一种快速提取和纯化植物病组织中病原菌dna的方法

专利名称：一种快速提取和纯化植物病组织中病原菌dna的方法
技术领域：
本发明属于分子生物学技术领域，涉及模板DNA的制备方法，更具体的说 是一种快速提取和纯化植物病组织中病原菌DNA的方法。
背景技术：
基因组DNA的提取是分子生物学研究的基础，DNA提取的质量和产量是直 接影响PCR扩增的关键步骤，自PCR技术问世以来，这一技术已被广泛应用到生 命科学的各检测领域。尤其是在植物病理学的发展研究中，对侵染植物组织的 病原真菌或细菌的病原物种类鉴定、病菌的系统进化研究和病菌抗性分子检测 等工作都离不开PCR技术，而开展上述这些工作的首要任务是从植物病组织中提 取病原菌的基因组DNA。传统的方法是对植物病组织进行培养，分离并纯化病 原菌，再对病原菌提取DNA进行进一步的研究。但是传统的方法耗时、繁瑣， 严重减慢了检测速度，并且在分离培养的过程中容易造成杂菌污染甚至分离不 到真正的病原菌，对专性活体寄生的病原菌也不适用。同时，从植物病组织培 养分离得到的病原菌只是代表该病组织的个体情况，而对病原菌群体分子检测 等工作的开展带来困难。因此，不经过分离培养而直接从植物病组织中快速提 取到高质量的病原菌DNA成为解决问题的关键。
目前关于DNA提取的方法，国内外已有很多报道。这些方法主要有SDS法， 尿素提取法，CTAB提取法，SDS-CTAB提取法，氯化千提取法。这些提取方法 步骤大体相似，主要过程包括样本的收集、细胞壁的破碎、DNA的抽提、有机 溶剂去蛋白质、DNA的沉淀和洗涤等。然而总体来说，这些方法比较耗时，流 程繁瑣，同时样品需要用多个离心管，容易造成功混淆和污染，而且操作时需 要用一些大量有毒的有机溶剂(如酚、氯仿，CTAB等)，若操作和处理不当，会 对实验人员的健康造成伤害。另外，许多公司开发了DNA提取试剂盒，试剂盒 法虽然比较省时省力，但是价格比较昂贵，难以用于对大量样品的检测。然而， 植物组织中还含有大量的酚和醌类物质以及碳水化合物等PCR反应抑制物，采用 上述方法提取植物组织中的病原菌DNA对其DNA的质量和产量以及PCR检测的
灵敏度都有一定的影响。
因此，建立一种省时省力、廉价、低污染的提取植物病组织中病原菌DNA 的方法，将会对许多植物病理学的研究有很大帮助。

发明内容
本发明提供了 一种改进的快速提取和纯化植物病组织中病原菌DNA的方 法，克服了传统病原菌分离培养和DNA提取的步骤多、费时等缺点，具有简单、 污染小、快速、经济、准确等优点。
一种快速提取和纯化植物病组织中病原菌DNA的方法，按如下步骤进行
(1) 取待测植物病组织样本，加入提取液(简称DEB )后进行研磨，充分研磨 至组织完全破碎，再加入提取液，混勻后静置；
所述的待测植物病组织是指由真菌或细菌侵染引起的无明显病症或有明显 病症的才直物組织；
通常，研磨前加入的DEB可以将待测样本浸没即可，并无严格要求； 所述的DEB由聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、 Tris-HCl、 EDTA、 NaCl、 SDS和ddH20 组成，pH为8.0;各组分的优选含量，以提取液总体积计PVP: l-2g/100ml， Tris-HCl: 200mM， EDTA: 50mM， NaCl: 20mM, SDS: lg/100ml，余量 为ddH2。；
所述的研磨时间最优应在l - 2min,可釆用将尖头玻棒安装在常用的电工手 电转上进行研磨的方式，转速为1500-2500rpm/min,不需要液氮研磨等繁瑣费力 的过程，既避免了交叉污染又减少了原材料的需求量；并且采用此方法只需l-2min即可研磨完成；
(2) 将步骤(1 )所得混合液离心，分离得到上清液后加入等体积的无水乙醇， 再次离心得到沉淀的DNA;两次离心的最优条件为4°C ,转速12000-15000rpm;
(3) 将沉淀的DNA用70。/。乙醇洗涤，干燥后溶于无菌水，即为提取的DNA;
(4) 将提取的DNA溶液过柱纯化；
纯化采用UNIQ-10柱式PCR产物回收试剂盒(上海生工生产)，其组分包括: Binding Buffer, Washing Buffer ， Elution Buffer和UNIQ画10柱。
本发明提供的一种快速便捷的提取和纯化植物病组织中病原菌DNA的方 法，与现有的方法比较具有以下优点
(1) 本发明直接从植物病组织中提取病原菌DNA,省去了病原菌分离培养等 繁瑣的过程，大大提高了检测的效率和病原物群体检测的可信度；对一些没有 明显病斑的植物组织的潜在病原菌和活体寄生菌的;f企测也有^[艮好的作用；
(2) 本发明的改进的DNA提取方法过程简单，整个过程可仅在两个离心管中 进行，避免造成混淆和污染；提取过程不需要使用昂贵的仪器和试剂，避免使 用有毒有机试剂，对人体和环境都不造成危害；整个提取过程只需要30min,加 上DNA的纯化过程后也不超过45min ，比以往任何提取DNA的方法都要省时省
力；
(3) 现有的DNA提取方法中使用的提取液一般包括Tris-HCl、 EDTA、 NaCl、 SDS这几种成分，而本发明中采用含有PVP成分的DNA提取緩冲液，有效抑制了 植物组织中酚类和醌类等氧化物质，减少了提取过程中DNA的降解，并且，最 后的DNA纯化步骤也最大程度地去除了提取物中PCR^良应抑制物，增加了 PCR 检测的灵敏度；
(4) 本发明中的研磨过程还釆用了尖头玻棒和电工手电转，可以保证较短的 研磨时间内完全破碎组织，最大限度减少DNA提取过程中PCR^应抑制物的生 成。
采用本发明方法所得到的DNA经凝胶电泳实验、PCR检测实验，证实与传 统方法得到的DNA基本一致，完全可以采用此方法代替传统CTAB法，大大节省 了时间，可在短时间内完成大量样本的DNA提取，大大提高了病害检测鉴定研 究的进程。


图l为采用本发明提取样本DNA的电泳图2为采用本发明提取样本DNA为模板的特异性PCR检测的电泳图。
具体实施方式
DEB配制:
取l-2g聚乙烯吡咯烷酮(PVP), 20mmolTris-HCl, 5mmolEDTA， 2mmolNaCl 溶于80mlddH2O中，调节pH值到8.0，高压灭菌后再加入用细菌滤器过滤除菌的 lgSDS,用ddH2O定容至100ml，室温保存备用。
DNA提取 实施例l
(1) 用无菌的镊子取油菜菌核病菌OSWera^/a ^/m^'onw7)侵染的油菜花瓣 100mg于1.5ml的灭菌离心管中；
(2) 加入100jlUDEB,用尖头玻棒安装在常用的电工手电转上研磨lmin，再 向离心管中加入400ial的DEB,蜗旋混匀后，室温静置10min;
("将上述混合液4。C， 15000rpm条件下离心5min，再将"0 ju l上清液转移到 另一离心管中，然后加入750jul无水乙醇，混匀后4。C， 15,000rpm条件下离心 2min， 弃上清；
(4) 将沉淀的DNA用70。/。乙醇洗涤，室温干燥后溶于50nl无菌水，即为提取 的DNA;
(5) 将上述的DNA溶液过柱纯化釆用UNIQ-10柱式PCR产物回收试剂盒(上 海生工生产)，具体操作步骤参见试剂盒说明书。DNA于-20。C保存备用。
用无菌解剖刀取桃褐腐病菌(7kfom7/"/a/ra"/co/a)侵染的桃果实病组织 1 OOmg于1.5ml的灭菌离心管中；其它提取步骤同实施例1 。
用无菌剪刀取小麦赤霉病菌CFmmWmw graw/"earww)侵染的小麦麦粒1 OOmg 于1.5ml的灭菌离心管中；其它提取步骤同实施例l。
用无菌剪刀取小麦白粉病菌Cg/wmeWa gram/m力侵染的d 、麦叶片1 OOmg于
实施例2
实施例3
实施例41.5ml的灭菌离心管中；其它提取步骤同实施例l。 电泳分析
将实施例1 4提取的DNA进行水平琼脂糖电泳，经溴化乙啶染色后，得到 的条带清晰明亮，其中1泳道是DNAMarkers, 2 ~ 5泳道分别为实施例l ~ 4中提取 的DNA (如图l所示)。
PCR扩增
将实施例l-4提取的DNA为模板，分别以油菜菌核病菌、褐腐病菌、小麦 赤霉病菌、小麦白粉病菌的种特异性引物进行PCR扩增，引物序列如下表所示。
病原物名称种特异性引物
油菜菌核病菌Ss-F:AGTCGAGGGACGGGTACTAA
Ss-R:CTTGTCCTCATTGCCGTTT
褐腐病菌Map-F: ATGTTCTCGGTACCCC AAC AA
Map-R:AATTCTTCGGGAATGGGGTT
小麦赤霉病菌Fga-F:GCGTTGAGCTTGTTTTTTG
Fga-R:GGTTACCCTAATAAACATTGTTAG
小麦白粉病菌Bg-F :TGCC ATTG ATATATTCTGGGG Bg-R:TGTGCAAATATCAGAATCTGATAC
PCR^应的体系为1 jiL DNA模板(约1 ng )，引物各0.2(imo1厂1, dNTP 0.2}imol 1 —'，MgCl2 2mmol l — 1, 1 x緩冲液(北京东胜公司生产)，聚合酶1.5 U个 单位，双蒸水补足至25pL。
反应条件为95。C预变性3min, 94。C变性20s, 53。C退火30s, 72。C延伸 30 s,进行35个循环，最后延伸5min。 PCR产物用1.5。/。的琼脂糖在lxTAE緩冲 液中电泳后，用EB显色拍照。
从电泳照片上看(如图2所示)，用4对种特异性引物对实施例1 4^是取的DNA 进行PCR扩增，均能得到预期的产物，且条带清晰，特异性好。
从以上分析得出本发明的提取方法适用于多种植物组织，包括花瓣、果
实、种子和叶片等等，能够从植物病组织中有效地得到病原物的基因组DNA, 能满足对侵染植物组织的病原真菌或细菌的病原物种类鉴定、病菌的系统进化 研究和病菌抗性分子检测等工作的需要。
权利要求
1.一种快速提取和纯化植物病组织中病原菌DNA的方法，按如下步骤进行(1)取待测植物病组织，加入提取液后进行研磨，使组织破碎，再加入提取液，混匀后静置；(2)将步骤(1)所得的混合液离心，分离得到上清液后加入无水乙醇，再次离心得到沉淀的DNA；(3)将沉淀的DNA用70％乙醇洗涤，干燥后溶于无菌水，即为提取的DNA；(4)将提取的DNA溶液过柱纯化。
2、 如权利要求l所述的方法，其特征在于所述的提取液由PVP、 Tris-HCl、 EDTA、 NaCl、 SDS和ddH20组成，pH为8.0。
3、 如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的提取液的各组分的含量， 以4是耳又液总体积计PVP: l画2g/100ml， Tris-HCl: 200mM， EDTA: 50mM, NaCl: 20mM， SDS: lg/100ml，余量为ddH20。
4、 如权利要求l所述的方法，其特征在于所述的研磨时间l-2min。
5、 如权利要求l所述的方法，其特征在于所述的离心条件为温度4。C,转 速12000-15000rpm。
全文摘要
本发明公开了一种快速提取和纯化植物病组织中病原菌DNA的方法，将植物不同发病部位的组织加入提取液，用尖头玻棒研磨后，上清液加入无水乙醇沉淀DNA，再用70％乙醇洗涤干燥，最后通过过柱纯化得到植物组织中病原物的基因组DNA。提取液的组分以提取液总体积计PVP1-2g/100ml，Tris-HCl200mM，EDTA50mM，NaCl20mM，SDS1g/100ml，余量为ddH₂O，pH8.0。本发明的方法具有简单、污染小、快速、经济、高效等优点，能够实现多个样品短时间内提取DNA，给病害分子检测提供了便捷、快速的途径。
文档编号C07H21/04GK101367858SQ200810121328
公开日2009年2月18日 申请日期2008年9月25日 优先权日2008年9月25日
发明者严蕾艳, 尹燕妮, 马忠华 申请人:浙江大学