专利名称：牛肝金属硫蛋白的提取方法
技术领域：
本发明涉及一种金属硫蛋白的制取方法，尤指一种牛肝金属 硫蛋白的提取方法。
背景技术：
金属硫蛋白是一种重要的生物活性物质，具有广泛的生理学 和生物学功能，尤以清除体内自由基、重金属解毒、抗氧化和抗 应激的作用甚大，因而作为食品以及美容化妆品的添加剂和某些 疾病的治疗药物在医学、食品加工、营养学等各个领域业已广泛 应用，并且可望在促进动物健康、提高畜产品产量、营养价值和 质量安全等方面发挥重要作用。
含有锌的金属硫蛋白(Zn-MT)是一种正四面体金属巯基螯合 族，结晶构相相当稳定，但它仍可通过提供Zn而激活许多以Zn 为辅基的酶。因此开展锌诱导金属硫蛋白合成的研究有着重要的 理论价值和广阔的应用前景。
市场上已有的产品多是从菌、蜗牛及兔肝内提取含有锌的的 金属硫蛋白，由于供体有限，且成本也高，不能满足国民经济发 展的需要。
由此可见，选择其它供体诱导合成金属硫蛋白，提高金属硫 蛋白产量，并降低其成本，显得十分必要和紧迫。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足， 提供一种牛肝金属硫蛋白的提取方法， 一种新金属硫蛋白的提取 途径，来提高金属硫蛋白的产量，降低成本。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是 一种 牛肝金属硫蛋白的提取方法，包括下列步骤
①诱导合成
选用健康的犊牛，用颈部肌肉注射ZnS04溶液进行5-7次剂量
4逐级递增的诱导合成金属硫蛋白，每次剂量为5-150mg/kg体重， 每隔ld诱导1次；
采用锌剂量逐渐递增的溶液对牛进行颈部肌肉注射诱导，开 始用低剂量的锌诱导只增强牛对锌的耐受性和适应性，当锌浓度 大幅度增加时，牛不会发生瘁死现象，从而激发了牛对金属硫蛋 白诱导合成的潜能，又保证了有充足的时间诱导金属硫蛋白的大 量合成。
② 定量检测
诱导完后的第1-3d将犊牛屠宰，取肝脏，将所取新鲜样品用 去离子水冲洗两次，洗净残血，直接用巯基显色法或间接竞争型 ELISA法对金属硫蛋白的含量进行检测，或用定量滤纸吸干后于 -20°。下冷冻保存待领"要求每lg牛肝中金属硫蛋白的含量^7mg。
③ 预处理与粗提
将检测合格的上述牛肝脏捣碎，用pH为8. 6的Tris-HCl溶液搅 拌匀浆，再加入500mLTris-HCl溶液和250mL体积比为1: 0.08的乙 醇-氯仿混合溶液，搅拌10min，冷冻离心，取上清液放入8(TC的 水浴锅内水浴5min，取出后迅速冷却至室温，再冷冻离心，离心 后的上清液即为金属硫蛋白粗提液，放置于4'C备用；离心温度为 4°C，转速为10000r/min，时间为20min。
④ 分离与纯化
按体积比为l: 3于金属硫蛋白粗提液中加入无水乙醇，4t:放 置过夜后离心，去上清液取沉淀物，再用O. lmol/L的NHJiC03溶液 完全溶解，之后滤纸过滤；用Sephedex G-100层析柱对滤液进行 层析，再用O. lmol/L NH4HC03进行洗脱，流速为20mL/min ，每5min 收集l管；收集完成后，分别于各试管中取5u l样品，各样品加入 10u 11. 2mol/L的盐酸后，再加入395 u l的巯基试剂，进行显色定 位；取显色最深的样品，在-8(TC下冷冻20 30h，得冻干粉即为 金属硫蛋白纯品；离心温度为4'C，转速为10000r/min，时间为 20min。 分装
将冻干粉分装待用。
本发明采用初生奶牛公犊作为供体，经微量元素锌颈部肌肉
注射诱导，5次诱导后宰杀，从牛的肝脏中分离提取一种具有稳定 性好，纯度高的金属硫蛋白。经锌诱导牛肝合成金属硫蛋白可达 到成本低、效果好、产量高、诱导剂来源广、无副作用等特点。 且牛是一种饲养非常普遍的动物，来源广，经诱导提取金属硫蛋 白后，牛肉可照常供食用，皮及其他副产品的价值也不受影响。 特别是奶牛公犊长大后不能产奶，且在育犊阶段要消耗大量牛奶， 所以一般奶牛场对奶牛公犊不进行饲喂，出生后即淘汰或以低价 处理。所以用刚出生的奶牛公犊诱导、合成和提取金属硫蛋白， 既充分利用了奶牛公犊资源，提高了奶牛业的经济效益，又为扩 大金属硫蛋白这一重要的生物活性物质的来源、促进金属硫蛋白 的研究和应用开辟了新的途径。用此法提取的金属硫蛋白可广泛 用于畜禽饲料抗氧化及畜禽抗应激中。
因此，本发明具有以下优点和积极效果
1、 现有技术中没有从牛肝中提取金属硫蛋白的报道，市场上 已有的产品是从兔肝和猪肝内提取的金属硫蛋白，而从牛肝中提 取金属硫蛋白的产量分别是从兔肝和猪肝提取金属硫蛋白产量的 2-3倍和1.5-2倍。而且牛的词养量大，特别是奶牛公犊弃之不用， 成本很低，用刚出生的奶牛公犊诱导、合成和提取金属 既充分利用了奶牛公犊资源，提高了奶牛业的经济效益 大金属硫蛋白这一重要的生物活性物质的来源、促进金 的研究和应用开辟了新的途径。
2、 一般诱导方法为皮下注射或腹腔注射，本方法为 注射，颈部肌肉注射安全，不会产生皮下注射时诱导液扩散不畅、 堆滞的现象和腹腔注射时引起的腹腔感染问题。采用锌剂量逐渐 递增的溶液进行颈部肌肉注射诱导，开始用低剂量的锌诱导增强 牛只对锌的耐受性和适应性，当锌浓度大幅度增加时牛不会发生
硫蛋白， ，又为扩 属硫蛋白
颈部肌肉瘁死现象，从而激发了对金属硫蛋白诱导合成的潜能，又保证了 有充足的时间诱导金属硫蛋白的大量合成。并且本方法诱导剂用 量小，诱导合成时间短，操作简便，成本低。
3、 得率高，每克牛肝含8.60-9.49mg金属硫蛋白。
4、 稳定性好，在低温条件下储藏时间较长。
5、 本发明所提取的产品广泛适用于畜禽饲料抗氧化及畜禽抗 应激效应中。
具体实施例方式
下面结合具体实施例进一步详细说明
实施例1:
① 诱导合成
选用健康的初生奶牛公犊，用配制好的ZnS04 7H20溶液采用 颈部肌肉注射法进行诱导，每隔ld诱导l次，共诱导5次。每次剂 量分另'J为5， 10， 20, 50， 100mg/kg，累计185mg/kg。
用牛为供体，通过5次诱导后牛肝内产生的金属硫蛋白量为 8.60 mg/g，显著高于平常的通过3次诱导产生的金属硫蛋白量 (2.62mg/g)和通过4次诱导产生的金属硫蛋白量(4.77mg/g); 而与经7次诱导产生的金属硫蛋白的量(9. 49mg/g))和经9次诱导 产生的金属硫蛋白的量(9.61mg/g)差异不显著，并且节省诱导时 间和成本。
② 定量检测
根据条件，任选下述一种方法
A. 巯基显色法
取30u l金属硫蛋白粗提液，加入1. 2mol/L的盐酸10u L和 0. lmol /L的EDTA200 u 1，反应10min，再力口入200 u L巯基试齐!j ， 用PH7. 2的0. lmol/L的磷酸缓冲溶液定容至4mL,反应3min,在波 长420nm处测定吸光度。空白管加入30 u l蒸馏水，同样处理。用 金属硫蛋白纯品制作标准曲线，根据A值可在标准曲线上读出金属 硫蛋白的浓度。
B. 间接竞争型ELISA法
7采用TECANA-5082型酶联免疫分析仪测定金属硫蛋白含量。反 应条件为抗原包被浓度为6.25Pg/ml; —抗(鼠抗牛)适宜浓度 为50Pg/ml;酶标抗体(山羊抗小鼠)的使用浓度为l/8000倍；反 应时间为3hr。
③ 预处理与粗提
取250g牛肝样用pH为8. 6的0. 01mol/L的Tris-HC1100mL捣碎 搅拌匀浆，倒入烧杯，再加入500mLTris-HCl和250mL乙醇-氯仿(按 1: 0.08的比例配制)混合溶液，搅拌10min，冷冻离心(10000r/min， 4°C， 20min)。取上清液于另一离心管，放入80°C的水浴锅内水浴 5min，取出后迅速冷却至室温，冷冻离心(10000r/min ， 4°C ， 20min)，离心后的上清液即为金属硫蛋白粗提液，放置于4。C备用。
④ 分离与纯化
金属硫蛋白粗提液经3倍体积的无水乙醇沉淀，4'C放置过夜 后离心(10000r/min， 4°C ， 20min)，去上清液取沉淀物，用0. lmol/L 的NH4HC03溶液完全溶解，之后滤纸过滤。对滤液用Sephedex G-100 层析柱进行层析，用0. lmol/L NH4HC0s进行洗脱，流速控制 20mL/min，每5min收集l管。收集完成后，分别从各试管中取5ul 样品，于各样品中先后加入lOii 11. 2mol/L的盐酸和395 u l的巯基 试剂，进行显色定位。取显色最深的样品，在-8(TC下冷冻25h， 所得冻干样即为金属硫蛋白纯品，含量为96%以上。每lg牛肝中可 提取7mg-9 mg的金属硫蛋白。
⑤ 分装
按每支安瓿20mg分装。 实施例2:
基本步骤与实施例l相同，不同的是共诱导7次，每次剂量分 另lj为5， 10， 20， 50， 100， 150， 200 mg/kg，累计535mg/kg;而 分离纯化步骤中在-8(TC下冷冻25 30h，所得冻干样即为金属硫蛋 白纯品，含量为96%以上。每lg牛肝中可提取8mg-10mg的金属硫蛋 白。
权利要求
1、一种牛肝金属硫蛋白的提取方法，其特征在于包括下列步骤①诱导合成选用健康的犊牛，用颈部肌肉注射ZnSO4溶液进行5-7次剂量逐级递增的诱导合成金属硫蛋白，每次剂量为5-150mg/kg体重，每隔1d诱导1次；②定量检测诱导完后的第1-3d将犊牛屠宰，取肝脏，将所取新鲜样品用去离子水冲洗两次，洗净残血，直接用巯基显色法或间接竞争型ELISA法对金属硫蛋白的含量进行检测，或用定量滤纸吸干后于-20℃下冷冻保存待测；要求每1g牛肝中金属硫蛋白的含量≥7mg；③预处理与粗提将检测合格的上述牛肝脏捣碎，用pH为8.6的Tris-HCl溶液搅拌匀浆，再加入500mLTris-HCl溶液和250mL体积比为1∶0.08的乙醇-氯仿的混合溶液，搅拌10min，冷冻离心，取上清液放入80℃的水浴锅内水浴5min，取出后迅速冷却至室温，再冷冻离心，离心后的上清液即为金属硫蛋白粗提液，放置于4℃备用；其中，离心温度为4℃，转速为10000r/min，时间为20min；④分离与纯化按体积比为1∶3于金属硫蛋白粗提液中加入无水乙醇，4℃放置过夜后离心，去上清液取沉淀物，再用0.1mol/L的NH4HCO3溶液完全溶解，之后滤纸过滤；用Sephedex G-100层析柱对滤液进行层析，再用0.1mol/L NH4HCO3进行洗脱，流速为20mL/min，每5min收集1管；收集完成后，分别从各试管中取5μl样品，各样品加入10μl 1.2mol/L的盐酸后，再加入395μl的巯基试剂，进行显色定位；取显色最深的样品，在-80℃下冷冻20～30h，得冻干粉即为金属硫蛋白纯品；其中，离心温度为4℃，转速为10000r/min，时间为20min；⑤分装将冻干粉分装待用。
2、按权利要求1所述的牛肝金属硫蛋白的提取方法，其特 征在于选用健康初生奶牛公犊，用配制好的ZnS0r7H20溶液 采用颈部肌肉注射法进行诱导，每隔Id诱导一次，共诱导5次， 每次齐!J量分另IJ为5mg/kg、 10mg/kg、 20mg/kg、 50mg/kg、 100mg/kg， 累计185mg/kg。
全文摘要
一种牛肝金属硫蛋白的提取方法，包括用健康的犊牛，用颈部肌肉注射ZnSO<sub>4</sub>溶液进行5-7次剂量逐级递增的诱导合成金属硫蛋白；定量检测，要求每1g牛肝中金属硫蛋白的含量≥7mg；将检测合格的牛肝脏捣碎，进行预处理和粗提；最后进行分离与纯化，得冻干粉即为金属硫蛋白纯品，含量为96％以上；从而，经锌诱导牛肝合成金属硫蛋白可达到成本低、效果好、产量高、诱导剂来源广、无副作用等特点；且为扩大金属硫蛋白这一重要的生物活性物质的来源、促进金属硫蛋白的研究和应用开辟了新的途径。
文档编号C07K1/14GK101580532SQ20081003127
公开日2009年11月18日 申请日期2008年5月12日 优先权日2008年5月12日
发明者彬 张, 李丽立, 莹 王 申请人:湖南农业大学