人羧肽酶A抑制因子Latexin的单克隆抗体及其应用的制作方法

专利名称：：人羧肽酶A抑制因子Latexin的单克隆抗体及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及人羧肽酶A抑制因子Latexin的单克隆抗体，同时涉及所述单克隆抗体的制备方法以及产生所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株，还涉及含有所述单克隆抗体的试剂盒、所述单克隆抗体在检测Latexin基因及其编码蛋白的水平中的应用、以及所述单克隆抗体在制备具有检测或辅助诊断肿瘤作用的组合物中的应用。
背景技术：
：癌基因和抑癌基因的研究使人们逐步认识癌变的分子过程，推动了细胞生物学基础理论知识的积累，同时为肿瘤防治提供分子靶点。羧肽酶A具有蛋白水解和蛋白保护双重功能，可提高弹性蛋白结合蛋白(EBP)的稳定性，而EBP是成纤维细胞、平滑肌细胞、白细胞以及多种肿瘤细胞(包括黑色素瘤、肺癌、乳腺癌等)膜表面受体的构成成分，介导了细胞与细胞基质间的相互作用，在组织血管形成、白细胞浸润以及肿瘤细胞远处转移等细胞生物学过程中发挥重要作用(1、PshezhetskyAV,AshmarinaM.Lysosomalmultienzymecomplex:biochemistry,genetics,andmolecularpathophysiology./Vog.7Vwc/e/cj"'dMo/,所o/.2001;69:81-114.)。己有研究显示人恶性黑色素瘤远处转移瘤组织内的羧肽酶A活性明显高于原发灶瘤组织内的酶活性，提示羧肽酶A与恶性黑色素瘤的细胞恶性转化和瘤细胞的远处转移密切相关(2、KozlowskiL,WojtukiewiczMZ,OstrowskaH.CathepsinAactivityinprimaryandmetastatichumanmelanocytictumors,yirc//.Dermato/.2000Feb-Mar;292(2-3):68-71.)，早期动物实验的结果也提示羧肽酶A的蛋白水解活性与胰腺癌的肿瘤发生相关(3、RabanalR,FondevilaD，VargasA,RamisA,BadiolaJ,FerrerL.Immunocytochemicaldetectionofamylase,carboxypeptidaseA,carcinoembryonicantigenandalpha1-antitrypsinincarcinomasoftheexocrinepancreasofthedog.K".5W.1992Mar;52(2):217-223.)。Latexin基因及其编码的Latexin蛋白是羧肽酶A抑制因子。Latexin蛋白最早是由ArimatsuY.等应用单克隆抗体PC3.1从大鼠脑组织中分离到的蛋白分子，随后的研究显示Latexin蛋白在中枢神经系统大脑皮层V和皮层VI的特异神经元细胞群中表达，在外周神经系统中的表达则仅限于小直径的初级感觉神经元细胞(4、ArimatsuY,MiyamotoM,NihonmatsuI,HirataK，UrataniY,HatanakaY,Takiguchi陽HayashiK.Earlyregionalspecificationforamolecularneuronalphenotypeintheratneocortex.尸roc.jVaZ/.爿cat/.5W.SA1992Octl;89(19):8879-8883.;5、ArimatsuY.Latexin:amolecularmarkerforregionalspecificationintheneocortex.jVewmsr/.ie义1994Aug;20(2》131-135.;6、ArimatsuY,IshidaM,Takiguchi-HayashiK，UrataniY.Cerebralcorticalspecificationbyearlypotentialrestrictionofprogenitorcellsandlaterphenotypecontrolofpostmitoticneurons.Dev—1999Feb;126(4):629-638.;7、MiyasakaN，HatanakaY,JinM，ArimatsuY.Genomicorganizationandregulatoryelementsoftheratlatexingene,whichisexpressedinacelltype-specificmannerinbothcentralandperipheralnervoussystems.5ra/"她/.Sra!、1999May21;69(1):62-72.)。已有的少数关于Latexin基因的功能研究主要是在大鼠中进行，大鼠Latexin蛋白是羧肽酶A的抑制剂，可在体外抑制羧肽酶Al、A2的蛋白水解活性(8、No画ntE,MartresMP,SchwartzJC，GrosC.Purification,cDNAcloning,functionalexpression,andcharacterizationofa26-kDaendogenousmammaliancarboxypeptidaseinhibitor.Prac.Ato/.^cad5W.USA1995Dec19;92(26):12225-12229.)，大鼠Latexin蛋白可能通过控制蛋白酶的活性参与调节神经元细胞的功能(9、BaiWZ，IshidaM，ArimatsuY.ChemicallydefinedfeedbackconnectionsfrominfragranularlayersofsensoryassociationcorticesintheratjVew簡dewce.2004;123(l》257-267.)。近来有研究显示大鼠Latexin蛋白与类固醇/甲状腺激素受体超家族成员Nuirl核受体在大脑皮层V、Via以及新皮层侧区的白质中共表达(10、ArimatsuY，IshidaM,KanekoT,IchinoseS，OmoriA.Organizationanddevelopmentofcorticocorticalassociativeneuronsexpressingtheorphannuclearrec印torNurrl.J.Cow;.Wewra/.2003Nov10;466(2):180-196.)，也有研究发现在大鼠造骨细胞的高分化阶段检测到Latexin基因的高表达(11、BalintE,LapointeD，DrissiH,vanderMeijdenC,YoungDW,vanWijnenAJ，SteinJL,SteinGS，LianJB.Phenotypediscoverybygeneexpressionprofiling:mappingofbiologicalprocesseslinkedtoBMP-2-mediatedosteoblastdifferentiation.O;〃说oc/zew.2003May15;89(2):401-426.)，但都没有关于Latexin蛋白的进一步功能提示，关于Latexin蛋白与肿瘤相关性的研究更未见报道。人羧肽酶A抑制因子一一Latexin基因是在人胃粘膜上皮细胞多步癌变过程中克隆到的基因。Latexin基因来源于GES-1与MC细胞系(GES-1细胞系是人胎儿胃粘膜上皮细胞经SV40转化而成的永生化细胞系，GES-1细胞再经化学致癌剂MNNG处理转4化成为具有恶性表型的MC细胞系)的差异显示分析，在GES-1细胞中高表达(12、柯杨，宁涛，王冰，路桂荣，冯莉雅，李吉友，吕有勇，鄂征.人胃粘膜上皮细胞系GES-1的建立及其生物学特性.中举,蘑染志1994;16(1):7-10.;13、苏秀兰，柯杨，王冰，宁乾冯莉雅，路桂荣，舍英.MNNG诱导人胃粘膜上皮细胞系GES-1及正常胃粘膜标本原癌基因的激活.^举##染盧1995;17:42-43.;14、柯杨，徐国威，KoichiHagiwara,张建明，宁涛，王冰，苏秀兰，冯莉雅，路桂荣，吕有勇，CurtisC.Harris.化学致癌作用靶基因的分离与测序.^房W学.1996;26(1):85-91.)。Latexin基因(登录号NM—020169)的cDNA全长1144bp，其序列如SEQIDNo.1所示，具有669bp的开放阅读框架(ORF)，编码222个氨基酸(编码的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，本发明中称为Latexin蛋白)，与大鼠Latexin基因编码的氨基酸序列存在84%的同源性，而且两者均具有相同的11个氨基酸残基(，LWHPQYGTKVK刑)的羧肽酶A作用结构域(15、HiraiwaM.CathepsinA/protectiveprotein:anunusuallysosomalmultifunctionalprotein.Ce//iWo/.Zz/e5W.1999;56(ll-12):894-907.)，提示Latexin蛋白也可能通过抑制羧肽酶A的活性参与肿瘤细胞多种生物学过程的调控。临床上研究表明，肿瘤相关的分子标志对肿瘤的诊断和治疗起着重要的作用。但是，由于肿瘤细胞的异质性和发生机制的复杂性，目前已知的分子标志只能解决部分患者的早期诊断和治疗指标的问题，因此寻找新的肿瘤标志分子，将为临床早发现早诊断和早治疗提供更多更可靠的靶分子，是肿瘤研究的重要内容。目前临床上迫切需要高度的抗原结合特异性的单克隆抗体，以有助于Latexin的功能检测，从而适于肿瘤的临床诊断、预后判断，并指导临床治疗。
发明内容本发明的一个目的在于提供人羧肽酶A抑制因子Latexin的单克隆抗体，该单克隆抗体对SEQIDNo.2所示蛋白有特异性。本发明的另一个目的在于提供产生所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本发明的另一个目的在于提供制备所述单克隆抗体的方法。本发明的另一个目的在于提供所述单克隆抗体在检测Latexin基因及其编码蛋白的水平中的应用，优选所述水平为在细胞内的分布水平。本发明的另一个目的在于提供一种检测试剂盒，该试剂盒含有所述的单克隆抗体、和用于与单克隆抗体结合的标记物。5本发明的另一个目的在于提供所述单克隆抗体在制备具有检测和/或辅助诊断肿瘤作用的组合物中的应用。本案发明人已利用差异显示法在人胃粘膜上皮细胞多步癌变过程中克隆到人羧肽酶A抑制因子——Latexin基因，人Latexin的序列如SEQIDNo.1所示。为了进一步研究Latexin，本发明应用杂交瘤技术制备了人羧肽酶A抑制因子Latexin的单克隆抗体。首先，本发明的一个方面是提供了一种对SEQIDNo.2所示蛋白有特异性的单克隆抗体。本发明中所述的"抗体的特异性"是指单克隆抗体对相应抗原或近似抗原物质的识别能力。特异性高，抗原的识别能力就强。本发明中SEQIDNo.2所示蛋白可以是由SEQIDNo.1第216至884位核苷酸编码产生。在本发明的一个具体实施方案中，本发明的单克隆抗体对GST(谷胱苷肽转移酶)-Latexin融合蛋白有特异性，对谷胱苷肽转移酶没有特异性。在本发明的一个优选的具体实施方案中，所述的单克隆抗体是由保藏号为CGMCCNo.2336的细胞株分泌产生。抗体类型属于IgGl。本发明的另一个方面提供了产生所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株。按照《国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约》的规定，一种产生本发明单克隆抗体的杂交瘤细胞株已保藏在国际保藏单位之一一一中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter,CGMCC，地址中国北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101)，保藏日期2008年1月10日，保藏编号CGMCCNo.2336，分类命名小鼠杂交瘤细胞(Mowse/3^〃'(i蘭(3)。本发明的另一个方面提供了一种制备所述单克隆抗体的方法。在本发明的实施方案中，是将本发明如SEQIDNo.2所示蛋白与已知的标签形成重组蛋白作为抗原，以制备获得本发明的单克隆抗体。所述的标签选自，但不限于，组氨酸标签(His标签)、谷胱苷肽-S-转移酶标签(GST标签)、HA标签、HSV标签、Myc标签和VSV-G-标签。在本发明的一个具体实施方案中，采用GST与如SIQIDNo.2所示蛋白形成的重组蛋白。制备本发明的单克隆抗体所用的抗原可以按本领域技术人员已知的常规固相合成方法合成。例如本发明如SEQIDNo.2所示蛋白可以按StewardandYoung(Steward,J.M.禾口Young,J.D.,SolidPhasePeptideSynthesis,2ndEd.，PierceChemicalCompany，Rockford,111.,(1984))描述的方法用AppliedBiosystem合成仪或Pioneer肽合成仪按固相化学技术合成。优选本发明的抗原通过基因工程的方法获得，利用在原核生物中表达含有编码本发明的抗原的多核苷酸序列。本领域普通技术人员熟知适用于表达本发明的抗原的载体。可根据所选用的适当启动子和待表达的结构基因序列来选择适当的载体。可使用任何适当的宿主细胞表达本发明的抗原。可提到的适当宿主的例子包括原核细胞如大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌等。转导、转化或转染的方法是本领域已知的，包括，但不限于，病毒感染、氯化钙转染法、脂质体转染法、电穿孔法或微粒轰击法等。为了活化启动子、选择转化体或扩增所需的基因，可以在适当修饰的常规营养培养基中培养被转导、转染或转化的宿主细胞。培养中所使用的温度、pH值等培养条件一般都是由所选用的表达特定蛋白质的宿主细胞决定的，并且这些条件都是本领域技术人员熟知的。为了大量获得重组蛋白，可以采用诱导型启动子，并利用诱导物诱导基因的表达。实质上，"诱导物"可以是任何能诱导宿主中基因表达的物质，可以化学物质或环境刺激，如，暴露于特定波长的光下。在本发明的一个优选实施方案中，采用的诱导物为IPTG(异丙基-e-D-硫代半乳糖苷)。在本发明的一具体实施例中，应用SMARTRACEcDNA扩增试剂盒(amplificationkit)，经过逆转录及特异引物进行PCR扩增以及质粒水平上的核苷酸序列重组得到了Latexin基因读码框的全长序列；并通过BamHI和SalI酶切、连接等步骤将包含Latexin基因全部开放读码框的669bp核苷酸序列克隆到原核表达载体pGEX-4T-3(购自Promega)中，构建成pGEX-4T-3-Latexin的原核表达载体，转化大肠杆菌，在IPTG的诱导下，分子量约50kD的pGEX-Latexin融合蛋白以包涵体形式存在。在本发明的一个优选的具体实施方案中，以GST-Latexin融合蛋白作为抗原免疫小鼠，取小鼠的脾细胞作为能够产生抗体的浆细胞(免疫细胞)，与同系动物的骨髓瘤细胞进行融合。筛选能够产生目的抗体的杂交瘤细胞，进行克隆化培养，并建立杂交细胞株。上述方法仅是示例性的，例如可以用同样的方法免疫其他哺乳动物，将其脾细胞作为免疫细胞。还可以选择适宜的骨髓瘤细胞用于融合，例如用来自大鼠、小鼠或仓鼠的骨髓瘤细胞。免疫细胞与骨髓瘤细胞的融合可以按照常规方法进行(Milsteinetal.,MechodsEnzymol.,1981,73,3-46)。更具体地说，免疫细胞和骨髓瘤细胞可以按照1:51:10的比例混合在培养基中充分混合，在融合促进剂的作用下进行细胞融合，例如将预热至37。C的PEG(平均分子量1,000-6,000)溶液以30%60%(W/V)的比例加入培养基。7可以作为融合促进剂的物质还有仙台病毒(HVJ)，此外，还可以根据需要适当加入佐剂(如二甲基亚砜)以增强融合效果。用于融合的培养基包括RPMI-1640培养基、DMEM培养基以及其他可用于此类培养的培养基，还可以根据需要补加新生小牛血清等物质。可以用普通的选择培养基筛选杂交瘤细胞，例如用含有次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷的HAT培养基。在HAT培养基中持续培养足够的时间，以使杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡，一般为几天至几周。然后筛选产生目的抗体的杂交瘤细胞并进行单克隆化。得到的产生本发明单克隆抗体的杂交瘤细胞，可以在普通培养基中传代培养或者在液氮长时间保存。从杂交瘤细胞收集本发明的单克隆抗体时，可以从杂交瘤细胞体外培养上清液中获得抗体，或者将杂交瘤细胞注入适宜的哺乳动物并从动物腹水中获取抗体。前一种方法适于获得高纯度的抗体，后一种方法适于大量获取抗体。通过上述方法获得的抗体，可以用常规方法纯化，例如盐析、凝胶过滤、亲合色谱等方法。在本发明的一具体实施方案中，所述制备单克隆抗体的方法包括用GST-Latexin融合蛋白免疫小鼠，取小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选出能够分泌对SEQIDNo.2所示蛋白有反应性、对谷胱苷肽转移酶没有反应性的单克隆抗体的杂交瘤细胞，从杂交瘤细胞上清液中或从注射杂交瘤细胞后的动物腹水中获取单克隆抗体。在该方案中，具体是用纯化的GST-Latexin融合蛋白常规免疫Balb/c小鼠，血清效价达10—5时，将免疫小鼠脾细胞与SP20骨髓瘤细胞融合。HAT选择培养第10天，杂交瘤细胞融合率约为60%。融合后第13天进行第一次ELISA双筛、亚克隆，此后重复进行ELISA双筛及亚克隆34次，直至每个单克隆孔均为GST-Latexin强阳性而GST阴性为止。该方案中筛选出了四株杂交瘤细胞株，其中命名为1G11的杂交瘤细胞株即为前述保藏编号为CGMCCNo.2336的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株能稳定分泌抗Latexin的单克隆抗体，体外连续培养2个月以上及液氮冻存4个月后，仍能稳定分泌单克隆抗体。将该株杂交瘤细胞扩大培养，能诱导Balb/c小鼠产生抗人Latexin的腹水，腹水产量在310ml之间，其效价达10—6。杂交瘤细胞株1G11所分泌产生的单克隆抗体(本发明中命名为单克隆抗体1G11)，具有高度的抗原结合特异性。在本发明的一具体实施方案(实施例三)中，为分析Latexin单克隆抗体的特异性，本发明用纯化的GST及GST-Latexin融合蛋白包被96孔板，ELISA实验结果表明，包被纯化的GST-Latexin融合蛋白的孔1G11为强阳性反应，包被GST蛋白的孔均为阴性。8本发明还提供了本发明的单克隆抗体的用途。在本发明的一个实施方案中，本发明提供了所述单克隆抗体在检测Latexin基因及其编码蛋白的水平中的应用，优选所述水平为在细胞内的分布水平。本发明的单克隆抗体特异性强、纯度高、效价高，并可同时应用于ELISA方法，WesternBlot杂交，免疫组织化学和细胞免疫化学方法检测Latexin基因编码蛋白的细胞核浆表达水平。本发明的另一个方面还提供了所述单克隆抗体在制备检测试剂盒中的应用。本发明提供了一种检测试剂盒，该试剂盒含有本发明的单克隆抗体、和用于与单克隆抗体结合的标记物。本发明的单克隆抗体可以用任何已知的方法与作为检测信号的标记物结合，标记物可以是放射性同位素、荧光化合物、生物素和酶等物质。本发明的检测试剂盒还可进一步包含用于检测的试剂和/或缓冲液。本发明应用所述的单克隆抗体，就人Latexin基因在人类细胞及组织中的亚细胞定位及功能，特别是与肿瘤发生发展的关系进行了研究，研究实验主要包括本发明利用所述的单克隆抗体，应用免疫组织化学及WesternBlot技术，将Latexin蛋白定位于胞浆区(参见实施例四)。本发明还应用免疫组织化学及WesternBlot技术检测了Latexin蛋白在多种肿瘤细胞系及组织中的表达水平，发现Latexin基因在永生化细胞系GES-l中表达水平较高，而在十几种肿瘤细胞系中表达水平较低或不表达；人Latexin蛋白在胃癌和食管癌组织的检出率均显著低于其对应的远端正常组织；贲门癌各个病理分期的检测结果显示从高分化至低分化的组织中Latexin蛋白表达量递减(参见实施例五)。本发明的实验研究结果有力提示Latexin基因的表达水平与胃癌、食管癌等肿瘤的发生、发展呈负相关，是一个新的候选抑癌基因。由于本发明的单克隆抗体具有高度的抗原结合特异性，利用本发明的单克隆抗体检测Latexin蛋白在多种肿瘤细胞系及组织中的表达水平发现Latexin基因在永生化细胞系GES-l中表达水平较高，而在十几种肿瘤细胞系中表达水平较低或不表达。因此，本发明的另一个方面还提供了本发明的单克隆抗体在制备具有检测和/或辅助诊断肿瘤作用的组合物中的应用。本发明中已检测的肿瘤具体包括胃癌、食管癌和贲门癌。本发明通过大量的实验研究证实本发明的单克隆抗体，尤其是1G11，具有以下两个显著的特点(一)高度的抗原结合特异性，主要的实验证据包括1.免疫裸鼠应用GST-Latexin融合蛋白，而获得的单克隆抗体1G11经ELISA法检测(参见实施例三)证实，1G11为强阳性反应，而包被GST蛋白的孔均为阴性；2.应用WesternBlot方法对永生化和肿瘤细胞系以及11种4月龄胎儿组织中Latexin蛋白表达水平进行检测(参见实施例四)，结果显示Latexin主要分布在细胞浆，杂交带行单一，对应分子量大小与Latexin蛋白的分子大小一致；应用免疫细胞化学技术检测四种细胞系(参见实施例四)的结果显示，Latexin蛋白主要分布在细胞浆中；3.应用免疫组织化学方法检测胃癌、食管癌及其远端的正常组织以及贲门癌中Latexin蛋白的表达(参见实施例五)，结果显示Latexin蛋白主要在腺体细胞的胞浆中表达。(二)由于本发明的单克隆抗体与Latexin高度特异性结合，而针对抗原Latexin蛋白发挥抑癌作用，因此，本发明的单克隆抗体可广泛应用于酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射免疫分析、WesternBlot、免疫组化等技术。主要的实验证据包括1.应用单克隆抗体1G11进行的消化道肿瘤(包括胃癌、食管癌和贲门癌及远端的正常对照组织)的免疫组织化学检测结果显示，Latexin蛋白在肿瘤组织中的表达水平明显低于其正常对照组织(参见实施例五)；2.应用逆转录病毒载体pLXSN构建Latexin基因的反义cDNA序列的重组体(pLXSN-LatexinAntisense)，转染Latexin蛋白基础表达水平较高的人胃粘膜腺癌细胞系BGC823并筛选稳定转染细胞系。进一步的克隆形成率实验分析显示转染反义Latexin基因的BGC823细胞生长速度加快，克隆形成能力明显增强(参见实施例六)；3.BGC823细胞裸鼠致瘤性实验结果显示，稳定转染pLXSN-LatexinAntisense的BGC823细胞裸鼠致瘤能力显著降低，高度支持Latexin基因具有抑制肿瘤生长的功能(参见实施例六)。所以，本发明所制备的Latexin单克隆抗体IGII为进一步深入研究Latexin基因的功能及其与肿瘤发生发展相关性的分子机制奠定了基础，有利于深入探讨Latexin基因的功能及其抑制肿瘤细胞生长的分子机制，并有利于开展Latexin基因与肿瘤细胞侵袭、转移等细胞生物学行为的相关性研究。图1显示应用内切酶EcoRI鉴定pcDNA3-Latexin重组质粒；其中，M:DNAladdermix。图2为pcDNA3-Latexin重组质粒测序图。图3为pGEX-4T-3-Latexin表达载体的构建示意图。图4显示GST-Latexin融合蛋白的表达与纯化结果；其中，M:低分子量蛋白marker;1:IPTG诱导前转化pGEX-4T-3-Latexin质粒的BL21细菌总蛋白；2:IPTG诱导1小时后转化pGEX-4T-3-Latexin质粒的BL21细菌总蛋白；3:IPTG诱导4小时后转化pGEX-4T-3-Latexin质粒的BL21细菌总蛋白；4:应用GlutathioneSepharose4B纯化的GST-Latexin融合蛋白。图5显示ELISA法检测单克隆抗体的特异性结果；其中，系列1:GST-Latexin;系歹'J2:GST。图6A显示WesternBlot方法检测抗Latexin蛋白的单克隆抗体1G11的特异性。图6B显示WesternBlot方法检测Latexin蛋白在细胞系中的核浆表达情况；其中，GES-1:人胃粘膜永生化细胞；MC、N87禾I3MGC803均为人胃癌细胞系；C:细胞浆蛋白；N:细胞核蛋白。所用一抗为1G11单克隆抗体，以1:500稀释。图6C显示11种人4月龄胎儿组织中Latexin蛋白在的表达情况；其中，1:BGC823做阳性对照；2:脑；3:心；4:肺；5:胃；6:肝；7:睥；8:小肠；9:结肠；10:肾；11:骨骼肌；12:皮肤；所用一抗为1G11单克隆抗体，以1:500稀释。图7显示免疫细胞化学方法检测Latexin蛋白在细胞系核浆分布情况；其中，A:胃癌细胞系BGC823;B:胃粘膜永生化细胞系GES-1;C:胃癌细胞系MC;D:胃癌细胞系N87。所用一抗为1G11单克隆抗体，以1:100稀释，DAB显色后再经10%苏木素复染(200X)。图8为免疫组织化学方法显示Latexin蛋白在肿瘤组织及其远端正常组织中的表达情况；其中，A:胃癌；B:正常胃组织；C:食管癌；D:正常食管组织；E:贲门癌；F:正常贲门组织。所用一抗为1G11单克隆抗体，以1:100稀释(200X)。图9A和图9B显示转染反义Latexin基因对胃癌细胞系BGC823克隆形成能力的影响；图9A中，1:BGC823;2:BGC823-pLXSN;3:BGC823-Anti-Latexin;图9B中，pLXSN:胃癌细胞系BGC823转染逆转录病毒载体pLXSN;Anti-Latexin:BGC823细胞转染pLXSN-反义LatexincDNA序列。图10A和图10B显示Latexin基因表达水平对BGC823细胞裸鼠致瘤性的影响；图10B中，1和2组织蛋白取自转染pLXSN空载的BGC823细胞接种裸鼠组，3和4组织蛋白取自转染pLXSN-Latexin反义的BGC823细胞接种裸鼠组。用于专利程序的微生物保存保藏日期2008年1月10日；保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC);保藏编号CGMCCNo.2336;分类命名小鼠杂交瘤细胞(Afoz^/7y6rWowa)。具体实施例方式为了更清楚地理解本发明的实质，下面通过具体实施例并配合附图进一步详细说明本发明，但本发明并不因此而受到任何限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件；实施例中所用到的各种常用化学试剂，除标注外，均购自北京化学试剂公司。实施例一.Latexin基因全长读码区序列的获得及鉴定一.RACE法扩增Latexin5'末端1.细胞总RNA的制备使用Invitrogene公司的产品TrizolLSReagent(Cat.No.10296-010)，按产品说明书操作。2.用SMARTRACEcDNA扩增试剂盒(购自Clontech公司)获得Latexin5'末端片段2.1cDNA第一条链的合成lOmMPolyOligo*(dT)lpl细胞总RNA3W(1昭)SMARTIIAOligo**(10mM)lpl丄70°C5min，冰浴2min丄5x第一条链合成液2plDTT(20mM)1^1dNTPC10mM)lplPowerScript逆转录酶lpl丄42°C1.5小时丄终止反应时向反应管内加入100mlTricine-EDTA缓冲液，72°C，加热7min。2.2PCR扩增LatexincDNA片段根据Latexin3'端片段设计特异3'PCR引物，其中具有Latexin片段单一的Sspl切点，位置在5'端447bp处。12PCR反应体系(50nl)10xAdvantage2PCR缓冲液(Buffer)5|al50xdNTPmixl^il5'PCR引物IIA***(10pM)l^il3'Latexin特异引物""(10pM)lpl50xAdvantage2聚合酶混合(PolymeraseMix)1^1cDNA产物lpl去离子水4(^1PCR反应程序95。C预变性3min，95'C变性15秒，55'C复性30秒，72。C延长2min，共30个循环。(注*5，_TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3，(SEQIDNo.3);**5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3'(SEQIDNo.4);5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'(SEQIDNo.5);****5，-CTGGAATATTTTGTGCTTCTAGC-3，(SEQIDNo.6);上述引物除试剂盒提供外，其余均为北京奥科生物技术有限责任公司合成)二.pcDNA3-Latexin基因读码区全长序列重组质粒的获得1.将PCR扩增片段连接到TA载体(购自Promega)中，获得TA/Latexin重组质粒，测序鉴定。2.用内切酶EcoRI(本发明具体实施例中所用内切酶均购自NEBENGLANDBioLabs公司)禾卩SspI从TA-Latexin中获得Latexin5'末端470bp片段。3.内切酶SspI和Xbal从pcDNA3-Latexin3'中获得Latexin3'末端528bp片段。4.用EcoRI和XbaI对pcDNA3进行双酶切获得pcDNA3线形载体。5.将Latexin5'EcoRI-SstI片段、Latexin3'SspI-XbaI片段和用SstI-EcoRI将pcDNA3线性化载体(购自Invitrogen公司)用T4连接酶(购自Promega)4'C连接过夜，构建成可用EcoRI单一酶切即可释放包括Latexin基因全部开放阅读框架(ORF)的669bp核苷酸序列在内的pcDNA3-Latexin重组质粒。6.测序鉴定。三.结果应用内切酶EcoRI鉴定pcDNA3-Latexin重组质粒的结果见图1;阳性克隆进一步测序鉴定，测序准确结果见图2。可以确定，本实施例中应用SMARTRACEcDNA扩增试剂盒，经过逆转录及特异引物进行PCR扩增得到了Latexin基因读码框的全长序13列。将Latexin基因读码框的全长序列进一步构建入pGEX-4T-3载体中，重组质粒结构示意图见图3。实施例二.Latexin原核表达载体pGEX/Latexin的构建、原核表达及抗原的纯化一.Latexin原核表达载体pGEX/Latexin的构建将pcDNA3-Latexin经EcoRI酶切，回收并纯化切出756bp的片段(LatexincDNA194887(SEQIDNo.1所示第194至887位)，此外包含一小段来自pcDNA3载体的序列)，将其克隆入pGEX-4T-3(购自Promega)中，构建成pGEX-4T-3-Latexin的原核表达载体，将其转化BL21表达菌，铺LBAmP+盘，挑克隆，小提质粒，酶切鉴定，全自动测序，鉴别插入片段和阅读框架，构建原核表达质粒pGEX-Latexin融合蛋白。二.GST-Latexin重组蛋白的诱导、表达及纯化1.无菌吸取经上述鉴定后的pGEX-4T-3-Latexin阳性菌5ml，接种于400mlLBAmp+培养液中，37。C200300g震荡培养23h，至0D6(X)=1左右；2.细菌加IPTG(Promega)至终浓度为lmM，继续培养，在4h后收集细菌；3.台式离心机离心(400ml分装成100ml、4管)4000g/min离心5min，弃上清，沉淀重悬于20ml用冰预冷过的lxPBS，混匀，此步后两管并作一管，即每管有200ml细菌；4.于4°C4000g离心5min，弃上清；5.沉淀加细菌裂解液10ml(50pl/ml)，冰浴20min;6.超声18Hz，约15秒x3次，每次中间间歇10秒，至细胞清亮，菌液不粘，并避免气泡；7.加TritonX-100(Promega)至终浓度1%，冰浴1030min;(此步骤有助于融合蛋白溶解)8.15000g离心20min，收集上清；9.细菌的裂解上清中加200^1的经PBS漂洗过的50%slurryofGlutathioneSepharose4B(谷胱苷肽琼脂糖凝胶4B)，室温下混合15min;10.于4°C500g离心10min，弃上清；11.收集吸附后的珠子，用lml的lmMPMSF(购自SIGMA)/PBS或PBS洗珠子并转移至1.5ml的离心管，于4'C500g离心10min，弃上清；12.重复第11步3次，每次混匀5min;13.力P100nl谷胱苷肽洗脱缓冲液(GlutathionElutionBuffer)，室温下孵育10min;14.于室温下500g离心5min，吸上清；15.重复13、14步2次；16.上清可用来定量lOD28。=0.5mg/ml，依次取1^1上清+9pl去离子水+10jal2xSDS-PAGE上样缓冲液(buffer)，5^1去离子水+10pl2><SDS-PAGE上样缓冲液，10pl上清+10nl2xSDS-PAGE上样缓冲液，混匀，在沸水中煮35min;17.行10。/。SDS-PAGE胶电泳，考马斯亮兰染液染l10h，脱色液脱色30min10h，观察重组蛋白的表达情况。三，结果将pGEX-4T-3-Latexin的原核表达载体转化BL21细菌，在IPTG诱导下，能稳定表达GST-Latexin融合蛋白，表达的融合蛋白的分子量约50kD，与推算值相符。该融合蛋白以包涵体形式存在。经碱变性法提取包涵体，又经SDS-PAGE、GlutathioneSepharose4B柱子纯化，获得了电泳纯的GST-Latexin融合蛋白(请参见图4，其中，M:低分子量蛋白marker;1:IPTG诱导前转化pGEX-4T-3-Latexin质粒的BL21细菌总蛋白；2:IPTG诱导1小时后转化pGEX-4T-3-Latexin质粒的BL21细菌总蛋白；3:IPTG诱导4小时后转化pGEX-4T-3-Latexin质粒的BL21细菌总蛋白；4:应用GlutathioneSepharose4B纯化的GST-Latexin融合蛋白；图中箭头所示即为GST-Latexin融合蛋白)。实施例三.人羧肽酶A抑制因子Latexin的单克隆抗体的制备、纯化、鉴定1.动物雌性，68W龄Balb/c小鼠4只(购自中国医学科学院实验动物研究所)，1820g/只。2.抗原GST-Latexin融合蛋白由原核表达，SDS-PAGE胶纯化，纯度达电泳级，50吗/只/次。3.免疫程序及途径初次免疫Latexin抗原与等体积完全弗氏佐剂充分混匀，形成油包水，于鼠背部皮内多点注射。四周后第一次加强免疫，Latexin抗原与不完全弗氏佐剂等体积混匀，背部皮内多点注射。之后每隔一个月加强免疫一次并于加强后第10天取尾血2^1，用ELISA法测抗体效价。待抗体效价达10—5或10—6时，尾静脉加强免疫(不加佐剂)，于三天后取脾，进行细胞融合。4.细胞融合4.1饲养细胞的制备取两只正常昆明小鼠，常规无菌取腹腔饲养细胞，加入含HAT选择培养基中。4.2脾细胞的制备取免疫的Balb/c小鼠，无菌取脾，置于盛有无血清1640培养基的平皿中，过钢丝网(200目)，收集过网后的脾细胞于试管中，静置数min;吸出上层细胞放入50ml无菌试管中。4.3骨髓瘤SP2/0细胞的准备取三瓶SP20细胞，弃培养液，加无血清1640培养基吹起，与上述分离的脾细胞混匀，1000g离心5min，弃上清，用无菌滤纸条吸净培养基，轻轻弹起细胞。4.4融合于37'C水浴中，将50%PEG慢慢加入细胞中，边加边轻轻搅拌，lml50%PEG于lmin内加完，继续搅拌30秒，静置30秒，于两分钟内轻轻加入4.5ml无血清1640培养基，1000g离心5min，弃上清，轻轻打散沉淀细胞，少量HAT培养基悬浮后加到已配好的含腹腔饲养细胞的HAT培养基中，用尖吸管滴加在96孔板中(3滴/孔)，37°C，5%0)2培养箱中培养。5.阳性克隆筛选及亚克隆融合后10天进行全换液，再过3天后进行第一次ELISA双筛，筛选到仅GST-Latexin包板阳性而GST包板阴性的孔进行亚克隆，710天进行ELISA双筛，对Latexin阳性、GST阴性孔进行第二次亚克隆，如此亚克隆35次，直至检测所有孔均为Latexin阳性而GST阴性为止。选出四株单抗，分别为命名为1G11、1G7、1F9、1D6。扩大培养、建株、冻存并制备腹水。其中，在选出的四株单抗中，命名为1G11的单抗能稳定分泌抗Latexin的杂交瘤细胞株，体外连续培养2个月以上及液氮冻存4个月后，仍能稳定分泌单克隆抗体，抗体类型属于IgGl。将1G11杂交瘤细胞扩大培养能诱导Balb/c小鼠产生抗人Latexin的腹水，腹水产量在310ml之间，其效价达10—6。6.单克隆抗体的纯化6.1小鼠杂交瘤腹水的制备及收集选取2022gBalb/c雌性小鼠，腹腔注射降殖烷(2,6,10,14-Tetramethylpen陽tradecaneJANSSENCHIMICA)，0.5ml/只。一周后，腹腔注射杂交瘤细胞2xl0"只小鼠，710天后待小鼠腹部明显膨胀后，收集腹水。将收集的腹水12000g离心30秒，去除底部沉淀和上层油脂，收集中段液体，-2(TC储存待用。6.2杂交瘤上清的浓縮取待测杂交瘤上清至少15ml，加等量饱和硫酸胺(50%)，充分混匀，4"C放置过夜，次日10000g离心10min，沉淀用500^1去离子水溶解，4'C存放待用。6.3单克隆抗体的纯化(高盐-Pro.ASepharose4B柱纯化)将收集的腹水以33%硫酸铵沉淀过夜，次日10000g离心4min，沉淀溶于去离子水中，对PBS透析。6.4高盐结合缓冲液平衡柱子以高盐结合缓冲液l:l稀释待纯化样品，然后上样(必要时可重复上样)。用23个柱床体积的BandingBuffer流洗柱子直至流出液体OD值O.01。用pH2.6、0.1M的柠檬酸钠缓冲液洗脱，用Eppendorf管收集洗脱液，1.5ml/管，紫外分光光度计测每管的OD280值，将峰值所在管的液体合并，再测OD280值，并推算所纯化的单克隆抗体含量。用5MTris(pH8.8)调pH至7，PBS透析过夜。行SDS-PAGE电泳鉴定其纯度，分装、-7(TC储存备用。7.单克隆抗体的储存7.1纯化的单克隆抗体透析至PBS中，以110mg/ml-70匸储存；低浓度时，加1%BSA及0.02%叠氮钠，-70°〇储存。7.2杂交瘤上清力n1/20体积的lMTris(pH8.0)，并加0.02%叠氮钠，-20。C保存，可保存数年；4'C可稳定存放6个月。8.单克隆抗体的鉴定8.1酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗体特异性8.1.1ELISA包被液稀释纯化的GST-Latexin抗原至浓度为5吗/ml，包被96孔板50pl/孔，4。C过夜；8.1.2用0.05%Tween20-PBS洗2遍，3%脱脂奶粉(PBS配制)封闭200^1/孔，室温12小时或4'C过夜；8.1.30.05。/。Tween20-PBS洗2遍，加入不同稀释度的抗血清(l(T3、l(T4、10-5、l(T6，用上述纯化的GST-Latexin融合蛋白常规免疫昆明小鼠，经三次加强免疫后，效价达10—5，取血得抗GST-Latexin融合蛋白的抗血清)和正常鼠血清(10—3)，50^1/孔，室温1小时；8.1.40.05%Tween20-PBS洗5遍，加羊抗鼠HRP(1:1000,购自中杉金桥公司)50pl/L,室温1小时；8.1.5PBS洗5遍，力POPD显色液lOOpl/孔，避光显色，显色后加终止液50^1/孔，观察结果并用ELISAReader测OD492。ELISA实验方法同上，检测的一抗分别为命名为1G11、1G7、1F9、1D6的四种单克隆抗体。ELISA检测抗体特异性的实验结果请参见图5所示，图中系列1表示GST-Latexin，系列2表示GST，可以看出，在4株单克隆抗体中包被纯化的GST-Latexin融合蛋白的孔1D6呈弱阳性反应，1F9和1D7呈阳性、1G11为强阳性反应，包被GST蛋白的孔均为阴性。表明本发明的命名为"1G11"的抗体具有高度的抗原结合特异性。因此除特别注明外，后续实施例的实验中所用的单克隆抗体均采用命名为"1G11"的抗体。8.2WesternBlot检测单克隆抗体的特异性吸去BGC823及Hela细胞培养基，加lmlPBS至培养瓶中，用细胞刮将细胞刮至一1.5mlEP管中，离心弃上清，重悬沉淀于RIPA(购自上海博彩生物科技有限公司)，冰上放置10min，4°C14000g离心30min，移上清至新EP管中(-70。C保存)。用Bradford比色法对蛋白定量。取BGC823、Hela细胞总蛋白、GST蛋白、GST-Latexin融合蛋白及BSA各30吗行12%SDS-PAGE电泳，电转移至PVDF膜(美国AmershamBiosciences公司)。5%脱脂奶粉封闭4匸过夜或37°C1小时，加Latexin单克隆抗体4。C过夜。0.5%Tween20-PBS充分洗涤后在加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体。按ECL(Westernblottingdetectionreagents,购自美国AmershamBiosciences公司)说明书方法进行化学发光、X光片曝光、洗片。WesternBlot检测单克隆抗体的特异性的结果显示制备的单克隆抗体1G11在4种细胞系总蛋白的约30kD处及GST-Latexin融合蛋白在约48kD处出现了一条特异的带(Latexin蛋白预计大小为29kD左右)，而在GST蛋白处却没有任何条带出现。说明1G11为Latexin特异性结合抗体(参见图6A、图6B)。实施例四.应用WesternBlot方法和免疫细胞化学技术检测Latexin蛋白在永生化和肿瘤细胞系中的表达本实施例中，应用WestemBlot方法，采用本发明的命名为"1G11"的单克隆抗体，对永生化和肿瘤细胞系以及11种4月龄胎儿组织中Latexin表达进行检测。本实施例中还应用免疫细胞化学技术检测细胞系中Latexin蛋白在细胞系核浆分布情况。具体方法可参照以下操作(其中，应用SP-9000/9001/9002HistostainTM-PlusKits免疫组化染色试剂盒，购自中杉金桥公司代理的美国ZYMED公司)石蜡切片常规脱蜡至水(二甲苯I60min—二甲苯II60min—二甲苯III60min—100%乙醇I3min—100。/。乙醇n3min—95%乙醇3min—75%乙醇3min—蒸馏水冲洗，lxPBS再洗一次)；1%H202阻断内源性过氧化物酶室温10min;抗原微波修复切片放入修复液中92'C98'C至少维持lOmin后室温冷却2030min;lxPBS洗3次每次5min，10%正常18羊血清37。C封闭4'C过夜；吸去羊血清(勿洗)，加入一抗(1:100)4。C过夜；^PBS洗3次，每次5min，加入生物素标记的羊抗鼠二抗，37'C作用30min至1小时；lxPBS洗3次，每次5min，加入辣根过氧化物酶标记的三抗链霉卵白素(HRP-Strepavidin)，37°C作用30min至1小时；lxPBS洗3次，每次5min，DAB避光显色510min，镜下观察有信号时可用自来水冲洗终止反应，10%苏木精复染(自来水冲洗)，1%盐酸-酒精分色(可滴片并直接泡在lxPBS里然后用水冲)；逐级酒精脱水、二甲苯透明(75%乙醇3min—95%乙醇3min—100%乙醇I3min—100%乙醇II3min—二甲苯I3min—二甲苯113min;中性树胶加盖玻片封片。结果判定标准以细胞胞浆内出现棕黄色颗粒状着染判断为阳性，细胞胞浆内无棕黄色颗粒着染为阴性。应用WesternBlot方法检测Latexin蛋白在永生化和肿瘤细胞系中的表达结果请参见图6B、图6C所示。其中，图6B显示的为WesternBlot方法检测Latexin蛋白在细胞系中的核浆表达情况，图中GES-1为人胃粘膜永生化细胞，MC、N87和MGC803均为人胃癌细胞系，C为细胞浆蛋白，N为细胞核蛋白；所用一抗为1G11单克隆抗体(以l:500稀释)。图6C显示ll种人4月龄胎儿组织中Latexin蛋白在的表达情况，其中，用BGC823做阳性对照，所用一抗为1G11单克隆抗体(以1:500稀释)。检测结果显示Latexin主要分布在细胞浆，杂交带行单一，对应分子量大小与Latexin蛋白的分子大小一致。免疫细胞化学方法检测Latexin蛋白在细胞系核浆分布情况的结果请参见图7;其中，图片A为胃癌细胞系BGC823，图片B为胃粘膜永生化细胞系GES-1，图片C为胃癌细胞系MC，图片D为胃癌细胞系N87。所用一抗为1G11单克隆抗体(以1:100稀释)，DAB显色后再经10%苏木素复染(200X)。检测结果表明Latexin在细胞内主要分布在细胞浆。实施例五.免疫组织化学方法检测Latexin蛋白在肿瘤组织中的表达本实施例应用本发明的单克隆抗体采用免疫组织化学方法检测了胃癌、食管癌及其远端的正常组织以及贲门癌中Latexin蛋白的表达，检测结果请参见图8和表1。图8中，图片A为胃癌，图片B为正常胃组织，图片C为食管癌，图片D为正常食管组织，图片E为贲门癌，图片F为正常贲门组织；所用一抗为1G11单克隆抗体，以1:100稀释(200X)。从图8中可以看出Latexin蛋白在肿瘤组织中的表达水平明显低于其正常对照组织。19表1.免疫组织化学技术检测Latexin在各种肿瘤组织及远端正常组织中的表达<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>从表1中的数据可以看出胃癌阳性率为14.63%(6/41)，而远端的正常组织为72.09%(31/43)，比较胃癌组织与正常组织的Latexin蛋白的表达量，发现远端正常组织的表达显著高于胃癌组织；食管癌阳性率为14.81%(8/54);而贲门癌的不同分化程度腺癌的Latexin蛋白表达情况为高-中分化腺癌阳性率为66.67%(6/9)、中分化腺癌为50%(7/14)、中低分化腺癌为42.86%(6/14)、低分化腺癌为37.50%(12/32)。对以上数据进行分析表明，随着分化程度的降低Latexin的表达量呈递减的趋势。实施例六，应用逆转录病毒载体pLXSN建立Latexin基因的反义RNA体系，研究Latexin蛋白表达水平对肿瘤细胞恶性程度的影响(一)应用逆转录病毒载体pLXSN构建Latexin基因的反义cDNA序列的重组体，转染Latexin蛋白基础表达水平较高的人胃粘膜腺癌细胞系BGC823并筛选稳定转染细胞系；进一步的克隆形成率实验分析显示转染反义Latexin基因的BGC823细胞生长速度加快，克隆形成能力明显增强(结果见图9A和图9B，图9A中，1:BGC823;2:BGC823-pLXSN;3:BGC823-Anti-Latexin;图9B中，pLXSN:胃癌细胞系BGC823转染逆转录病毒载体pLXSN;Anti-Latexin:BGC823细胞转染pLXSN-反义LatexincDNA序列)。(二)检测Latexin基因表达水平对BGC823细胞裸鼠致瘤性的影响分别应用稳定转染pLXSN空载和pLXSN-Latexin反义(Antisense)的BGC823细胞接种B/C裸鼠各IO只(接种细胞数100万/只)致瘤，4周后将瘤体剥离称重(称重量结果参见图10A和表2，表2中的裸鼠编号与图10A中瘤体从左至右的位置相对应)，并进行WesternBlot检测Latexin蛋白的表达水平，结果见图IOB(图10B中，1和2组织蛋白取自转染pLXSN空载的BGC823细胞接种裸鼠组，3和4组织蛋白取自转染pLXSN-Latexin反义(Antisense)的BGC823细胞接种裸鼠组)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>T检验结果P0.05，两组数据有统计学差异。本实施例的实验结果显示Latexin蛋白的表达水平降低，肿瘤生长速度显著增加，高度支持Latexin基因具有抑制肿瘤生长的功能。序列表<110>北京市肿瘤防治研究所<120>人羧肽酶A抑制因子Latexin的单克隆抗体及其应用〈130〉GAI08C翻88C<160>6<170>Patentlnversion3.3<210〉1<211>1144<212>薩<213〉人类(Homosapiens)<220><221>CDS<222>(216)..(884)<400>1agaagcagtcagcccagggctctcggatgcagggagcctgggcccaaacagcagcttccg60gagtcggaaggagctgaggaagaagacagactgaaggagcttgcgacttttccgcctcgg120caaccggacccagcagcaagcaggacgggcggcgctctgctactggtcccgttaagccag180agtagcccaagccctgaagtcactgctcatccggaatggaaateccgccgacc233MetGlulieProProThr15aactacccagcctecagggcggccttggtggcacagaactacateaac281AsnTyrProAlaSerArgAlaAlaLeuValAlaGinAsnTyrlieAsn101520taccagcaggggaccccgcacagggtgtttgaggtgcagaaggtcaaa329TyrGinGinGlyThrProHisArgValPheGluValGinLysValLys253035caagccageatggaggatattccaggaagaggacata_agtatcgcctt377GinAlaSerMetGluAsplieProGlyArgGlyHisLysTyrArgLeu404550aaatttgetgttgaagaaattatacaaaaacaagttaaggtgaactgc425LysPheAlaValGluGlulielieGinLysGinValLysValAsnCys55606570acagetgaagtactttaccctteaacgggacaagaaactgcaccagaa473ThrAlaGluValLeuTyrProSerThrGlyGinGluThrAlaProGlu758085gtcaacttcacatttgaaggagaaactgg已aagaatccagatgaagaa521ValAsnPheThrPheGluGlyGluThrGlyLysAsnProAspGluGlu9095100gacaacacattttotcaaagacttaagtecatgaaggaaccgetagaa569AspAsnThrPheTyrGinArgLeuLysSerMetLysGluProLeuGlu105110115gcacaaaatattccagacaattttgga犯tgtatctccsgaastgacg617AlaGinAsnlieProAspAsnPheGlyAsnValSerProGluMetThr120125130etcgttetacatttagcctgggttgcctgtggttatataatatggcaa665LeuValLeuHisLeuAlaTrpValAlaCysGlyTyrlielieTrpGin135140145150aattctactgaagacacatggtataaaatggtaaaaattcaaactgtc713AsnSerThrGluAspThrTrpTyrLysMetValLyslieGinThrVal155160165aagcaagtgcaaagaaatgatgactttattgaattagactacaccatt761LysGinValGinArgAsnAspAspPhelieGluLeuAspTyrThrlie170175180etacttcataatatagcatctcaggagattattccctggcaaatgcaa809LeuLeuHisAsnlieAlaSerGinGlulielieProTrpGinMetGin185190195gttetctggcatccacaatacggcactaaagtaaaacataatagecgt857ValLeuTrpHisProGinTyrGlyThrLysValLysHisAsnSerArg200205210ctgccagaagtactggaataaacaaaaaccctsacactgga904LeuProLysGluValGinLeuGlu215220tgtctattgatgtgtatgccaatttcactggcatctagct964aataatcccaaagtgtcactgtcttgattacagtatagaactttatagag1024aaagtatcactacataaaaatgtctttaaatggtatgtat1084atccaaaataaaaagcttca1144〈210〉2<211>222〈212〉PRT〈213〉人类(Homosapiens)〈400〉2MetGlulieProProThrAsnTyrProAlaSerArgAlaAlaLeuVal15101523AlaGinGluValGlyHis50GinVal65GinGluLysAsnMetLysValSer130GlyTyr145ValLysAsnTyrlie20GinLysVal35LysTyrArgLysValAsnThrAlaPro85ProAspGlu100GluProLeu115ProGluMetlielieTrplieGinThr165GluLeuAspTyrThr180lieProTrpGinMet195ValLysHisAsnSerArgLeu210215AsnTyrGinGinGlyThrProHisArgValPhe2530LysGinAlaSerMetGluAsplieProGlyArg4045LeuLysPheAlaValGluGlulielieGinLys5560CysThrAlaGluValLeuTyrProSerThrGly707580GluValAsnPheThrPheGluGlyGluThrGly9095GluAspAsnThrPheTyrGinArgLeuLysSer105110GluAlaGinAsnlieProAspAsnPheGlyAsn120125ThrLeuValLeuHisLeuAlaTrpValAlaCys135140GinAsnSerThrGluAspThrTrpTyrLysMet150155160ValLysGinValGinArgAsnAspAspPhelie170175lieLeuLeuHisAsnlieAlaSerGinGlulie185190GinValLeuTrpHisProGinTyrGlyThrLys200205ProLysGluValGinLeuGlu220<210>3<211>20<212>DNA〈213>人工序列(Artificial)〈220>〈223>引物<400〉3tttttttuttututttt<210>4<211>302024〈212〉賺<213>人工序列(Artificial)<220>〈223〉引物〈400>4aagcagtggtatcaacgcagagtacgcggg30〈210〉5〈211>23<212>DNA〈213〉人工序列(Artificial)〈220〉〈223>引物〈400〉5aagcagtggtatcaacgcagagt23〈210>6<211>23<212>廳〈213〉人工序列(Artificial)<220〉<223>引物〈400〉6ctggaatattttgtgcttctage232权利要求1.一种对SEQIDNo.2所示蛋白有特异性的单克隆抗体。2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，该抗体对GST-Latexin融合蛋白有特异性，对谷胱苷肽转移酶没有特异性。3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，该抗体由保藏号为CGMCCNo.2336的细胞株分泌产生。4.产生权利要求1所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。5.根据权利要求4所述的杂交瘤细胞株，该细胞株的保藏号为CGMCCNo.2336。6.—种制备权利要求1所述的单克隆抗体的方法，该方法包括用GST-Latexin融合蛋白免疫小鼠，取小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选出能够分泌对SEQIDNo.2所示蛋白有反应性、对谷胱苷肽转移酶没有反应性的单克隆抗体的杂交瘤细胞，从杂交瘤细胞上清液中或从注射杂交瘤细胞后的动物腹水中获取单克隆抗体。7.权利要求1所述的单克隆抗体在检测Latexin基因及其编码蛋白的水平中的应用，优选所述水平为在细胞内的分布水平。8.—种检测试剂盒，该试剂盒含有权利要求1所述的单克隆抗体、和用于与单克隆抗体结合的标记物。9.权利要求1所述的单克隆抗体在制备具有检测和/或辅助诊断肿瘤作用的组合物中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其中所述肿瘤为胃癌、食管癌、或贲门癌。全文摘要本发明涉及一种人羧肽酶A抑制因子Latexin的单克隆抗体，同时涉及该单克隆抗体的制备方法以及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本发明还涉及含有所述单克隆抗体的试剂盒、所述单克隆抗体在检测Latexin基因及其编码蛋白的水平中的应用、以及所述单克隆抗体在制备具有检测和/或辅助诊断肿瘤作用的组合物中的应用。文档编号C07K16/18GK101497664SQ20081005702公开日2009年8月5日申请日期2008年1月29日优先权日2008年1月29日发明者丁慧荣,涛宁,巴桑卓玛,勇李,杨柯,陆哲明,魏浩然申请人:北京市肿瘤防治研究所