专利名称：：拟茎点菌素化合物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及两种化合物，尤其是涉及一类来源于海藻真菌一拟茎点属hzla01-l(i^omo;w^sp.hzlaOl-l)的具有抗菌活性的拟茎点菌素化合物及其制备方法，以及它们在制备抗菌药物中的应用。
背景技术：
：抗菌药物的临床应用，使感染性疾病的发生及转轨产生了根本性的变化，同时也带来两种后果，即临床常见致病菌的改变和菌株耐药性的变迁。因此，寻找高效、广谱和安全的抗菌药物是一个十分紧迫的问题。海洋微生物由于其特殊的生存环境(高盐、高压、低温、低光照和寡营养)，从而可合成一些结构新颖的抗菌药物，是筛选抗菌新药的重要资源库之一。目前已从海藻真菌中分离鉴定了许多特殊结构、活性独特的新化合物，其中有些具有较强的抗菌活性。Bugni([1]BugniTS,JansoJE,WilliamsonRT，efa/..DictyosphaericAcidsAandB:NewDecalactonesfromanUndescribed/^m'"7/iw附sp.ObtainedfromtheAlgaZ)/c(yos//iaen'flvera/—[J].J.Nat.Prod.2004,67:1396-1399)等从海藻Z^c/yosp/taen'awrs/i^!!'中分离到内生真菌尸ew'"7/z'wwsp.，从其代谢产物中分离到两个新的聚酮类化合物dictyosphaericacidA和dictyosphaericacidB，这两个化合物具有罕见的十元环内酯结构。目前仅有两个具有相同碳骨架的化合物见报道，其中dictyosphaericacidA具有抗革兰氏阳性菌活性，当以50ng/孔试验时，对甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌和耐万古霉素粪肠球菌的抑菌圈分别为llmm和7mm。五环化合物SeragakinoneA来源于从角网藻(CeratotfeOw^o"g/o^m)分离的真菌，对白色假丝酵母有微弱的抗菌活性，对金黄色葡萄球菌、结膜干燥棒状杆菌、藤黄微球菌和枯草杆菌有中等的抗菌活性，MIC值分别为83、20、10、20和41pg/mL([2]ShigemoriH,KomatsuK,MikamiaY,aa/..SeragakinoneA,aNewPentacyclicMetabolitefromaMarine-DerivedFungus[J].Tetrahedron,1999，55:14925-14930)。海洋真菌Z>ecfes/eraifewarioWea来自海洋红藻Zz'agoravh^Ja，从其固体代谢产物中分离得到10个新倍半萜化合物，其中DrechslerineD禾卩DrechslerineF能抑制/a/"jrara附的生长，IC50^5.1ng/mL。Lorenz等从来源于马尾藻(&rgo^K/Msp.)的曲霉(^y;7^gz7/^sp.)的发酵液中分离到一个具有抗真菌活性的二酮哌嗪类(环縮二氨酸)化合物mactanamide([4]BugniTS，IrelandCM.Marine-derivedfiingi:achemicallyandbiologicallydiversegroupofmicroorganisms[J].Nat.Prod.Rep.,2004，21:143-163)。我国海藻分布广，种类多，在这些海藻中广泛分布着各种海藻真菌，具有得天独厚的海藻真菌资源优势。然而，国内对海藻共附生真菌的研究极少，迄今为止鲜见对海藻真菌活性物质的研究报道。
发明内容本发明的目的在于提供一类来源于海藻真菌的具有强抗菌活性，可应用于抗菌药物的拟茎点菌素化合物及其制备方法。本发明的另一目的在于提供拟茎点菌素化合物在制备抗菌药物中的应用。本发明所用的海藻真菌为拟茎点属hzla01-lCPtowo戸hsp.hzla01-l)，已于2007年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC中国武汉大学)，保藏号为CCTCCNO:M207184。本发明所述的拟茎点菌素化合物是从海藻真菌拟茎点属hzla01-l(户/wmo;w^sp.hzla01-l)的发酵产物中得到的两种结构类似的新化合物，两种新化合物分别为拟茎点菌素化合物A，(6Z，8E)-3-propyl-4,ll-dioxa-bicyclo[8丄0]undeca-6，8-dien隱5-one(简称化合物A)和拟茎点菌素化合物B，(E)-7-hydroxy-3-propyl-4,ll-dioxa-bicyclo[8丄0]undec-8-en-5-one(简称化合物B)。拟茎点菌素化合物A和拟茎点菌素化合物B的结构式分别为A拟茎点菌素化合物A为无色油状物，HRESI-Q-TOFw/z209.1235[M+H]+，417.2404[2M+H]+(calcdforC12H1603);13C-NMR数据见表1。拟茎点菌素化合物B为无色针状晶体，HRESI-Q-TOFw/z227.1435[M+H]+，453.2758[2M+H]+(calcdforC12H1804);!H-，13C-NMR数据见表1。表1化合物A和B的iH-，13C-NMR数据<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>本发明所述的拟茎点菌素化合物的制备方法包括以下步骤1)拟茎点属hzla01-l(户/wwo戸红sp.hzla01-l)的种子培养a.菌株的斜面培养马铃薯去皮、切成小块，加水煮沸，纱布过滤，得马铃薯滤液，马铃薯滤液中加葡萄糖和琼脂，海水定容，灭菌，得斜面培养基；将斜面培养基制成试管斜面，挑取拟茎点属hzla01-l菌种接入斜面培养基，培养得斜面菌种；b.菌株的种子培养采用与步骤1)a相同的方法制得马铃薯滤液，在马铃薯滤液中加葡萄糖和琼脂，灭菌，得种子培养基；将种子培养基倒平板，冷却后，将上述培养的斜面菌种转接到种子培养基中，培养后得种子平板；2)拟茎点属hzla01-l(尸/zowo/w"sp.hzla01-l)的发酵培养采用与步骤l)a相同的方法制得马铃薯滤液，在马铃薯滤液中加葡萄糖和琼脂，海水定容，灭菌，得发酵培养基；将发酵培养基倒平板；冷却后，将上述种子平板转接到发酵培养基中，发酵后得发酵物；3)拟茎点菌素化合物的提取将发酵物切成小块，用混合有机溶剂浸提，合并提取液，减压浓缩至干，甲醇溶解过滤，滤液减压浓縮至干，加入少量水，再用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯相减压浓縮得到浸膏；4)拟茎点菌素化合物的精制浸膏用中压液相柱层析，甲醇/水梯度洗脱得到组分l和组分2;组分l用两次硅胶柱层析，有机溶剂洗脱，得到化合物A;组分2用凝胶柱层析，有机溶剂洗脱，所得组分用正相硅胶柱和反相硅胶柱层析，得到化合物B。在步骤l)a中，加水煮沸的时间最好为30min。所得马铃薯滤液中所加的葡萄糖与马铃薯的质量比最好为10:1，所加的琼脂与马铃薯的质量比最好为10:1。海水定容采用海水与自来水混合定容，海水占混合水的总体积最好为10%100%。灭菌在121'C下灭菌20min。培养斜面菌种是在2330'C培养37d。在歩骤l)b中，在每升马铃薯滤液中加1030g葡萄糖和1030g琼脂。海水定容采用海水与自来水的混合水定容，其中海水占混合水的总体积为10%100%。灭菌在121'C下灭菌20min。在233(TC培养37d得种子平板。在步骤2)中，加水煮沸的时间最好为30min。在每升马铃薯滤液中加1030g葡萄糖和1030g琼脂。海水定容采用海水与自来水的混合水定容，其中海水占混合水的总体积为10%100%。灭菌在121'C下灭菌20min。发酵在2330"C培养1018d。在步骤3)中，混合有机溶剂采用乙酸乙酯-甲醇-乙酸。减压浓縮采用旋转蒸发仪减压浓縮。在步骤4)中，甲醇/水=0/100到100/0，v/v;组分1两次硅胶柱层析的有机溶剂分别为石油醚-乙酸乙酯和石油醚-丙酮，石油醚-乙酸乙酯=10:1到1:1，v/v，石油醚-丙酮=50:l到l:l，v/v;组分2用凝胶柱层析的有机溶剂为乙酸乙酯、氯仿、丙酮、甲醇中的一种，所得组分用正相硅胶柱层析采用氯仿-甲醇=200:1到10:1，v/v，洗脱，用反相硅胶柱层析采用甲醇-水梯度洗脱。所述的拟茎点菌素化合物A或拟茎点菌素化合物B在制备抗菌药物中的应用。本发明具有以下突出的优点和效果经实验检测，拟茎点菌素化合物A和拟茎点菌素化合物B具有很强的抗菌活性。拟茎点菌素化合物A对大肠杆菌的MIC为5pg/mL，而拟茎点菌素化合物B对白色假丝酵母、酿酒酵母、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的MIC均为5pg/mL。MIC表示没有实验菌生长的最小的样品浓度。由于拟茎点菌素化合物A和拟茎点菌素化合物B具有很强的抗菌活性，因此可将它们应用于制备抗菌药物。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。实施例1A.培养基配方斜面培养基配方取200g马铃薯去皮，切成小块，加水煮沸30min，4层纱布过滤，滤液中加20g葡萄糖，20g琼脂，用50%海水(海水与自来水按体积比混合)定容至1000mL。种子培养基配方，在每升马铃薯滤液(制备方法同上)中加20g葡萄糖和20g琼脂，用50%海水(海水与自来水按体积比混合)定容至1000mL。发酵培养基配方同种子培养基。B.发酵工艺:斜面培养:按上述斜面培养基配方配制培养基，分装试管，12rC灭菌20min，制成斜面培养基。挑取拟茎点属hzla01-l(尸/w膨;w红sp.hzla01-l)转接至斜面培养基上，28°C培养3d;按种子培养基配方配制培养基，灭菌(121°C，30min)，将种子培养基倒平板，20mL/培养皿，冷却后，将上述培养的斜面菌种转接到种子培养基中，培养后得种子平板。按发酵培养基配方配制培养基，将上述培养好的种子平板转接入发酵培养基中，28。C培养13d。C.拟茎点菌素化合物的提取将发酵物切成小块，用乙酸乙酯-甲醇-乙酸(80:15:5)混合有机溶剂浸提，合并提取液用旋转蒸发仪减压浓縮至干，甲醇溶解过滤，滤液减压浓縮至干，加入少量水，再用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相减压浓縮得到浸膏。D.拟茎点菌素化合物的精制浸膏用中压液相柱(RP-18)层析，甲醇/水(甲醇/水=0/100到100/0，v/v)梯度洗脱得到组分1和组分2。组分1用两次硅胶柱层析，洗脱剂分别为石油醚-乙酸乙酯(5:1，v/v)和石油醚-丙酮(石油醚-丙酮=10:1到5:1，v/v)得到化合物A;组分2用凝胶柱(SephadexLH-20)层析，用甲醇洗脱。所得组分先用正相硅胶柱层析，氯仿-甲醇=100:1(v/v)洗脱；再用反相硅胶柱层析，甲醇-水=5:5(^力洗脱，得到化合物B。实施例2A.培养基配方斜面培养基配方取300g马铃薯去皮，切成小块，加水煮沸30min，4层纱布过滤，滤液中加30g葡萄糖，30g琼脂，用100%海水(海水与自来水按体积比混合)定容至1000mL。种子培养基配方，在每升马铃薯滤液(制备方法同上)中加30g葡萄糖和30g琼脂，用100%海水(海水与自来水按体积比混合)定容至1000mL。发酵培养基配方同种子培养基。B.发酵工艺:斜面培养按上述斜面培养基配方配制培养基，分装试管，12rC灭菌20min，制成斜面培养基。挑取拟茎点属hzla01-l(i^omo戸&sp.hzla01-l)转接至斜面培养基上，28°C培养5d;按种子培养基配方配制培养基，灭菌(12rC，30min)，将种子培养基倒平板，20mL/培养皿，冷却后，将上述培养的斜面菌种转接到种子培养基中，培养后得种子平板。按发酵培养基配方配制培养基，将上述培养好的种子平板转接入发酵培养基中，28'C培养15d。C.拟茎点菌素化合物的提取将发酵物切成小块，用乙酸乙酯-甲醇-乙酸(85:10:5)混合有机溶剂浸提，合并提取液用旋转蒸发仪减压浓縮至干，甲醇溶解过滤，滤液减压浓縮至干，加入少量水，再用乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯相减压浓縮得到浸膏。D.拟茎点菌素化合物的精制浸膏用中压液相柱(RP-18)层析，甲醇/水(甲醇/水=0/100到100/0，v/v)梯度洗脱得到组分1和组分2。组分1用两次硅胶柱层析，洗脱剂分别为石油醚-乙酸乙酯(4:1，v/v)和石油醚-丙酮(石油醚-丙酮=8:1到6:1，v/v)得到化合物A;组分2用凝胶柱(SephadexLH-20)层析，用乙酸乙酯洗脱。所得组分先用正相硅胶柱层析，氯仿-甲醇=80:1(v/v)洗脱；再用反相硅胶柱层析，甲醇-水二3:2(v/v)洗脱，得到化合物B。实施例3A.培养基配方斜面培养基配方取150g马铃薯去皮，切成小块，加水煮沸30min，4层纱布过滤，滤液中加15g葡萄糖，15g琼脂，用30%海水(海水与自来水按体积比混合)定容至1000mL。种子培养基配方，在每升马铃薯滤液(制备方法同上)中加15g葡萄糖和15g琼脂，用30%海水(海水与自来水按体积比混合)定容至1000mL。发酵培养基配方同种子培养基。B.发酵工艺:斜面培养按上述斜面培养基配方配制培养基，分装试管，12rC灭菌20min，制成斜面培养基。挑取拟茎点属hzla01-lCP/wwo戸^sp.hzla01-l)转接至斜面培养基上，28°C培养7d;按种子培养基配方配制培养基，灭菌(121°C，30min)，将种子培养基倒平板，20mL/培养皿，冷却后，将上述培养的斜面菌种转接到种子培养基中，培养后得种子平板。按发酵培养基配方配制培养基，将上述培养好的种子平板转接入发酵培养基中，28'C培养18d。C.拟茎点菌素化合物的提取将发酵物切成小块，用乙酸乙酯-甲醇-乙酸(75:20:5)混合有机溶剂浸提，合并提取液用旋转蒸发仪减压浓縮至干，甲醇溶解过滤，滤液减压浓縮至干，加入少量水，再用乙酸乙酯萃取5次，合并乙酸乙酯相减压浓縮得到浸膏。D.拟茎点菌素化合物的精制浸膏用中压液相柱(RP-18)层析，甲醇/水(甲醇/水=0/100至lj100/0，v/v)梯度洗脱得到组分1和组分2。组分1用两次硅胶柱层析，洗脱剂分别为石油醚-乙酸乙酯(6:1，v/v)和石油醚-丙酮(石油醚-丙酮=15:1到4:1，v/v)得到化合物A;组分2用凝胶柱(SephadexLH-20)层析，用丙酮洗脱。所得组分先用正相硅胶柱层析，氯仿-甲醇=50:1(v/v)洗脱；再用反相硅胶柱层析，甲醇-水二7:3(v/v)洗脱，得到化合物B。实施例4采用微量二倍稀释法对拟茎点菌素化合物进行抗菌活性检测。用无菌水将斜面上培养的指示菌洗下，制成菌体或孢子浓度为107CFU/mL的菌液，4'C保存备用。使用时，与适量培养基混匀(细菌终浓度约为105CFU/mL，真菌终浓度约为104CFU/mL)。将待测样品溶解于甲醇中，配制成一定浓度的溶液，把样品加到96孔细胞板中，采用微量二倍稀释法稀释样品。未加待测样品只含指示菌的为阴性对照；只含培养基的为空白对照；阳性对照指示菌为细菌时用氨苄青霉素，指示菌为真菌时用两性霉素B。细菌37'C培养24h，真菌25'C培养48h，肉眼观察，没有菌生长的最小的样品浓度即为MIC。结果表明(见表2)，拟茎点菌素A和B具有很强得抗菌活性。拟茎点菌素A对大肠杆菌的MIC为5pg/mL，而拟茎点菌素B对白色假丝酵母、酿酒酵母、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的MIC均为5pg/mL。表2拟茎点菌素化合物的抗菌活性MIC(ng/mL)_大肠杆菌枯草芽孢杆菌~~金黄色葡萄球菌CMCC44103CMCC63501CMCC260035_^_^_*:化合物在l(Hig/mL时没有抗菌活性。指示菌白色假丝酵母酿酒酵母权利要求1.拟茎点菌素化合物，其特征在于所用的海藻真菌为拟茎点属hzla01-1(Phomopsissp.hzla01-1)，已于2007年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC中国武汉大学)，保藏号为CCTCCNOM207184，所述的拟茎点菌素化合物是从海藻真菌拟茎点属hzla01-1(Phomopsissp.hzla01-1)的发酵产物中得到的两种结构类似的新化合物，两种新化合物分别为拟茎点菌素化合物A，(6Z，8E)-3-propyl-4，11-dioxa-bicyclo[8.1.0]undeca-6，8-dien-5-one和拟茎点菌素化合物B，(E)-7-hydroxy-3-propyl-4，11-dioxa-bicyclo[8.1.0]undec-8-en-5-one；拟茎点菌素化合物A和拟茎点菌素化合物B的结构式分别为拟茎点菌素化合物A为无色油状物，HRESI-Q-TOFm/z209.1235[M+H]+，417.2404[2M+H]+(calcdforC12H16O3)；拟茎点菌素化合物B为无色针状晶体，HRESI-Q-TOFm/z227.1435[M+H]+，453.2758[2M+H]+(calcdforC12H18O4)。2.如权利要求l所述的拟茎点菌素化合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤1)拟茎点属hzlaOl-l的种子培养a.菌株的斜面培养马铃薯去皮、切成小块，加水煮沸，纱布过滤，得马铃薯滤液，马铃薯滤液中加葡萄糖和琼脂，海水定容，灭菌，得斜面培养基；将斜面培养基制成试管斜面，挑取拟茎点属hzla01-l菌种接入斜面培养基，培养得斜面菌种；b.菌株的种子培养采用与步骤1)a相同的方法制得马铃薯滤液，在马铃薯滤液中加葡萄糖和琼脂，灭菌，得种子培养基；将种子培养基倒平板，冷却后，将上述培养的斜面菌种转接到种子培养基中，培养后得种子平板；2)拟茎点属hzla01-l(尸/2owop^ysp.hzla01-l)的发酵培养采用与步骤l)a相同的方法制得马铃薯滤液，在马铃薯滤液中加葡萄糖和琼脂，海水定容，灭菌，得发酵培养基；将发酵培养基倒平板；冷却后，将上述种子平板转接到发酵培养基中，发酵后得发酵物；3)拟茎点菌素化合物的提取将发酵物切成小块，用混合有机溶剂浸提，合并提取液，减压浓縮至干，甲醇溶解过滤，滤液减压浓縮至干，加入少量水，再用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯相减压浓縮得到浸膏；4)拟茎点菌素化合物的精制浸膏用中压液相柱层析，甲醇/水梯度洗脱得到组分l和组分2;组分l用两次硅胶柱层析，有机溶剂洗脱，得到拟茎点菌素化合物A;组分2用凝胶柱层析，有机溶剂洗脱，所得组分用正相硅胶柱和反相硅胶柱层析，得到拟茎点菌素化合物B。3.如权利要求2所述的拟茎点菌素化合物的制备方法，其特征在于在步骤l)a中，加水煮沸的时间为30min，所得马铃薯滤液中所加的葡萄糖与马铃薯的质量比为10:1，所加的琼脂与马铃薯的质量比为io:i。4.如权利要求2所述的拟茎点菌素化合物的制备方法，其特征在于在步骤l)a中，海水定容采用海水与自来水混合定容，海水占混合水的总体积为10%100%，培养斜面菌种是在233(TC培养37d。5.如权利要求2所述的拟茎点菌素化合物的制备方法，其特征在于在步骤l)b中，在每升马铃薯滤液中加1030g葡萄糖和1030g琼脂，海水定容采用海水与自来水的混合水定容，其中海水占混合水的总体积为10%100%，在233(TC培养37d得种子平板。6.如权利要求2所述的拟茎点菌素化合物的制备方法，其特征在于在步骤2)中，加水煮沸的时间为30min，在每升马铃薯滤液中加1030g葡萄糖和1030g琼脂，海水定容采用海水与自来水的混合水定容，其中海水占混合水的总体积为10%100%，发酵在2330。C培养1018d。7.如权利要求2所述的拟茎点菌素化合物的制备方法，其特征在于在步骤3)中，混合有机溶剂采用乙酸乙酯-甲醇-乙酸。8.如权利要求2所述的拟茎点菌素化合物的制备方法，其特征在于在步骤4)中，甲醇冰=0/100到100/0，v/v。9.如权利要求2所述的拟茎点菌素化合物的制备方法，其特征在于在步骤4)中，组分1两次硅胶柱层析的有机溶剂分别为石油醚-乙酸乙酯和石油醚-丙酮，石油醚-乙酸乙酯=10:1到1:1，v/v，石油醚-丙酮=50:1到1:1，v/v;组分2用凝胶柱层析的有机溶剂为乙酸乙酯、氯仿、丙酮、甲醇中的一种，所得组分用正相硅胶柱层析采用氯仿-甲醇=200:1到10:1，v/v，洗脱，用反相硅胶柱层析采用甲醇-水梯度洗脱。10.如权利要求1所述的拟茎点菌素化合物在制备抗菌药物中的应用。全文摘要拟茎点菌素化合物及其制备方法和应用，涉及两种化合物。提供一类来源于海藻真菌的具有强抗菌活性，可应用于抗菌药物的拟茎点菌素化合物及其制备方法和应用。海藻真菌为拟茎点属hzla01-1(Phomopsissp.hzla01-1)。化合物分别为拟茎点菌素化合物A和B，化合物A为无色油状物，化合物B为无色针状晶体。拟茎点属hzla01-1的种子培养，拟茎点属hzla01-1的发酵培养，拟茎点菌素化合物的提取，拟茎点菌素化合物的精制。经药理实验证实该类化合物具有显著的抗菌作用，可用于制备新的抗菌药物。文档编号C07D493/04GK101235040SQ20081007062公开日2008年8月6日申请日期2008年2月4日优先权日2008年2月4日发明者宋思扬,杜希萍,沈月毛,苏文金,郑忠辉,黄耀坚申请人:厦门大学