专利名称：弗氏链霉菌变种gb-2生产西索霉素的方法
技术领域：
本发明为一种弗氏链霉菌变种GB-2生产西索霉素的方法，属于微生物发酵技术领 域，专用于弗氏链霉菌变种GB-2产生西索霉素的微生物发酵和分离鉴定。
二背景技术：
放线菌中的小单孢菌属微生物能产生许多重要的氨基糖苷类抗生素，如庆大霉素， 西索霉素(Sisomicin)等。而西索霉素可由玫瑰小单 包菌(M/crawo"as^ora m^a,和伊纽 小单孢菌产生(M/crawo"o^wra/"yoe似zX)。西索霉素是一种氨基糖苷类广谱抗生素，是 氨基糖苷类抗生素中副作用最小,抗绿脓杆菌最强，抗钝化酶能力最广的抗生素。目前， 国内外还没有报道除上述的其他菌种可以产西索霉素。本课题组从海洋中筛选出了一 株具有广谱抗菌活性的海洋链霉菌GB-2 (刘姝等，南京农业大学学报，2007， 4: 124 一129)，并通过生理生化特性、细胞壁化学组分分析和分子生物学法鉴定，确定菌株 GB-2为链霉菌属弗氏链霉菌变种(Sy"/^omyc^/ra^"e)。通过对弗氏链霉菌变种所产
生的抗细菌物质进行分离纯化，并对其结构鉴定，最终确定为西索霉素。这也是首次 在非小单孢菌属微生物属的菌株中得到西索霉素，具有非常重大的意义。
西索霉素(Lee B K, et al. J Antibiot， 1976, 29(7):677-684; Reimann H, et al. J Org chem., 1874， 39(11):1451-1457)被誉为第三代氨基糖苷类抗生素，是氨基糖苷类抗生素 中副作用最小，抗菌谱最广的抗生素。本发明首次在链霉菌中发现产生西索霉素，为以 后进一步生产提供了理论依据。
三
发明内容
技术问题本发明目的在于提供新的弗氏链霉菌变种GB-2菌株产生西索霉素的 微生物发酵和分离鉴定方法。 技术方案
1、弗氏链霉菌变种GB-2生产西索霉素的微生物发酵方法，包括
1) 发酵培养液配制可溶性淀粉2.0g，黄豆粉1.5g，葡萄糖0.5g，酵母膏0.25g， CaCO30.1g，人工海水lOOOmL， pH7.5;
2) 将弗氏链霉菌变种GB-2的菌悬液按体积比10%的接种量接种于上述发酵培养液 中，于28°C 180 r.min-1培养7d;
3) 收集发酵液，5000 rmin—1离心15 min;
4) 过0.45pm滤膜后的发酵上清液即为所获得的含西索霉素产品。 2、弗氏链霉菌变种GB-2生产西索霉素的分离方法，包括
1) 取1L上述所获得的含西索霉素产品，首先用孔径为O.lnm的膜对发酵液进行 分离，收集所得截留液和透过液；再将透过液经过截留分子量为50KDa的超滤膜进一 步分离，随后按照同样方法分别采用30KDa、 lOKDa、 3KDa、 lKDa的超滤膜继续进 行逐级分离；
2) 将超滤所得的《lKDa的透过液以1 : 1的比例加入乙酸乙酯，200 r'tnin—1振荡 2h，静置过夜分层，弃去上层有机相，同样的方法再用正已烷萃取，弃去上层有机相， 如此重复3次，然后以旋转蒸发仪浓縮获得经预处理的《lKDa浓縮液；
3) 将经预处理的《lKDa浓縮液上Sephadex LH-20，以lmL上样体积进行凝胶层 析，洗脱液为甲醇水=3 : 7，流速为15mL七—1，收集液并测抑菌活性，得到两个抗菌 组分，选择抑菌效果最好的组分l;
4) 西索霉素高效液相色谱分析HPLC纯化 柱类型及规格Agilent Cl8反相色谱柱，ODS-①4.6x250mm;
流动相乙腈A—色谱纯，去离子水B—加入0.02mmd三氟乙酸，使用前经 5-10min超声波脱气；
洗脱条件0 30min;乙腈A:体积比15%;去离子水B:体积比85%;流速
0.20mL/min;检测波长220nm;进样量20pL;
步骤3)所获得的LH-20组分1浓縮液样品为和去离子水B上柱前经0.45pm纤维 素微孔滤膜过滤，乙腈A上柱前经0.22pm尼龙微孔滤膜过滤；
测定LH-20组分l浓縮液的HPLC色谱图，得到两个峰，收集收集有抑菌效果的 第二个峰即为西索霉素产品。
有益效果
本发明首次从弗氏链霉菌变种所产生的抗细菌物质中分离纯化并鉴定得到一种氨 基糖苷类抗生素---西索霉素。弗氏链霉菌变种GB-2产生的广谱抗菌物质，经过ESI-MS 鉴定其分子量为w/z 447.7。氨基糖苷类抗生素中的西索霉素的分子量与其吻合。并通 过二级质谱，最终确定其为西索霉素。
之前的报道显示，西索霉素可由玫瑰小单孢菌(Mkrowo"oy/wra raye^和伊纽小单 孢菌产生(M/cTowo"owora/w少omwX)。目前，国内外还没有报道有其他菌种可以产西索 霉素。这也是首次在非小单孢菌属微生物属的菌株中得到西索霉素，具有非常重大的 意义。西索霉素(Lee B K, et al. J Antibiot， 1976, 29(7):677-684; Reimann H, et al. J Org chem.， 1874, 39(11):1451-1457)被誉为第三代氨基糖苷类抗生素,是氨基糖苷类抗生素 中副作用最小，抗绿脓杆菌最强,抗钝化酶能力最广，抗菌谱最广的抗生素.。有潜在的
市场应用前景。
本发明通过对弗氏链霉菌变种GB-2的发酵液中抗菌物质进行超滤以及Sephadex LH-20色谱柱分离后，再经过高效液相色谱(HPLC)纯化，在图谱上出现2个峰，其 中第2个峰具有抑菌活性，表明该物质得到了纯化。对此峰进行了液质联用分析以及 全扫描二级质谱分析确定此抗菌物质为西索霉素。此分离纯化及结构鉴定方法的优点 在于快捷且准确，对于分离一种未知的物质有着很大的优势，也为实验节省了大量时 间和金钱。本发明提供了新的弗氏链霉菌变种GB-2菌株产生西索霉素的微生物发酵和 分离鉴定方法。很具有参考价值。
四
图1弗氏链霉菌变种GB-2抗菌物质高效液相色谱分析(HPLC) 图2弗氏链霉菌变种GB-2抗菌物质对大肠杆菌的抑菌效果 图3弗氏链霉菌变种GB-2抗菌物质对蜡样芽孢杆菌的抑菌效果 图4弗氏链霉菌变种GB-2抗菌物质西索霉素的ESI-MS图 图5弗氏链霉菌变种GB-2抗菌物质西索霉素的ESI-MS/MS图 图6西索霉素的结构图
五具体实施例方式
弗氏链霉菌变种GB-2产生西索霉素的发酵和分离鉴定方法如下
1) 弗氏链霉菌变种GB-2产生西索霉素的发酵
将弗氏链霉菌GB-2 (刘姝等，南京农业大学学报，2007， 4: 124—129)接种于 高氏合成一号培养基(Zheng Z H,et al. FEMS Microbiol Lett，2000,188:67-91)斜面上，28 'C培养7d。取新鲜培养的GB-2斜面用50mL含玻璃珠的无菌水洗下孢子，180 rmin—1 振荡20min，制成菌悬液。将菌悬液按10%的接种量接种于发酵培养液(黄豆粉培养 基可溶性淀粉2.0g，黄豆粉1.5g，葡萄糖0.5g，酵母膏0.25g， CaCO30.1g， 人工海水1000mL， pH7.5)中，于28°C180 r'min—1培养7d。收集发酵液，5000r'min—1 离心15 min，除去菌体和较大固形物，上清液过0.45pm滤膜后即为所需的发酵上清 液。
2) 弗氏链霉菌变种GB-2产生西索霉素的分离
①取1L发酵上清液，首先用孔径为0.1pm的膜对发酵液进行分离，收集所得截留液 和透过液。再将透过液经过截留分子量为50KDa的超滤膜进一步分离，随后按照同样 方法分别采用30KDa、 10KDa、 3KDa、 lKDa的超滤膜继续进行逐级分离，发酵上清
液被分为7个组分。收集到的超滤片段经真空浓縮后，定容至1L，采用管碟法检测各 个片段的抑菌活性，每个牛津杯中加入200pL滤液。以蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌为指 示菌。细菌于37'C培养24h，用游标卡尺测量抑菌圈直径并记录抑菌结果，以抑菌圈 的直径表示各个超滤片段的抗菌活性。结果表明链霉菌GB-2产生的抗细菌物质能通过 截留分子量(COMW)为lKDa的膜，所以该抗菌物质的分子量比较小，并且超滤组 分vn对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌都有很好的抑制作用。
将超滤所得的《lKDa的透过液用pH为4的盐酸试剂处理，再经过12h处理将透 过液中的蛋白质类物质变性沉淀。最后将透过液的pH调回原来的7.0。经抑菌活性实 验，证明透过液有很好的抑菌活性。通过对抗菌物质溶解性的测定，可推知链霉菌GB-2 所产抗细菌物质是极性较大且水溶性的物质，因此把经过酸沉实验的超滤收集液(《 lKDa)中以1 : 1的比例加入乙酸乙酯，200r'min—1振荡2h，静置过夜分层，弃去上层 有机相，同样的方法再用正已烷萃取，弃去上层有机相，如此重复3次，这样可以除 去了滤液中大部分的脂溶性物质及杂质。然后以旋转蒸发仪浓縮。经抑菌活性实验， 证明萃取后的超滤收集液有很好的抑菌活性。
② 将经预处理的浓縮液(《1KDa)上Sephadex LH-20 (柱床02.6xl00cm)，以lmL 上样体积进行凝胶层析。洗脱液为甲醇水=3 : 7，流速为15mL七—1，每管收集3mL， 共收集70管。并测抑菌活性。得到两个抗菌组分，其中组分l的抑菌效果最好。
③ 西索霉素高效液相色谱分析(HPLC)
HPLC条件柱类型及规格Agilent C18反相色谱柱，ODS-O4.6x250mm;流动 相乙腈(A)(色谱纯)，去离子水(B)加入0.02mmo1三氟乙酸，使用前经5 10min 超声波脱气；洗脱条件0 30min A:15% B:85%;流速0.20mL/min;检测波长220nm; 进样量20nL。样品和去离子水(B)上柱前经0.45nm纤维素微孔滤膜过滤。乙腈(A) (色谱纯)上柱前经0.22pm尼龙微孔滤膜过滤。测定LH-20组分1的浓縮液的HPLC 色谱图。得到两个峰，分别测定其抑菌效果可知第二个峰的抑菌效果明显，而第一个 峰没有抑菌效果。收集第二个峰。 3)弗氏链霉菌变种GB-2产生西索霉素的鉴定
利用ESI-MS (电喷雾电离质谱)测定HPLC色谱图第二个峰的分子量和结构。采 用配备了电喷雾离子源的LCQDECAXP PLUS Thermo Finnigan液质联用设备(Thermo Corporation, USA)。电喷雾源操作电压为4.5KV，操作温度为300°C。负离子方式检 测,CID实验采用氦气作为碰撞气体。接着，电喷雾电离/诱导碰撞解离二级质谱采用配备了电喷雾离子源的Agilent1100 质谱仪来进一步鉴定西索霉素的分子量和结构。电喷雾源操作电压为3.5KV，操作温 度为300。C。 CID实验采用氮气作为碰撞气体。离子扫描范围100-1000m/z;负离子 方式检测，采用离子全扫描二级质谱(FullscanMS2)
弗氏链霉菌变种GB-2产生西索霉素分子量和结构鉴定
首先，图5中呈现出在保留时间RT为9.56min时，m/z 447.7片断为该物质的[M]—， M为447.7。通过査阅文献可知，氨基糖苷类抗生素中的西索霉素的分子量与其吻合。 故初步断定其为西索霉素。
接着，假定M为西索霉素，通过对抗菌物质的二级质谱进一步分析。从图6可知， 观测的质核比和对应的片断类型分别为w/z 447.2为M; w々428.6为M-H20 ; w/z411.2 为M-H20-NH3 ; w/z288.2为BC; m/z 253.1为BC-2NH3 。而通过计算得到的质核比 分别为447.2; 429.1; 412.2; 288.0; 254.0 。通过二级质谱，可以确定此抗细菌物质 是西索霉素。见表l。
表l wA447.2各二级离子片断的信号强度
观测的质核比提出的片断类型 计算的质核比
447.2 网— 447.2
428.6 [M-H2Or 429.1
411.2 [M-H20-NH3]- 412.2
288.2 [BCy 288.0
253.1 [BC-2NH3]- 254.0
权利要求
1、弗氏链霉菌变种GB-2生产西索霉素的微生物发酵方法，包括1)发酵培养液配制可溶性淀粉2.0g，黄豆粉1.5g，葡萄糖0.5g，酵母膏0.25g，CaCO30.1g，人工海水1000mL，pH 7.5；2)将弗氏链霉菌变种GB-2的菌悬液按体积比10％的接种量接种于上述发酵培养液中，于28℃180r.min-1培养7d；3)收集发酵液，5000r.min-1离心15min；4)过0.45μm滤膜后的发酵上清液即为所获得的含西索霉素产品。
2、 权利要求l所述方法所获得的含西索霉素产品。
3、 弗氏链霉菌变种GB-2生产西索霉素的分离方法，包括1) 取1L权利要求1所获得的含西索霉素产品，首先用孔径为O.lpm的膜对发酵 液进行分离，收集所得截留液和透过液；再将透过液经过截留分子量为50KDa的超滤 膜进一步分离，随后按照同样方法分别采用30KDa、 10KDa、 3KDa、 lKDa的超滤膜 继续进行逐级分离；2) 将超滤所得的《lKDa的透过液以体积比1 : 1的比例加入乙酸乙酯，200r'min" 振荡2h，静置过夜分层，弃去上层有机相，同样的方法再用正己烷萃取，弃去上层有 机相，如此重复3次，然后以旋转蒸发仪浓縮获得经预处理的《lKDa浓縮液；3) 将经预处理的《lKDa浓縮液上Sephadex LH-20，以lmL上样体积进行凝胶层 析，洗脱液为体积比甲醇水=3 : 7，流速为15mL七—、收集液并测抑菌活性，得到两 个抗菌组分，选择抑菌效果最好的组分l;4) 西索霉素高效液相色谱分析HPLC纯化 柱类型及规格Agilent Cl8反相色谱柱，ODS-O4.6x250mm;流动相乙腈A—色谱纯，去离子水B—加入0.02mmo1三氟乙酸，使用前经 5 10min超声波脱气；洗脱条件时间0 30min;乙腈A:体积比15%;去离子水B:体积比85%;流 速0.20mL/min;检测波长220nm;进样量20pL;步骤3)所获得的LH-20组分1浓縮液样品和去离子水B上柱前经0.45pm纤维素 微孔滤膜过滤，乙腈A上柱前经0.22pm尼龙微孔滤膜过滤；测定LH-20组分l浓縮液的HPLC色谱图，得到两个峰，收集有抑菌效果的第二 个峰即为西索霉素产品。
4、 权利要求3所述方法所获得的西索霉素产品。
全文摘要
本发明为一种弗氏链霉菌变种GB-2生产西索霉素的方法，属于微生物发酵技术领域。将菌种GB-2接种于发酵培养液，28℃180r·min<sup>-1</sup>培养7d；离心，上清液超滤所得的≤1KDa的透过液经预处理；上Sephadex LH-20柱，收集液并测抑菌活性，再进行高效液相色谱分析HPLC纯化后收集第二个峰即为西索霉素产品。经过ESI-MS鉴定其分子量为m/z 447.7，通过二级质谱，确其为西索霉素。本发明首次在放线菌链霉菌属的弗式链霉菌中得到西索霉素。西索霉素被誉为第三代氨基糖苷类抗生素，是氨基糖苷类抗生素中副作用最小，抗绿脓杆菌最强，抗钝化酶能力最广，抗菌谱最广的抗生素，有潜在的市场应用前景。
文档编号C07H1/00GK101338334SQ20081002169
公开日2009年1月7日 申请日期2008年8月13日 优先权日2008年8月13日
发明者姝 刘, 别小妹, 吕凤霞, 昕 董, 陆颖健 申请人:南京农业大学