专利名称：一种制备高纯度芦丁单体及芦丁标准样品的方法
技术领域：
本发明涉及一种采用高速逆流色谱法从含芦丁的天然产物或其提取物、芦丁粗粉中分离 精制高纯度的卢丁单体化合物的方法。所制得的芦丁单体化合物可用于卢丁标准样品的研制。技术背景-芦丁具有祛痰、止咳、平喘、降低血压、增强毛细血管抵抗力、减少毛细血管脆性、降 血脂、扩张冠状动脉、增加冠脉血流量等作用，已被用于治疗慢性支气管炎和对冠心病及高 血压患者的辅助治疗药物。它也是评价常用中草药及保健食品原料山楂叶、天山雪莲、沙棘、 桑叶、槐花、槐米、满山红等品质的重要指标之一。因此，制备高纯度戸丁单体和标准样品 是满足上述药物或保健食品原料使用中分析检测工作的需要，保证检测结果的准确性、可比性和溯源性的重要环节。但目前，国内外可购买到的都是芦丁对照品，且纯度都仅为用uv方法检测95%以上的产品。这些对照品因为只给出纯度值，没有不确定度的说明，既不符合 现代测量理论的要求，更无法满足目前食品、保健品、药品等行业中对于芦丁含量的准确、 可比、可溯源的检测要求。芦丁标准样品研制的关键步骤是高纯度芦丁单体的制备，本发明充分利用高速逆流色谱 无固定支撑载体，可有效地排除不可逆吸附，实现高纯度、高回收率样品分离精制的优点， 分离制备了纯度高于98%，可达克量级生产的芦丁单体，并将该单体用于了标准样品的研制。
发明内容
本发明的目的是采用高速逆流色谱法制备纯度达98%以上，可达克量级生产的芦丁单体， 该单体化合物可用于标准样品的研制。本发明的基本工艺路线是(1) 用有机溶剂浸提，浸提液减压蒸馏至干后，用柱色谱进行分离，得到粗提物；(2) 粗提物用高速逆流色谱仪进行分离，制得芦丁高纯度单体；(3) 以所得高纯度单体为原料，进行标准样品的研制工作。高速逆流色谱法对含戸丁的天然产物或其提取物、戸丁粗粉进行纯化，可选用的溶剂体系主要有三个，一-号溶剂体系为T A组分为烷烃或/和醚类，包括正庚烷、正己烷、环己垸、辛垸、癸烷、 乙醚、石油醚或/和甲基叔丁基醚的一种或几种的混合；B组分为呋喃类或/和脂肪酯，包括 四氢呋喃、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异丙酯或/和乙酸正丁酯的一种或几种的混合；C组分 为腈类、脂肪醇或/和脂肪酮，包括乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、丙醇、正丁醇、异丁醇、叔 丁醇、丙酮、甲基乙基酮或/和环己酮的一种或几种的混合，D组分为纯水或以酸、碱调节pH 值在1-11的水溶液，优选正己垸-乙酸乙酯-甲醇-水体系，A、 B、 C、 D的体积比为1 : 0. 1-20:0. 1-20 : 0. 1-20。二号溶剂体系为A组分为呋喃类或/和脂肪酯，包括四氢呋喃、乙酸乙酯、乙酸丙酯、 乙酸异丙酯或/和乙酸正丁酯的一种或几种的混合；B组分为腈类、脂肪醇或/和脂肪酮，包 括乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、丙酮、甲基乙基酮或/和环 己酮的一种或几种的混合，C组分为纯水或以酸、碱调节pH值在1-11的水溶液，优选乙酸 乙酯-正丁醇-水体系，A、 B、 C的体积比为1 : 0. 01-20 : 0. 1-20。三号溶剂体系为A组分为腈类、脂肪醇或/和脂肪酮，包括乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、丙酮、甲基乙基酮或/和环己酮的一种或几种的混合，B组分为纯水或以酸、碱调节Ph值在1-ll的水溶液，优选正丁醇-水体系，A、 B的体积比为 1 : 0.1-20。按一定比例配置足量的两相溶剂体系，静置分层，使用前将两相分开，其中上相用作固 定相，下相用作流动相。先将高速逆流色谱柱充满固定相，调整主机转速，然后以1-2ml/min的流速泵入流动相， 待体系达到动态平衡即可进样(样品用适量的两相溶剂充分溶解)。流出液用检测器进行检测， 根据记录仪上所显示的色谱图对目标组分进行收集。把收集的溶液用旋转蒸发器去除有机溶 剂，将每次分离所得的高纯度产品合并后在冷浴中冷冻，用真空冷冻干燥机冻干，得到纯品。实验适合于在室温为5-3(TC下进行，室温的变化对分离效果影响不大，对保留时间稍有 影响。用本法制备的芦丁单体化合物纯度可达到98%以上，制备量在克量级。本法适用于以各 种含戸丁的天然产物、天然产物的提取物、戸丁粗粉为原料制备的高纯度的芦丁单体化合物。 适用于采用各种型号的逆流色谱仪分离制备芦丁单体。本法具有技术工艺先进、分离效率高回收率高、产品纯度高、制备量较大等特点。制得的纯品用棕色瓶进行分装，编号后置于2-8'C密封保存。再经过定性检验、均匀性 检验、稳定性检验和定值实验，研制芦丁标准样品。
具体实施例方式实施例1采用正己垸-乙酸乙酯-甲醇-水体系，以桑叶为原料制备纯度高于98%的芦丁单体。 芦丁粗提物的制备以70%的乙醇浸提桑叶，浸提液用旋转蒸发器蒸至近干，呈浸膏状。 以大孔树脂填料D-ll装柱，乙醇、水为流动相进行梯度洗脱，每10min接收一个样品，用 HPLC分析，将卢丁的组分收集到一起，蒸干溶剂，得到纯度为50%的戸丁粗提物。芦丁单体的制备将体积比为1 : 18 : 1 : 20的正己垸一 乙酸乙酯-甲醇一水混溶于分液漏斗中，摇匀后静置分层，取其上层溶液(上相)为固定相，下层溶液(下相)为流动相。使用分析型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，20ml进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为240ml， 8823A-UV紫外检测器，Yokogawa3057便携式记录仪。进样前，先用固定相充满整个柱子，调 整主机转速为800rpm，以2. 0ml/min的流速将流动相泵入柱内，待整个体系建立动态平衡后， 由进样阀进样，样品浓度为10mg/ml，进样量为20ml。根据紫外检测器检测的谱图，接收目 标成分。将多次精制得到的芦丁组分合并，冷冻干燥，得到黄色粉末，经HPLC分析，其纯度 达到98%以上。实施例2采用乙酸丙酯—异丁醇一水体系，以芦丁含量为1%的槐米提取物为原料制备纯度高于 98%的戸丁单体。芦丁粗提物的制备以大孔树脂填料D-16装柱，乙醇、水为流动相进行梯度洗脱，每 10min接收一个样品，用HPLC分析，将芦丁的组分收集到一起，蒸干溶剂，得到纯度为50 %的芦丁粗提物。芦丁单体的制备将体积比为2:1:3的乙酸丙酯一异丁醇一水混溶于分液漏斗中，摇匀后静置分层，取其上层溶液(上相)为固定相，下层溶液(下相)为流动相。使用半制备型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，20ml进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为240ml， 8823A-UV紫外检测器，Yokogawa3057便携式记录仪。进样前，先用固定相充满整个柱子，调整主机转 速为800rpm，以2. 0ml/min的流速将流动相泵入柱内，待整个体系建立动态平衡后，由进样 阀进样，样品浓度为10mg/ml，进样量为20ml。根据紫外检测器检测的谱图，接收目标成分。 将多次精制得到的芦丁组分合并，冷冻干燥，得到黄色粉末，经HP1X分析，其纯度达到98% 以上。实施例3采用正丁醇一水体系，以芦丁含量为10%的山楂提取物为原料制备纯度高于98%的芦丁单体。芦丁粗提物的制备以大孔树脂填料D-11装柱，乙醇、水为流动相进行梯度洗脱，每 10min接收一个样品，用HPLC分析，将芦丁的组分收集到一起，蒸干溶剂，得到纯度为80 %的芦丁粗提物。芦丁单体的制备将体积比为1 : 1的正丁醇一水混溶于分液漏斗中，摇匀后静置分层， 取其上层溶液(上相)为固定相，下层溶液(下相)为流动相。使用半制备型高速逆流色谱 仪，配有NS-1007泵，20ml进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为240ml， 8823A-UV紫外检测器， Yokogawa3057便携式记录仪。进样前，先用固定相充满整个柱子，调整主机转速为800rpm， 以2.0ml/min的流速将流动相泵入柱内，待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样，样品 浓度为10rag/ml，进样量为20ml。根据紫外检测器检测的谱图，接收目标成分。将多次精制 得到的芦丁组分合并，冷冻干燥，得到黄色粉末，经HPLC分析，其纯度达到98%以上。实施例4采用正庚烷一乙酸丙酯一丙酮一水体系，以戶丁含量为20%的沙棘提取物为原料制备纯 度高于98%的戸丁单体。戸丁粗提物的制备以大孔树脂填料D-16装柱，乙醇、水为流动相进行梯度洗脱，每 5min接收一个样品，用HPLC分析，将芦丁的组分收集到一起，蒸干溶剂，得到纯度为80% 的芦丁粗提物。芦丁单体的制备将体积比为1 : 20 : 0.5 : 18的正庚烷-乙酸丙酯-丙酮-水混溶于分液漏斗中，摇匀后静置分层，取其上层溶液(上相)为固定相，下层溶液(下相)为流动相。使用半制备型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，20ml进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为 240ml， 8823A-UV紫外检测器，Yokogawa3057便携式记录仪。进样前，先用固定相充满整个 柱子，调整主机转速为800卬m,以2.0ml/min的流速将流动相泵入柱内，待整个体系建立动 态平衡后，由进样阀进样，样品浓度为10mg/ml，进样量为20ml。根据紫外检测器检测的谱 图，接收目标成分。将多次精制得到的芦丁组分合并，冷冻干燥，得到黄色粉末，经HPLC分 析，其纯度达到98%以上。实施例5采用甲基叔丁基醚-四氢呋喃-乙腈-水体系，以芦丁含量为20%的沙棘提取物为原料制备 纯度高于98%的芦丁单体。戸丁粗提物的制备以大孔树脂填料D-16装柱，乙醇、水为流动相进行梯度洗脱，每 10min接收一个样品，用HPLC分析，将芦丁的组分收集到一起，蒸干溶剂，得到纯度为80 %的戸丁粗提物。戸丁单体的制备将体积比为1 : 10 : 0. 5 : 12的甲基叔丁基醚一 四氢呋喃一乙腈一水混 溶于分液漏斗中，摇匀后静置分层，取其上层溶液(上相)为固定相，下层溶液(下相)为流动相。使用半制备型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，20ml进样阀，聚四氟乙烯柱，柱 容积为240ml， 8823A-UV紫外检测器，Yokogawa3057便携式记录仪。进样前，先用固定相充 满整个柱子，调整主机转速为800rpm，以2. 0ml/min的流速将流动相泵入柱内，待整个体系 建立动态平衡后，由进样阀进样，样品浓度为10mg/ml，进样量为20ml。根据紫外检测器检 测的谱图，接收目标成分。将多次精制得到的芦丁组分合并，冷冻干燥，得到黄色粉末，经 HPLC分析，其纯度达到98%以上。实施例6采用乙酸正丁酯一叔丁醇一水体系，以芦丁含量为40%的槐花提取物为原料制备纯度高 于98%的卢丁单体。芦丁单体的制备将体积比为1 : 0.8 : 2.2的乙酸正丁酯一叔丁醇一水混溶于分液漏斗 中，摇匀后静置分层，取其上层溶液(上相)为固定相，下层溶液(下相)为流动相。使用 半制备型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，2ml进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为40ml,8823A-UV紫外检测器，Yokogawa3057便携式记录仪。进样前，先用固定相充满整个柱子，调 整主机转速为1800rpm，以1. 0ml/min的流速将流动相泵入柱内，待整个体系建立动态平衡 后，由进样阀进样，样品浓度为3mg/ml，进样量为2ml。根据紫外检测器检测的谱图，接收 目标成分。将多次精制得到的芦丁组分合并，冷冻干燥，得到黄色粉末，经HPLC分析，其纯 度达到98%以上。实施例7采用异丁醇一水体系，以80%的芦丁粗粉为原料制备纯度高于98%的芦丁单体。制得的单 体与实施例10中制得的单体合并后，进行标准样品的研制。芦丁单体的制备将体积比为1 : 0.9的异丁醇一水混溶于分液漏斗中，摇匀后静置分层， 取其上层溶液(上相)为固定相，下层溶液(下相)为流动相。使用半制备型高速逆流色谱 仪，配有NS-1007泵，20ml进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为240ml， 8823A-UV紫外检测器， Yokogawa3057便携式记录仪。进样前，先用固定相充满整个柱子，调整主机转速为800rpm， 以2.0ml/min的流速将流动相泵入柱内，待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样，样品 浓度为10mg/ml，进样量为20ml。根据紫外检测器检测的谱图，接收目标成分。将多次精制 得到的芦丁组分合并，冷冻干燥，得到黄色粉末，经HPLC分析，其纯度达到98%以上。实施例8采用乙酸乙酯-正丁醇-水体系，以90%的戸丁粗粉为原料制备纯度高于98%的芦丁单体， 并进行标准样品的研制。芦丁单体的制备将体积比为1:1:2的乙酸乙酯-正丁醇-水混溶于分液漏斗中，摇匀 后静置分层，取其上层溶液(上相)为固定相，下层溶液(下相)为流动相。使用半制备型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，20ml进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为240ml， 8823A-UV 紫外检测器，Yokogawa3057便携式记录仪。进样前，先用固定相充满整个柱子，调整主机转 速为800rpm，以2. Oml/min的流速将流动相泵入柱内，待整个体系建立动态平衡后，由进样 阀进样，样品浓度为10mg/ml，进样量为10ml。根据紫外检测器检测的谱图，接收目标成分。 将多次精制得到的芦丁组分合并，冷冻干燥，得到黄色粉末，经HPLC分析，其纯度达到98% 以上。卢丁标准样品的研制将制得的芦丁高纯度单体进行定性检测分别用红外、紫外、核 磁、质谱检测，所得数据与文献值比较，证明所得样品为芦丁；均匀性检验证明该样品是均 匀的；稳定性检验证明该样品在一年内稳定；6家实验室联合定值，结果该样品的标准值为 99.59%，置信度为95%的不确定度为0. 04%。该芦丁标准样品及其研制过程可以符合国家标准 样品的相关规定。
权利要求
1.一种采用高速逆流色谱法制备高纯度芦丁单体和芦丁标准样品的方法，其特征在于选用的溶剂体系是一号溶剂体系A组分为烷烃或/和醚类，B组分为呋喃类或/和脂肪酯，C组分为腈类、脂肪醇或/和脂肪酮，D组分为纯水或以酸、碱调节pH值在1-11的水溶液，A、B、C、D的体积比为1∶0.1-20∶0.1-20∶0.1-20；或二号溶剂体系A组分为呋喃类或/和脂肪酯，B组分为腈类、脂肪醇或/和脂肪酮，C组分为纯水或以酸、碱调节pH值在1-11的水溶液，A、B、C的体积比为1∶0.01-20∶0.1-20；或三号溶剂体系A组分为腈类、脂肪醇或/和脂肪酮，B组分为纯水或以酸、碱调节pH值在1-11的水溶液，A、B的体积比为1∶0.1-20。
2. 根据权利要求1所述的采用高速逆流色谱法制备高纯度芦丁单体的方法，其特征在于.-垸烃包括正庚垸、正己烷、环己垸、辛烷或/和癸烷的一种或几种的混合。
3. 根据权利要求1所述的采用高速逆流色谱法制备高纯度芦丁单体的方法，其特征在于 醚类包括乙醚、石油醚或/和甲基叔丁基醚的一种或几种的混合。
4. 根据权利要求1所述的采用高速逆流色谱法制备高纯度芦丁单体的方法，其特征在于腈类、脂肪醇或/和脂肪酮包括乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、 丙酮、甲基乙基酮或/和环己酮的一种或几种的混合。
5. 根据权利要求1所述的采用高速逆流色谱法制备高纯度芦丁单体的方法，其特征在于呋喃类或/和脂肪酯包括四氢呋喃、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异丙酯、乙酸正丁酯的一种或 几种的混合。
全文摘要
本发明为一种制备高纯度芦丁单体及芦丁标准样品的方法。本发明涉及一种采用高速逆流色谱法从含芦丁的天然产物或其提取物、芦丁粗粉中分离精制高纯度的芦丁单体化合物的方法。所制得的芦丁单体化合物可用于芦丁标准样品的研制。其特点是采用含水、多元有机溶剂体系，利用高速逆流色谱无不可逆吸附、回收率高、分离效率高的特点，分离精制含芦丁的天然产物或其提取物，制备达克量级、纯度98％以上的芦丁单体，该单体可满足芦丁标准样品研制的需要。
文档编号C07H1/08GK101260132SQ20081000792
公开日2008年9月10日 申请日期2008年2月20日 优先权日2008年2月20日
发明者刘庆辉, 钱渊华, 笑 韩 申请人:北京天宝物华生物技术有限公司