专利名称：：1-氧-取代苯甲酰奎尼酸及其抑制乙肝病毒的药物用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及有机化学、药物化学和药理学领域，具体而言，本发明涉及1-氧-取代苯甲酰奎尼酸类化合物和其关键中间体以及它们的制备方法和医药用途。该类化合物被发现有抑制乙型肝炎病毒DNA(HBVDNA)复制和降低乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的表达功能，因此可以预期用于制备治疗相关的乙肝病毒感染性疾病。
背景技术：
：病毒感染引起人和动物多种疾病，严重危害健康和生命，约60%的传染病是由病毒引起的。迄今，全世界发现的病毒已经达3000多种，新的病毒不断被发现。20世纪80年代医学家发现的人类免疫缺陷病毒(fflV)所致艾滋病是危害性极大，死亡率很高的传染病。2003年又发现了一种由新的冠状病毒所致严重急性呼吸道综合征(severeacuterespiratorysyndome，SARS)，具有高度传染性，致死率高。目前对病毒性疾病的治疗仍缺乏专属性强的药物，理想的抗病毒药物应是仅干扰病毒的复制而不影响正常细胞的代谢。但是由于病毒和宿主细胞相互作用的复杂性，大多数抗病毒的药物在发挥治疗作用时，对人体易产生毒.性，或者药物本身抗病毒作用较低而无法达到抑制的作用。因此，寻找和发现新的选择性高的强效抗病毒药物是世界范围内的研究热点，我们也致力于抗病毒药物的研究。乙型病毒型肝炎(HepatitisB)是中国多发和常见重型传染性疾病，其病原体是乙型肝炎病毒(HBV)。全国约1.2亿HBV携带者，每年死于原发性肝癌的15万人中，大多数与乙型肝炎感染有关。目前，临床上对HBV病患的治疗方案只能达到抑制HBV复制和继发感染，最主要药物仍是核苷类药物如拉米呋啶(3-TC)、恩替卡韦、阿德福韦(ADV)等，它们虽然能有效地控制病情，但一则售价昂贵，二则长期使用均可出现耐药性，以及不同程度的反跳，三是长期使用核苷类药物出现的较为明显的众所周知的不良作用。所以从民族民间长期使用的药物中发现新的非核苷类乙肝病毒抑制剂有着很大的意义，而有效的乙肝病毒抑制剂的主要判断指标在于该类新颖的非核苷类药物必须具有对乙肝病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)和/或乙肝表面抗原(HBsAg)的抑制活性。单苯甲酰取代奎尼酸类化合物是一类新型的源自天然产物的先导化合物，其中4-氧-没食子酰奎尼酸被发现具有抑制人DNA聚合酶作用(BiochemicalPharmacologyVolume38，Issue21,1989,3759-3765)，从而可以应用于抗肿瘤药物的开发中。类似化合物theogallin和奎尼酸(quinicacids)与添加物一同使用可以治疗病毒性疾病如AIDS，HCV，ARDS等(美国专利，US20060210424)。1995年，台湾学者ChangChia-wen报道3，4，5-氧-三没食子酰奎尼酸对HIV逆转录病毒的ICso抑制浓度达0.08nM(Chang,C.W.;Lin，M.T.;Lee，S.S.;Liu,K.C.S.C.;Hsu,F丄.;Lin,LY.(1995)AntiviralResearch,27，367~374)。考虑到抗HIV药物和HBV药物的高同源性，因此本发明对上述化合物进行了合成和结构改造，设计并合成了一系列1-氧-取代苯甲酰奎尼酸类化合物，并测试了其对HBVDNA和/或HBsAg的抑制活性。药理测试结果证明，本发明涉及的苯甲酰奎尼酸及其类似物和重要中间体对乙肝病毒复制产生一定的抑制作用，从而完成本发明。本发明的目的在于提供一类新的抗乙肝病毒药物，具体而言，本发明提供了一类具有式(I)所示结构的1-氧-取代苯甲酰奎尼酸类化合物，其中取代基R卩,R2'，R3',R4'和R5'可以相同或不同，分别选自氢，羟基，卤素，巯基，硝基，氰基，含1~8个碳的烷基，含1~8个碳的烷氧基，含18个碳的烷胺基，1~15个碳的不饱和烃基，115碳的不饱和烃氧基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的芳氧基，取代或未取代的芳垸氧基，含1~8个碳的酰氧基，含18个碳的垸氧烷氧基；其条件是RAR2'，R3'，RV和R5'
发明内容式(I)不能同时为氢；当RV和Rs'同时为氢时，R2'，R3'，R4'不能同时是羟基或甲氧基;当R2'和R4'同时为氢时，R,',R3',R5'不能同时是甲基；当IV和R5'同时为氢而R2'和R4'同时为羟基时，R5'不能是没食子酰基；当W和R5'同时为氢而R3'和RV同时为羟基时，R2'不能是没食子酰基。本发明的又一目的是提供了式(I)化合物的用于制备抗乙肝病毒药物的用途。本发明的再一个目的是提供了一种含有式(I)化合物的用于抗乙肝病毒疾病的药物组合物。根据本发明，该药物组合物中可加各种药用赋形剂，添加剂及载体。本发明优选的式(I)化合物包括I-a.l-氧-(4-甲氧基苯甲酰)-奎尼酸；I-b.l-氧-(3-氯苯甲酰)-奎尼酸；I~C.1-氧-(3，5-二羟基苯甲酰)-奎尼酸；I-d.l-氧-(4-硝基苯甲酰)-奎尼酸；I_e.l-氧-(4-溴苯甲酰)-奎尼酸；I-f.l-氧-(4-氯苯甲酰)-奎尼酸；I-g.1-氧-(3，5-二硝基苯甲酰)-奎尼酸。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>此外，本发明还提供了一种如式(II)所示的制备式(I)化合物的关键中间体化合物以及其可药用盐其中取代基Ri',R2',R3'，R4'和R5'可以相同或不同，分别选自氢，羟基，卤素，巯基，硝基，氰基，含1~8个碳的烷基，含18个碳的垸氧基，含卜8个碳的烷胺基，115个碳的不饱和烃基，1~15个碳的不饱和烃氧基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的芳氧基，取代或未取代的芳烷氧基，含18个碳的酰氧基，含1~8个碳的烷氧垸氧基。其条件是R"R2'，R3'，RV和R5'不能同时为氢；当&邻R5'同时为氢时，R2'，R3'，R4'不能同时是羟基或甲氧基;当R2'和R4'同时为氢时，Rr,R3',Rs'不能同时是甲基；当Rt'和Rs'同时为氢而R2'和R4'同时为羟基时，Rs'不能是没食子酰基；当RV和Rs'同时为氢而R3邻R4'同时为羟基时，R2'不能是没食子酰基。本发明优选的式(II)化合物包括II-a.l-氧-(4-甲氧基苯甲酰)-3，4-丙酮叉奎尼酸内酯；II-b.l-氧-(3-氯苯甲酰)-3，4-丙酮叉奎尼酸内酯；II~c.1-氧-(3，5-二羟基苯甲酰)-3，4-丙酮叉奎尼酸内酯；n_d.l-氧-(4-硝基苯甲酰)-3，4-丙酮叉奎尼酸内酯；n_e.l-氧-(4-溴苯甲酰)-3，4-丙酮叉奎尼酸内酯。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>具体实施例方式本发明提供了一种由中间体式(II)化合物制备式(I)化合物的方法，该合成工艺路线特征是奎尼酸与丙酮在酸性条件下縮合生成丙酮叉保护的奎尼酸内酯化合物，再与取代的苯甲酸在縮合剂如1，l'-羰基二咪唑(CDI)，1，8-二氮杂双环[5，4，0]11垸-7-烯(DBU)存在下通过酯化反应制备得到式(II)化合物，将其在酸性条件下水解得到式(I)化合物。具体制备过程如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>本发明的式(I)化合物及其关键中间体式(II)化合物或其可药用盐对乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)及乙型肝炎表面抗原(HBsAg)有良好的抑制作用。根据本发明，该类化合物或其可药用盐可以与药学上常用的辅料或载体结合，制备得到可以用于防治乙肝病毒引起的疾病的药物组合物。下面通过实施例进一步说明本发明，实施例给出了代表性化合物的合成及相关结构鉴定数据。必须说明，下述实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。实施例1:化合物3，4-丙酮叉奎尼酸内酯的制备3，4-丙酮叉奎尼酸内酯反应瓶中，加入奎尼酸(500毫克，2.6毫摩尔)，无水硫酸钠(2.5g,17.6毫摩尔)，15毫升无水丙酮，搅拌数分钟，再向反应瓶中滴加3微升浓硫酸，加热回流5小时。冷却到室温，加入碳酸氢钠调节pH约为7，抽滤除去不溶物，滤液浓縮。脱溶所得固体分散在3毫升氯仿和3毫升蒸馏水中，水层再用氯仿萃取3次(5毫升x3)，合并所有有机相，用水洗，饱和食盐水洗涤数次，无水硫酸钠干燥。减压蒸馏除去溶剂得白色固体，在乙酸乙酯中重结富得白色粉末350毫克，产率为63.2%。熔点120~122°C;核磁共振氢谱。HNMR，400MHz,氘代甲醇)S1.29(3H,单峰)，1.46(3H，单峰)，2.00~2.49(4H,多重峰)，4.27(1H,双双峰)，4.50(1H，多重峰)，4.65(1H,双双峰)。实施例2:化合物II-a[1-氧-(4-甲氧基苯甲酰)-3,4-丙酮叉奎尼酸内酯]的制备<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>向反应瓶中加入对甲氧基苯甲酸(90毫克，0.58毫摩尔)，羰基二咪唑(190毫克，1.17毫摩尔)，无水四氢呋喃8毫升，回流2小时，再向其中加入3，4-丙酮叉奎尼酸内酯(100毫克，0.47毫摩尔)，1，8-二氮杂双环[5，4，0]11垸-7-烯(DBU)(90毫克,0.58毫摩尔)，整个溶液回流反应8小时。脱溶得到淡黄色粘稠状固体，经HPLC分离得到白色固体50毫克，产率为31.8%。熔点63~64°C;i/(氯仿/甲醇/甲酸50/2/1):0.75;核磁共振氢谱('HNMR，400MHz，氖代甲醇)S1.33(3H,单峰)，1.43(3H，单峰)，2.46~2.76(4H,多重峰)，3.91(3H,单峰)，4.09(1H,双双峰)，4.51(1H，多重峰)，4.74(1H,双双峰)，7.07(2H，单峰)，8.03(2H,单峰)。根据实施例1和2相同的方法制备得到表一所示实施例3~6化合物:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>表一<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>下面列出表一中各化合物的理化数据化合物II-b:白色固体，熔点5860°C，A(氯仿/甲醇/甲酸50/2/1):0.68;核磁共振氢谱。HNMR，400MHz，気代甲醇)S1.26(3H,单峰)，1.44(3H，单峰)，2.45-2.83(4H,多重峰)，3.96(1H，双双峰)，4.11(1H,多重峰)，4.75(1H，双双峰)，7.40(1H,多重峰)，7.57(1H，双峰)，7.72(1H，双峰)，8.01(1H,单峰)。化合物II"C:白色固体，熔点45~47°C，及/(氯仿/甲醇/甲酸50/2/1):0.31;核磁共振氢谱。HNMR，400MHz,氖代甲醇)S1.29(3H,单峰)，1.46(3H,单峰)，2.00-2.49(4H,多重峰)，4.27(1H，双双峰)，4.50(1H,多重峰),4.65(1H，双双峰)，6.58(1H，单峰)，7.10(2H,单峰)。化合物II-d:白色固体，熔点60~62°C，及/(氯仿/甲醇/甲酸50/2/1):0.45;核磁共振氢谱。HNMR，400MHz，氘代甲醇)S1.03(3H,单峰)，1.51(3H,单峰)，2.07~2.18(3H,多重峰)，2.71(1H，双峰)，4.10(1H，双双峰)，4,33(1H,多重峰)，4.71(1H,双双峰)，8.28(2H，单峰)，8.38(2H,单峰)。化合物II-e:白色固体，熔点7376°C，&(氯仿/甲醇/甲酸50/2/1):0.71;核磁共振氢谱。HNMR，400MHz,氖代甲醇)S1.35(3H，单峰)，1.52(3H，单峰)，1.96(1H，多重峰)，2,01(1H,多重峰)，2.45(1H,多重峰)，2.72(1H，双峰)，4.13(1H,双双峰)，4.38(1H,多重峰)，4.70(1H,双双峰)，7,72(2H，单峰)，7.95(2H,单峰)。实施例化合物I-a[l-氧-(4-甲氧基苯甲酰)-奎尼酸]的制备<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>在二颈瓶中加入化合物l-氧-(4-甲氧基苯甲酰)-3，4-丙酮叉奎尼酸内酯'II-a(50毫克，0.144毫摩尔)，加入5毫升四氢呋喃，再滴加5毫升1N盐酸，在室温下反应72小时，向反应体系中加入食盐饱和，用氯仿萃取，合并氯仿层用大量水洗，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。经HPLC分离得到白色固体29毫克，产率为62.5%。熔点84~87°C，i,(氯仿/甲醇/甲酸50/2/1):0.25;核磁共振氢谱。HNMR，400MHz,氖代甲醇)52.46~2.76(4H,多重峰),3.91(3H，单峰),4.09(1H，双双峰)，4.51(1H，多重峰)，4.74(1H,双双峰)，7.07(2H,单峰)《8.03(2H，单峰)。根据实施例7相同的方法制备得到表二所示实施例8-13化合物:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>表二<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>下面列出表二中各化合物的理化数据化合物I-b:白色固体，熔点82~83°C，i/(氯仿/甲醇/甲酸50/2/1):0.23;核磁共振氢谱(^HNMR，400MHz，氘代甲醇)2.45~2.83(4H,多重峰)，3.96(1H,双双峰)，4.11(1H,多重峰)，4.75(1H,双双峰)，7.40(1H,多重峰)，7.57(1H,双峰)，7.72(1H,双峰)，8.01(1H，单峰)。化合物I-c:白色固体，熔点74~76°C，及,(氯仿/甲醇/甲酸50/2/1):0.14;核磁共振氢谱。HNMR,400MHz,氘代甲醇)S2.00~2.49(4H,多重峰)，4.27(1H，双双峰)，4.50(1H,多重峰)，4.65(1H,双双峰)，6.58(1H,革峰)，7.10(2H,单峰)。化合物I"d:白色固体，熔点93~95°C，i/(氯仿/甲醇/甲酸50/2/1):0.25;核磁共振氢谱。HNMR，400MHz,氘代甲醇)S2.07-2.18(3H，多重峰)，2.71(1H,双峰)，4.10(1H,双双峰)，4.33(1H,多重峰)，4.71(1H,双双峰)，8.28(21"1,单峰)，8.38(2H,单峰)。化合物I-e:白色固体，熔点105~107°C，/,(氯仿/甲醇/甲酸50/2/1):0.23;核磁共振氢谱(iHNMR，400MHz,氘代甲醇)S1.96(1H,多重峰),2.01(1H，多重峰)，2.45(1H，多重峰)，2.72(1H,双峰)，4.13(1H,双双峰)，4.38(1H，多重峰)，4.70(1H,双双峰)，7.72(2H，单峰)，7.95(2H，单峰)。化合物I-f:白色固体，熔点136137。C(氯仿)，A(氯仿/甲醇/甲酸=50/2/1):0.15;核磁共振氢谱(400MHz，氖代甲醇)S2.293.12(4H,多i峰)，4.07(1H，双双峰)，4.21(1H,多重峰)，4.97(1H,双双双峰)，7.43(2H，双峰)，7.98(2H,双峰)。化合物I-g:白色固体，熔点130133。C(氯仿)，&(氯仿/甲醇/甲酸=50/2/1):0.18;核磁共振氢谱(400MHz，氖代甲醇)S2.27~3.19(4H，多重峰)，3.86(1H，双双峰)，4.25(1H，多重峰)，5.02(1H，双双双峰)，9.17(2H，单峰)，9.25(1H,单峰)。本发明的式(I)化合物及其关键中间体和它们的可药用盐具有抑制乙型肝炎病毒(HBV)复制，降低乙肝病毒表面抗原(HBsAg)表达的功能；可以用于制备治疗相关的乙肝病毒感染性疾病的药物。该药物可以与药学上常用的辅料或载体结合，用制药领域中的常规技术制备得到具有抗乙肝病毒活性从而可以用于防治乙肝病毒引起的疾病的药物组合物。上述药物组合物可以采用注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂等剂型药物，或控释或缓释剂型或纳米制剂。本发明的式(I)化合物及其关键中间体和它们的可药用盐可以与现已上市的治疗乙型病毒性肝炎药物如拉米呋啶(lamivuding)、阿德福韦及其二匹伏酉旨(adevovir/adevovirdipivoxil)、恩替卡韦(entecavir)、恩曲他滨(emtricitabine)、克来福定(clevudine)、泛昔络韦(famciclovir)、洛布卡韦(lobucavir)、干扰素(IFN)等联合使用，制备得到具有治疗乙型病毒性肝炎的药物或者保健品。上述各类药物组合物或者保健品均可以采用注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂等剂型药物，或控释或缓释剂型或纳米制剂。为了更好地理解本发明的实质，下面分别用药理实施例的形式简述式(I)化合物及其关键中间体对乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和对乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)的抑制试验的药理实验结果，说明其在抗乙肝病毒药物开发领域中的用途。药理实施例给出了式(I)化合物及其关键中间体的部分活性数据。同样必须说明，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。药理实施例1:化合物I"C对HepG2.2.15分泌的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)抑制率(％)1.1细胞培养将HepG2.2.15细胞培养于含10%灭活胎牛血清，100U/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素，100微克/毫升G418的DMEM培养基中，置37'C，5X二氧化碳C02，100%相对湿度的培养箱中培养。1.2采用MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)法测定式(I)化合物I-c对HepG2.2.15细胞生长的抑制作用取对数生长期的HepG2.2.15细胞，用培养基将细胞稀释成1X105/毫升，接种于96孔细胞培养板，每孔100微升，在37。C，5%C02，100%相对湿度的培养箱中培养24小时后加入用培养基稀释的化合物I-c，浓度分别为100微克/毫升，20微克/毫升，和4微克/毫升，每孔200微升，每个浓度设三个复孔，置于37'C，5%C02，100%相对湿度的培养箱中培养，培养72小时后，每孔加入5毫克/毫升MTT试剂10微升，继续培养4小时，弃去培养基，每孔加入DMSO200微升，用振荡器振荡20分钟，在570nm波长下用酶标仪测定OD值。以只加培养基的培养孔为对照孔。实验重复三次。抑制率(％)二(对照孔OD值_实验组OD值)/对照孔OD值X100%。1.3测定化合物I-c对乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的抑制作用取对数生长期的HepG2.2.15细胞，用培养基将细胞稀释成^105/毫升，接种于96孔细胞培养板，每孔100微升，在37。C，5%C02，100%相对湿度的培养箱中培养24小时后加入用培养基稀释的化合物I-c化合物，浓度分别为100微克/毫升，20微克/毫升和4微克/毫升，每孔200微升，每个浓度设三个复孔，置于37。C，5%C02，100%相对湿度的培养箱中培养，每4天换含相同浓度样品的培养基，将同一样品同一浓度的换出的培养基等体积混匀，作为待测样品。用酶联反应ELISA试剂盒测定培养基中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)浓度，以P/N表示；以拉米呋啶(3-TC)为阳性对照。1.4实验结果实验结果如表三所示，化合物I-c有显著的抑制乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的作用。其对HepG2.2.15细胞的生长无明显抑制作用，但对HepG2.2.15细胞分泌的乙型肝炎表面抗原HBsAg在高、中、低剂量下抑制活性都高于拉米呋啶。表三.化合物I-c对HepG2.2.15分泌的乙型肝炎表面抗原抑制率(％)样品编号浓度(微克/毫升)4天8天10031.8540.11I一c2012.7216.0944.859.333-TC画20412.12/a/a11.37/a/a(拉米呋啶)表示无抑制活性。1.5结果说明乙型肝炎表面抗原(HBsAg)抑制率是判断乙型肝炎病毒感染重要标志^有效抑制HBsAg分泌并使HBsAg反应转阴是治疗乙型肝炎的目标之一。化合物1-c在第八天对HepG2.2.15细胞分泌的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)具有显著的抑制作用，说明此类l-氧-苯甲酰奎尼酸类化合物和其可药用盐可预期发展为降低乙型肝炎表面抗原、控制病毒性乙型肝炎症状的药物。药理实施例2:化合物II-c对HepG2.2.15分泌的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)抑制率(％)2.1细胞培养将HepG2.2.15细胞培养于含10%灭活胎牛血清，100U/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素，100微克/毫升G418的DMEM培养基中，置37。C，5%C02，100%相对湿度的培养箱中培养。2.2采用MTT法测定化合物II-c对HepG2.2.15细胞生长的抑制作用取对数生长期的HepG2.2.15细胞，用培养基将细胞稀释成lxloV毫升，接种于96孔细胞培养板，每孔100微升，在37-C,5%C02，100%相对湿度的培养箱中培养24小时后加入用培养基稀释的化合物I1-c，浓度分别为100微克/毫升，20微克/毫升，和4微克/毫升，每孔200微升，每个浓度设三个复孔，置于37。C，5%C02，100%相对湿度的培养箱中培养，培养72小时后，每孔加入5毫克/毫升MTT试剂10微升，继续培养4小时，弃去培养基，每孔加入DMSO200微升，用振荡器振荡20分钟，在570nm波长下用酶标仪测定OD值。以只加培养基的培养孔为对照孔。实验重复三次。抑制率(％)二(对照孔OD值-实验组OD值)/对照孔OD值X100%。2.3测定化合物I1-c对乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的抑制作用检测方法同药理实施例1。用酶联反应ELISA试剂盒测定培养基中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)浓度，以P/N表示；以拉米呋啶(3-TC)为阳性对昭。八、、o2.4实验结果实验结果如表四所示，化合物II-c有显著的抑制乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的作用。其对HepG2.2.15细胞分泌的乙型肝炎表面抗原HBsAg在高、中、低剂量下抑制活性都高于拉米呋啶。表四.化合物II-c对HepG2.2.15分泌的乙型肝炎表面抗原抑制率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>〃表示无抑制活性。2.5结果说明乙型肝炎表面抗原(HBsAg)抑制率是判断乙型肝炎病毒感染重要标志,有效抑制HBsAg分泌并使HBsAg反应转阴是治疗乙型肝炎的目标之一。化合物II-c在第八天对H印G2.2.15细胞分泌的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)具有显著的抑制作用，说明此类l-氧-取代苯甲酰-3，4-丙酮叉奎尼酸内酯类中间体化合物和其可药用盐可预期发展为降低乙型肝炎表面抗原、控制病毒性乙型肝炎症状的药物。药理实施例3:化合物I-c对HepG2.2.15细胞分泌的乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)的抑制作用3.1仪器与试剂PE7700自动荧光PCR仪，美国PerkinElmer公司生产；HBVDNA荧光定量检测试剂盒由中山医科大学达安基因诊断中心提供；胎牛血清、DMEM、G418、胰蛋白酶均购自Gibco公司。3.2细胞培养将HepG2.2.15细胞接种于DMEM培养液(含10%胎牛血清，380微克/毫升G418)，置5X二氧化碳C02培养箱中37'C培养，具体方法同药理实施例1。3.3采用MTT法测定化合物I-c对HepG2.2.15细胞生长的抑制作用方法同药理实施例l。3.4测定化合物I-c对乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)复制的抑制作用取对数生长期的HepG2.2.15细胞，用培养基将细胞稀释成lxloV毫升，接种于96孔细胞培养板，每孔100微升，在37-C，5%CQ2，100%相对湿度的培养箱中培养24小时后加入用培养基稀释的化合物I-c，浓度分别为100微克/毫升，20微克/毫升和4微克/毫升，每孔200微升，每个浓度设三个复孔，置于37°C，5%CQ2，100%相对湿度的培养箱中培养，每4天换含相同浓度样品的培养基，将同一样品同一浓度的换出的培养基等体积混匀，作为待测样品。第8天时用HBVDNA定量PCR仪测定培养基中HBVDNA浓度。按试剂盒说明书操作，50微升反应体积中含30微升反应缓冲液，5微升氯化镁，5微升引物和探针，7微升样品处理上清液和3微升Taq酶。各反应管放入PCR仪中，按下列条件扩增92°C，2分钟预变性；然后按93。C，45秒-55°C，120秒；共40个循环。反应结束后，由自动分析软件计算出结果。以拉米呋啶(3-TC)为阳性对照，实验结果说明于表五。化合物I-c具有强效的抑制乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)复制的作用。表五.化合物I-c对HepG2.2.15脱氧核糖核酸的百分抑制率以及第12天对细胞生长的百分抑制率<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>3.5试验结果说明第八天和第十二天检测结果显示化合物I-c对HBVDNA显示出一定的抑制活性，虽然比阳性对照药品拉米呋啶对HBVDNA的抑制活性要弱，但属于有较强活性的HBVDNA抑制剂。3.6结论化合物I-c能显著抑制HBVDNA的复制，说明此类1-氧-苯甲酰奎尼酸类化合物和其可药用盐可以预期发展成为治疗病毒性乙型肝炎疾病的药物。药理实施例4:化合物II~c对HepG2.2.15细胞分泌的乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)的抑制作用4.1仪器与试剂PE7700自动荧光PCR仪，美国PerkinElmer公司生产；HBVDNA荧光定量检测试剂盒由中山医科大学达安基因诊断中心提供；胎牛血清、DMEM、G418、胰蛋白酶均购自Gibco公司。4.2细胞培养将H印G2.2.15细胞接种于DMEM培养液(含10%胎牛血清，380微克/毫升G418)，置5X二氧化碳C02培养箱中37-C培养，具体方法同药理实施例1。204.3采用MTT法测定化合物II~c对H印G2.2.15细胞生长的抑制作用方法同药理实施例1。4.4测定化合物I1-c对乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV-DNA)复制的抑制作用测试方法同药理实施例3，实验结果说明于表六。化合物II《具有强效的抑制乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)复制的作用。表六.化合物11~€对HepG2.2.15脱氧核糖核酸的百分抑制率以及第12天对细胞生长的百分抑制率样品编号浓度(微克/毫升)8天12天12天的MTT化合物n-c10023.3438.5616.962012.3723.4513.7347,8213.589.98拉米呋啶10081.2583.569.772072.8576.316.13437.2737.814.224.5试验结果说明第八天和第十二天化合物II~c对HBVDNA显示出一定的抑制活性，虽然比阳性对照药品拉米呋啶对HBVDNA的抑制活性要弱，但属于有较强活性的HBVDNA抑制剂。4.6结论化合物II-c能显著抑制HBVDNA的复制，说明此类1-氧-取代苯甲酰-3，4-丙酮叉奎尼酸内酯类中间体化合物和其可药用盐可以预期发展成为治疗病毒性乙型肝炎疾病的药物。在上述说明书阐述本发明时，同时提供了实施例和药理实施例的目的是举例说明本发明的实际操作过程和本发明的意义。在进入本发明权利要求和其等同物范围内时，本发明的实际应用包括所有一般变化、配合，或改进。权利要求1.一种式(I)所示的1-氧-取代苯甲酰奎尼酸类化合物及其可药用盐式(I)其中取代基R1′，R2′，R3′，R4′和R5′可以相同或不同，分别选自氢，羟基，卤素，巯基，硝基，氰基，含1～8个碳的烷基，含1～8个碳的烷氧基，含1～8个碳的烷胺基，1～15个碳的不饱和烃基，1～15碳的不饱和烃氧基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的芳氧基，取代或未取代的芳烷氧基，含1～8个碳的酰氧基，含1～8个碳的烷氧烷氧基；其条件是R1′，R2′，R3′，R4′和R5′不能同时为氢；当R1′和R5′同时为氢时，R2′，R3′，R4′不能同时是羟基或甲氧基；当R2′和R4′同时为氢时，R1′，R3′，R5′不能同时是甲基；当R1′和R5′同时为氢而R2′和R4′同时为羟基时，R5′不能是没食子酰基；当R1′和R5′同时为氢而R3′和R4′同时为羟基时，R2′不能是没食子酰基。2.根据权利要求1的式(I)化合物，其特征为取代基R"R2'，R3'，RV和R5'可以相同或不同，分别选自氢，羟基，卤素，硝基，含18个碳的烷氧基和含18个碳的酰氧基，其条件是R卩，R2'，R3'，R4'和Rs'不能同时为氢；当.R和R5'同时为氢时，R2',R3',R4'不能同时是羟基或甲氧基；当！12'和RV同时为氢时，Ri'，R3',R5'不能同时是甲基；当R,'和R5'同时为氢而R2'和R4'同时为羟基时，R5'不能是没食子酰基；当IV和R5'同时为氢而R3'和R4'同时为羟基时，R2'不能是没食子酰基。3.根据权利要求1、2任一所述的式(I)化合物，其特征为式(I)化合物是选自下列化合物I—a.l-氧-(4-甲氧基苯甲酰)-奎尼酸；I-b.l-氧-(3-氯苯甲酰)-奎尼酸；I-c.1-氧-(3,5-二羟基苯甲酰)-奎尼酸；I-d.1-氧-(4-硝基苯甲酰>奎尼酸；I~e.l-氧-(4-溴苯甲酰)-奎尼酸；I-f.l-氧-(4-氯苯甲酰)-奎尼酸；I-g.1-氧-(3，5-二硝基苯甲酰)-奎尼酸。4.一种具有式(II)所示的制备式(I)化合物的关键中间体1-氧-取代苯甲酰-3，4-丙酮叉奎尼酸内酯及其可药用盐式(II)其中取代基R,'，R2'，R3'，R4邻R5'可以相同或不同，分别选自氢，羟基，卤素，巯基，硝基，氰基，含卜8个碳的烷基，含1~8个碳的垸氧基，含18个碳的烷胺基，1~15个碳的不饱和烃基，115个碳的不饱和烃氧基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的芳氧基，取代或未取代的芳烷氧基，含1~8个碳的酰氧基，含18个碳的烷氧垸氧基。其条件是&'，R2'，R3'，R4'和R5'不能同时为氢；当R,邻R5'同时为氢时，R2',R3',R4'不能同时是羟基或甲氧基、当R2'和R4'同时为氢时，R,，R3'，R5'不能同时是甲基；当RV和Rs'同时为氢而R2'和R4'同时为羟基时，Rs'不能是没食子酰基；当R,'和Rs'同时为氢而R3'和R4'同时为羟基时，R2'不能是没食子酰基。5.根据权利要求4的式(II)化合物，其特征为取代基RAR2'，R3'，RV和R5'可以相同或不同，分别选自氢，羟基，卤素，硝基，含18个碳的垸氧基和含18个碳的酰氧基，其条件是R/，R2'，R3',R4'和R5'不能同时为氢；当Ri'和Rs'同时为氢时，R2',R3',R4'不能同时是羟基或甲氧基；当R2'和R4'同rf为氢时，IV,R3'，R5'不能同时是甲基；当Ri'和R5'同时为氢而R2'和R4'同时为羟基时，R5'不能是没食子酰基；当R,'和R5'同时为氢而R3'和R4'同时为羟基时，R3'不能是没食子酰基。6.根据权利要求4、5任一所述的式(II)化合物，其特征为式(II)化合物是选自下列化合物II-a.1-氧-(4-甲氧基苯甲酰)-3,4-丙酮叉奎尼酸内酯；II-b.l-氧-(3-氯苯甲酰)-3，4-丙酮叉奎尼酸内酯；II~c.l-氧-(3，5-二羟基苯甲酰)-3，4-丙酮叉奎尼酸内酯；II~d.l-氧-(4-溴苯甲酰)-3，4-丙酮叉奎尼酸内酯；II~e.l-氧-(4-硝基苯甲酰)-3，4-丙酮叉奎尼酸内酯。7.根据权利要求1-6任一所述之1-氧-苯甲酰奎尼酸类化合物及其关键中间体和它们的可药用盐用于制备治疗乙型病毒性肝炎的药物用途，其特征为该类药物具有抑制乙型肝炎病毒DNA复制药物和/或降低乙肝病毒表面抗原表达的功效。8.—种用于制备治疗乙型病毒性肝炎药物的药物组合物，其含有治疗有效量的作为活性成分的根据权利要求l-6之一的化合物或者它们的混合物，以及它们的可药用盐和可药用辅料。9.根据权利要求7、8任一所述的药物和药物组合物，其剂型是注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂，或控释或缓释剂型或纳米制剂。全文摘要本发明涉及一种具有抗乙型肝炎病毒活性的式(I)所示的1-氧-取代苯甲酰奎尼酸类化合物及其可药用盐，本发明还涉及这些化合物的制备方法及其中间体化合物。本发明同时还涉及这些化合物的药物用途和含有该类化合物的药物组合物，本发明的式(I)化合物及其中间体化合物以及它们的可药用盐具有抑制乙型肝炎病毒DNA(HBVDNA)复制和降低乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的表达功能。该类1-氧-取代苯甲酰奎尼酸类化合物及其中间体化合物可以预期用于制备治疗相关的乙肝病毒感染性疾病的药物用途。文档编号C07C69/76GK101293836SQ20081006245公开日2008年10月29日申请日期2008年6月17日优先权日2008年6月17日发明者冯治国,巫秀美,李校堃,李海波,佳瞿,胡利红,昱赵,黄可新申请人:温州医学院