A.H.andQuai1,P.H,(1989).Sequenceanalysisandtranseriptionalregulationbyheatshockofpolyubiquitintranscriptsfrommaize.PlantMolBioll2:619_632.Christensen，A.H.etal.(1992).Maizepolyubiquitingenes:structure，thermalperturbationofexpressionandtranseriptsplicing，andpromoteractivityfοllowingtransfertoprotoplastsbyelectroporation.PlantMolBiol18:675-689.Christouetal.(1988).StableTransformationofSoybeanCallusbyDNA-CoatedGoldParticles.PlantPhysiol87:671-674.Christou，P.andFord，T.L.(1995).Recoveryofchimericriceplantsfromdryseedusingelectricdischargeparticleacceleration.AnnalsofBotany75407-413.Christou，P.etal.(2006).Recentdevelopmentsandfutureprospectsininsectpestcontrolintransgeniccrops.TrendsPlantSci11:302_308·Chye，M.L.etal.(1999).IsolationofageneencodingArabidopsismembrane-associatedacyl—CoAbindingproteinandimmunolocalizationofitsgeneproduct.PlantJ18:205-214.Conrad，U.andFiedler，U.(1998).Compartment-specificaccumulationofrecombinantimmunoglobulinsinplantcells:anessentialtoolforantibodyproductionandimmunomodulationofphysiologicalfunctionsandpathogenactivity.PlantMolBiol38:101_109·Cordero，M.J.etal.(1992).InductionofPRproteinsingerminatingmaizeseedsinfectedwiththefungusFusariummoniliforme.PhysiolMolPlantPath41189-200.Cordero,M.J.etal.(1994).Expressionofamaizeproteinaseinhibitorgeneisinducedinresponsetowoundingandfungalinfectionsystemicwound-responseofamonocotgene.PlantJ6:141_150·Crossway,A.etal.(1986).MicromanipulationTechniquesinPlantBiotechnology.Biotechniques4:320_334·Dangl,J.L.andJones,J.D.G.(2001).Plantpathogensandintegrateddefenseresponsestoinfection.Nature411:826-833.Datta，S.K.etal.(1990).GeneticallyEngineeredFertileIndica-Rice26RecoveredfromProtoplasts.Biotechnology8:736_740·Dayhoffetal.(1978).AtlasofProteinSequenceandStructure，Natl.Biomed.Res.Found.，Washington,D.C.Dellaporta，S.L.etal.(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