专利名称：一种多亚基蛋白的复性方法
技术领域：
本发明属于生物化学与分子生物学技术领域，特别涉及一种多亚基蛋白的复 性方法。
背景技术：
变性蛋白的复性技术是现代生命科学领域经常使用的一种实验技术，是指变 性蛋白质在变性剂如盐酸或尿素去除或浓度降低后，就会自发地从变性的热不稳 定状态向热力学稳定状态转变，从而形成具有生物学功能的天然结构。目前常用 的复性方法可以分为两类稀释/透析复性法和色谱复性法。稀释/透析复性法是 目前最简单也是最常采用的复性方法，包括稀释复性法和透析复性法。稀释复性 法是将变性蛋白质溶液直接加入到复性緩冲液中进行复性的一种方法，操作简 单，缺点是蛋白复性时必须保持在较低的浓度(一般为10-100吗/mL)，复性反 应的体积较大，需要昂贵的复性添加剂并且必须保证质量要高，废水处理也相当 昂贵。透析复性法是将蛋白质加入到透析装置中，通过透析的过程将变性剂浓度 降低，从而使变性的蛋白质恢复到天然的状态，其才乘作相对简单，蛋白浓度也较 高，但其缺点是复性所需时间较长，需要大量的透析液，且蛋白质浓度较高而易 导致蛋白质的聚集沉淀。总体来说，稀释/透析复性法中蛋白质的复性率较低，且 费时，复性结束后需对复性蛋白质进行进一步的纯化。色谱复性法是一种色谱柱 辅助的在柱复性方法，其复性过程与蛋白质的纯化过程相似，将变性蛋白质吸附 在色谱柱上，然后梯度降低变性剂的浓度而使蛋白复性，或是利用蛋白质分子与 变性剂在凝胶柱介质中具有不同的迁移速率而使两者分离，从而使蛋白质复性。 色谱复性中常用的色谱有尺寸排阻色谱、离子交换色谱、疏水相互作用色谱和亲 和色谱。与传统的稀释或透析法相比，色语复性法的优点是l)在进样后可很 快脱除变性剂，操作效率高；2)减少了变性蛋白在脱除变性剂后形成聚集体， 提高了蛋白质复性的质量回收率和活性回收率，同时提高了蛋白质复性的初始浓 度；3)在复性的同时可以使目的蛋白与杂蛋白分离；4)便于回收变性剂，降低 了废水处理的成本。但是现有的色谱复性技术仅限于一条完整肽链的单亚基蛋白 的复性，对于两个或两个以上亚基组成的蛋白如主要组织相容性复合体没有合适 的色谱复性方法。
发明内容
技术问题本发明针对上述问题提供一种省时高效的适用于两个或两个以上 亚基组成蛋白复性的多亚基蛋白的复性方法。
技术方案本发明的多亚基蛋白的复性方法为对由两个或两个以上亚基組 成的蛋白按如下步骤进行复性先通过基因工程技术将各亚基分别在表达性宿主 菌中以包涵体形式表达，收获包涵体蛋白；再通过稀释/透析复性法对其中一个 或多个蛋白亚基进行预复性；然后进行多亚基蛋白的色谱复性，方法是首先将未 进行预复性的另 一个或其余多个蛋白亚基结合在色谱柱上，然后将含有预复性蛋 白亚基的复性液上柱，并梯度性地增加已预复性蛋白亚基的浓度，使结合在色谱 柱上的蛋白亚基在复性的同时并与已预复性的蛋白亚基结合而折叠成完整的蛋白 质分子，最后经过洗涤后将复性后的蛋白从色谱柱上洗脱下来。
多亚基蛋白的色谱复性之前对其一个或多个蛋白亚基预复性的方法为稀释/ 透析复性法或色谱复性法。
多亚基蛋白的色谱复性时所采用的色语柱为离子交换色语柱、疏水相互作用 色谱柱或亲和色谱柱。
多亚基蛋白的一个或多个蛋白亚基预复性方法中的色谱复性法所采用的稀释 /透析复性法为稀释复性法或透析复性法。
多亚基蛋白的一个或多个蛋白亚基预复性方法中的色语复性法所采用的色谱 柱为离子交换色谱柱、疏水相互作用色谱柱、亲和色诿柱或尺寸排阻色i普柱。
有益效果本发明的有益效果如下
(1) 应用此复性方法可以对多个亚基组成的蛋白进行色谱法复性；
(2) 蛋白复性率和产量均丰支高；
(3) 由于复性和分离同时进行，所以所得复性后的蛋白不需纯化，简化了操 作过程；
(4)与稀释或透析复性法相比，此复性方法节省原料，省时省力。
图1 蛋白复性方法复性MHC/HBc18.27复合体原理示意图。
图中l.变性的HBc18-27- P 2微球蛋白，2.稀释法预复性，3.预复性的HBc18—27-
P2微球蛋白，4.变性的MHCI重链蛋白，5.阴离子交换色谱柱介质，6.复性后的
MHC/HBc18.27复合体。
具体实施例方式
本发明对于多个亚基组成的蛋白，其中一个或多个蛋白亚基先行预复性，形 成预复性的蛋白亚基，其它的一个或多个蛋白亚基结合在色谱柱介质上，梯度增 加含预复性蛋白亚基的复性液使结合在色谱柱上的蛋白亚基复性并与预复性的蛋 白亚基结合而形成完整的蛋白质分子，经过洗涤后将复性后的蛋白从色谱柱上洗 脱下来。预复性时采用的复性方法可以是稀释/透析复性法，也可以是现有的色谱 复性法。多亚基蛋白的色谱复性时所采用的色谱可以是离子交换色谱、疏水相互 作用色语或亲和色谱。
本发明以主要组织相容性复合体I类分子(MHC I)为目标复性蛋白，HBV
核心抗原的抗原肽HBd8—27序列为加载到复合体中的抗原肽段，以稀释复性法进
行亚基的预复性，以离子交换色谱进行MHC/HBc18-27复合体分子复性的新型复性 方法为例进一步说明本发明的技术方案
MHC I重链基因和HBc18-27- P 2微球蛋白基因分别以相应的冲莫板经过PCR扩 增而获得，其中HBc18-2r 微球蛋白基因是利用已有的"肽-Linker-P 2微球蛋 白"融合表达策略而构建。将获得的MHC I重链基因和HBds-27-P2微球蛋白基 因经过分子克隆手段分别插入到质粒pET28a中，并在表达宿主菌BL21中经 IPTG诱导而表达出相应的蛋白MHC I重链蛋白和HBc18-27- p 2微球蛋白。
MHC/HBc18_27复合体应用多亚基蛋白的复性方法进行复性时有以下过程 (1 ) HBc18-27- P 2微球蛋白的预复性
将5 mg HBc18—27- P 2微球蛋白加入到预冷的50 ml Buffer D ( 20 mM Tris, 150 mM L墨arginine, 0.2 mM EDTA, 5 mM GSH， 0.5 mM GSSG， 0.2 mM PMSF, pH8.0 ) 中，4'C搅拌复性8h。复性后将预复性反应液离心(3000rpm， lOmin),弃沉淀
并用0.22 ^m的滤器过滤。
(2) MHC I重链蛋白结合于阴离子交换层析柱上
Q sepharose HP (5 ml)阴离子交换层才斤柱用Buffer C (20 mM Tris， 8 M urea, pH8.0)平衡5个柱床体积(CV)后将6 mg HC蛋白加样到层析柱，流速O.l ml/min。收集穿过峰并进行蛋白定量。上样结束后继续用Buffer C洗涤2 CV。
(3) 多亚基蛋白的色谱复性
将含预复性HBd8-27-p2微球蛋白的复性緩冲液梯度增加(0-100%)以进行复 性反应。梯度时间8h,流速0.05 ml/min。然后100%轻链复性緩冲液继续复性8 h， 流速0.05 ml/min。预复性的朋(:18-27-P 2微球蛋白在150 mM L-arginine存在的情况 下不能结合在色语柱上，而是穿过色谱柱，这样就保证了 HBc18-27- P 2微球蛋白可 以在位置上较为自由，方便了与复性中的重链蛋白结合而形成复合体蛋白。
(4) 洗涤及复性蛋白的洗脱
用Buffer A (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH8.0)洗涤层析柱，6 CV, 2 h。最 后用Buffer E (20 mM Tris， 1 M NaCl, pH8.0)梯度(0-100%)洗脱蛋白，6 CV， 0.5 ml/min。用自动组份收集器收集洗脱峰，1 ml/管。取峰值收集管液体进行SDS-PAGE电泳，鉴定洗脱峰成份。将复合体峰蛋白用0.22 pm的注射过滤器过滤备 用。
将复性得到的MHC/HBc18-27复合体运用尺寸排阻色谱进行结构及纯度鉴定； 将MHC/HBci8-27复合体经过与相应的抗体反应制备出MHC/HBc18—27多聚体，然 后进行乙型肝炎患者和健康献血者外周血PBMC中的HBc^27特异性T细胞检测 以评价复性得到的MHC/HBc18-27复合体的功能。
本发明以主要组织相容性复合体I类分子(MHC I)为目标复性蛋白，HBV 核心抗原的抗原肽HBc18-27序列为加载到复合体中的抗原肽^:，以稀释复性法进 行亚基的预复性，以离子交换色谱进行复合体分子的复性的新型复性方法为例说 明具体实施方式
。
实施例1: MHC I重链基因的扩增和重组质粒的构建。
根据GenBank中人MHC I重链的cDNA序列(AF036921.1 GI:4104536) 设计引物。在重链基因C端，有一段用来生物素化的BSP (biotinproteinligase BirA substrate peptide )序列(17aa: GSLHHILDAQKMVWNHR)和能与Ni2+-NTA 结合的His-tag(6aa: HHHHHH)。上游引物含起始密码子、JVC0 I识别位点及保护碱基，下游引物含XhoI酶切位点。它们的序列分别为
上游pl: 5、-GCCCATGGGCTCTCACTCCATGAGGTAT-3、；
下游p2: 5、-GCCTCGAGACGATGATTCCACACCATTTTCTGTGCATCCAG AATATGATGCAGGGATCCGGTGAGGGGCTTGGGCAA-3、。
扩增重链基因采用的聚合酶链式反应"PCR"的体系为在50 pi PCR总反应 体系中加入5 [il 10xTaq DNA聚合酶Buffer, 5 ^ 25 mM MgCl2， lpIlOmM dNTP, 1 pi质粒pBluescript II sk-HLA-A*0201才莫板(由上海第二医科大学周光炎 教授惠赠；也可从基因型为HLA-A*0201供血者外周血中提取细胞总RNA并进 行逆转录反应获得cDNA以作为模板，步骤参考实施例2), 0.25 ^ Taq DNA聚 合酶，110 pM上游特异引物p6, 1 ^ 10 pM下游特异引物p7, 35.75 ^水， PCR程序为95°C 5min; 94°C 1 min, 58°C 1 min, 72。C 2min; 72°C 10 min; 4°C 保温。PCR产物用1 1.5。/。琼脂糖胶电泳分离,溴化乙锭(EB)染色,用紫 外检测仪观察结果。
利用JVco I、 ^T o I酶切位点将PCR产物插入质粒pET28a以构建含重链基因 的重组质粒。采用的酶切体系为50nl总反应体系中加入32pl水，5nll0xR+ Buffer(MBI), 15 M(l.5 nl) iVco I(MBI), 15 M(l.5 pi) J^o I(MBI)， 50 ng(lO pl)质粒 DNA或PCR产物，混匀，37。C水浴3h或过夜，利用上海华舜生物公司胶回收 试剂盒按说明书操作回收纯化酶切产物，进行连接。采用的连接体系为40 pl总 反应体系中加入23.3 pi水，4 nl 10xT4 DNA连接酶Buffer, 4 |il质粒载体酶切纯 化产物，4.7plPCR酶切纯化产物，4 |al T4 DNA连接酶，16。C过夜。连接产物 转化转化感受态DH5a菌，37°C 16h后挑克隆与LB液体培养基(卡那霉素35 pg/ml),过夜培养后提质粒，经酶切、PCR、测序等手萃殳证明以上重组质粒插入 子正确。
实施例2:人外周血细胞总RNA的提取及HBc18-27- P 2微球蛋白的重组质粒 的构建。
(1 ) |32微球蛋白(卩2m) cDNA的扩增
人外周血细胞总RNA的提取步骤按TRIZOL试剂盒(Promega公司)推荐 的方法进4亍。
根据GenBank中人卩2m的cDNA序列(S71244.1 GI:547297 )设计引物。
上游引物含起始密码子、iVco I识别位点及保护碱基，下游引物含Xho I酶切 位点。它们的序列分别为
上游p3: 5、-GGCCCATGGATATCCAGCGTACTCCAAAG-3、；
下游p4: 5、 - CAACTCGAGattaCATGTCTCGATCCCACTTAAC-3、。
扩增p2微球蛋白基因采用的逆转录聚合H^式反应"RT-PCR"的逆转录"Rr， 体系及过程为在20 nl总反应体系中加入6 pl DEPC水，加入细胞总RNA约5 RNasin 0.5 pl和OligdT 2 pl。混勻，在65。C变性5 min后置冰浴。再加入5x 反应緩沖液4pl， lOmMdNTPlpl， RNasin 0.5 pl及O.lmol/1 DTT 0.5 pl，最后加 入M-MLV逆转录酶1 nl(200 u)，混勻后，置37。C水浴1.5 h。再在95°C中变性5 min终止反应后得到逆转录产；采用的PCR体系为在50 pl PCR总反应体系中 加入5 pl 10xTaq DNA聚合酶Buffer (含Mg2+) 、 1 pi 10 mM dNTP, 4 pi逆转 录产物，2 |xl Taq DNA聚合酶，1 pi 10 pM上游特异引物p3， 1 nl 10 pM下游特 异引物p4, 32 pl水；PCR程序为94°C 4 min; 94°C 1 min, 60°C 1 min， 72°C 2 min; 72°C 10 min; 4°C 保温。PCR产物用1.5~2%琼脂糖胶电泳分 离，溴化乙锭(EB)染色，用紫外检测仪观察结果。
(2 ) P2微球蛋白重组质粒的构建
利用Wcro I、 Wo I酶切位点将PCR产物插入质粒pET28a以构建含p2微球 蛋白基因的重组质粒。采用的酶切体系为20 ^总反应体系中加入12.6 ^水，4 Hi 10xf Buffer(MBI), 7 U(0.7 jil) iVco I (MBI), 7 U(0,7 pi)為I (MBI), 20吗(2 pi) cDNA产物,混匀，37。C水浴4 h，也可过夜，利用上海华舜生物公司胶回收试剂 盒按说明书操作回收纯化酶切产物，进行连接。采用的连接体系为30[il总反应 体系中加入18 pl水，3 |al 10xT4 DNA连接酶Buffer, 5 pl质粒载体酶切纯化产 物，1 pl PCR酶切纯化产物，3 T4 DNA连接酶，16。C过夜。连接产物转化转 化感受态DH5a菌，37°C 16h后挑克隆与LB液体培养基(卡那霉素35吗/ml), 过夜培养后提质粒，经酶切、PCR、测序等手段证明以上重组质粒插入片段正 确。
(3 ) HBc18-27- P 2微球蛋白重组质粒的构建
以步骤(3)得到的)32孩"求蛋白重组质粒为模板进行如下扩增在轻链基因 N端，有一段来源于HBV核心抗原的抗原肽HBc18-27序列(10aa: FLPSDFFPSV) 和一段Linker序列(15aa: GGGGGGSGGSGGSGG)。因序列较长，故分两步分别 引入此两段序列。上游引物*始密码子，i^c I识别位点及保护碱基，下游引物 含WoI酶切位点。它们的序列分别为
上游p5: 5'-GGAGGTGGTGGTGGCGGATCAGGAGGCTCAGGAGGTTCAG GAGGCATCCAGCGTACTCCAAAG ATT -3，；
上游p6: 5，- GGCACATGTTTTTACCTTCTGATTTCTTTCCTTCGGTCGGA GGTGGTGGTGGCGGA -3，；
下游p7: 5，-CAACTCGAGATTACATGTCTCGATCCCACTTAAC-3'。
第一轮扩增采用的聚合酶链式反应"PCR"的体系为在25 ^ PCR总反应体 系中加入2.5 jil 10xTaq DNA聚合酶Buffer, 2.5 25 mM MgCl2, 0.5 pl 10 mM dNTP, 2 pl质粒模板，0.5 pi Taq DNA聚合酶，1 pl 10 pM上游引物P5， 1 pl 10 pM下游引物p7， 15 pl水，PCR程序为95°C 5 min; 94°C 1 min, 48°C 1 min， 72 °C 1 min; 72 °C lOmin; 4°C 保温。
以第一轮PCR扩增产物为才莫板(1: 1000稀释)，以上游引物p6和下游引 物p7为引物，进行第二轮扩增。PCR体系及程序同第一轮，退火温度为58。C。
将第二轮PCR产物用尸sc I和屈o I双酶切，质粒pET28a用I和Wo I 双酶切，然后进行连接反应以将HBc18-27- e 2孩i球蛋白基因插入质粒pET28a构建 HBcI8-27-P2微球蛋白重组质粒。酶切及连接体系同步骤(3)。连接产物转化转 化感受态DH5a菌，37°C 16 h后挑克隆与LB液体培养基(卡那霉素35吗/ml), 过夜培养后提质粒，经酶切、PCR、测序等手段证明以上重组质粒插入子正确。
实施例3: MHCI重链蛋白和HBci8-27- p 2微球蛋白的表达与初步纯化 将MHC 1重链和1^018-27- P 2微球蛋白重组质粒分别转化入宿主菌E. co// BL21 (DE3),挑克隆后接种于含卡那霉素(35吗/ml)的LB培养基，培养至OD咖为 0.6-0.8，加IPTG至终浓度为0.1 mM， 37。C诱导3 h。 5000 g离心10 min收集细菌 沉淀，并重悬于冰冷的Buffer A ( 20 mM Tris， 150 mM NaCl, pH8.0)中，充分混 匀后行高压均质破菌，4°C 10000 g离心IO min后弃上清，沉淀重悬于Buffer B (20 mM Tris, 150 mM NaCl， 0.5% Triton X-100, pH8.0 )中，混勻后于4。C 10000 g离心10 min,弃尽上清液，收集包涵体沉淀。然后重复洗涤一次，沉淀 重悬于BufferB中混匀后离心。再将沉淀重悬于Buffer A中，混勻后于4。C 10000g
离心IO min，弃尽上清液，收集包涵体沉淀。最后沉淀重悬于5 ml Buffer C (20 mM Tris， 8 M ure^ pH8.0)中，室温轻緩搅拌，直至沉淀'溶解、变清晰透明。于4 。C 20000 x g离心20 min，收集上清，用SDS-PAGE鉴定表达蛋白的纯度，用 Bradford法进行蛋白定量(Bio-Rad蛋白定量试剂)，分装后置-70。C冰箱保存备 用。
实施例4:应用多亚基蛋白的复性方法制备MHC/HBc!8-27复合体
(1) HBc18-27- P 2雀史球蛋白的预复性
将5 mg HBc18-27- p 2微球蛋白加入到预冷的50 ml Buffer D ( 20 mM Tris, 150 mM L-arginine, 0.2 mM EDTA, 5 mM GSH, 0.5 mM GSSG, 0.2 mM PMSF, pH8.0) 中，4。C搅拌复性8 h 复性后将预复性反应液离心(3000 rpm， lOmin),弃沉淀 并用0.22 nm的滤器过滤。
(2) MHC I重链蛋白结合与阴离子交换层析柱上
Q sepharose HP ( 5 ml)阴离子交换层析柱用Buffer C平衡5个柱床体积 (CV)后将6 mg HC蛋白加样到层析柱，流速O.l ml/min。收集穿过峰并进行蛋 白定量。上样结束后继续用Buffer C洗涤2 CV。
(3) 多亚基蛋白的色镨复性
将含预复性HBc^27- p 2微球蛋白的复性緩冲液梯度增加(0-100%)以进行复 性反应。梯度时间8 h,流速0.05 ml/min。然后100°/。轻链复性緩冲液继续复性8 h, 流速0.05 ml/min。预复性的HBdg-27-P 2微球蛋白在150 mM L-arginine存在的情况 下不能结合在色谱柱上，而是穿过色语柱，这样就保证了 HBc18-27- P 2微球蛋白可 以在位置上较为自由，方便了与复性中的重链蛋白结合而形成复合体蛋白。
(4) 洗涤及复性蛋白的洗脱
用Buffer A洗涤层析柱，6 CV, 2 h。最后用Buffer E ( 20 mM Tris, 1 M NaCl, pH8.0)梯度(0-100%)洗脱蛋白，6 CV， 0.5 ml/min。用自动组份收集器收集洗脱 峰，1 ml/管。取峰值收集管液体进行SDS-PAGE电泳，鉴定洗脱峰成份。将复合 体峰蛋白用0.22 nm的注射过滤器过滤备用。
层析柱用l M NaOH和2 M NaCl清洗，各5 CV,以除去层析柱中残留的未 复性的蛋白备下次使用，
实施例5:运用尺寸排阻色谘进行MHC/HBd8-27复合体的结构及纯度鉴定 将凝胶层析柱Superdex 75 prep grade (内径l.O cm,长70 cm)与FPLC系统相 连，置4。C冷室。用3个柱床体积的Buffer A洗泵和平衡层析柱，流速设为0.5 ml/min，柱压< 0.3 Mpa。然后取l ml复性得到的HLA/HBci8-27复合体上柱，用 FPLC緩冲液洗柱，流速设为0.5 ml/min。洗脱液用UV检测仪(280 nm)监测蛋白 含量，并用记录仪画图记录蛋白峰。
实施例6: MHC/HBds-27复合体的功能检测 (1 )外周血PBMC的分离和培养 将慢性乙肝患者和健康人(HBV表面抗原阴性)的外周血标本5 ml在15 ml 离心管中用无菌D-HANKS稀释至8ml。取无菌15ml离心管，每管加入5ml淋 巴细胞分离液Ficoll，将稀释的外周血小心加到分离液上层，然后离心，2000 rpm, 20min。用吸管轻轻吸取淋巴细胞层，置于另一细胞离心管中。之后用无菌 的不含人AB血清的1640培养液洗涤细胞沉淀2次，每次加8 ml，于1200 rpm, 12 min离心。所得细胞沉淀用4 mL含15 %人AB血清及2000 U/mL IL-2 的1640培养液重悬，并用滴管转移到50 mL细胞培养瓶中，置细胞培养箱中培 养。培养细胞在2周内行FACS检测。
(2) PE标记的MHC/HBc18-27多聚体的制备 首先计算应加试剂量(按每管样品加入量计) MHC/HBc18.27复合体(48kDa) 8pmo1, 0.4 pg
Anti-His-tag mAb (150 kDa) 2 pmol, 0.3昭
PE-rat-anti-mouse IgG (390 kDa) 0.5 pmol, 0.2吗
将MHC/HBC18-27复合体和Anti-His-tag单克隆抗体加入Ep管中，4'C孵育 30 min。然后加入PE标记的rat-anti-mouse IgG,继续于4。C避光孵育30 min。 (3 ) HBc18-27特异性T细胞的FACS检测
培养的PBMC用细胞计数板进行细胞计数后取5xl()S细胞于小试管中，用 PBS2mL洗涂l次，于1200rpm, 12 min离心。用含1。/。BSA的PBS2mL洗涤 细胞2次，于1200rpm， 12min离心。之后将上清倒掉，细胞沉淀中加入20iaL 的PE标记的MHC/HBc^27多聚体，4。C染色lh。小试管中加入含1。/。BSA的PBS 2mL洗涤细胞2次，于1200rpm, 12min离心。将上清倒掉，细胞沉淀中加入 10 nL FITC标记的小鼠抗人CD8抗体，4 。C染色15 min。(同时做PE/FITC标 记的鼠IgGl isotype control ， PE标记的鼠抗人CD3单克隆抗体和FITC标记的鼠 抗人CD4单克隆抗体对照各一管，共4管，以便进行质量控制。)小试管中加入 含P/oBSA的PBS2mL洗涤细胞1次，于1200rpm, 12min离心。小试管中 加入PBS 2 mL洗涤细胞1次，于1200 ipm, 12 min离心。细胞沉淀用含0.5% 的PBS600[xL重悬，备流式细胞分析时所用。做流式细胞分析时，每管采集细胞 30,000个。结果用CellQuest和WinMDI 2.8软件分析。
实验结果表明运用蛋白复性方法制备MHC/HBc18.27复合体时，经NaCl梯 度洗脱得到两个洗脱峰，经SDS-PAGE鉴定后确定第一个洗脱峰的成分为 MHC/HBc18-27复合体，MHC/HBc18_27复合体的复性率(以MHC I重链蛋白计) 为20%,高于稀释复性法的复性率(7%),复性所用时间为30h,低于稀释复性 法的复性时间(72h以上)；运用尺寸排阻色谱进行MHC/HBd8-27复合体的结构 及纯度鉴定时得到一主洗脱峰，其保留时间与稀释复性法得到的MHC/HBc18.27复 合体的保留时间相一致，纯度均在85%以上；将MHC/HBd8-27复合体经过与相 应的抗体反应制备出MHC/HBc^-27多聚体，然后进行乙型肝炎患者和健康献血者 外周血PBMC中的HBc18-27特异性T细胞检测，在HLA-A2+的乙型肝炎患者外周 血PBMC中可以检测到HBc18-27特异性T细胞，而在HLA-A2-的乙型肝炎患者和 HLA-A2+的健康献血者外周血PBMC中没有检测到HBc18—27特异性T细胞，这个 结果与稀释复性法得到的MHC/HBd8-27复合体经相同的操作后的结果相一致，说 明复性得到的MHC/HBc18_27复合体具有相应的生物学功能。
权利要求
1.一种多亚基蛋白的复性方法，其特征在于对由两个或两个以上亚基组成的蛋白按如下步骤进行复性先通过基因工程技术将各亚基分别在表达性宿主菌中以包涵体形式表达，收获包涵体蛋白；再通过稀释/透析复性法对其中一个或多个蛋白亚基进行预复性；然后进行多亚基蛋白的色谱复性，方法是首先将未进行预复性的另一个或其余多个蛋白亚基结合在色谱柱上，然后将含有预复性蛋白亚基的复性液上柱，并梯度性地增加已预复性蛋白亚基的浓度，使结合在色谱柱上的蛋白亚基在复性的同时并与已预复性的蛋白亚基结合而折叠成完整的蛋白质分子，最后经过洗涤后将复性后的蛋白从色谱柱上洗脱下来。
2. 根据权利要求1所述的多亚基蛋白的复性方法，其特征在于多亚基蛋白的 色谱复性之前对其一个或多个蛋白亚基预复性的方法为稀释/透析复性法或色谱 复性法。
3. 根据权利要求1所述的多亚基蛋白的复性方法，其特征在于多亚基蛋白的 色谱复性时所采用的色谱柱为离子交换色谦柱、疏水相互作用色谱柱或亲和色谱 柱。
4. 根据权利要求2所述的多亚基蛋白的复性方法，其特征在于多亚基蛋白的 一个或多个蛋白亚基预复性方法中的色谱复性法所采用的稀释/透析复性法为稀 释复性法或透析复性法。
5. 根据权利要求2所述的多亚基蛋白的复性方法，其特征在于多亚基蛋白的 一个或多个蛋白亚基预复性方法中的色谱复性法所采用的色谱柱为离子交换色镨 柱、疏水相互作用色谙柱、亲和色谙柱或尺寸排阻色谱柱。
全文摘要
一种多亚基蛋白的复性方法，其特征在于对两个或两个以上亚基组成的蛋白，其中一个或多个蛋白亚基先行预复性，其它的一个或多个蛋白亚基结合在色谱柱上，梯度增加含预复性蛋白亚基的复性液使结合在色谱柱上的蛋白亚基复性并与预复性的蛋白亚基结合而形成完整的蛋白质分子，经过洗涤后将复性后的蛋白从色谱柱上洗脱下来。应用此复性方法制备的多个亚基组成的蛋白，蛋白得率高，不需纯化，操作简便，节省原料，省时省力。
文档编号C07K1/14GK101343311SQ200810124598
公开日2009年1月14日 申请日期2008年8月26日 优先权日2008年8月26日
发明者孟凡岩, 张建琼, 沈传来, 维 谢 申请人:东南大学