一种重组水蛭素编码基因与应用的制作方法

专利名称：：一种重组水蛭素编码基因与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种重组水蛭素编码基因与应用。技术背景水蛭素是凝血酶的特异性直接抑制剂，水蛭素最初从欧洲医蛭唾液腺中提纯，现在用重组DNA技术可大量制备。水蛭素是由65个氨基酸残基组成的单链多肽，分子量为7,000Da。对其抑制作用的机理已做了大量研究。水蛭素分子包括两个功能区含3个二硫键结构的N端核心区域(1-52残基)和无规则的C端尾部(53-65残基)。水蛭素与凝血酶以l:1的方式形成一个非常紧密的非共价的可逆复合物，N端核心区域结合于凝血酶的水解活性位点，而C端尾部则结合于凝血酶对纤维蛋白原的识别位点。两个功能区以一种相互协调的方式与凝血酶结合。同时，水蛭素中的Pro46、Lys47、Pro48三肽结构，起着促进N端与活性位点结合等重要作用。水蛭素对凝血酶具有高度亲和性抑制作用，它是迄今为止世界上最强的凝血酶特异抑制剂。多形汉逊酵母(学名尸ic力iaa/7^/sfs，曾用名jyayseyw2a/Wj^orp力3)是目前国际上公认的一种理想的外源基因表达系统，适于大规模工业化生产外源蛋白。多形汉逊酵母的技术优势和产业化应用价值可归纳为①多形汉逊酵母的外源基因整合于细胞染色体中，重组菌株有丝分裂遗传稳定性高；②可利用甲醇氧化酶基因(M0X)和甲醛脱氢酶基因(FMD)等强启动子，高效地启动外源基因的表达；③具有自主复制序列(HARS)，重组的频率高，重组质粒可以高拷贝整合到染色体上，易获得高拷贝整合的转化子；④蛋白的表达通常在过氧化物酶体内进行，可使其免受细胞内蛋白酶的降解，并降低了对细胞的毒害作用；⑤能利用廉价的化学合成培养基进行细胞高密度发酵，不需要添加价格昂贵的天然组分，进一步降低了生产成本并提高了外源基因的表达水平；⑥耐高温，最适生长温度为37-43°C，生长速率快，大规模发酵的培养时间短；⑦发酵中以甘油或甲醇为唯一碳源和能源，能利用甘油的微生物不多，能利用甲醇的微生物更少，发酵染菌率低；⑧外源蛋白的表达量和分泌效率比酿酒酵母高10倍左右，且没有过度糖基化现象，因此适合于大规模发酵生产目的蛋白。
发明内容本发明的目的是提供一种重组水蛭素编码基因与应用。本发明提供的一种重组水蛭素编码基因，其氨基酸序列是序列表中的序列2自5'末端第7-459位所示；其中，所述重组水蛭素编码基因采用多形汉逊酵母偏爱密码子。含有所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。所述重组表达载体是如图1所示的pMPT-hirudin载体。本发明的另一个目的是提供一种含有所述基因的重组菌。将所述重组表达载体导入多形汉逊酵母中可获得含有所述基因的重组菌。其中，所述重组多形汉逊酵母的出发菌株可为发明专利CN1651570A中所述的多形汉逊酵母HU-IICCMCCNO.1218。多形汉逊酵母HU-IICCMCCNO.1218中乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(URA3)的第31位核苷酸残基后插入"GAACT"5个碱基，从而产生移码突变，移码突变导致第10位后的253个密码子全部被置换并且突变产生了共15个终止密码子，这表明URA3的结构基因已不可能再表达。GAAGT五个碱基同时产生回复突变的概率极小，实验也证明多形汉逊酵母HU-IICCMCCNO.1218的回复突变率为零；这种"0"回复突变率的宿主菌对转化筛选特别有利。所述重组菌是多形汉逊酵母(学名尸icAz'a朋^/s&，曾用名ife/^e/whpW，oip力3)205-17，所述205-17已于2008年3月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCCNo.2424。本发明所述的基因、所述的重组表达载体或所述重组多形汉逊酵母菌在生产水蛭素中的应用。本发明的重组多形汉逊酵母菌中重组水蛭素基因高拷贝整合，实时荧光定量PCR检测外源基因整合拷贝数高达198个，外源基因整合拷贝数为198个的重组多形汉逊酵母命名为多形汉逊酵母205-17CGMCCNo.2424。本发明的重组多形汉逊酵母菌生产水蛭素的实验结果表明，每升发酵上清液中重组水蛭素的含量达到2.0克左右；经过阳离子交换层析和反相层析纯化，纯度95%的重组水蛭素达到1.0克左右/升发酵上清液，生色底物法检测该纯度重组水蛭素的比活性达到19000ATU/mg。实验证明本发明的重组水蛭素能够抑制凝血酶的活性，可用于制备血液和血浆的抗凝剂。图l为pMPT-hirudin载体的构建示意图具体实施方式实施例1、重组水蛭素基因的获得水蛭素是由65个氨基酸组成的活性多肽，将氨基酸解译为相应的密码子时，尽量使氨基酸的密码子的频数分布与多形汉逊酵母偏爱密码子频数分布一致，为了便于克隆和表达，N端前面加了必须的碱基顺序，包括限制性内切酶识别位点I和^a历^I及酿酒酵母a信号肽序列，并反复搜寻调整使基因中不存在7个碱基以上的发卡结构序列；不存在启动子序列和核糖体结合位点如转录起始序列TATA和翻译位点GGAGG;不出现下列终止子序列如ATTATTTTAT、TTTTTATA(富含AT)…TTT、TAG(富含T)TA(T)GT等；只存在最高1处为7个碱基正向重复序列；并且基因转录后的RNA序列二级结构自由能降低至-135.90kcal/mo。最终确定由474个碱基组成的整个序列，如序列表中序列2所示。利用全人工合成方法合成序列表中序列2所示的DNA序列。其中，序列2的自5'末端第7-459位序列编码酿酒酵母a信号肽和水蛭素的融合蛋白；序列2的自5'末端第262-459位为水蛭素基因的编码序列，编码序列表中序列1的蛋白。^MI和fe/^I酶切合成的DNA序列，电泳回收酶切后的片段，-2(TC保存备用。实施例2、构建生产重组水蛭素的重组多形汉逊酵母a)载体pMPT-02的构建以多形汉逊酵母CGMCC2.2497基因组DNA为模板，克隆1.5kb的甲醇氧化酶基因(MOX)启动子、350bp的甲醇氧化酶基因(MOX)终止子、l.Okb的自主复制序列HARS;并从YIp5(GenBankAcessionNo.L09157)质粒中克隆出1.lkb的酿酒酵母脲嘧啶基因ScURA3;将上述4部分连接后，插入pBluescripII质粒的多克隆位点，构建成穿梭载体pMPT-02。b)载体pMPT-hirudin的构建用fcoTI和^3/^1酶切载体pMPT-02，低熔点琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的大片段，T4-DNA连接酶的作用下，与同样双酶切的合成的DNA序列连接，得到载体pMPT-hirudin,见图1。c)重组菌的获得用5"sc/酶切载体pMPT-hirudin,使载体线性化。线性化的载体通过电转化法(天津理工大学生产的LN-101型基因脉冲导入仪，1.5kV，50uF，200Q，3-5mSec)转化多形汉逊酵母(泡/^e"〃h/oA/zorp力3)CGMCCNO.1218。在含有13.4g/1000mlYNB(酵母氮源基础培养基)，20g/1000ml葡萄糖的培养基平板上筛选转化子。d)实时荧光定量PCR检测外源基因整合的拷贝数水蛭素基因通过质粒载体转化到受体菌并稳定整合后才能高效表达，其拷贝数一定程度上反映工程菌株能否高效表达目的蛋白。实时荧光定量PCR检测外源基因整合的拷贝数用来筛选水蛭素高表达的候选菌株。采用相对定量法，即同时对同一样品细胞中的外源基因(合成Hirudin基因)和已知单拷贝MOX基因进行扩增，通过两者比较而确定单个细胞内外源基因的拷贝数。实时荧光定量PCR检测引物序列如下，由大连宝生物工程有限公司合成。水蛭素基因正向引物5'-TCATCAACACCACTATTGCCTC-3';水蛭素基因反向引物5'-GGGATTTCCTCAAAGTCGC-3'。MOX基因正向引物5'-GCCACCTTCTACTCGTCCAG-3';MOX基因反向引物5'-ACTCCCAGTCGTCGTAGTCG-'3。用玻璃珠制备法(A.亚当斯等，《酵母遗传学方法实验指南》，科学出版社，2000)提取多形汉逊酵母(泡^eyH^a/x^7膨i7^a)重组水蛭素转化子基因组DNA。取某一基因组DNA溶液先稀释20倍，然后进行系列稀释，每次稀释10倍，稀释4次，此稀释要求精确。其他的基因组DNA溶液先稀释20倍，然后进行系列稀释，每次稀释10倍，稀释2次。以上述稀释后的基因组DNA溶液为模板。实时定量PCR反应体系总体积20uL，其中正反向引物(1Ommol/L)各0.5uL，EXPremixTaq(4mmol/LMg2+、0.4mmol/LdNTP、0.5UExTaq)10uL，SYBR0.5uL模板5uL。实时定量PCR检测使用澳大利亚CorbettResearch公司的荧光定量PCR仪(型号Rotor-Gene3000)。实时定量PCR反应热循环参数预变性94°C5min，变性94°C15secs，退火及延伸60°C50sees,35个循环。其中，所扩增Hirudin基因片段长度为241bp,扩增的MOX基因片段长度为145bp，扩增时两种片段都采用SYBRGreenl作为荧光指示剂，荧光强度变化由Rotor—Gene检测系统在每个循环延伸阶段末期进行检测，扩增反应结束后作溶解曲线，从6(TC缓慢升温到94°C，每5秒升温一次，每次升温0.5'C，每升高一次进行信号采集。利用Rotor"Gene5.0.28(CorbettResearch)软件分析样品拷贝数。将外源基因整合拷贝数高达198个的重组多形汉逊酵母工程菌株命名为多形汉逊酵母205-17，所述205-17已于2008年3月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCCNo.2424。e)高密度发酵生产重组水蛭素用多形汉逊酵母205-17CGMCCNo.2424高密度发酵生产重组水蛭素。①培养基的配制种子培养基20g/1000ml葡萄糖、13.4g/1000mlYNB;—级种子培养基200mL，二级种子培养基1600mL，高压灭菌。发酵培养基发酵起始体积12L;NH4H2P04192g、MgS04'7H2036g、苯二甲酸氢钾128g、NaCl4g、甘油384g，另加10mL消泡剂，罐内110-115。C高压灭菌30分钟。补料/去阻遏溶液共计5L;NH4H2P0480g、MgS(V7H2015g、苯二甲酸氢钾53g、NaCl1,7g，以上原料溶于1.25L水中，高压灭菌；另取3.75L甘油，高压灭菌。②发酵过程种子培养分两级扩大培养，-72"保存的多形汉逊酵母205-17CGMCCNo.2424菌种一支(lmL、OD6。。m"100)接入200mL—级种子培养基，3rC培养20小时转接1600mL二级种子培养基扩大培养，3rC培养18小时细胞0De。，达到10以上，作为发酵种子。发酵工艺用日本丸菱理化装置研究所生产的30L发酵罐(型号MSJ-J2)进行发酵工艺，用上海佳田制造有限公司的全自动电热蒸汽发生器(型号DZF26)产生的蒸汽对发酵罐进行灭菌，华东理工大学生物工程学院的FC-280型溶解氧监控仪进行溶氧的监测和控制。多形汉逊酵母205-17CGMCCNo.2424原代种子经两级种子扩大培养后，将ISOOmL二级种子接入装有12L发酵培养基灭菌的发酵罐中开始发酵。多形汉逊酵母205-17CGMCCNo.2424的发酵工艺主要包含两个时相，即生长时相和去阻遏时相。生长时相I发酵罐pH值控制设定在5.4-5.5;发酵温度控制3(TC;罐压0.5Kg/cm2。II生长时相中，发酵罐内溶氧会缓慢下降，当下降至60%左右时(发酵约16小时)，连接好补料管路，用蠕动泵匀速打入约385mL补料溶液。111当发酵罐溶氧水平降至40%以下时，将空气流量调至15L/min，搅拌转速调至700rpm。IV生长时相后期(发酵约22小时左右)，若细胞生长状态良好，发酵罐溶氧水平可下降至20%以下；细胞ODe。，达到80以上。去阻遏时相I溶氧回升前将蠕动泵电源插头与溶解氧监控仪信号输出电源连接；监控仪溶氧控制40%，死区为2%，高端打开；蠕动泵电源开关关闭。11当观察到发酵罐溶氧由最低点回升到60%以上时，进入去阻遏时相；此时打开蠕动泵电源开关，设定泵速22rpm，开始流加去阻遏溶液。m发酵罐pH值控制设定在3.9-4.0;细胞代谢产物偏酸性，pH可自然下降至控制点，只检测发酵液pH值，不控制，pH值自然下降至3.9时开始控制pH值，设定3.9-4.0。IV去阻遏后期，若细胞生长良好，ODei可达到350以上，发酵时间大约96小时。上述发酵实验重复三次。f)重组水蛭素的纯化及定量用阳离子交换层析和反相层析纯化重组水蛭素，高效液相色谱分析水蛭素纯度及含量。阳离子交换层析前微滤收获发酵液上清，用德国Sartorius公司的切向流微滤/超滤系统(型号Sartocon2Plus)，配以0.22um规格的膜包。取10L发酵液，微滤过程中进口压力保持在lbar，回流压力为0.5bar，滤过压力为0.2bar，通过微滤回收滤过端溶液4L。向切向流微滤/超滤系统中添加4L缓冲液(20raM，pH3.0的柠檬酸缓冲液)混匀，继续微滤回收滤过端溶液4L。再次向切向流微滤/超滤系统中添加4L同样柠檬酸缓冲液，混匀，微滤回收滤过端溶液4L。将三次回收的过滤端溶液合并共12L。阳离子交换层析采用如下方法应用SP-550Cmatrix(TosoHaas)阳离子-交换层析树脂填充层析柱(lOOramIDxl40咖)，在美国COMetro公司的层析系统(型号6000SeriesFPLCSystem)上经层析柱初级分离重组水蛭素。微滤收获12L样品与上样缓冲液(20raM，pH3.0的柠檬酸缓冲液)混合约18L至电导小于5mS/cm，用ftP04调节pH至3.0作为离子交换层析的上样液。层析柱使用前用0.5MNaOH清洁消毒。在室温下用5倍柱体积上样缓冲液平衡层析柱，280nm波长监测，上样液以150mL/min上柱，用2倍柱体积上样缓冲液流洗，用3倍柱体积洗脱液I(20mM，pH3.0的柠檬酸缓冲液和0.1MNaCl)洗脱层析柱，再用2倍柱体积洗脱液II(20mM，pH3.0的柠檬酸缓冲液和1.OMNaCl)洗脱层析柱，收集洗脱峰组分，用高效液相色谱检测各组分中水蛭素含量纯度。反相层析纯化采用如下方法用GC300sdmatrix(TosoHaas)层析树脂填充层析柱(49mmIDx490rran)，在美国LabAlliance公司的液相系统(Model500检测器，SeriesIII泵配40raL泵头)上经反向层析柱分离重组水蛭素。上一步阳离子交换层析洗脱液I洗脱收集组分作为反向层析的上样液。在室温下，流速25mL/min，依次用1个柱体积BufferA(0.1%三氯乙酸)、l个柱体积BufferB(0.1%三氯乙酸+40%异丙醇)和2个柱体积BufferA平衡层析柱，280nm波长监测。上样液以流速20mL/min上柱，以流速25mL/min用300min从100%BufferA到100%BufferB线性梯度洗脱层析柱，分部收集组分，用RP-HPLC检测各组分中水蛭素含量纯度，收集纯度大于95%的组分合并，冷冻干燥前4t:保存。高效液相色谱分析具体方法如下检测设备LabAlliance(Model500检测器，SeriesIII泵配10mL泵头)；分析软件ANASTARCHROMATOGRAPHY;分析柱C18柱4.6*250mm，5u，IOOA;流动相A液:5ml/100ral乙腈、高氯酸钠3.5g/100ml、0.lg/100ral三氟乙酸；B液:80ml/100ml乙腈、0.lg/100ml三氟乙酸。线性梯度时间流速AB01901016145551811090201109022190102519010流速lml/min;检测波长214nm。纯化得到的样品用德国MarinChrist公司的真空离心浓縮仪(型号RVC2-18)脱去异丙醇，用同一家公司的冷冻干燥机(型号ALPHA1-2LD)隔夜冷冻干燥后-2(TC保存。三批发酵、纯化得到纯度为95%以上的重组水蛭素总量分别为10.2g、9.8g和9.5g。2.重组水蛭素的抗凝比活性测定釆用生色底物的比色法，测定重组水蛭素的抗凝比活性。生色底物的比色法的原理是利用凝血酶水解生色底物ChroraonymTH中酰胺键产生生色效应，而水蛭素以1:l关系抑制凝血酶，通过比色法测定不同稀释度水蛭素的回归直线方程，可以精确测定出水蛭素的单位抗凝活性(ATU/ral)，ATU为能够完全中和1NIH单位凝血酶的水蛭素的量。实验重复3次。抗凝比活性(ATU/mg)二单位抗凝活性(ATU/ml)/单位蛋白(mg/ml)具体方法如下溶液的配制①工作液缓冲液Tris50mM，NaCl227raM，BSA0.1%(质量百分含量)，NaN30.1%(质量百分含量)，2MHC1调pH至8.3;②生色试剂ChromozymTH(Roche)，用工作液缓冲液配制成2mM;③凝血酶溶液，凝血酶(Sigma，NIHunits)溶于工作液缓冲液中，凝血酶终浓度为11.65IU/mL;④醋酸终止液，50%醋酸；⑤以水为溶剂，配制不同浓度的水蛭素样品溶液。测定步骤如下①7个1.5mL离心管，每管分别加入50uL不同浓度水蛭素样品溶液；②每管加入50uL凝血酶溶液，37。C保温5分钟；③每管加入50uL生色试剂ChromozyraTH，37。C反应2分钟；④每管加入50uL醋酸终止液；⑤每管补加600uL蒸馏水后，立即在405nm处测0D值。以水蛭素含量为横坐标，OD值为纵坐标，做线性回归，与横坐标交点处表明水蛭素在此含量下能全部抑制凝血酶的活力，假设这点横坐标截距为X，贝U:水蛭素抗凝比活性(ATU/mg)=(11.65X50/1000)/(X/10—6)第1次测定的回归方程为Y=-0.0127X+0.4027R2=0.9983抗凝比活性活性=(11.65X50/1000)/(31.7087/10—6)=18370.3ATU/mg第2次测定的回归方程为Y=-0.0158X+0.4672R2=0.9961抗凝比活性活性=(11.65X50/1000)/(29.5696/10—6)=19699.3ATU/mg第3次测定的回归方程为Y=-0.0161x+0.476R2=0.9973抗凝比活性活性=(11.65X50/1000)/(29.5652/10—6)=19702.2ATU/mg生色底物的比色法测定重组水蛭素的抗凝比活性的平均值为19257.3ATU/mg，达到现有的水蛭素的抗凝比活性最高水平。实施例4、重组水蛭素的应用与现在所用的抗凝剂不同，水蛭素是凝血酶的特异性直接抑制剂，它对血液细胞中无机物和蛋白质组份影响最小。为了保护体外检验用血液和血浆，向血液采集管加入抗凝剂和保护剂几乎是不可避免的事，但是它们的加入造成对血液样品的影响，可能干扰对某些检验项目的分析。因此某种抗凝剂更适合检测一些特定的项目，而其它抗凝剂则是禁忌的。含有本发明重组水蛭素的抗凝血浆同时适用于临床血液学(除综合凝血参数如活化部分凝血活酶时间、凝血酶原时间等不能测定外，单一凝血因子如纤维蛋白原、ATIII仍可测定)、临床生物化学、临床免疫学、临床血液流变学、免疫原型分析及RT-PCR技术等方面的检验。a.制备含有本发明的重组水蛭素的真空采血管通用真空采血管的制备按中华人民共和国卫行业标准WS/T224-2002"真空采血管及其添加剂"进行。使用单头喷雾机(浏阳市集里宏远吸塑包装机械厂)将上述获得的重组水蛭素喷涂于塑料管(PET管)(湖南安信医用高分子材料有限公司)内壁，喷雾量为0.02ml/次，每管喷涂2次，盖上丁基胶塞和塑料帽盖，然后抽真空，在管的外壁贴上带刻度标注的标签制成含有本发明重组水蛭素的真空采血管，将其命名为通用真空采血管。其中，水蛭素的喷涂量为100-2000ATU/ml血量。b.重组水蛭素对血细胞分析的影响使用重组水蛭素的喷涂量800ATU/ml血量的通用真空采血管与BD公司生产的K2-EDTA抗凝真空采血管随机采取体检者和住院患者的血液标本50份，每份血液标本2ml，进行21项血细胞分析检验。血细胞分析检验采用如下方法血细胞分析用日本光电CelltacMEK-6318型全自动血液分析仪(白细胞5分类)及其全部配套试剂。利用SPSS12.0软件对数据进行正态分布检验后，采用双变量相关性分析法(Spearman相关分析法)判断重组水蛭素的喷涂量800ATU/ml血量的通用真空采血管与BD公司的K2-EDTA抗凝真空采血管采取的血液标本的各指标对比结果的相关性。结果如表l所示表1.两种真空采血管中的血液样本的各项血细胞分析指标的相关性测试参数测试的样本数r(Spearman)ICR白细胞总数(WBC)500.983**0.994**中性粒细胞数(NE)500.954氺*0.986**淋巴细胞数(LY)500.853**0.790林单核细胞数(MO)500.918承水0.927**嗜酸粒细胞数(EO)500.805氺*0.766*噬碱粒细胞数(BA)500.846**0.826**中性粒细胞％500.985**0.987林淋巴细胞％500.992**0.994林单核细胞％500.713林0.798林嗜酸粒细胞％500.701**0.755林嗜碱粒细胞％500.714氺氺0.721林红细胞计数(RBC)500.978**0.976承承血红蛋白(HGB)500.970承氺0.989林红细胞比积(HCT)500.902氺承0.607承氺红细胞平均容积(MCV)500.941承*0.946**红细胞平均血红蛋白(MCH)500.824氺氺0.925林红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)500.839**0.918林红细胞分布宽度(RDW)500.949承*0.963**血小板计数(PLT)500.984**0.973**平均血小板容积(MPV)500.943**0.958**血小板分布宽度(PDW)500.878**0.933***代表0.OKp《0.05林代表p《0.01使用重组水蛭素的喷涂量800ATU/ml血量的通用真空采血管与BD公司的K2-EDTA抗凝真空采血管采取的血液标本的21项血细胞分析指标对应结果均成正相关；说明重组水蛭素的喷涂量800ATU/ml1血量的通用真空采血管适用于血细胞分析。在血细胞分析中嗜酸性和嗜碱性粒细胞的r值和ICS值略低，这与血细胞分析仪非染色镜检而形成的局限性有关，但结果仍是可接受的。c.重组水蛭素对血液生化分析的影响使用重组水蛭素的喷涂量800ATU/ml血量的通用真空采血管与BD公司生产的普通真空采血管或促凝管随机采取体检者和住院患者的血液标本50份，每份血液标本2ml，进行24项血液生化分析检验。血液生化分析检验采用如下方法血液生化指标检验用日本东芝公司TBAFR-120型全自动生化分析仪，电解质分析用上海迅达公司DSI903B型电解质分析仪及配套试剂；利用SPSS12.0软件对数据进行正态分布检验后，采用双变量相关性分析法(Spearman相关分析法)判断重组水蛭素的喷涂量800ATU/ml血量的通用真空采血管与BD公司生产的普通真空采血管或促凝管采取的血液标本的各指标对比结果的相关性。结果如表2所示。表2.两种真空采血管中的血液样本的各项血液生化指标的相关性测试参数测试的样本数ri(Spearman)ICR谷氨酰转移酶(GGT)500.942林0.92l林谷丙转氨酶(ALT)500.969**0.998**碱性磷酸酶(ALP)500.929**0.997**谷草转氨酶(AST)500.960**0.997林总蛋白(TP)500.829**0.872**白蛋白(ALB)500.975氺*0.969**球蛋白(GLO)500.934氺*0.947氺*总胆红素(TB)500.870**0.953林尿素(Urea)500.985林0.992**肌酐(Cr)500.979**0.988**尿酸(UA)500.965**0.980**葡萄糖(GLU)500.952林0.992**总胆固醇(TC)500.986氺*0.988林甘油三酯(TG)500.930**0.964**高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)500.922**0.932林低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)500.972氺氺0.980**肌酸激酶(CK)500.962**0.996**乳酸脱氢酶(LDH)500.933林0.993求求羟丁酸脱氢酶(HBDH)500.904林0.994氺氺钠离子(Na)500.922**0.952氺氺钾离子(K)500.941氺氺0.938承*氯离子(Cl)500.857氺氺0.853**,丐(Ca)500.938氺氺0.929**磷(P)500.898**0.931林*代表0.0Kp《0.05**代表p《0.01重组水蛭素的喷涂量800ATU/ml血量的通用真空采血管与BD公司的普通真空采血或促凝管采取的血液标本的24项血液生化分析指标的对应结果均成正相关，说明重组水蛭素的喷涂量800ATU/ml血量的通用真空采血管适用于生化学检验；重组水蛭素的喷涂量800ATU/ml血量的通用真空采血管中血液标本测定的总蛋白量较高，是由于纤维蛋白原在血浆中存在的原故。d.重组水蛭素对血流变分析的影响使用重组水蛭素的喷涂量800ATU/ml血量的通用真空采血管与BD公司生产的肝素抗凝真空采血管随机采取体检者和住院患者的血液标本50份，每份血液标本2ml，进行16项血流变学分析检验。血流变学分析检验方法如下血流变学分析用赛科希德公司SA-6000型全自动血流变仪，纤维蛋白原测定用Stago公司的Compact自动血凝仪。利用SPSS12.0软件对数据进行正态分布检验后，采用双变量相关性分析法(Spearman相关分析法)判断重组水蛭素的喷涂量800ATU/ml血量的通用真空采血管与BD公司生产的肝素抗凝真空采血管采取的血液标本的各指标对应结果的相关性。结果如表3所示。表3.两种真空采血管中的血液样本的各项血流变学指标的相关性_项目_检测的样本数r(Spearman)_ICR全血黏度，高切1/200S500.902**0.9654**全血年度，中切1/30S500.933**0.9986林全血年度，低切1/5S500.890**0.8799**全血年度，低切1/S500.939氺氺0.9089**血浆黏度500.975氺承0.9719**血沉ESR500.982林0.9866**红细胞比积Hct500.843承求0.7198**全血高切还原黏度RH500.690氺氺0.7269**全血低切还原黏度RL500.940氺求0.9250**全血高切相对指数HI500.906求承0.9561水氺全血低切相对指数CI500.845氺求0.9096**血沉方程K值EK500.976**0.9854**红细胞聚集指数RH1500,895**0.8936**红细胞刚性指数RL1500.963求承0.9510林红细胞变形指数TK500.860**0.8513**纤维蛋白原Fig500.967氺氺0.9811***代表0.01〈p《0.05，**代表p《0,01重组水蛭素的喷涂量800ATU/ml血量的通用真空采血管与BD公司的肝素抗凝真空采血管采取的血液标本的16项血流变分析指标的对应结果均成正相关，说明重组水蛭素的喷涂量800ATU/ml血量的通用真空采血管适用于血流变学检验。国内血流变学检验应用较多，重组水蛭素的喷涂量800ATU/ml血量的通用真空采血管特别适用于血流变学与上述各检验项目共用，如同时检验可明显减少所用的采血管。e.重组水蛭素对ELISA试验和发光免疫学检验分析的影响使用重组水蛭素的喷涂量800ATU/ml血量的通用真空采血管与BD公司生产的普通真空采血管随机采取体检者和住院患者的血液样本50份，每份血液标本2ml，进行ELISA试验和发光免疫学检验。ELISA试验和发光免疫学检验采用如下方法ELISA检验用Biorad-680型自动酶免疫分析仪，试剂为上海实业科华生物技术有限公司提供的乙型肝炎表面抗原诊断试剂盒和厦门新创公司提供的抗-丙型肝炎ELISA试剂盒。发光免疫学检验用Abbott公司的Axsym全自动免疫发光仪。利用SPSS12.0软件对数据进行正态分布检验后，采用双变量相关性分析法(Spearman相关分析法)判断重组水蛭素的喷涂量800ATU/ml血量的通用真空采血管与BD公司生产的普通真空采血管采取的血液标本的各指标对应结果的相关性。结果如表4和表5所示。15表4.两种真空采血管中的血液样本的各项免疫指标的相关性<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>*代表0.01<p《0.05，林代表p《0,01表5.两种采血管中血液样本的ELISA试验对照结果项目检测的样本数BD采血管本发明的采血管<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>重组水蛭素的喷涂量800ATU/ml血量的通用真空采血管与BD公司的普通真空采血管采取的血液样本的各项免疫指标对应结果均成正相关；两种采血管中血液样本的ELISA试验的结果完全一致。说明重组水蛭素的喷涂量800ATU/ml血量的通用真空采血管适用于免疫学检验。f.重组水蛭素对荧光定量PCR试验的影响使用重组水蛭素的喷涂量800ATU/ml血量的通用真空采血管与BD公司生产的普通真空采血管随机采取体检者和住院患者的血液样本50份，每份血液标本2ral，荧光定量PCR检测血样中乙型肝炎病毒DNA拷贝数。荧光定量PCR检测用Roche公司Lightcycler荧光定量PCR仪。结果如表6所示表6.两种采血管中血液样本的荧光定量PCR检测结果_<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>重组水蛭素的喷涂量800ATU/ml血量的通用真空采血管与BD公司的普通真空采血管中血液样本的荧光定量PCR检测结果一致，重组水蛭素的喷涂量800ATU/ml血量的通用真空采血管适用于荧光定量PCR检验。〈110〉一种重组水蛭素编码基因与应用<120〉汪和睦<130〉CGGNARW81213<160〉2<210〉1<211〉65〈212〉PRT<400〉1ITYTDCTESGQNLCLCEGSNVCGQGNKCILGSDGE認QCVTGEGTPKPQSHNDGDFEEIP60EEYLQ65<210〉2<211〉474<212〉DNA<213〉人工合成<220〉<223〉〈400〉2gaattcatgagattcccttcgatctttaccgccgtgctgttcgcagcatcttccgccctggccgctccagtcaataccacgacagaggacgagaccgctcagatccccgctgaggccgtcatcggttactctgatcttgagggagacttcgacgtggctgttttgccattttccaactcgactaataacggacttctgttcatcaacaccactattgcctcgattgccgcgaaagaagagggcgtcagcctcgagaaaagaatcacttacaccgactgcaccgagtctggtcaaaacctttgtctctgcgagggttccaacgtttgcggtcaaggcaacaagtgcatcctgggcagcgatggcgagaagaaccagtgcgttaccggcgaaggaacgccaaagccccagtcccacaacgacggcgactttgaggaaatccctgaagagtacctgcagtaatgaagatctggatcc6012018024030036042047权利要求1、一种重组水蛭素基因，所述基因的核苷酸序列是序列表中序列2自5′末端第7-459位所示。2、一种重组表达载体，是含有权利要求l所述基因的重组表达载体。3、根据权利要求2所述重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为如图l所示的pMPT-hirudin载体。4、含有权利要求l所述基因的重组菌。5、根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于所述重组菌的出发菌株为多形汉逊酵母，优选为多形汉逊酵母HU-IICCMCCNO.1218。6、根据权利要求4或5所述的重组菌，其特征在于所述重组菌为多形汉逊酵母205-17CGMCCNo.2424。7、权利要求l所述的基因、权利要求2或3所述的重组表达载体或权利要求4或5或6所述重组多形汉逊酵母菌在生产水蛭素中的应用。全文摘要本发明公开了一种重组水蛭素编码基因与应用。该重组水蛭素编码基因的核苷酸序列是序列表中的序列2自5′末端第7-459位所示。本发明还公开了一种重组表达载体，该重组表达载体含所述水蛭素编码基因。将该重组表达载体导入多形汉逊酵母中可获得的重组菌。该重组菌能高水平生产重组水蛭素；所生产的重组水蛭素具有高抗凝比活性。生产的重组水蛭素可制备血液或血浆的通用抗凝剂。文档编号C07K14/81GK101250530SQ20081010315公开日2008年8月27日申请日期2008年3月31日优先权日2008年3月31日发明者珺杨,汪和睦,王昌华,王玉香申请人:汪和睦