专利名称：：3，6-二取代甾体肟类化合物作为抗肿瘤药物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一类3，6-二取代甾体肟类化合物及其合成方法，以及其在制备治疗癌症药物中的应用。(二)
背景技术：
：癌症是对人类健康和生活素质危险最大的疾病之一。寻找高效、高选择性和副作用小的抗癌药物是抗癌药物开发的主要方向。在抗癌药物的研究中，曾报导过4-烯-6-肟甾体化合物(Krstic'^N.M.;Bjelakovic',M.S.;Ziz'akb，Z.;Pavlovic，M.D.;Jurani'c，Z.D.;Pavlovi'c，V.D.Synthesisofsomesteroidaloximes，lactams,thiolactamsandtheirantitumoractivities,2007，steroids,72:406^14)、3-羰基-4-烯-6-后甾体化合物、3-羟基-4-烯-6-后甾体化合物(Deive，N.;Rodn'guez,丄；Jime'nez^C.，Synthesisofcytotoxic6￡-hydroximino-4-enesteroids:structure/activitystudies,/Afed.CAe附.2001，44,2612-2618;)、2國茅5基國3-羰基-1，4-二烯陽6-后甾体化合物(Po叫J.;Rega^M.;Paz，V.;Alonso，B.;Rodn'guez，J.;Salvador,N.;Fema'ndezbA.;Jime'nezC.Synthesisandevaluationofnew6-hydroximinosteroidanalogsascytotoxicagents,Bioorg.Med.Chem.2007，15:4722~4740)和4-烯-3-烃基胺乙基肟甾体化合物(Jindal，D.P.;Chattopadhaya^R.;Guleria^S.;Gupta^R.Synthesisandantineoplasticactivityof2-alkylaminoethylderivativesofvarioussteroidaloximes，Euro.J.Med.Chem"2003，38:1025-1034)在体外对某些肿瘤细胞具有显著细胞毒性。但是在进行动物体内评估时发现这些化合物的抗癌作用并不明显，目前未能在临床上作为抗癌药物使用。(三)
发明内容本发明的目的是提供一类3，6-二取代甾体肟类化合物，该类化合物的合成方法及其在制备治疗癌症药物中的应用。本发明的3，6-二取代甾体肟类化合物具有下列通式l:(1)其中，R为拥有l-14个C原子的直链或具有不同位置取代支链的碳链或拥有不同官能团取代基的碳链，或者是含有不同杂原子的官能团如-OS03Na、=NOH、-OH、=0、-OCH2CH2N(R)2、一N(CH2CH2C1)2、卤素、-SH、-OR中不同的取代基。Ri和R2为-OS03Na、=NOH、-OH、=0、-OCH2CH2N(R)2、一N(CH2CH2C1)2、卤素、-SH、-OR等不同的取代基。和R2可以是相同的取代基，也可以是不同的取代基，但在或R2中至少有一个是=NOH(肟基)取代基。本发明的3，6-二取代甾体肟类化合物，可由天然甾体化合物经过化学修饰得到。如胆甾醇经过3-位羟基的官能团转换，5-位烯基转化为6-位取代基得到(3E，6E)-二肟基胆甾烷。所说的天然甾体化合物，包括胆甾醇、豆甾醇，谷甾醇、孕甾醇酮、剑麻皂甙等甾体化合物。制备本发明3,6-二取代甾体肟类化合物中的部分化合物的反应式如下所示1)(3E，6E)-二肟基胆甾烷(5)的合成452)(3E，6E，20E)-3,6，20-三肟基孕甾烷(IO)的合成67891046)(6E)-肟基-胆甾-3-硫酸酯钠盐(15)的合成其它类似的3，6-二取代甾体肟类化合物可通过采用不同的底物，如具有不同支链或不同甾核结构的底物，参照类似的方法通过甾核或支链的改造得到。例如从谷甾醇出发，采用与(3E)-后基-6-羰基胆甾垸(11)的合成相类似的反应路线，可得到24-乙基-(3E)-后基-6-羰基胆甾烷(16)。通过体外癌细胞抑制活性试验表明，本发明的3，6-二取代甾体肟类化合物对多种肿瘤细胞株如肝癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌等有显著的抑制作用。在动物体内试验也表明，本发明的化合物对小白鼠皮下植入的卵巢癌、乳腺癌等肿瘤具有明显的抑制作用，因此本发明的3，6-二取代甾体肟类化合物可用于制备治疗癌症的药物。本发明还提供一种用于治疗癌症的药物，其含有上述3，6-二取代甾体肟类化合物以及药学上可接受的辅助剂。该药物可以制成注射剂、，片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮剂或乳剂的形式使用，其给药途径可为口服，或经皮下、静脉或肌肉注射。具体实施方式以下通过实施例对本发明作进一步说明。实施例l:(3E，6E)-二肟基胆甾垸(5)的制备步骤l:中间产物(2)的制备胆甾醇1.544g(4mmo1)溶于无水二氯甲烷30mL，加入PCC(pyridiniumchlorochromate)5.200g(24mmo1)。室温下反应29h，加入乙醚30mL，采用硅胶短柱过滤，用乙醚不断淋洗。减压蒸去滤液中的溶剂，残留的黄色固体通过柱层析分离，得到4-烯-3，6-二羰基胆甾烷(2)1.211g，产率76%。产物结构经IR，NMR和MS分析确定。步骤2:中间产物(3)的制备200mg(0.50mmol)4-烯-3，6-二羰基胆甾垸(2)溶于20mL甲醇中，加入120mg(0.50mmo1)NiCl2.6H20，溶解完全后。于1min内快速加入90mg(2.37腿o1)NaBH4，20min后停止反应，蒸去大部分甲醇，加进适量水，用乙酸乙酯15mLx3萃取，洗至中性，无水硫酸钠干燥。蒸去溶剂，粗产品经柱层析分离得到产物3,6-二羟基胆甾垸(3)，产率为81%。产物结构经IR,NMR和MS分析确定。步骤3:中间产物(4)的制备3，6-二羟基胆甾垸(3)82mg溶于10mL丙酮，在冰浴中逐滴加入0.2mL琼斯试剂，继续反应10min.，用饱和NaHC03中和至PH-7,,萃取、干燥，减压蒸去溶剂，柱层析分离得到3,6-二羰基胆甾烷(4)，产率88%。产物结构经IR，NMR和MS分析确定。步骤4:化合物(5)的制备202mg(0.5mmo1)3,6-二羰基胆甾烷(4)溶于20mL95%乙醇中，60。C时加入NaOAc'3H20272mg(2mmo1),溶解后，一次性加入138mg(2mmo1)NH20H'HC1，lh后停止反应，蒸去大部分乙醇，加入少量水，乙酸乙酯萃取，有机层用蒸馏水、饱和食盐水洗涤，干燥并蒸去溶剂后，柱层析分离后得到产物(3E，6E)-二肟基胆甾垸(5)，产率86%。产物结构经IR，NMR和MS分析确定。实施例2:(3E，6E，20E)-3，6，20-三肟基孕甾烷(10)的制备步骤l:中间产物(7)的制备2.212g孕烯醇酮(6)用60mLCH2Cl2溶解后，加入PCC9.100g，室温下反应30h.后停止反应。反应物倾进一硅胶短柱，乙酸乙酯洗脱，乙酸乙酯相分别用饱和碳酸氢钠溶液、水、饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥。减压蒸出溶剂，柱层析分离得到化合物孕甾-4-烯-3，6,20-三酮(7)1.522g，产率66.3%。产物结构经IR，NMR和MS分析确定。步骤2:中间产物(9)的制备室温下164mg(0.5mmol)化合物(7)溶解于15mL无水甲醇，加入120mg(0.5mmo1)NiCl2'6H20，完全溶解后，一次性加入60mg(1.58mmol)NaBH4，反应30min后，用1MHC1中和反应液至PH-7，减压蒸去大部分甲醇，乙酸乙酯萃取，有机层分别水洗、饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥。蒸去溶剂，得到白色固体(8)，该白色固体不需提纯，直接用8mL丙酮溶解，逐滴加入琼斯试剂，不断搅拌，当溶液橙色不再退去时，停止加入琼斯试剂，继续反应10min.，用饱和NaHC03中和至PH7，乙酸乙酯萃取，有机层水洗、饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥。减压蒸去溶剂，柱层析分离得到化合物孕甾-3，6，20-三酮(9)142mg，产率84.5%。产物结构经IR，NMR和MS分析确定。步骤3:化合物(10)的制备165mg(0.5mmol)孕甾-3,6，20-三酮(9)溶于25mL95%乙醇，溶解后在60。C下加入三水乙酸钠238mg(1.75mmo1)、盐酸羟胺121mg(1.75mmo1)，在60。C左右反应一小时。停止反应，减压蒸出大部分乙醇。然后加入少量蒸馏水，有白色^:淀生成。加入乙酸乙酯溶解固体，乙酸乙酯萃取，有机层洗至中性。无水硫酸钠干燥，减压蒸出溶剂，得到白色固体，板层析分离得到化合物(3E,6E，20E)-3,6,20-三肟基孕甾垸(10)169mg，产率90%。产物结构经IR，NMR和MS分析确定。实施例3:6-羰基-(3E)-肟基胆甾烷(ll)的制备0.152mmol3，6-二羰基胆甾垸(4)溶解于10mL95%乙醇中，60。C时加入NaOAc'3H200.152mmol，溶解后分批加入0.167mmolNH2OH.HCl。lh后停止反应，蒸去大部分乙醇，加入少量水，乙酸乙酯萃取，有机层用蒸馏水、饱和食盐水洗涤，干燥并蒸去溶剂后，柱层析分离后得到产物6-羰基-(3E)-肟基胆甾垸(11)，产率90.2%。产物结构经IR，NMR和MS分析确定。实施例4:6-羟基-(3E)-诉基胆甾烷(12)的制备(3E)-肟基-6-羰基胆甾烷(11)3001^溶解于301^无水甲醇中，然后分批加入55mgNaBH4，反应lh后，用1MHC1中和到PH-7终止反应。蒸去大部分甲醇，加入少量水，有大量白色固体析出，用乙酸乙酯溶解固体，并用乙酸乙酯萃取。有机层洗至中性，无水硫酸钠干燥。减压蒸去溶剂，柱层析分离得到化合物6-羟基-(3E)-肟基胆甾烷(12)220mg，产率74%。产物结构经IR,NMR和MS分析确定。实施例5:3-羟基-(6E)-肟基胆甾烷(14)的制备步骤l:中间产物(13)的制备3，6-二羰基-4-烯胆甾烷(2)119mg(0.3mmo1)与71mg(0.3mmol)NiCl2'6H2O溶于15rnL甲醇中，于5分钟内分批加入35mg(0.92mmo:l)NaBH4,反应5min后用1N盐酸淬灭反应，减压蒸去大部分甲醇，加入15mL水，乙酸乙f旨萃取，萃取液用饱和食盐水洗至中性。干燥，蒸去溶剂，粗产品柱层析分离得到3-羟基-6-羰基胆甾垸(10)87mg,产率72%。产物结构经IR，NMR和MS分析确定。步骤2:3-羟基-(6E)-肟基胆甾烷(14)的制备3-羟基-6-羰基胆甾烷(10)80mg(0.198mmo1)溶于15mL95%乙醇中，溶解后加入27mg(0.198mmo1)NaAc'3H20，搅拌10min后加入21mgNH2OH'HCl，在60。C左右继续反应3h，减压蒸去大部分乙醇，加入适量水，用乙酸乙酯萃取，有机相用饱和食盐水洗至中性，无水硫酸钠干燥，过滤并减压蒸去溶剂，粗产品柱层析分离得产物3-羟基-(6E)-肟基胆甾烷(14)，产率96%。产物结构经IR,NMR和MS分析确定。实施例6:(6E)-躬基胆甾-3-硫酸酯钠盐(15)的制备230mg化合物13和415mg三乙胺三氧化硫溶解于1.8mL吡啶中，氩气保护下在卯。C反应3h,将反应液直接倒入少量硅胶中，拌样，柱层析分离。产物用15mL95X乙醇溶解，加入118mgNaOAc'3H2O和40mgNH2OH'HCl，5(TC反应lh，蒸去大部分溶剂，柱层析分离得到化合物9256mg，产率86%。产物结构经IR，NMR和MS分析确定。实施例7:本实施例是采用本发明所述的3，6-二取代甾体肟类化合物对某些肿瘤细胞进行细胞毒性试验的测试结果。选择本发明的部分3，6-二取代甾体肟类化合物试验其对人肝癌细胞株(Sk-Hep-1)，肺癌细胞株(H-292)，前列腺癌细胞株(PC-3)，卵巢癌细胞株(Hey-1B)的细胞毒性。采用MTS方法，进行体外细胞毒性测定。在96孔板中培养的对数生长期细胞中加入不同浓度的3，6-二取代甾体肟类化合物，同时进行3个平行试验，与对照组进行比较，培养72小时后，加入MTS，测定其吸光度，分别计算抑制肿瘤细胞生长到50%时化合物的浓度，以ICso值表示，结果如表1所示表l某些3，6-二取代甾体肟类化合物抗肿瘤活性测试结果(MTS方法)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>权利要求1、一种3，6-二取代甾体肟类化合物，其特征在于所述的化合物具有下列通式(1)id="icf0001"file="S2008100734974C00011.gif"wi="47"he="37"top="37"left="88"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>其中R为拥有1-14个C原子的直链或具有不同位置取代支链的碳链或拥有不同官能团取代基的碳链，或者是含有不同杂原子的官能团如＝NOH、-OSO3Na、-OH、＝O、-OCH2CH2N(R)2、-N(CH2CH2Cl)2、卤素、-SH、-OR中不同的取代基。R1和R2为＝NOH、-OSO3Na、-OH、＝O、-OCH2CH2N(R)2、-N(CH2CH2Cl)2、卤素、-SH、-OR中不同的取代基。式(1)中的R1和R2可以是相同的取代基，也可以是不同的取代基，但在R1或R2中至少有一个是＝NOH(肟基)取代基。2.—种制备3，6-二取代留体肟类化合物的方法，其特征在于所述方法是1)将具有不同支链结构的3-羟基-5-烯甾体化合物经过氧化、还原、取代、加成的化学方法转化为3，6-二羟基甾体化合物；2)通过置换、取代、加成、氧化、还原的官能团转换方法，把3，6-二羟基甾体化合物转化为3，6-二取代甾体肟类化合物。3.—种如权利要求1所述3，6-二取代甾体肟类化合物的应用，其特征在于其单独或作为药用组合物作为制备治疗抗肿瘤药物的应用。全文摘要本发明涉及3，6-二取代甾体肟类化合物及其作为抗肿瘤药物在药物中的应用。实验证明本发明的3，6-二取代甾体肟类化合物对多种肿瘤细胞株具有明显的抑制作用，可用于制备治疗癌症的药物。本发明也涉及制备所述化合物的方法。所述的3，6-二取代甾体肟类化合物的化学结构式如式I所示。式中R为拥有1-14个C原子的直链或具有不同位置取代支链的碳链或拥有不同官能团取代基的碳链。R<sub>1</sub>和R<sub>2</sub>为-OSO<sub>3</sub>Na、＝NOH、-OH、＝O、-OCH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>N(R)<sub>2</sub>、-N(CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>Cl)<sub>2</sub>、卤素、-SH、-OR等不同的取代基。文档编号C07J9/00GK101245090SQ20081007349公开日2008年8月20日申请日期2008年3月14日优先权日2008年3月14日发明者周爱民,崔建国,磊范,黄立梁申请人:广西师范学院