专利名称：一种邻苯二甲酸二辛酯人工抗原的制备方法
一种邻苯二甲酸二辛酯人工抗原的制备方法技术领域一种邻苯二甲酸二辛酯人工抗原的制备方法，属于生物化工技术领域。
技术背景邻苯二甲酸二辛酯(Dioctylphthalate， DOP)是酞酸酯的一种。酞酸酯作为增 塑剂在塑料的加工生产中尤其是聚氯乙烯(PVC)的加工生产中被广泛的使用。由 于酞酸酯增塑剂与塑料基质之间没有形成共价键，而是以氢键和范德华力连接， 彼此保持各自独立的化学性质，因而在接触到包装食品中所含的水、油脂时， 便会溶出。经过研究发现，酞酸酯是一种环境激素物质，它干扰生物为保持体 内平衡并调节生长过程的正常激素的产生、释放、转移、代谢、反应和消除， 或在未受损的生物后代中引起不良的健康影响和内分泌功能的改变。美国环保 局将六种酞酸酯列入重点控制的污染物名单中，我国优先污染物黑名单中包括 邻苯二甲酸二辛酯。目前，国内外有关邻苯二甲酸二辛酯的检测主要采用高效 液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、气-质联用法(GC-MS)、液-质联用法(LC -MS)等，这些方法虽然灵敏但其需要昂贵的仪器设备，专业的操作人员，对检 材的要求也比较高，并且需要进一步的样本前处理才能进行，这已经不能达到 现代检测对快速、方便、准确的要求。近年来，国内外已经开展了对酞酸酯类 免疫分析方法的研究，但国内外尚没有针对邻苯二甲酸二辛酯的酶联免疫检测 的报道，为了弥补这一空白，有必要制备邻苯二甲酸二辛酯人工抗原。 发明内容本发明的目的是提供一种邻苯二甲酸二辛酯人工抗原的制备方法，所制备 的产品可用于邻苯二甲酸二辛酯免疫分析方法的研究，为今后人们的研究提供 了方便的途径。本发明的技术方案第一步为半抗原的制备及检测，以4-硝基邻苯二甲酸为原料，在浓硫酸的催化下与正辛醇发生酯化反应，然后利用铁粉还原法使4-硝基邻苯二甲酸二辛酯苯环上的硝基还原为胺基；第二步为人工抗原的制备及检测，利用重氮化法对胺基进行重氮化并使之与牛血清蛋白(BSA)结合，制 备邻苯二甲酸二辛酯的人工抗原。其反应方程式为<formula>formula see original document page 31</formula>(1) 人工半抗原的制备① 4-硝基邻苯二甲酸二辛酯的合成称取0.12mol的4-硝基邻苯二甲酸于lOOmL的三颈烧瓶中，加入O.lmol 即15.74mL的正辛醇，加入一定量的苯助溶，在搅拌的条件下，缓慢加入1.6mL 的浓硫酸，加热升温至110-13(TC，反应7-24h，减压蒸去有机溶剂，油状残留 加入到冷水中用质量浓度10。/。的Na2C03溶液洗至下层水层无色，取上层得到 暗红色的油状粗品，用无水乙醇进行重结晶，得到45mmol的4-硝基邻苯二甲 酸二辛酯；薄层层析法检测硅胶薄板下端lcm处作一水平线，吸取反应液1^L点 于线上，点样结束后吹干，将薄板放入层析缸中，层析液为乙酸正己垸体积 比为1 : 15，展开至薄板3/4处，取板，吹干溶剂；将薄板置于紫外分析仪中， 在254nm波长观察，在Rf为0.74处观察到显色点作为反应终点；② 4-氨基邻苯二甲酸二辛酯的合成称取9mmo1还原铁粉于50mL圆底烧瓶中，加入10mL水、3mmo1氯化铵， 水浴中加热15min;另称取4-硝基邻苯二甲酸二辛酯3mmo1，用一定量的甲醇 溶解后，分3次加入上述的反应液当中，回流反应4-6h;趁热过滤铁粉，将滤 液进行减压蒸馏，得到的橙红色残留用少量热甲醇溶液溶解，低温析出 1.17mmd橘红色油状液体的4-氨基邻苯二甲酸二辛酯作为半抗原备用；薄层层析法检测硅胶薄板下端lcm处作一水平线，吸取反应液1mL点 于线上，点样结束后吹干，将薄板放入层析缸中，层析液为乙酸正己烷体积 比为l : 15，展开至薄板3/4处，取板，吹干溶剂；将薄板置于紫外分析仪中， 在254nm波长观察，在Rf为0.52处观察到显色点作为反应终点；(2) 人工抗原的制备①制备A液取0.023mmol半抗原于25mL烧杯中，加入2mL二甲基甲 酰胺、0.2mL水和0.2mL的lmol/L盐酸，形成黄色溶液，冷却至0-5'C，然后逐步滴加lmol/L亚硝酸钠溶液，用淀粉碘化钾试纸监测，直到试纸变蓝灰色 停止滴加，4'C下搅拌lh，此液为A液；② 制备B液称取150mg的牛血清蛋白溶于6mL的pH9.0硼酸盐缓冲 液，4'C保存，此液为B液；③ 在4"C搅拌下，将A液逐滴地滴加到B液中，并用lmol/L的氢氧化钠 溶液调节pH，使pH保持在9， 4'C下，搅拌过夜，即得到人工抗原混合液；④ 将人工抗原混合液移入透析袋中，用6xlL的去离子水透析4-6天；最 后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原邻苯二甲酸二辛 酯-牛血清蛋白。透析袋前处理取10cm的透析袋，煮沸5min，再用6(TC的去离子水冲 洗3min，保存在4'C去离子水中备用。(3)邻苯二甲酸二辛酯人工抗原的鉴定测定偶联物的蛋白浓度和偶联比。偶联物蛋白浓度测定配制浓度为0， 40， 60， 80， 100， 120， 160， 200吗'mU1 的牛血清蛋白溶液各1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30°C 水浴温热5分钟，每个浓度做平行样.在595nm处测吸光值，绘制蛋白浓度 与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例稀释，在595nm处测定抗原溶 液的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。本实验计算得偶联物 蛋白浓度为7.67mg-ml/1。偶联比测定采用分光光度法测定偶联比。分光光度法是利用物质对光的 吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度，在大分子与小分子偶联物中，两种分子有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加 的性质。摩尔吸收系数s:配制4-氨基邻苯二甲酸二辛酯浓度为0，10，20，30吗，m1/1 的20%乙醇溶液，通过紫外扫描可知4-氨基邻苯二甲酸二辛酯的最大吸收波长 为288nm，在288nm处测吸光值，每个浓度做平行样.摩尔吸光系数计算为 s-吸光值/摩尔浓度。本实验计算得s=16048.56 Lmor1。偶联比测定配制150 ^mL"牛血清蛋白的20。/。乙醇溶液，将偶联产物 用20°/。乙醇稀释到150吗'm!/1，在288nm处测吸光值，以20°/。乙醇为空白， 测出的光值分别为A,， A2，则偶联比率r为r = [U -4)/e]/(150xl(T3/66200)， 本实验计算得Pl8。其中s为摩尔吸光系数(L'mor1)， 66200为牛血清蛋白的分子量，150xl(T3 为牛血清蛋白浓度(^ml/1)。本发明的有益效果本发明合成了邻苯二甲酸二辛酯的人工抗原，合成步 骤简洁，有效，完全可用于免疫分析，为以后的研究提供了方便，可满足国内 对其研究的需要。
图l4-硝基邻苯二.甲酸」二辛酯的液相色谱图。图24-硝基邻苯二.甲酸」二辛酯的质谱图。图34-硝基邻苯二.甲酸:二辛酯的紫外图。图44-氨基邻苯二.甲酸」二辛酯的液相色谱图。图54-氨基邻苯二.甲酸」二辛酯的质谱图。图64-氨基邻苯二.甲酸」二辛酯的紫外图。
具体实施方式
(1) 人工半抗原的制备① 4-硝基邻苯二甲酸二辛酯的合成称取0.12mol的4-硝基邻苯二甲酸于100mL的三颈烧瓶中，加入 0.1mol(15.74ml)的正辛醇，加入一定量的苯助溶，在搅拌的条件下，缓慢加入 1.6mL的浓硫酸，加热升温至110-130'C,反应7-24h，减压蒸去有机溶剂，油 状残留加入到冷水中用质量浓度10。/。的Na2C03溶液洗至下层水层无色，得到 暗红色的油状粗品，用无水乙醇进行重结晶，得到45mmol的4-硝基邻苯二甲 酸二辛酯。硅胶薄层板的制作称取硅胶12g，溶解在40mL0.5。/。质量浓度的羟甲基 纤维素钠溶液中，用玻璃棒充分搅拌成糊状，超声波振荡l分钟，均匀涂布在 玻璃板上，置于阴凉处自然干燥后，放入105'C的烘箱中活化lh，最后放入干 燥箱中备用。薄层层析法检测硅胶薄板下端lcm处作一水平线，吸取反应液l(iL点 于线上，点样结束后吹干，薄板放入层析缸中，层析液为乙酸正己垸体积比 为1 : 15，展开至薄板3/4处，取板吹干溶剂。将薄板置于紫外分析仪中，254nm 波长观察，在Rf为0.74处观察到显色点且原点处无显色点作为反应终点。② 4-氨基邻苯二甲酸二辛酯的合成称取7mmo1还原铁粉于50mL圆底烧瓶中，加入2mL水、lmmol氯化铵， 水浴中加热15min。另取4-硝基邻苯二甲酸二辛酯1.4mmo1，用一定量的甲醇 溶解后，分3次加入上述的反应液当中，回流反应4-6h。趁热过滤铁粉，将滤 液进行减压蒸馏，得到的橙红色残留用少量热甲醇溶液溶解，低温析出 1.17mmol(0.47g)橘红色油状液体的4-氨基邻苯二甲酸二辛酯作为半抗原备用。薄层层析法检测硅胶薄板下端lcm处作一水平线，吸取反应液l)iL点 于线上，点样结束后吹干，将薄板放入层析缸中，层析液为乙酸正己垸体积 比为1 : 15，展开至薄板3/4处，取板，吹干溶剂。将薄板置于紫外分析仪中， 在254nm波长观察，在Rf为0.52处观察到显色点作为反应终点。(2) 人工抗原的制备① 制备A液取0.023mmol半抗原于25mL烧杯中，加入2mL二甲基甲 酰胺、0.2mL水和0.2mL的lmol/L盐酸，形成黄色溶液，冷却至0-5X:。然后 逐步滴加lmol/L亚硝酸钠溶液，用淀粉碘化钾试纸监测，直到试纸变蓝灰色 停止滴加，4'C下搅拌lh，此液为A液。② 制备B液称取150mg的牛血清蛋白溶于6mL的pH9.0硼酸盐缓冲 液，4'C保存。此液为B液。硼酸盐缓冲液0.2mol/L硼酸硼酸12.37g加水至1000mL， 0.05mol/L 硼砂硼砂19.07g加水至1000mL，将上述两溶液以体积比2:8的比例混合即 为pH9.0的硼酸盐缓冲液。③ 在4'C搅拌下，将A液逐滴地滴加到B液，并用lmol/L的氢氧化钠溶 液调节pH，使pH保持在9， 4'C条件下搅拌过夜，即得到人工抗原混合液。④ 将人工抗原混合液移入透析袋中，用6xlL的去离子水透析4-6天。最 后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原邻苯二甲酸二辛 酯-牛血清蛋白。透析袋前处理取10cm的透析袋，煮沸5min，再用6(TC的去离子水冲 洗3min，保存在4"C去离子水中备用。(3)邻苯二甲酸二辛酯人工抗原的鉴定测定偶联物的蛋白浓度和偶联比。偶联物蛋白浓度测定配制浓度为0， 40， 60， 80， 100， 120， 160， 200吗'mr1 的牛血清蛋白溶液1.5ml，加入5ml考马斯亮蓝染色液，立即混匀，3(TC水浴 温热5分钟，每个浓度做平行样.在595nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸 光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例稀释，在595nm处测定抗原溶液的 吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。本实验计算得抗原溶液的 蛋白浓度为7.67mg.mr1。偶联比测定用分光光度法测定偶联比。分光光度法用物质对光的吸收与 其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度，在大分子与小分子 偶联物中，两种分子有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。摩尔吸收系数s:配制4-氨基邻苯二甲酸二辛酯浓度为0， 10， 20， 30吗'mr1 的20%乙醇溶液，通过紫外扫描可知4-氨基邻苯二甲酸二辛酯的最大吸收波长 为288nm，在288nm处测吸光值，每个浓度做平行样.摩尔吸光系数计算为 ￡=吸光值/摩尔浓度。本实验计算得s=16048.56 LTno1-1。偶联比测定配制150吸ml"牛血清蛋白的20Q/。乙醇溶液，将偶联产物用 20%乙醇稀释到150吗.mr1，在288nm处测吸光值，以20%乙醇为空白，测出 的吸光值为A1， A2，则偶联比率r为r = 4)/e]/(150x10-3/66200)，本实 验计算得p18。其中s为摩尔吸光系数(Irmor1)， 66200为牛血清蛋白的分 子量，150><10-3为牛血清蛋白浓度(吗-mr1)。
权利要求
1.一种邻苯二甲酸二辛酯人工抗原的制备方法，其特征是以4-硝基邻苯二甲酸为原料，在浓硫酸的催化下与正辛醇发生酯化反应，然后利用铁粉还原法使4-硝基邻苯二甲酸二辛酯苯环上的硝基还原为胺基，制备半抗原；利用重氮化法对半抗原上的胺基进行重氮化并使之与牛血清蛋白结合，制备邻苯二甲酸二辛酯的人工抗原，即邻苯二甲酸二辛酯-牛血清蛋白；步骤为(1)人工半抗原的制备①4-硝基邻苯二甲酸二辛酯的合成称取0.12mol的4-硝基邻苯二甲酸于100mL的三颈烧瓶中，加入0.1mol即15.74mL的正辛醇，加入一定量的苯助溶，在搅拌的条件下，缓慢加入1.6mL的浓硫酸，加热升温至110-130℃，反应7-24h，减压蒸去有机溶剂，油状残留加入到冷水中用质量浓度10％的Na2CO3溶液洗至下层水层无色，取上层得到暗红色的油状粗品，用无水乙醇进行重结晶，得到45mmol的4-硝基邻苯二甲酸二辛酯；薄层层析法检测硅胶薄板下端1cm处作一水平线，吸取反应液1μL点于线上，点样结束后吹干，将薄板放入层析缸中，层析液为乙酸∶正己烷体积比为1∶15，展开至薄板3/4处，取板，吹干溶剂；将薄板置于紫外分析仪中，在254nm波长观察，在Rf为0.74处观察到显色点作为反应终点；②4-氨基邻苯二甲酸二辛酯的合成称取9mmol还原铁粉于50mL圆底烧瓶中，加入10mL水、3mmol氯化铵，水浴中加热15min；另称取4-硝基邻苯二甲酸二辛酯3mmol，用一定量的甲醇溶解后，分3次加入上述的反应液当中，回流反应4-6h；趁热过滤铁粉，将滤液进行减压蒸馏，得到的橙红色残留用少量热甲醇溶液溶解，低温析出1.17mmol橘红色油状液体的4-氨基邻苯二甲酸二辛酯作为半抗原备用；薄层层析法检测硅胶薄板下端1cm处作一水平线，吸取反应液1μL点于线上，点样结束后吹干，将薄板放入层析缸中，层析液为乙酸∶正己烷体积比为1∶15，展开至薄板3/4处，取板，吹干溶剂；将薄板置于紫外分析仪中，在254nm波长观察，在Rf为0.52处观察到显色点作为反应终点；(2)人工抗原的制备①制备A液取0.023mmol半抗原于25mL烧杯中，加入2mL二甲基甲酰胺、0.2mL水和0.2mL的1mol/L盐酸，形成黄色溶液，冷却至0-5℃，然后逐步滴加1mol/L亚硝酸钠溶液，用淀粉碘化钾试纸监测，直到试纸变蓝灰色停止滴加，4℃下搅拌1h，此液为A液；②制备B液称取150mg的牛血清蛋白溶于6mL的pH 9.0硼酸盐缓冲液，4℃保存，此液为B液；③在4℃搅拌下，将A液逐滴地滴加到B液中，并用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH，使pH保持在9，4℃下，搅拌过夜，即得到人工抗原混合液；④将人工抗原混合液移入透析袋中，用6×1L的去离子水透析4-6天；最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原邻苯二甲酸二辛酯-牛血清蛋白。
全文摘要
一种邻苯二甲酸二辛酯人工抗原的制备方法，属于生物化工技术领域。本发明以4-硝基邻苯二甲酸为原料，在浓硫酸的催化下与正辛醇发生酯化反应，然后利用铁粉还原法使4-硝基邻苯二甲酸二辛酯苯环上的硝基还原为胺基，制备半抗原；利用重氮化法对半抗原上的胺基进行重氮化并使之与牛血清蛋白结合，制备邻苯二甲酸二辛酯的人工抗原，即邻苯二甲酸二辛酯-牛血清蛋白；本发明合成了邻苯二甲酸二辛酯的人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析，为以后的研究提供了方便，可满足国内对其研究的需要。
文档编号C07K14/435GK101328204SQ20081002224
公开日2008年12月24日 申请日期2008年6月27日 优先权日2008年6月27日
发明者彭池方, 徐丽广, 李灼坤, 胥传来, 伟 陈, 伟 马 申请人:江南大学